Downloaded 64 times
บทที่ 6 เทคโนโลยีดีเอ็นเอ
- 2. 6.1 พันธุวิศวกรรมและการโคลน 6.2 การหาขนาดของDNA และการหาลาดับนิวคลีโอไทด์ 6.3 การประยุกต์ใช้เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอ 6.4 เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอกับความปลอดภัยทางชีวภาพ และชีวจริยธรรม
- 4. 6.1 พันธุวิศวกรรมและการโคลน > เป็นการตัดต่อและถ่ายยีนที่ต้องการเข้าสู่สิ่งมีชีวิตจะได้สิ่งมีชีวิตดัดแปร พันธุกรรม (genetically modified organism: GMO) ทาให้ได้สิ่งมีชีวิตที่ มีสมบัติตามต้องการหรือมีลักษณะเปลี่ยนแปลงไปจากเดิม
- 5. > เป็นการเพิ่มปริมาณยีน หรือDNA ที่ต้องการโดยใช้ดีเอ็นเอพาหะหรือเวกเตอร์ (vector) เช่น พลาสมิดของแบคทีเรีย นายีนเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย และนาแบคทีเรีย ไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจานวน พลาสมิดที่มียีนที่ต้องการจะเพิ่มจานวนด้วย มี 3 ขั้นตอน 1.1 การตัดสาย DNA ด้วยเอนไซม์ตัดจาเพาะ 1.2 การเชื่อมสาย DNA ด้วยเอนไซม์ DNA ligase 1.3 การถ่าย DNA recombinant เข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย และคัดเลือกเซลล์ต้องการ
- 7. พลาสมิดที่ใช้เป็นเวกเตอร์ มีสมบัติดังนี้ 1. มีจุดเริ่มต้นของการจาลองดีเอ็นเอเพื่อให้สามารถเพิ่มจานวนได้ด้วยตัวเอง 2.มียีนสาหรับคัดเลือกในเซลล์เจ้าบ้าน เช่น ยีนต้านทานยาปฏิชีวนะ 3. มีบริเวณที่เป็นตาแหน่งตัดของเอนไซม์ตัดจาเพาะหลายชนิดสาหรับแทรก DNA หรือยีนที่ต้องการ พลาสมิด (plasmid)
- 8. 1.1 การตัดสาย DNAด้วยเอนไซม์ตัดจาเพาะ > เอนไซม์ตัดจาเพาะ (restriction enzymes) ได้มาจากแบคทีเรีย > ทาหน้าที่ตัดพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ภายในสาย DNA มีลาดับนิวคลีโอไทด์จาเพาะ > เอนไซม์ตัดจาเพาะจะจดจาและเข้าจับ DNA ในบริเวณที่มีลาดับเบสที่เป็นบริเวณจดจา (recognition site) > เอนไซม์ตัดจาเพาะแต่ละชนิดจะมีลาดับเบสที่เป็นบริเวณจดจาและจุดตัดจาเพาะที่ แตกต่างกัน
- 11. > ถ้าตัดสาย DNAแล้วทาให้เกิดปลายสายเดี่ยวที่มีนิวคลีโอไทด์ยื่นออกมา เรียกว่า ปลายเหนียว (sticky end) > ถ้าเอนไซม์ตัดจาเพาะมีจุดตัดอยู่ตรงกันทั้งสองสายของ DNA จะทาให้เกิดปลายทู่ (blunt end)
- 13.
- 14. 1.2 การเชื่อมสาย DNAด้วยเอนไซม์ DNA ligase > เอนไซม์ DNA ligase สามารถเร่งปฏิกิริยาการสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ระหว่าง ปลายสาย DNA สองปลายเชื่อมต่อกันได้
- 18. 1.3 การถ่าย DNArecombinant เข้าสู่เซลล์แบคทีเรียและคัดเลือกเซลล์ที่ ต้องการ > เพิ่มจานวน DNA recombinant โดยถ่ายเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย แล้วนาแบคทีเรียที่ได้รับ DNA recombinant ไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจานวน DNA ที่ต้องการที่แทรกอยู่ในพลาสมิดก็จะเพิ่ม จานวนด้วย และทาการคัดเลือกเซลล์ที่ต้องการ เซลล์แบคทีเรียที่ได้รับพลาสมิดจะเจริญได้ ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใส่ยาปฏิชีวนะ
- 20.
