Download as PDF, PPTX
More Related Content
พันธุเทคโน
- 1. บทที่ 3 พันธุศาสตร์และเทคโนโลยีทางชีวภาพ (Geneticsand Biotechnology) รายวิชาชีววิทยา 4 (ว33244) ภาคเรียนที่ 1 ปีการศึกษา 2556
- 2. เทคโนโลยีชีวภาพ (Biotechnology) การใช้เทคโนโลยีเพื่อทาให้สิ่งมีชีวิตหรือองค์ประกอบของสิ่งมีชีวิตมีสมบัติตาม ต้องการ ยกตัวอย่างเช่น ◦ การใช้จุลินทรีย์ในการหมัก ◦ การพัฒนาปรับปรุงพันธุ์พืชและสัตว์ ◦ เทคโนโลยีชีวภาพที่เกี่ยวกับ DNA (DNA Technology)
- 3. การคัดเลือกพันธุ์และการปรับปรุงพันธุ์โดยคน การคัดเลือกโดยคนจะเกิดสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะดีเด่นตาม ความต้องการของคน เช่นการคัดเลือกพันธุ์ปลาทับทิม (การเจริญเติบโตเร็วมีส่วนที่เป็นเนื้อมาก โครงกระดูก เล็ก ก้างน้อย เส้นใยกล้ามเนื้อละเอียด รสชาติดี ไม่มีกลิ่นที่เกิดจากไขมันปลา ต้านทานต่อโรค : พัฒนามาจาก พันธุ์ปลานิลทั่วโลกผสมข้ามพันธุ์) การปรับปรุงพันธุ์ข้าว (พันธุ์ข้าวพันธุ์ดีที่นามาใช้ คือ พันธุ์ข้าวขาวดอกมะลิ 105 ปลูกได้ทุกภาค ใช้เวลา 160 วัน ทนแล้งและดินเปรี้ยวดินเค็ม มาอาบรังสีแกมมา เกิดมิวเทชันได้พันธุ์ข้าว กข 6 กข 10 และกข 15 ที่มีลักษณะดีขึ้นคือ กข 6 เป็นพันธุ์ข้าวเหนียวที่มีกลิ่นหอม ให้ผลผลิตสูง ทนแล้ง ต้านทานโรคไหม้และโรคใบจุดสีน้าตาลได้ดี กข 15 เป็นพันธุ์ข้าวเจ้าที่ให้ผลผลิต เท่ากับข้าวดอกมะลิ 105 แต่ กข 15 มีอายุสั้นกว่า 10 วัน เก็บเกี่ยวได้เร็วกว่า ต้านทานโรคได้ดีกว่าข้าวดอกมะลิ 105)
- 4. การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เป็นการโคลนในพืช โดยการนาเอาส่วนของพืชมาเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ที่พืช ต้องการในสภาพปลอดเชื้อควบคุมแสงสว่าง อุณหภูมิ ความชื้น และกระตุ้นการเจริญของพืชด้วยฮอร์โมนพืช ประโยชน์ 1. ได้พืชจานวนมากที่มีลักษณะเหมือนเดิม 2. ใช้เวลาสั้นในการผลิตต้นพันธุ์ดี 3. ต้นพันธุ์ที่ได้ปราศจากโรค 4. ใช้ผลิตต้นพันธุ์ที่ผสมกันเองในธรรมชาติยาก เสี่ยงต่อการสูญพันธุ์
- 5. พันธุวิศวกรรม (Genetic Engineering) พันธุวิศวกรรม (genetic engineering) หมายถึง เทคโนโลยีที่ทาการเคลื่อนย้าย ยีน (gene) จากสิ่งมีชีวิตสปีชีส์หนึ่งไปสู่สิ่งมีชีวิตอีกสปีชีส์หนึ่ง เป็นการสร้าง DNA สายผสม (recombinant DNA) สร้างสิ่งมีชีวิตรูปแบบใหม่ (novel) ที่มีคุณลักษณะแบบใหม่ ซึ่งไม่เคยปรากฏใน ธรรมชาติมาก่อน เปลี่ยนแปลงหน่วยพันธุกรรม หรือ DNA ของสิ่งมีชีวิต เคลื่อนย้ายยีนที่อยู่เหนือกฎเกณฑ์ ธรรมชาติ สิ่งมีชีวิตที่เกิดขึ้นอาจมียีน ลูกผสมแบบใหม่
