bioteknologi pertanian

2. Bahan bakar fosil
adalah sumber utama
energi. Karena
meningkatnya jumlah
penduduk dan
kebutuhan akan bahan
bakar, bahan bakar
fosil ini sangat banyak
digunakan.
Harga bahan bakar yang
terus meningkat,
perubahan iklim, dan
pemanasan global juga
membuat para peneliti
untuk berpikir tentang
bahan bakar alternatif.

3. Jatropha curcas dianggap sebagai
tanaman biodiesel karena
kandungan minyaknya tinggi (50-
60% dari total biomassa biji), yang
bisa menggantikan minyak fosil
diesel konvensional.
J. curcas sangat mudah beradaptasi dan
dapat tumbuh di daerah semi-kering,
kering, dan lahan-lahan marjinal, tetapi
masih dalam tipe liar, sehingga
pertumbuhannya serta hasilnya sangat
dipengaruhi oleh berbagai cekaman biotik
dan abiotik.

4.  Perlu untuk mengembangkan J. curcas yang
toleran cekaman biotik dan abiotik, hasil
yang tinggi, dan bebas racun.
 Transformasi tanaman dapat mengurangi
waktu, biaya, tenaga kerja, dan
menghindari variasi somaklonal.
 Efisiensi transformasi diperoleh melalui
transformasi tanaman jauh lebih tinggi
daripada transformasi berbasis kultur
jaringan konvensional.

5.  Perbanyakan konvensional menggunakan kultur
jaringan membutuhkan lebih banyak waktu,
dan tanaman rekalsitran seperti J. curcas
menunjukkan respon yang buruk terhadap
perbanyakan. Hal ini dapat diatasi dengan
menggabungkan transformasi tanaman dan
penyambungan in vivo.
 Penyambungan adalah teknik vegetatif yang
digunakan untuk menggabungkan
tunas/cabang dari sebuah tanaman dengan
akar dan pangkal tanaman lain.

6. Penelitian ini dilakukan
dengan tujuan untuk
mengembangkan
tanaman berbasis
penyambungan in vivo
diikuti dengan
transformasi tanaman
untuk menghasilkan
tanaman J. curcas
yang bertransformasi.

7.  Bahan Tanam
Benih-benih J. curcas var. AG001
 Konsentrasi penghambat minimum (MIC)
garam amonium fosfinotrisin (PPT)
Penyemprotan MIC PPT (100 ml) pada
pertumbuhan tanaman dengan konsentrasi yang
berbeda (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 atau 3,0 g l-1)
pada tanaman jenis liar (WT) yang berumur 45
hari menggunakan hand sprayer. Konsentrasi
PPT di mana seluruh daun menunjukkan gejala
nekrotik dianggap sebagai MIC, dan konsentrasi
ini digunakan untuk menyeleksi tanaman
transformasi. Setiap perlakuan terdiri dari 50
tanaman dengan 3 kali ulangan.

8.  Jenis Agrobacterium dan vektor biner
 Tiga jenis Agrobacterium tumefaciens - LBA
4404, EHA 101, dan EHA 105 - dengan vektor
biner pGA 492 membawa gen bar, npt II, dan
gus pada promotor kontrol CaMV35 S dan
pembatas nos.
Skema vektor pGA 492 yang digunakan dalam tranformasi
tanaman J. curcas

9.  LBA 4404 adalah jenis otopine dengan latar
belakang kromosom Ach5 membawa pAL4404
sebagai plasmid virulensi.
 EHA 105 adalah jenis L,L-succinamopine dengan
latar belakang kromosom C58. EHA 105
mengandung pEHA 105 sebagai plasmid virulensi
pembantu yang berasal dari supervirulent pTiBo
542.
 EHA 101 mengandung jenis agropine supervirulen
plasmid Ti pTiBo 542.
 Tiga jenis Agrobacterium dipelihara pada medium
agar AB ditambah dengan 10 mg l-1 rifampicin dan
50 mg l-1 kanamisin.

10.  Transformasi tanaman menggunakan
Agrobactorium
 Koloni Agrobacterium ke dalam 35 ml LB
dilengkapi dengan antibiotik dan diinkubasi
satu malam pada suhu 28 °C di sebuah
orbital shaker dengan 180 rpm.
 Kemudian, sel-sel bakteri yang di
sentrifugasi pada 6.000 rpm selama 8
menit.
 Pelet sel bakteri disuspensikan kembali
dalam medium infiltrasi (medium cair MS
yang mengandung 5% sukrosa) dan
terakhir OD600 disetel hingga. 0,6.

