Pelatihan pcr 1 eijkman

2,827 views

Published on

Published in: Education, Technology

Pelatihan pcr 1 eijkman

  1. 1. PERIODE 31 OKTOBER s/d 12 NOVEMBER 2011 OLEH KURNIA FITRI JAMIL
  2. 2. ISOLASI DNA• Tujuan : Melakukan Isolasi DNA• Alat dan Bahan :  Tabung Eppendorf (1,5 ml)  Sampel (Whatman Paper Blood)  Saponin 0,5 % + 1 x PBS  Sentrifus  Chelex – 100 20 %  dd H2O
  3. 3. ISOLASI DNA (lanjutan)• Cara Kerja :1. Siapkan tabung Eppendorf ukuran 1,5 ml dan raknya.2. Masukkan sampel (Whatman paper blood)3. Tambahkan Saponin 0,5 % + 1 X PBS 1 ml (1000µl)Kemudian di inkubasi 4 jam atau 24 jam (overnight)
  4. 4. ISOLASI DNA (lanjutan)• Setelah inkubasi  Sentrifus 10 menit (12.000 rpm)  Ambil presipitat secara hati-hati  Tambahkan 1ml=1000µl  di ulang sentrifus (5 menit) 12.000 rpm  Ambil presipitat tambahkan 100µl ddH2O + 50µl 20 % Chelex-100  Boiling 10 menit (Vertex tiap 5 menit)  Sentrifus (12.000 rpm)  Ambil supernatan (mengandung DNA)  Kemudian simpan pada suhu 4ºC atau - 20ºC  Dilanjutkan ke PCR
  5. 5. KEGIATAN ISOLASI DNA Memotong Whatman Paper Blood (P falciparum) dimasukkan ke tabung Eppendorf
  6. 6. ISOLASI DNA (lanjutan)LEMARI INKUBASI - 20ºC SAPONIN 0,5% 1XPBSMASUKKAN SAPONIN 0,5% 1XPBS KE SAMPEL MELAKUKAN VORTEX
  7. 7. ISOLASI DNA (lanjutan)BOILING (MEREBUS) CENTRIFUSHASIL ISOLASI DNA START ALAT PCR
  8. 8. PCR (Polymerase Chain Reaction)• Tujuan : Untuk mengamplifikasi DNA• Alat & Bahan :  Tabung Eppendorf 0,2 ml = 200 µl  Larutan TAE  Rak tabung, Pipet  MgCl2  Alat PCR  dNTP  Alat Elektroforesis + Agarosse 2 %  Primer (Forward  Timbangan Agarrosse dan Reverse)  Alat Pemanas (Microwave) sesuai dengan  Sarung Tangan ( anti panas) tujuan (misal: genus  Ethidium Bromida atau spesies)  dd H2O  Tag-Polymerase  Buffer PCR (Kappa)  Sampel (Template)
  9. 9. PCR (lanjutan) Cara Kerja: 1. Siapkan Tabung Eppendorf 200 µl (Biasanya total volume PCR = 25 µl) 2. Masukkan 18 µl ddH2O 3. Masukkan 2,5 µl (10x buffer PCR) 4. Masukkan MgCl2 0,5 µl 5. Primer (forward) 0,25 µl 6. Primer (reverse) 0,25 µl 7. Masukkan Tag-Polymerase (Kappa) 0,2 µl 8. Template (sampel ) 2,5 µl
  10. 10. PCR (lanjutan)• Siapkan Alat PCR Pra – PCR r – PLU (± 2 jam 5 menit) 94ºC 55ºC 72ºC 5 menit 30 detik 2 menit PCR – Running 94ºC 55ºC 72ºC 30 detik 30 detik 1 menit 30 detikSelama PCR berlangsung peneliti menyiapkan alatElektroforesis
  11. 11. KEGIATAN PCRFORMULASI BAHAN UNTUK PCR SAMPEL UNTUK PCRATUR WAKTU DAN SUHU ALAT PCR ALAT PCR
  12. 12. ELEKTROFORESIS• Alat & Bahan:  Siapkan Alat cetakan Agarosse 2 %  Timbang Agarosse 2 % sebanyak 1 gram  Masukkan ke dalam tabung Erlenmeyer  Siapkan gelas ukur dan ukur cairan TAE 50 ml  Campurkan TAE ke Agarosse 2 %  Tutup tabung Erlenmeyer dengan plastik dan dilubangi kecil-kecil (pori-pori)  Panaskan (dengan Microwave 1 menit)  Tambahkan E-Bromida 5 µgr/ml (= 5 µl)  Homogenkan, kemudian di panaskan kembali (Microwave) 10 detik  Tuangkan Agarosse 2 % ke wadah cetakan yang telah disiapkan, tunggu mengeras (± 30 menit)
  13. 13. KEGIATAN ELEKTROFORESISALAT CETAKAN ALAT TIMBANGANAGAROSSE 2% AGAROSSE 2% MELAKUKAN ELEKTROFORESIS WELLING
  14. 14. ELEKTROFORESIS (lanjutan) Ambil sampel DNA sebanyak 0,8 µl secara hati-hati dengan menggunakan pipet Tanamkan sampel DNA tersebut kedalam sumur (well) chamber elektroforesis dan Markernya (diujung) Setelah selesai welling, tutup Alat Elektroforesis Sambungkan dengan Arus Listrik (± 80 Volt) selama 1 jam Angkat Agarosse dari Alat Elektroforesis Visualisasikan hasil tersebut dengan sinar Ultraviolet (UV) Lihat hasil PCR (Pita DNA)/band pada layar monitor dan di print hasilnya Contoh : (Gambar terlampir)
  15. 15. KEGIATAN VISUALISASI PCRHASIL ELEKTROFORESIS VISUALISASI SINAR UVGBR MONITOR PITA DNA PRINT GBR PITA DNA
  16. 16. HASIL PCR