- 21. การคัดเลือก โดยวิธี Bluewhite screening
- 22. เมื่อมี DNA แทรกในยีนLacZ บนพลาสมิด ยีนนั้นไม่สามารถสร้างเอนไซม์ที่ทางานได้ จึงไม่ย่อยสารตั้งต้นให้สารสีฟ้า โคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อจึงเป็นสีขาว แต่ถ้าไม่มี DNA แทรก ยีนจะทางานได้ สร้างเอนไซม์ย่อยสารตั้งต้นได้สารสีฟ้า โคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อจึงเป็นสีฟ้า ดังนั้นสีของโคโลนีจึงบอกได้ว่าเซลล์แบคทีเรียได้รับดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์หรือไม่ เรียกวิธี การคัดเลือกนี้ว่า blue white screening
- 27. > PCR =polymerase chain reaction > เป็นการเพิ่มจานวน DNA ในหลอดทดลองเพื่อให้ได้โมเลกุลของ DNA ที่เหมือนกันใน ปริมาณมาก โดยใช้ เครื่อง thermal cycler > ในการทาปฏิกิริยา PCR เป็นการเพิ่มจานวน DNA บางบริเวณไม่ได้ครอบคลุมทั้งสาย ของ DNA ต้นแบบ ถ้าต้องการเพิ่มจานวน DNA ที่บริเวณใด ให้เลือกไพรเมอร์ (primer) ที่มีลาดับเบสเป็นเบสคู่สมกับดีเอ็นเอแม่แบบที่จุดเริ่มต้นของแต่ละสายซึ่งครอบคลุม บริเวณนั้นของสายดีเอ็นเอแม่แบบซึ่งมีลาดับเบสเป็นเบสคู่สมกับไพรเมอร์
- 33. > ข้อดี :สามารถเพิ่มปริมาณส่วนของ DNA ที่ต้องการได้ปริมาณมากในเวลาอันรวดเร็ว > ข้อจากัด : ไม่สามารถเพิ่มปริมาณส่วนของ DNA ที่มีขนาดใหญ่ได้ และต้องทราบลาดับ เบสของส่วนปลายของ DNA ที่ต้องการให้ไพรเมอร์เข้าจับ
- 35. 6.2 การหาขนาดของ DNAและการหาลาดับนิวคลีโอไทด์ เมื่อเพิ่มจานวน DNA แล้ว สามารถนามาหาขนาดของ DNA ได้ด้วย เทคนิค เจลอิเล็กโทรฟอริซิส (gel electrophoresis) ซึ่งแยกโมเลกุลของ DNA ที่มีขนาด แตกต่างกันออกจากกันในสนามไฟฟ้าผ่านตัวกลางที่มีลักษณะเป็นวุ้นที่รูพรุน นอกจากนี้ ยังสามารถใช้แยกและศึกษาโมเลกุลของโปรตีนได้อีกด้วย
- 40.