11.  Planlet J. curcas umur tiga minggu digunakan dalam
transformasi tanaman menggunakan Agrobacterium.
 Tiga jenis infeksi dilakukan. Pada infeksi pertama, planlet
dipotong batangnya dengan mengambil meristem apikal dan daun
menggunakan pisau bedah No. 22. Getah dari pelukaan itu
dibersihkan dan suspensi Agrobacterium (2 ml) diaplikasikan
dengan menggunakan kapas penyerap steril.
 Di jenis infeksi kedua, daun diambil dari tunas dan daerah tunas
apikal ditusuk (8-10 kali) dengan jarum bedah steril dan
suspensi Agrobacterium (2 ml) diaplikasikan dengan
menggunakan kapas penyerap steril.
 Pada tipe infeksi ketiga, daerah apikal tunas ditusuk (8-10 kali),
supensi Agrobacterium (2 ml) diaplikasikan dengan menggunakan
kapas penyerap steril, dan di vakum infiltrasi dalam suspensi
Agrobacterium pada 100, 150 atau 200 mmHg selama 1, 2, 3
atau 4 menit dengan menggunakan vakum desikator yang
terhubung ke pompa vakum.
1
2
3

12.  Tanaman yang terinfeksi dipelihara pada
kondisi gelap selama 3 hari tanpa air dan
kemudian tanaman disiram secara normal di
rumah kaca. Tanaman yang diduga
bertransformasi dipilih dengan penyemprotan
2 g l-1 PPT pada tanaman umur 8 minggu
menggunakan hand sprayer. Tanaman yang
menunjukkan resistensi signifikan terhadap
PPT dipilih untuk analisis lebih lanjut. Setiap
percobaan diulang tiga kali dengan 50 planlet.

13. Plantlet J.
curcas umur tiga
minggu
Plantlet J. curcas
dipotong, ditusuk, di-vakum
infiltrasi
selama infeksi
dengan A.
tumefaciens EHA
105
Pengembangan
cabang dan daun
dari titik yang
terinfeksi setelah
45 hari infeksi

14.  Analisis histokimia dari ekspresi gen gus. Sampel
daun yang diduga bertransformasi, tanaman
sambungan, dan tanaman WT diinkubasi selama
24 jam pada suhu 37 °C dalam sebuah buffer
yang mengandung 0,1 M NaPO4 (pH 7.0), 0,1 M
kalium ferrisianida, 0,1 M ferrosianida, 0,2 M
EDTA (pH 7.0), 0,05 % Triton X-100, 500 mg l-1
5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-D-glukuronat (X-gluc)
dan 20% metanol. Setelah pewarnaan X-gluc,
sampel daun diinkubasi dalam aseton dingin
untuk menghilangkan klorofil.

15.  Lima tanaman umur 12 minggu dipilih secara acak yang
diduga bertransformasi yang positif GUS dan tanaman
WT digunakan untuk penyambungan. Metode yang
digunakan adalah sambung celah atau berbentuk V.
 Batang atas (panjang 3-5 cm) disiapkan dari tunas
dengan memangkas daun dan memotong pangkal batang
bawah untuk sambungan dan batang bawah disiapkan
dengan memotong daun dan kemudian membuat
potongan vertikal 1-2 cm di pusat batang.
 Sambungan batang bawah/batang atas dibungkus
dengan Parafilm dan pembungkus Saran untuk mencegah
penguapan air dan menjaga dari hama. Ketika batang
atas yang menyatu dengan batang bawah, pembungkus
Saran dan Parafilm dilepas. Tanaman disiram 2 hari
sekali dan dipelihara di rumah kaca.
 Tanaman sambungan berumur 8 minggu dipilih dengan
menyemprotkan 2 g l-1 PPT menggunakan hand sprayer.
Tanaman yang bertahan diseleksi dengan analisis
histokimia GUS, polymerase chain reaction (PCR), dan
Southern blot hybridization.