  17. 17. SEKUENSING• Tujuan : Untuk mengetahui urutan basa, sehingga dapat mengetahui ada mutasi & konfirmasi hasil amplifikasi yang telah di kerjakan (PCR)• Tahap Sekuensing : 1. Produk PCR 2. Purifikasi 3. Cycle Sequensing 4. Presipitasi
  18. 18. PURIFIKASI Siapkan Tube mini Columns Campurkan sampel DNA dengan Mem – BS (perbandingan 1 : 1) (misal: sampel DNA = 20 µl MBS = 20 µl) Inkubasi 1 menit Sentrifus selama 1 menit (12.000 rpm)
  19. 19. PURIFIKASI Setelah sentrifus, endapan di luar membran tabung dibuang + 700 µl Membran Wash Solution (MWS) dan sentrifus 12.000 rpm (1 menit) Buang sisa zat diluar tabung columns, kmd tambahkan 500 µl MWS, centrifus 12.000 rpm (1 menit) Zat sisa diluar membran tabung columns dibuang Ambil supernatan (tanpa MWS) disentrifus lagi 12.000 rpm (1 menit) Supernatan diambil  masukkan ke tabung Eppendorf ukuran 1,5 µl Tambahkan 30 µl Nuclease free water (NFW) Tambahkan 20 µl Nuclease free water (NFW) (Total 50 µl Nuclease free water (NFW))Fungsi NFW untuk meloloskan DNA dari membran tabung column ketabung Eppendorf
  20. 20. PURIFIKASI (lanjutan)• Inkubasi selama 2 menit• Sentrifus lagi 12.000 rpm (1 menit)• Selesai tahap purifikasi• Endapan di tabung columns dibuang• 50 µl cairan di tabung Eppendorf diambil (DNA)• Selanjutnya ke tahap Cycle Sequencing(Tetapi harus diukur dulu kadar konsentrasidan kemurnian dari sampel DNA tersebut)
  21. 21. PURIFIKASI (lanjutan) Mengukur kadar konsenterasi dan kemurnian dengan alat Nandrops. Tera dulu dengan 1 µl ddH2Omisalnya : Sampel A (DNA) 50 µl1 µl sampel hasil konsentrasi = 24,2 ng/µlDNA(artinya: dalam 1 µl sampel mengandungkonsentrasi = 24,2 ng/µlDNA, 50 µl X 24,2ng/µl = 1200 ng/ µlDNA)Sampel A – 260 = 0,782 A – 280 = 0,418
  22. 22. PURIFIKASI (lanjutan) Kemurnian 260/280 = 1,87 Panjang gelombang 260 Panjang gelombang 280 DNA dinyatakan murni bila = 1,8 – 2
  23. 23. DNA Purifikasi “ PROMEGA” New tube (mini column) PCR Product : memb.Bind.Solution (1:1) Incubate 1’ at room temperature (25oC) 12.000 rpm 1’ Discard the solution (put mini column back) Add 700 µl membrane wash solution 12.000 rpm 1’
  24. 24. DNA Purifikasi “ PROMEGA”(lanjutan) Discard supernatant Add 500 µl membrane wash solution 12.000 rpm 1’ Discard supernatant, 12.000 rpm 1’ Transfer 1,5 µl tube 30 nuclease free water So nuclease free water Incubate 2’ , 12.000 rpm: 1’
  25. 25. TAHAP CYCLE SEQUENCING Tabung sampel DNA ukuran 0,5 µl (dilabel) Formulasinya : 1. Sampel sesuai perhitungan 2. ddH2O sesuai perhitungan 3. Primer 4 piccomol (biasa 1 µl) 4. Bigdye (biasa 6 µl)Biasanya : total volume = 15 µlKemudian ke tahap PCR untuk Cycle Sequencing
  26. 26. TAHAP CYCLE SEQUENCING(lanjutan) Setting Alat PCR (Cycle Sequencing) Pre – PCR Cycle Sequencing 96ºC 96ºC 50ºC 60ºC 4ºC 3 menit 10 detik 5 detik 4 menit ~ 1 X Cycle 25 X CycleKet :Suhu 96ºC : DenaturasiSuhu 50ºC : Anealing (penempelan primer)Suhu 60ºC : Elongation (perpanjangan urutan basa)Selanjutnya ketahap presipitasi 
  27. 27. “Precipitation Method” Sample Spindown & move 1,5 µl tube (wrap in alufo) Add 1,5 µl of 125 mm EDTA Add 1,5 µl of 3 m Sodium Acetate Add 37,5 µl of 100 % ETOH (mix by invert 4x) Incubate in room temperature ± 15’Spin in refrigerator centrifuge (4 oC : 12.000 rpm; 20’)
  28. 28. Precipitation Method (lanjutan) Aspirate solution Add 250 µl of 70 % ETOH Spin in refrigerator centrifuge (4 oC : 12.000 rpm; 20’) Aspirate solution Dry it using speed vac ± 15’ Cover the tube with alufo Store at 4 oC
  29. 29. KEGIATAN SEQUENCING PROSES SAMPLING SAMPEL UTK SEKUENSINGALAT DAN BAHAN SEKUENSING ALAT NANODROP
  30. 30. HASIL SEQUENCINGKONFIRMASI KE GEN BANK NCBIDICOCOKKAN APAKAH BENAR YG DIBACASESUAI GEN YG DIPERIKSAURUTAN WARNA:T : MERAHC: BIRUG: HITAMA: HIJAUTINGGI RENDAHNYA GELOMBANG TGTKONSENTRASI SAAT TERBACA OLEH ALATSEKUENSING.

×