- 42. การหาขนาดของ DNA สามารถทาได้โดยเปรียบเทียบกับโมเลกุลดีเอ็นเอมาตรฐาน (DNAmarker ; M) ซึ่งประกอบด้วยชิ้น DNA ที่ทราบขนาดเป็นจานวนคู่เบส (base pair; bp) จะทาให้ทราบขนาดโมเลกุลของ DNA ที่ต้องการศึกษาได้
- 43. ลองทา กรณีศึกษา หน้า130-131 แนวการคิด การทาปฏิกิริยา PCR นั้น ไพรเมอร์ จะจับกับดีเอ็นเอแม่แบบในตาแหน่งที่จาเพาะซึ่ง อาจได้ผลิตภัณฑ์เป็นชิ้น DNA ขนาดแตกต่างกัน ในการตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อแบคทีเรียใน อาหาร เป็นดังนี้ - B1 เป็นแบคทีเรียสายพันธุ์ไม่ก่อโรค จะได้ชิ้น DNA จานวน 1 ขนาด คือ 150 คู่เบส - F1 ที่มีแบคทีเรียสายพันธุ์ไม่ก่อโรคและที่ก่อ โรค จะได้ชิ้น DNA จานวน 2 ขนาด คือ 150 และ 400 คู่เบส - F2 ที่มีแบคทีเรียสายพันธุ์ไม่ก่อโรคจะได้ชิ้น DNA จานวน 1 ขนาด คือ 150 คู่เบส - B2 เป็นแบคทีเรียสายพันธุ์ก่อโรค จะได้ชิ้น DNA จานวน 1 ขนาด คือ 400 คู่เบส
- 44. > ทาได้โดยใช้ เครื่องหาลาดับนิวคลีโอไทด์แบบอัตโนมัติ(automated sequencer) ซึ่งเมื่อทราบลาดับนิวคลีโอไทด์ของโมเลกุล DNA แล้วจะสามารถบอกได้ว่า DNA นั้นเป็น ยีนใดโดยนาไปเทียบกับฐานข้อมูลที่มีการศึกษาแล้ว > นอกจากนี้ลาดับนิวคลีโอไทด์ยังสามารถใช้วิเคราะห์การเกิดมิวเทชันได้อีกด้วย รวมทั้ง นาลาดับนิวคลีโอไทด์ไปแปลเป็นลาดับกรดแอมิโนเพื่อใช้ในการทานายโครงสร้างและการ ทางานของโปรตีนได้
- 45.
- 46.
- 47.
- 48. > การวินิจฉัยโรค เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอสามารถใช้วินิจฉัยโรคต่าง ๆได้ เช่น โรคทางพันธุกรรมซึ่งรวมถึง การเป็นพาหะที่อาจไม่แสดงอาการของโรค โรคที่เกิดจากการทางานของยีนที่ผิดปกติก่อนมี อาการของโรค โรคที่เกิดจากไวรัส เป็นต้น ซึ่งมีข้อดี คือ ทาให้สามารถตรวจพบและรักษาได้ อย่างรวดเร็ว และสามารถวางแผนการรักษาได้อย่างมีประสิทธิภาพ
- 49. > การบาบัดด้วยยีน (genetherapy) เป็นการรักษาโรคทางพันธุกรรมรวมถึงอาการผิดปกติต่าง ๆ ที่เกิดขึ้นจากยีน โดย การถ่ายแอลลีลที่ปกติเข้าสู่เซลล์หรือเนื้อเยื่อที่แสดงอาการผิดปกติ เพื่อให้ยีนนั้นแทรก เข้าสู่จีโนมของมนุษย์และควบคุมให้มีการแสดงออกและสร้างโปรตีนที่ปกติ
- 51. การรักษาโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องรุนแรงชนิด ADA (adenosinedeaminase severe immunodeficiency)
- 53. เครื่องหมายโมเลกุล (molecular marker): ลาดับนิวคลีโอไทด์ภายในจีโนมที่สามารถใช้ ระบุตัวตนหรือชนิดของสิ่งมีชีวิต รวมถึงยีนที่ สนใจ โดยอาศัยความแตกต่างในรูปแบบต่างๆ เช่น ความต่างของลาดับนิวคลีโอไทด์ซึ่งเกิดจาก การแทนที่คู่เบส การเพิ่มขึ้นหรือขาดหายไป ของนิวคลีโอไทด์ ใช้ในการคัดเลือกพืชและสัตว์ด้วยการตรวจหาเครื่องหมายโมเลกุล (molecular marker) ของลักษณะที่ต้องการเพื่อช่วยลดระยะเวลาการปรับปรุงพันธุ์แบบดั้งเดิมซึ่ง เป็นการคัดเลือกจากลักษณะฟีโนไทป์
- 54. พืชดัดแปรพันธุกรรม การทา GMO ในพืชโดยใช้A. tumefaciens โดยถ่ายยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้าง สารสีน้าเงินจากต้นไอริสเข้าสู่จีโนมของกุหลาบ
- 57. ภาพ ฝ้ายธรรมดา (ซ้าย)และฝ้ายที่มียีนบีที (ขวา) ภาพ มะละกอที่มียีนต้านทานต่อโรคใบด่างจุดวงแหวน
- 59.