16.  Untuk menganalisis integrasi gen bar pada tanaman J.
curcas yang bertransformasi, genom DNA diisolasi dari
daun tanaman sambunganyang positif GUS dan tanaman
WT dengan menggunakan GenElute™ plant genomic DNA
miniprep kit. Penggunaan PCR dengan menggunakan gen bar
spesifik (BARFP: 5'-ATCGTCAACCACTACATCGAGAC-3')
dan (BARRP: 5'-CCAGCTGCCAGAAACCCACGTC-3') yang
secara spesifik mengaplifikasi 462 bpbar. PCR dilakukan
dalam PTC100™ thermal cycler diprogram dengan
denaturasi awal DNA pada 95 °C selama 5 menit, kemudian
dengan 35 siklus 95 °C selama 1 menit, 71 °C selama 1
menit, 72 °C selama 1 menit, diikuti dengan ekstensi akhir
pada suhu 72 °C selama 5 menit. Plasmid pGA 492 dan
genom DNA tanaman WT digunakan masing-masing sebagai
kontrol positif dan negatif. Hasil amplifikasi dipisahkan
pada 1% (w/v) gel agarosa.

17.  Southern blot hybridization dilakukan untuk mencari
jumlah salinan gen bar pada tanaman sambungan J.
curcas yang melalui PCR.
 Sepuluh microgram genom DNA dari tanaman
sambungan yang melalui PCR, tanaman WT, dan 5 μg
plasmid DNA pGA 492 dicerna semalam dengan SacI
pada 37°C. Sampel DNA yang dicerna dipisahkan pada
1% (w/v) gel agarose dan di-blotted dengan membran
Hybond N+.
 Membran di hibridisasi dengan pemeriksaan dengan
menggunakan produk amplifikasi PCR 462 bp dari gen
bar. Membran hibridisasi dicuci dan diperlakukan
untuk perkembangan chemiluminescent menggunakan
substrat CDP-Star, dan terkena sinar X-ray. Vektor
biner pGA 492 dan genom DNA dari tanaman WT
berperan masing-masing sebagai kontrol positif dan
negatif.

18.  Analisis kemurnian genetik dilakukan tiga kali pada
tanaman yang diduga bertransformasi dan tanaman
sambungan dengan penanda RAPD. Sebanyak sepuluh
primer RAPD digunakan untuk meneliti kemurnian
genetik pada tanaman yang disambung.
 RAPD-PCR, diprogram untuk memulai denaturasi pada
suhu 94 °C selama 6 menit dan 35 siklus pada suhu 94
°C selama 1 menit, 37 °C selama 1 menit, 72 °C selama
2 menit dilanjutkan dengan ekstensi akhir pada 72 °C
selama sekitar 7 menit.
 Produk yang diamplifikasi dipisahkan secara
elektroforesis pada 1% (w/v) gel agarosa yang
mengandung etidium bromida pada 100 V dan difoto
dibawah sinar ultraviolet dengan menggunakan Gel
Doc 2000. Setiap RAPD-PCR dilakukan sebanyak 3
kali.

19.  MIC PPT pada perkembangan tanaman
 Pemilihan tanaman transformasi dari non-transformasi
merupakan langkah penting dalam
memproduksi tanaman transgenik. Adanya gen
bar di daerah T-DNA dari vektor biner pGA 492
memberikan perlawanan terhadap PPT dan
digunakan untuk memilih jaringan/tanaman yang
bertransformasi. PPT digunakan sebagai agen
penyeleksi pada beberapa tanaman minyak
seperti jarak, canola, dan kelapa sawit. Namun,
belum ada laporan penggunaan PPT sebagai agen
penyeleksi dalam transformasi J. curcas.
Perbedaan konsentrasi penyemprotan PPT pada
tanaman WT, pada 2,0 g l-1 menunjukkan gejala
nekrotik pada daun, dan dalam waktu seminggu
semua tanaman mati. Oleh karena itu, 2,0 g l-1
digunakan sebagai MIC untuk menyeleksi tanaman
J. curcas

20.  Jenis Agrobacterium, latar belakang kromosom, potensi
gen yang aktif di wilayah virulensi dan jenis pelukaan
adalah faktor penting yang mempengaruhi efisiensi
transformasi. Tiga jenis Agrobacterium dievaluasi,
tanaman yang terpotong diinfeksi dengan EHA 105, 62,30%
tanaman bertahan setelah penyemprotan PPT (14,33
tanaman dari 23 tanaman yang bertahan setelah infeksi) ,
dari tanaman ini 79,06% mengekspresikan gen gus (11.33
tanaman dari 14.33 tanaman yang bertahan setelah
penyemprotan PPT) dengan efisiensi transformasi 22,66%.
 Ketika tanaman yang terpotong diinfeksikan jenis
Agrobacterium EHA 101 dan LBA 4404, efisiensi
transformasi adalah masing-masing 18% dan 12,66%. Latar
belakang kromosom dan plasmid pembantu vir (pEHA 105)
ada dalam jenis Agrobacterium EHA 105 yang mengandung
lebih banyak gen vir dibandingkan dengan 2 jenis yang lain.
EHA105 memiliki kemampuan kuat untuk menginfeksi J.
curcas daripada EHA101 dan LBA4404.