- 6. Cloning : หมายถึงกระบวนการสร้างสิ่งที่มีลักษณะทางพันธุกรรม เหมือนกันกับสิ่ง ที่มีอยู่ก่อน มนุษย์รู้จักโคลนนิ่งมาแต่สมัยโบราณแล้ว แต่เป็นการรู้จักโคลนนิ่ง ที่ เกิดกับพืช นั่นคือ การขยายพันธุ์พืชโดย ไม่อาศัยเพศ เช่น การแตกหน่อ
- 7. กระบวนการในพันธุวิศวกรรม ประกอบด้วยกระบวนการโดยรวมคือ 1. การเตรียมยีน (gene)หรือDNA ที่สนใจ 2. การตัด DNA อย่างจาเพาะด้วยเอนไซม์ตัดจาเพาะ 3. การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNA ที่แยกได้กับ DNA พาหะ (vector) เช่น พลาสมิด (plasmid), phage, cosmid 4. การนาพาหะ (vector) ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่ หรือ DNA สายผสม ใส่เข้าไปในเซลล์ ผู้รับ (host) หลังจากนั้นเลี้ยงเซลล์ผู้รับให้แบ่งเซลล์หลายๆครั้ง ทาให้เพิ่มจานวน เซลล์ หรือเพิ่มปริมาณยีนที่น่าสนใจ กระบวนการนี้เรียกว่า การโคลนยีน (gene cloning) 5. การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ
- 8.
- 9. 1. การเตรียมยีน (gene)หรือDNA ที่น่าสนใจ การเตรียมชิ้นส่วนยีนหรือ DNA ที่น่าสนใจมีหลายวิธีดังนี้ 1. การสกัดจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อของสิ่งมีชีวิตที่ต้องการศึกษา ซึ่งเป็น DNA ทั้งหมดในจีโนม ของสิ่งมีชีวิตชนิดนั้น เรียกว่า genomic DNA 2. การเตรียม DNA จาก mRNA ◦ โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase ◦ จะได้ DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นหรือถอดรหัสจาก mRNA เรียกว่า complementary DNA (cDNA) 3. การสังเคราะห์ DNA โดยวิธีทางเคมี ◦ สามารถสังเคราะห์ oligonucleotide ให้มีลาดับเบสที่ต้องการโดยเครื่องสังเคราะห์ อัตโนมัติ ◦ มี 2 วิธีที่ใช้กันอย่างกว้างขวางคือ วิธี phosphate triester และวิธี phosphite triester
- 10. 2. การตัด DNAอย่างจาเพาะด้วยเอนไซม์ตัดจาเพาะ เอนไซม์ตัดจาเพาะ (Restriction enzyme or restriction endonuclease) แบบที่ 2 (type II) เป็นเอนไซม์ที่ใช้กันมากในการ ตัดต่อยีน ประกอบด้วยโพลีเพพไทด์เพียงชนิดเดียว การตัด DNA จะเกิดที่ตาแหน่งจาเพาะในบริเวณจดจา (recognition site) หรือจุดใกล้กับบริเวณจดจา ทาให้ได้ชิ้นขนาด DNA ที่มีขนาดแน่นอน
- 11. Blunt end กับSticky end
- 12.
