Kloning gen fim-C Salmonella typhimurium ke vektor pGEM-T easy untuk pengembangan vaksin typhus. Gen fim-C diisolasi dari DNA genom S. typhimurium, diamplifikasi melalui PCR, dan dikloning ke vektor pGEM-T easy melalui ligasi. Plasmid rekombinan kemudian dikarakterisasi dengan restriksi enzim dan sekuensing untuk pengembangan vaksin typhus manusia.

1. KLONING GEN UNTUK
PENGEMBANGAN VAKSIN
REKOMBINAN PENYAKIT
TYPHUSKELOMPOK 15
BANGKIT A. SIPAYUNG 151501064
TAMELIA 151501169
CHRISTOPHER RANDY. S 151501185
EKO KESATRIA SURBAKTI 151501229
MAULANA SAKTI 151501234
CYNTHIA FRISILIA 151501240

2. Kloning Gen fim-C Salmonella typhimurium dengan vektor pGEM-T easy untuk
pengembangan vaksin rekombinan penyakit typhus pada manusia
Nurjayadi, M., et al. 2013.
Jurnal Riset Sains dan Kimia Terapan, Vol. 3, No. 2, Desember 2013.
ISSN: 2302-8467

3. PLASMID & GEN
• pGEM-T easy (Plasmid Vektor)
• pGEM-T-Stpm-fim-C (Plasmid Rekombinan)
• Fimbrial-C, disingkat fim-C (Gen Salmonella typhimurium)

4. pGEM-T easy

5. 1.Isolasi DNA genom Salmonella typhimurium. Proses isolasi DNA genom bakteri
mengikuti kit isolasi wizard dari Promega.
2.Amplifikasi gen fim-C dengan metode PCR. Dilakukan dengan mesin thermal
cycle, pasangan primer, nuclease free water, serta Master Mix PCR.
3.Karakterisasi gen fim-C hasil amplifikasi, dengan elektroforesis gel agarosa 2%
dengan pewarna etidium bromida 0,1%.
4.Purifikasi gen fim-C, dipurifikasi mengikuti kit PCR purification dari Promega.
5.Kloning gen fim-C dengan vektor pGEM-T easy.
6.Karakterisasi hasil kloning

6. • Reaksi ligasi dilakukan sesuai prosedur kit vektor pGEM-T easy.
• Jumlah vektor dan DNA hasil PCR yang digunakan dalam reaksi ligase diambil
sesuai dengan rasio perbandingan molar yang dianjurkan pada kit
(perbandingan molar sisipan : vektor adalah 3 : 1).
• Ukuran vektor pGEM-T easy 3kb dan ukuran sisipan gen fim-c S. typhimurium
0,7kb.
• Berdasarkan perbandingan molar dengan rumus dari kit pGEM-T easy untuk
reaksi ligase menggunakan 50 ng vektor, jumlah sisipan yang harus
ditambahkan adalah 35ng.
• Reaksi dilakukan dalam tabung eppendorf 1,5 mL dengan mencampurkan 5μL
bufer ligasi 2x T4 DNA ligase; 1μL (50 ng) vektor pGEM-T easy; 1μL enzim T4
DNA ligase 3 u/μL; 3 μL (35ng) hasil PCR yang telah dimurnikan dengan
presipitasi etanol. Volume akhir campuran dibuat menjadi 10μL.
• Campuran dihomogenkan, dilanjutkan dengan inkubasi pada 40°C selama satu
malam.
• Hasil reaksi ligasi dapat disimpan pada suhu 2-80°C sampai akan digunakan.

7. • E. coli TOP10 selanjutnya ditransformasi dengan hasil ligasi, dilakukan dengan
metode kejut panas.
• Setelah itu dilakukan skrining. Koloni yang diduga positif (koloni putih) lalu di ambil
dan dikultur dalam media LB-ampisilin cair untuk selanjutnya diekstrak plasmidnya.
• Koloni positif plasmid dikarakterisasi. Plasmid rekombinan diisolasi menggunakan
High-Speed Plasmid Kit.
• Karakterisasi hasil isolasi dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan
pewarna etidium bromida 0,1%. Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan di bawah
lampu UV.
• Karakterisasi hasil kloning dilakukan dengan enzim restriksi Enzim restriksi yang
digunakan adalah BamH I dan Hind III.
• Hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi tersebut selanjutnya dianalisis
dengan metode elektroforesis gel agarosa 1%. Proses elektroforesis dan visualisasi
hasil dilakukan sama dengan tahap sebelumnya.
• Terakhir DNA target disekuensing dengan menggunakan sekuenser (Applied
Biosystem Instrument) untuk mengetahui sekuen gen target telah terfusi his-tag.

8. PRIMER YANG DIGUNAKAN

9. • Karakterisasi hasil isolasi DNA
Genom bakteri

10. • Hasil amplifikasi

11. • Hasil purifikasi gen fim-C

12. • Hasil isolasi plasmid rekombinan

13. • Hasil analisis restriksi

14. • Gambaran hasil
analisis restriksi
plasmid
rekombinan
pGEM-fimC
S.typhimurium.
• Analisis teoritis
menunjukkan
plasmid
rekombinan
pGEMfimC
S.typhimurium
dapat dipotong
dengan enzim
restriksi BamHI
dan Hind III.

15. TERIMA KASIH