21.  Efisiensi transformasi tergantung pada sejauh mana
sel-sel meristematik terkena A. tumefaciens. Perlu
untuk membuat Agrobacterium masuk lebih dalam ke
dalam jaringan. Penusukan adalah salah satu metode
yang digunakan untuk menginfeksi sel-sel meristematik.
Tiga jenis Agrobacterium dievaluasi, saat tanaman
ditusuk dan diinfeksikan EHA 105, 73,17% tanaman
bertahan setelah penyemprotan PPT , dan 86,65%
(17,33 tanaman dari 20 tanaman bertahan setelah
penyemprotan PPT) tanaman ini mengekspresikan gen
gus dengan efisiensi transformasi 34,66% (17,33
tanaman dari 20 tanaman bertahan setelah
penyemprotan PPT). Di sisi lain, EHA 101 dan LBA 4404
menunjukkan efisiensi transformasi masing-masing 24%
dan 16.66%.

22.  Tabel 1

23.  Untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada J.
curcas, suspensi A. tumefaciens EHA 105 diaplikasikan
pada tempat tusukan daerah apikal dari tanaman dengan
kapas penyerap steril dan diperlakukan vakum infiltrasi
pada tekanan yang berbeda (100, 250 atau 500) pada
interval waktu yang berbeda (1, 2, 3 atau 4 menit). .
Efisiensi transformasi meningkat dengan peningkatan
tekanan vakum dan 250 mm Hg (selama 1 menit)
ditemukan optimal dimana pada 84,99% (28,33 tanaman
dari 33,33 tanaman bertahan setelah infeksi) dari
tanaman bertahan setelah penyemprotan PPT dan dari
jumlah 88,24% (25 tanaman dari 28,33 tanaman
bertahan setelah penyemprotan PPT) tanaman ini
mengekspresikan gen gus dengan efisiensi transformasi
50%.

24.  Penginfiltrasian vakum selama 3 menit optimal pada 100
dan 250 mmHg, dimana 83,19 % (31,33 tanaman dari
37,66 tanaman bertahan setelah infeksi) dan 89,91%
(35,66 tanaman dari 39,66 tanaman bertahan setelah
infeksi) tanaman bertahan setelah penyemprotan PPT
dan dari jumlah ini 91,47% (28,66 tanaman dari 31,33
tanaman bertahan setelah penyemprotan PPT) dan
87,85% (31,33 dari 35,66 tanaman bertahan setelah
penyemprotan PPT) tanaman mengekspresikan gen gus
dengan efisiensi transformasi masing-masing 57,32%
dan 62,66 %.
 Jika melewati 3 menit (pada 100 dan 250 mmHg) dan 1
menit (pada 500 mmHg), infiltrasi vakum berdampak
negatif terhadap kelangsungan hidup tanaman dan
akhirnya menyebabkan efisiensi transformasi rendah.
 Oleh karena itu, penusukan (8-10 kali) di daerah tunas
apikal utama dengan jarum suntik steril dan vakum
infiltrasi dengan suspensi A. tumefaciens EHA 105 pada
250 mmHg selama 3 menit optimal dan menyebabkan
efisiensi transformasi maksimum 62,66%.

25.  Daun dari tunas yang tumbuh umur 70 hari
dari tanaman J. curcas yang terinfeksi dan
tanaman WT diuji secara histokimia untuk
ekspresi gen gus. Warna biru intens diamati
dari daun yang diduga bertransformasi,
sedangkan tidak berwarna biru seperti yang
diamati dari sampel daun WT. Hal ini
menunjukkan bahwa gen gus terintegrasi dan
terekspresi dalam transformasi genom J.
curcas. Pengujian tunas positif GUS untuk
seleksi dalam perbanyakan tanaman
transformasi melalui penyambungan.