- 14. 3. การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNAที่แยกได้กับ DNA พาหะ (vector) การเชื่อมต่ออาศัยเอนไซม์ ligase การทาพันธุวิศวกรรมต้องนา DNA ที่สนใจเข้าสู่ภายในเซลล์ผู้รับ โดยอาศัย DNA พาหะ (vector) คุณสมบัติของ DNA พาหะ (vector)มีดังนี้ ◦ มีส่วนของ DNA ที่เป็นจุดเริ่มในการจาลองตัว (origin of replication,ORI) ทาให้สามารถเพิ่มจานวนตัวเองได้พร้อมๆ กับ DNA ที่ใส่เข้าไป ◦ มียีนเครื่องหมาย (marker gene) สาหรับใช้ในการคัดเลือก เช่น ยีนที่ดื้อยา ปฏิชีวนะ ยีนที่เกี่ยวกับการสร้างหรือสลายกรดอะมิโนและน้าตาลบางชนิด ◦ มีบริเวณจดจาของเอนไซม์ชนิดใดชนิดหนึ่งหรือหลายชนิดเพียง ตาแหน่งเดียว ในโมเลกุลของ DNA พาหะ (unique or polylinker site)
- 15. ชนิดของ DNA พาหะ(vector) ขึ้นอยู่กับขนาดของDNA ที่นามาเชื่อมและเซลล์ผู้รับ ตารางแสดง DNA พาหะ (vector) ชนิดต่างๆและขนาดของชิ้น DNA ที่แทรกในพาหะได้ DNA พาหะ (vector) รูปร่าง เซลล์ผู้รับ (host) ขนาดของชิ้น DNA ที่แทรกได้ Plasmid DNA สายคู่, วงกลม E. coli ยาวได้ถึง 10 กิโลเบส Bacteriophage DNA สายตรง, ไวรัส E. coli ยาวได้ถึง 20 กิโลเบส Cosmid DNA สายคู่, วงกลม E. coli 30-50 กิโลเบส Yeast Artificial Chromosome-YACs โครโมโซมเทียม ,ยีสต์ yeast 250-1000 กิโลเบส (1 เมกะ เบส)
- 16.
- 17.
- 19. Fig. 14-9: Cloningby cosmids. The cosmid is cut at a BglII site next to the cos site. Donor genomic DNA is cut using Sau3A, which gives sticky ends compatible with BglII. A tandem array of donor and vector DNA results from mixing. Phage is packaged in vitro by cutting at the cos site. The cosmid with inserts recircularizes once in the bacterial cell.
- 21. 4. การนาพาหะ (vector)ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่ หรือ DNA สายผสม ใส่เข้าไปในเซลล์ผู้รับ ขั้นตอนการนา DNA สายผสม ใส่เข้าไปในเซลล์ผู้รับมีหลายวิธี คือ 4.1 Transformation เป็นการนา DNA ในรูปplasmidเข้าสู่เซลล์ผู้รับ เซลล์ผู้รับที่นิยมใช้กันมากคือ E. Coli โดยทาให้เซลล์ผู้รับเป็น competent cell ก่อน มีสองวิธีคือ ◦ การใช้สารเคมี เช่น dimethyl sulfoxide-DMSO, CaCl2, MgCl2 ◦ Electroporation- ใช้กระแสไฟฟ้าทาให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์ ทาให้ DNA หรือพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้ ◦ การใช้แสงlaser ทาให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์
- 22. 4.2 Transfection ◦ เป็นการนาDNA ของphageที่มีขนาดเล็ก เช่น M13 เข้าสู่เซลล์ผู้รับ ◦ เมื่อแบคทีเรียได้รับ DNA ของphageจานวนมาก เซลล์จะแตกและ phage จะบุกรุกเซลล์อื่นต่อไปทาให้เกิดจุดใส (clear plaque) ◦ จุดใส (clear plaque)คือจานวน DNA ของphageที่เข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย 4.3 Transduction ◦ เป็นการนา DNA ของcosmid,lamda phage ที่มีขนาดใหญ่เข้าสู่เซลล์ ผู้รับ ◦ โดยบรรจุลงในอนุภาคของ phage ก่อนแล้วจึงนาเข้าเซลล์ ◦ วิธีนี้มีประสิทธิภาพสูงกว่า Transformation
