Dokumen tersebut membahas tentang teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk memeriksa molekuler lalat, kutu, pinjal dan nyamuk. PCR adalah teknik perbanyakan potongan DNA secara in vitro dengan menggunakan primer dan siklus pemanasan dan pendinginan untuk memisahkan dan memperbanyak DNA target. Hasil PCR kemudian dianalisis lebih lanjut dengan elektroforesis dan sekuensing untuk menentukan urutan basa nitrogen DNA.

1. “PEMERIKSAAN
MOLEKULER LALAT, KUTU,
PINJAL DAN NYAMUK”

2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi)
potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik
yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida.
Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah
yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang
urutannya komplemen dengan DNA templatenya.
POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR)
2

3. PCR MEMERLUKAN SIKLUS BERULANG
3
Tahap pertama adalah proses denaturasi DNA target sehingga DNA yang
berutas ganda akan terpisah menjadi DNA berutas tunggal. Proses ini
dilakukan dengan cara memanaskan sampel DNA pada temperatur 90oC -
95oC selama 1 - 2 menit.
Tahap kedua adalah proses perlekatan (annealing). Pada tahap ini primer
akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA target pada daerah yang
komplementer dengan sekuens primer. Primer dapat melekat pada sekuens
komplementernya dengan cara menurunkan temperatur antara 40 - 60oC.
Tahap ketiga adalah tahap pemanjangan atau extension. Tahap ini
dilakukan dengan cara menaikkan temperatur antara 70 - 75oC. Lamanya
reaksi bergantung pada DNA polimerase yang digunakan dan panjangnya
fragmen DNA yang akan diamplifikasi
Elektroforesis

5. 5

6. 6

8. 8

9. 9

10. 10
Sekuensing merupakan tahap akhir dalam menentukan
urutan nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan
PCR. Sekuensing dilakukan dengan metode Sanger
menggunakan Automatic DNA Sequencer yang berdasarkan
pada metode dye terminator labelling.

11. SEKUENSING DNA
11
1. Fragmen DNA dengan panjang sekitar 800 – 1000 pasang basa didenaturasi,
dicampur dengan primer, DNA polimerasi, 4 macam dNTPs
(deoxyribonucleotide) yaitu deoxyadenosine triphosphate (dATP),
deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP) dan
deoxycytidine triphosphate (dCTP) dan 4 macam ddNTPs
(dideoxyribonucleotide). ddNTPs (dideoxyribonucleotide) yang digunakan dalam
metode Sanger tersebut telah dilabeli dengan fluorescent. Perbedaan antara
dNTPs (deoxyribonucleotide) dan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) terletak
gugus kimia yang menempel pada ujung 3’. dNTPs (deoxyribonucleotide)
mempunyai gugus –OH pada ujung 3’ sedangkan ddNTPs
(dideoxyribonucleotide) tidak mempunyai gugus –OH pada ujung 3’.

12. SEKUENSING DNA
12
2. Jika primer mereplikasi DNA dengan menambahkan dNTPs
(deoxyribonucleotide) maka proses replikasi DNA tersebut akan terus berjalan
karena gugus –OH pada ujung tiga bisa ditempeli oleh dNTPs atau ddNTPs.
Namun jika primer mereplikasi DNA dengan menambahkan ddNTPs
(dideoxyribonucleotide) proses replikasi DNA tersebut akan terhenti karena
ddNTPs (dideoxyribonucleotide) tidak dapat ditempeli dNTPs atau ddNTPs baru
pada ujung 3’ nya (ujung 3’ tidak mempunyai gugus -OH).

13. SEKUENSING DNA
13
3. Dengan adanya dNTPs (deoxyribonucleotide) dan ddNTPs
(dideoxyribonucleotide) maka dalam campuran tersebut akan terbentuk
fragmen- fragmen DNA hasil replikasi dengan ukuran yang berbeda-beda
sebanyak jumlah basa nitrogen dari template DNA yang digunakan. Campuran
tersebut kemudian dilewatkan pada suatu pipa kapiler yang dapat memisahkan
fragmen –fragmen DNA dalam larutan berdasarkan beratnya (panjang
fragmen). Fragmen – fragmen DNA yang telah terpisah-pisah tersebut
kemudian dideteksi secara berurutan mengunakan fluorescence detector
sehingga dihasilkan urutan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) yang menempel
pada tiap-tiap ujung fragmen. Urutan ddNTPs (dideoxyribonucleotide) tersebut
merupakan urutan basa komplementer dari DNA template.