- 61. แอนดี (ANDi) ลิงตัดต่อพันธุกรรมที่มียีนเรืองแสงตัวแรกของโลกเกิดเมื่อวันที่ 2 ต.ค. 2543 (ภาพจาก www.abc.net.au)
- 64. สิ่งมีชีวิตมีความแตกต่างทางพันธุกรรมในระดับบุคคล จะไม่มีใครที่มีลาดับเบสเหมือนกัน ทุกประการ จึงสามารถใช้ความแตกต่างนี้เป็นข้อมูลในการระบุบุคคลได้(ยกเว้น แฝดร่วมไข่) โดยใช้เทคนิคการวิเคราะห์ STR (short tandem repeat analysis) คือ การตรวจหา จานวนซ้าของ STR ในแต่ละตาแหน่งโดยการใช้เทคนิค PCR STR (short tandem repeat analysis): บริเวณที่มีการซ้าๆ กันของลาดับเบสสั้น ๆ ต่อเนื่องกัน พบกระจายทั่วไปในจีโนมของ สิ่งมีชีวิต
- 66.
- 67.
- 70. - ระบุตัวบุคคล เช่นผู้เสียชีวิตจากเครื่องบินตกหรือไฟไหม้ หรือการระบุผู้กระทาความผิด ในคดีฆาตกรรม - ระบุตัวตนของสิ่งมีชีวิต เช่น ช้าง เสือ เพื่อป้องกันการนาช้างป่าหรือช้างที่นามาจาก แหล่งอื่นมาสวมสิทธิ์ว่าเป็นช้างบ้านซึ่งขึ้นทะเบียนถูกต้องตามกฎหมาย - ตรวจพิสูจน์ความสัมพันธ์ทางสายเลือด หาความสัมพันธ์ทางสายเลือดของพ่อแม่กับ ลูก รวมทั้งความสัมพันธ์ในหมู่เครือญาติ - จาแนกสิ่งมีชีวิตในระดับประชากร ใช้ระบุเชื้อชาติ ระบุถิ่นที่อยู่ของสิ่งมีชีวิตซึ่งสามารถ นามาใช้เป็นข้อมูลเกี่ยวกับการลักลอบนาเข้าสัตว์ผิดกฎหมาย - ใช้ในการระบุสปีชีส์ของสิ่งมีชีวิต ใช้ระบุได้ว่าชิ้นเนื้อเยื่อหรือชิ้นส่วนของมนุษย์หรือ สิ่งมีชีวิตอื่น หรือตรวจสอบการปนเปื้อนของอาหารว่ามีส่วนประกอบหรือมีการปนเปื้อน ของสิ่งมีชีวิตหรือไม่ เช่น เนื้อหมูในอาหารฮาลาล หรือการปนเปื้อนของสิ่งมีชีวิตที่อาจเป็น อันตรายต่อผู้บริโภค เช่น เนื้อปลาปักเป้าในลูกชิ้นปลา
- 73. 6.4 เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอกับความปลอดภัยทางชีวภาพและชีวจริยธรรม > เทคโนโลยีทางดีเอ็นเอมีการนามาใช้ประโยชน์ในด้านต่างๆ แต่ในขณะเดียวกันก็ทาให้ เกิดข้อกังวลเกี่ยวกับผลกระทบที่อาจเกิดขึ้น > การใช้เทคโนโลยีเหล่านี้จึงควรคานึงถึงความปลอดภัยทางชีวภาพและชีวจริยธรรม เช่น - ความปลอดภัยต่อชีวิตและสุขภาพของมนุษย์ - การป้องกันการสูญเสียความหลากหลายทางชีวภาพ - การปฏิบัติต่อสิ่งชีวิตอย่างมีคุณธรรม
- 74.