- 23. จุดใส (clear plaque)คือจานวนDNA ของphageที่เข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย
- 24. 5.การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ 5.1การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype) ◦ เป็นการอาศัยการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย (marker gene) และมีการ สร้างโปรตีนออกมา เช่น การสร้างเอนไซม์บางชนิดที่ทาให้เกิด clear zone ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี substrate (IPTG) อยู่ หรือพบลักษณะการดื้อยาใน เซลล์ผู้รับที่ได้รับมาจากพลาสมิด 5.2 การคัดเลือกโดย DNA hybridization ◦ อาศัยการจับคู่กันของสาย DNA ที่เป็นตัวติดตาม (probe) กับ DNA เป้าหมายที่ต้องการตรวจหาที่มีลาดับเบสคู่สมกัน บน membrane โดย probe จะติดฉลากด้วยสารไอโซโทปหรือเอนไซม์ 5.3 การคัดเลือกโดยวิธีทางอิมมิวโนวิทยา ◦ ทาได้เมื่อโคลนที่ต้องการแสดงออกได้ โดยผลิตโปรตีน แต่โปรตีนไม่แสดง ลักษณะหรือ phenotype ที่ชัดเจน เป็นการตรวจสอบโปรตีนที่เซลล์ผลิต ขึ้นโดยใช้แอนติบอดีที่จาเพาะกับโปรตีนที่ต้องการนั้น
- 25. การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype) Plasmid/phageที่มีส่วนของยีนที่สร้างb-galactosidase จะสร้างเฉพาะ a- fragment เมื่อ Plasmid/phage ถูกนาเข้าสู่แบคทีเรีย ภายใต้ภาวะที่ถูกกระตุ้นด้วย IPTG จะทา ให้มีการสร้าง b-galactosidaseในแต่ละ fragment ซึ่งสามารถเปลี่ยน X-gal ให้เป็น สีน้าเงินได้ แต่ถ้ามี foreign DNA มาเชื่อมจะทาให้เกิดการทางานของยีนดังกล่าวบกพร่อง ไม่มีการสร้าง b-galactosidase ไม่สามารถเปลี่ยน X-gal ได้จึงให้โคโลนีสีขาว
- 26. Polymerase Chain Reaction(PCR) เพิ่มจานวน DNA ในหลอดทดลอง เครื่องมือ thermocycler
- 27. ขั้นตอนของกระบวนการ PCR 1. การแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกัน(Denaturation) ใช้อุณหภูมิ ประมาณ 94 องศา เซลเซียส เมื่อเริ่มต้นดีเอ็นเอแม่แบบ จะอยู่ในลักษณะที่เป็นเกลียวคู่ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิถึง ประมาณ 94 องศาเซลเซียส จะทาให้พันธะไฮโดรเจนระหว่างคู่เบสของดีเอ็นเอถูกทาลาย ทา ให้เส้นดีเอ็นเอแยกออกจากกัน 2. การจับของไพรเมอร์กับ DNA แม่แบบ (Annealing) เมื่อแยกสายดีเอ็นเอออกจากกันแล้ว จะ ลดอุณหภูมิลงเหลือ 40 - 62 องศาเซลเซียส เพื่อให้ดีเอ็นเอสังเคราะห์ขนาดสั้นประมาณ 15 - 25 คู่เบส ที่เรียกว่า ไพร์เมอร์ (Primer) เข้ามาจับบริเวณที่มีลาดับเบสคู่สมกัน ในการสังเคราะห์ดี เอ็นเอ 3. การสังเคราะห์ DNA สายใหม่ต่อจากไพรเมอร์ (Extension) ใช้อุณหภูมิ ประมาณ 68-72 องศาเซลเซียส ในขั้นตอนนี้จะเป็นการสร้างสายดีเอ็นเอต่อจาก ไพร์เมอร์ โดยอุณหภูมิที่ใช้จะพอเหมาะกับ การทางานของ Taq DNA polymerase
- 28. ลายพิมพ์ DNA (DNAFingerprint)
- 29. ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ ของคนเป็นเอกลักษณ์ของแต่ละบุคคล เพราะคนทุกคนจะมีแตกต่างกันยกเว้นแฝดแท้ที่จะ เหมือนกันลายพิมพ์ดีเอ็นเอของลูกจะได้จากดีเอ็นเอของพ่อและแม่อย่างละครึ่ง ประโยชน์ 1. พิสูจน์เพื่อบุคคลในกรณีฆาตกรรม กรณีบุคคลสูญหาย 2. พิสูจน์ความสัมพันธ์ของพ่อแม่และลูก