14. 14

15. 15

16. 16

17. DIVERSITAS GENETIK ANOPHELES BALABACENSIS, BAISAS DI BERBAGAI
DAERAH INDONESIABERDASARKAN SEKUEN GEN ITS 2DNARIBOSOM
WIDIARTI,TRIWIBOWOAMBARGARJITO,UMIWIDYASTUTI
17
Berdasarkan hubungan kekerabatan An. leucosphyrus group, An.
balabacensis dari Berjoko, Kabupaten Nunukan menunjukkan
kecenderungan terpisah cukup jauh dibandingkan dengan An.
Balabacensis kompleks lainnya yang berasal dari Jawa Tengah dan
Lombok, NTB

18. SAMPELDARI BERBAGAI LOKASI PENELITIAN DIPERIKSAKERAGAMAN
GENETIKNYA. EKSTRAKSI DNADILAKUKAN SECARAINDIVIDUAL.
18

19. 19

20. 20

21. 21
Sekuensing fragmen gen produk PCR

22. 22
Pohon
Filogenetik

23. 23

24. 24
Methods
Louse sampling
Louse sampling was performed over a period
ranging from June 2017 to August 2018 in
two regions of France: Marseille and Bobigny.
In Bobigny, a town located close to Paris, lice
were collected from patients attending the
Avicenne Hospital. In total, 63 pubic lice, 24
head lice, and 54 body lice were collected
from six patients (Table 1). In Marseille, lice
were collected from homeless people at one
shelter in May 2017. In total, 9 head lice and
53 body lice were collected from four
individuals. All the sampled individuals were
thoroughly examined for the presence of the
all three types of lice. All visible lice were
carefully removed using forceps. All collected
lice were preserved in 70% alcohol and then
transported to our IHU-Méd
DNA extraction
Prior to DNA isolation and in order to
eliminate exter- nal contaminants, each
louse was washed in iterranée Infection
laboratory in Marseille (France).10%
sodium hypochlorite for 10 min, 70%
ethanol for 5 min, and finally rinsed three
times with distilled water and dried on
sterile filter paper. Genomic DNA was
extracted using the DNA extraction kit,
QIAamp Tissue Kit (Qiagen,
Courtaboeuf, France) with the EZ1
apparatus accord- ing to the
manufacturer’s instructions and stored at
4 °C until use in PCR amplifications.
Molecular detection of the presence of
pathogen DNA Screening of pathogen
DNA by real-time quantitative PCR
(qPCR)
Each DNA sample was tested for the
presence of Bar- tonella spp., Borrelia spp.,
Anaplasma spp., Rickettsia spp.,
Acinetobacter spp., R. prowazekii, Y. pestis, B.
quin- tana and C. burnetii, using previously
reported specific primers and probes
(Additional file 1: Table S1). qPCRs were
performed using a CFX96 Real-Time system
(Bio- Rad Laboratories, Foster City, CA,
USA) with Roche LightCycler 480 Probes
Master Mix PCR kit (Roche Applied
Science, Mannheim, Germany) in
accordance with the manufacturer’s
instructions. Negative (PCR mix and sterile
water) and positive controls (including DNA
of each target bacterium) were included for
each qPCR run.

25. 25
Conventional PCR and sequencing
All samples that tested positive using Acinetobacter genus-specific
primers were subjected to standard PCR targeting a portion of the
RNA polymerase β subunit (rpoB) gene (zone1), using the primers and
all conditions previously described (Additional file 1: Table S1). PCR
amplification was performed in a Peltier PTC- 200 model thermal
cycler (MJ Research Inc., Watertown, MA, USA) and the AmpliTaq
Gold 360 PCR Master Mix kit (Life Technologies, Villebon sur Yvette,
France) in accordance with the manufacturer’s instructions. Suc-
cessful amplification was confirmed via gel electropho- resis and PCR
products were sequenced using a Big Dye Terminator kit and an ABI
PRISM 3130 Genetic Analyser (Applied BioSystems, Courtabeauf,
France) according to the manufacturer’s protocol.

26. 26

27. 27

28. 28

29. 29

30. 30

31. 31

32. 32

33. 33

34. 34

35. 35

36. 36

37. THANK
YOU
Esandhi Resnhaleksmana
resnha@gmail.com
087839861002
Dosen D3 TLM Mataram