26.  Analisi Histokimia GUS tanaman yang
diduga bertransformasi
 Analisi Histokimia GUS tanaman kontrol WT

27.  Perkembangan daun dari sambungan batang atas diamati
dari hari ketiga penyambungan dan banyak daun muncul
dalam waktu 2 minggu dari sambungan. Setelah 3
minggu penyambungan, perkembangan jaringan diamati
di sekitar tempat sambungan. Daun berkembang dari
seluruh daerah nodal dari sambungan atas. Tidak ada
penolakan sambungan yang diamati antara tanaman
sambungan, dan karenanya, 100% penyambungan
berhasil. Hal ini disebabkan aktivitas meristematik di
tempat penyambungan yang sangat penting dalam
penyatuan batang atas dengan batang bawah.
 Sebanyak 15 tanaman sambungandiperoleh dari lima
tunas yang diduga bertransformasi. Tanaman yang
disambung disemprot dengan 2 g l-1 PPT dan diamati
untuk mendapatkan resistensi yang signifikan terhadap
PPT, sedangkan tanaman kontrol dengan batang atas
WT mengalami gejala nekrotik terhadap penyemprotan
PPT. Integrasi transgen dan ekspresi pada tanaman
sambungan selanjutnya dilihat dengan analisis GUS
histokimia, PCR, dan Southern hybirdization.

28. Batang atas yang
diduga
bertransformasi
disambung pada
tanaman WT
Munculnya daun
dari daerah nodus
dari tanaman
sambungan
setelah 3 hari
Tanaman
sambungan umur 2
minggu

29.  Untuk mengkonfirmasi integrasi gen bar dalam uji positif gus dalam
tanaman transformasi J. curcas, PCR dan Southern blot hybridization
dilakukan dengan menggunakan genomik DNA yang diisolasi dari uji
sambungan yang positif gus dan tanaman J. curcas WT. Dalam PCR, adanya
fragmen yang diamplikasi dari 462 bp pada sampel genom DNA dari uji
tanaman sambungan yang positif gus dan plasmid pGA 492.
 Untuk mengkonfirmasi integrasi gen bar dan jumlah salinan dalam tanaman
transformasi J. curcas, Southern blot hybridization dilakukan pada genom
DNA yang diisolasi dari PCR tanaman sambungan J. curcas dan J. curcas
WT. Karena daerah T-DNA dari plasmid pGA 492 hanya memiliki satu situs
SacI diatas dari gen bar, kita menyingkat genomik DNA dengan SacI dan
hibridisasi dengan produk PCR yang diamplifikasi dari gen bar. Setiap
fragmen hibridisasi dihasilkan berada dibawah tempat restriksi SacI dalam
genom tanaman dan selanjutnya berhubungan dengan jumlah urutan gen bar.
DNA dari tanaman sambungan WT konttrol negatif tidak menunjukkan
hibridisasi, sedangkan plasmid pGA 492 menghasilkan sinyal hibridisasi.
Tanaman yang sambung memunculkan empat salinan integrasi gen bar, dan
pola hibridisasi yang non-identik karena peristiwa transformasi yang
berbeda.

30.  Lima tanaman sambungan yang
bertransformasi yang dipilih secara acak dan
tanaman pendonor bagian atas sambungan
yang dihasilkan jelas dan bisa meproduksi
fragmen yang diamplifikasi ketika disaring
dengan menggunakan sepuluh primer RAPD.
Kemiripan genetik juga ditemukan 100%
antara tanaman sambungan dan tanaman
pendonor bagian atas. Penanda RAPD berhasil
digunakan untuk mempelajari kemurnian
genetik tanaman J. curcas secara
mikropropagasi.

31.  Penelitian ini jelas menunjukkan bahwa ketika daerah
apikal ditusuk dan mengalami vakum infiltrasi dengan A.
tumefaciens EHA 105 pada 250 mmHg selama 3 menit,
mengakibatkan efisiensi transformasi tertinggi 62,66%.
Tanaman transformasi diperbanyak menggunakan
sambungan, yang lebih mudah daripada di perbanyakan
tanaman transformasi berbasis in vitro. Analisis
kemurnian genetik sambungan tanaman transformasi J.
curcas menggunakan penanda RAPD mengungkapkan
tidak ada variasi genetik. Protokol yang dikembangkan
dapat digunakan untuk mengembangkan tanaman
transformasi J. curcas dengan sifat yang diinginkan
dalam waktu yang relatif singkat.