- 30. ลายพิมพ์ DNA (DNAFingerprint) DNA ทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตนั้นประกอบด้วย 2 ส่วน coding DNA ทาหน้าที่ควบคุมการสร้างโปรตีนที่มีความสาคัญต่อกลไกต่างๆ ภายใน ร่างกาย ซึ่งจะมีอยู่เพียงร้อยละ 5 ของชุด DNAทั้งหมด noncoding DNA ร้อยละ 95 มีส่วนหนึ่งที่เป็นเบสซ้าต่อเนื่อง (tandem repeat) อยู่หลาย ตาแหน่ง Tandem Repeat เบสซ้าต่อเนื่องนี้เองที่นามาทาเป็นลายพิมพ์ดีเอ็นซึ่งเป็นเครื่องหมายพันธุกรรม ทาให้สามารถรู้ ลักษณะของจานวนการซ้าของท่อน DNA แต่ละชุดในแต่ละตาแหน่งบนสาย DNA ของ สิ่งมีชีวิตและบุคคลได้ สามารถใช้ความแตกต่างกันของขนาดและจานวนการซ้าของท่อน DNA แต่ละชุดนี้ บ่งบอกถึง ข้อมูลพันธุกรรมเฉพาะของแต่ละบุคคลได้
- 32. หลักการทางานของเทคโนโลยีลายพิมพ์ DNA 1. เก็บตัวอย่างเซลล์ตัวอย่างต้องมี DNA ที่มี คุณภาพ ไม่เสื่อมสลาย (ปัจจัยที่ทาให้ DNA เสื่อมสลายคือ ระยะเวลา อุณหภูมิ ความชื้น แสงแดด สารเคมี จุลินทรีย์ ฯลฯ) 2. สกัด DNA จากเซลล์ของตัวอย่าง 3. ตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ หลักการคือ เลือกตัด DNA ในส่วนที่แสดงเอกลักษณ์เฉพาะบุคคล โดยใช้ restriction enzyme จากนั้นนา ชิ้นส่วน DNA ที่ถูกตัดมาวิเคราะห์ตามขนาด ด้วยวิธี Gel Electrophoresi 4. แปลผลลายพิมพ์ DNA โดยการอ่านผลจาก ลักษณะตาแหน่งของแถบดีเอ็น หรือกราฟที่ได้
- 33. Gel Electrophoresis Electrophoresis เป็นเทคนิคที่ใช้แยกโมเลกุลของสารที่มีประจุออกจากกันโดยใช้กระแสไฟฟ้า สารที่มีประจุนั้นเคลื่อนที่ผ่านตัวกลางชนิดหนึ่งในสารละลายสารที่ประจุต่างกันจะเคลื่อนที่ไป ในทิศทางตรงกันข้าม อัตราการเคลื่อนที่ยังขึ้นอยู่กับขนาด รูปร่างโมเลกุล แรงเคลื่อนไฟฟ้า และตัวกลางที่ใช้ด้วย โมเลกุลของ DNA ประกอบด้วยหมู่ฟอสเฟตจานวนมาก สารละลายของ DNA จึงมีประจุเป็นลบ ที่ pH เป็นกลาง เมื่ออยู่ในสนามไฟฟ้าโมเลกุลของ DNA จะเคลื่อนที่จากขั้วลบไปยังขั้วบวก ความเร็วในการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA จึงขึ้นอยู่กับขนาดเป็นส่วนใหญ่ อย่างไรก็ตามมี ปัจจัยอื่นที่มีผลต่อการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA ด้วยดังนี้
- 36. การประยุกต์ใช้เทคโนโลยีของ DNA 1. เชิงการแพทย์และเภสัชกรรม การวินิจฉัยโรค การบาบัดด้วยยีน การสร้างผลิตภัณฑ์ทางเภสัชกรรม 2. เชิงนิติวิทยาศาสตร์ 3. เชิงการเกษตร การทาฟาร์มสัตว์เพื่อสุขภาพมนุษย์ การสร้างสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (transgenic organisms) 4. การใช้พันธุศาสตร์เพื่อศึกษาค้นคว้าหายีนและหน้าที่ของยีน 5. การประยุกต์ใช้เพื่อสิ่งแวดล้อม
- 37. ความก้าวหน้าทางพันธุศาสตร์และเทคโนโลยีชีวภาพ 1. ด้านการเกษตร สร้างพืชGMO ลักษณะตามที่ต้องการ เช่น ต้านทานโรค ทนแล้ง ให้ผลผลิตคุณค่าทางอาหาร 2. การพัฒนาผลิตสัตว์ เช่น การผสมเทียม การถ่ายฝากตัวอ่อน การโคลน 3. การแพทย์และสาธารณสุข เช่น การตรวจโรคหาความบกพร่องก่อนแต่งงาน การรักษาโรคด้วยวิธียีนบาบัด 4. เทคโนโลยีดีเอ็นเอ เช่น การตรวจสอบดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตเพื่อการพิสูจน์เอกลักษณ์บุคคล พันธุ์พืช พันธุ์สัตว์
- 38. “THE END” THANK YOUFOR YOUR ATTENTION!