Prosedur isolasi plasmid bakteri dengan kit ekstraksi plasmid membahas proses isolasi plasmid dari bakteri menggunakan metode mini-prep yang meliputi pertumbuhan bakteri, lisis sel, pemurnian DNA plasmid, dan analisis menggunakan elektroforesis. Kit ekstraksi plasmid komersial mempermudah proses isolasi plasmid.

1. PROSEDUR ISOLASI PLASMID BAKTERI
DENGAN KIT EKSTRAKSI PLASMID
Plasmid secara alami dapat ditemukan hampir di semua spesies bakteri. Plasmid merupakan
molekul DNA kecil, sirkuler, untai ganda yang dapat dibedakan dari DNA kromosom sel.
Plasmid bereplikasi secara independen dari DNA genom dan diwariskan secara stabil pada
generasi berikutnya. Plasmid umumnya hanya mencakup sebagian kecil dari genom bakteri
dan memiliki panjang bervariasi dari beberapa kilobase hingga ratusan kilobase. Terdapat
kemungkinan banyak salinan plasmid dengan berat molekul (BM) rendah, sedangkan sedikit
salinan plasmid dengan BM lebih lebih besar seringkali dijumpai. Plasmid berperan sangat
penting Kingdom Prokariotik karena memberikan keuntungan genetik, misalnya resistensi
antibiotik. Plasmid merupakan vektor kunci untuk transfer gen horizontal pada bakteri
melalui konjugasi.
Dalam isolasi plasmid, sel bakteri umumnya ditumbuhkan hingga fase logaritmik akhir atau
fase stasioner awal. Proses awal yaitu penggunaan lisozim untuk mendegradasi dinding sel.
Seperti DNA kromosom, plasmid juga dalam bentuk sirkuler tertutup secara kovalen
(supercoiled). Setelah lisis alkalin lembut dilakukan, plasmid dapat ditemukan pada sel dapat
dibedakan lebih mudah. Sebab DNA merupakan molekul yang sangat sensitif terhadap
tekanan mekanis, semua prosedur pencampuran selama dan setelah lisis sel harus dilakukan
dengan hati-hati. Pada saat ini, semua makromolekul intraseluler perlu dihilangkan untuk
memurnikan DNA plasmid. DNA sirkuler yang telah didenaturasi dapat ditambahkan ke
natrium asetat untuk renaturasi, sementara DNA kromosom tetap terdenaturasi sebagai
ssDNA. Molekul ssDNA dan makromolekul lain yang tidak dibutuhkan perlu diendapkan
untuk memisahkan kontaminan dari DNA plasmid. Metode ekstraksi fenol-kloroform
merupakan metode yang sering digunakan dalam isolasi yang dilanjutkan dengan
pengendapan DNA dengan etanol dan perlakuan RNase. Analisis DNA plasmid dilakukan
dengan elektroforesis horizontal pada suhu 4 °C pada voltase rendah. Metode mini-prep ini
umumnya menghasilkan antara 5 dan 10 μg DNA plasmid yang relatif murni yang cukup
untuk beberapa aplikasi, seperti karakterisasi strain, transkripsi atau translasi in vitro, dan
digesti restriksi. Aplikasi selanjutnya yang sering dilakukan, seperti ligasi, transformasi,
sekuensing, peningkatan skala dan purifikasi lanjut mungkin dapat diperlukan yang akan
menghasilkan konsentrasi DNA plasmid lebih tinggi.
1. PERALATAN
Incubator shaker, refrigerated microcentrifuge, water bath, heating block, kulkas, freezer,
deep freezer, mikropipet, pipet tip, tabung 13-mL sterile polypropylene snap-cap, tabung
1.5-mL microcentrifuge, dan tusuk gigi.

2. 2. BAHAN
LB broth, antibiotik (ampisilin, tetrasiklin), sukrosa, Triton X-100, EDTA, Tris base, lisozim,
natrium asetat (NaOAc), NaOH, isopropanol, dan DNase-free RNase.
3. LARUTAN DAN BUFFER
STET Buffer
Components Final Concentration Stock Amount
Sucrose 8% 8 g
Triton X-100 0.5% 20% 2.5 mL
EDTA 50 mM 500 mM 10 mL
Tris–HCl, pH 8.0 500 mM 1 M 1 mL
Tambahkan aquabidest hingga 100 mL.
Lisozim (10 mg/mL)
Larutkan 10 mg lisozim dalam 1 ml 10 mM Tris.Cl (pH 8,0)
TE
Component Final concentration Stock Amount
Tris–HCl, pH 8.0 10 mM 1 M 1 m
EDTA 0.1 mM 500 mM 20 mL
Tambahkan aquabidest hingga 100 mL.
4. PREPARASI
Transformasikan DH5α dengan DNA plasmid yang diinginkan, baik plasmid terpurifikasi
atau reaksi ligasi untuk diskrining untuk keberadaan insert, dan letakkan bakteri pada pelat
selektif yang sesuai. Pilih koloni individu dari galur Escherichia coli yang telah transformasi
dan inokulasikan pada 3 mL kaldu LB yang disuplementasi dengan 25 mg/ml ampisilin atau
antibiotik lain yang sesuai di dalam tabung snap-cap polipropilen 13 mL. Tumbuhkan kultur
bakteri dalam satu malam (18-20 jam) pada suhu 37°C dalam shaker untuk pertumbuhan
yang seragam hingga kepadatan sekitar A650=1,2.
5. PANEN BAKTERI
Sel bakteri dikumpulkan dengan sentrifugasi:
1) Pindahkan 1,5 ml biakan bakteri ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 mL dan
simpan sisa biakan dalam lemari es (4°C).

3. 2) Sentrifugasi pelet bakteri pada 8000 rpm selama 5 menit dan pisahkan media.
3) Biarkan pelet bakteri dipaparkan dengan udara untuk mengering.
6. LISIS SEL DAN ISOLASI DNA PLASMID
Sel bakteri dipanaskan dengan air secara singkat pada 100 °C dengan adanya agen yang
melemahkan dinding sel dan membantu mencegah degradasi DNA oleh nuklease. DNA
genomik yang terdenaturasi sebagian dan protein yang terdenaturasi dibuat menjadi pelet
dengan sentrifugasi. Plasmid diperoleh kembali dengan pengendapan isopropanol dan RNase
mendegradasi RNA menjadi komponen yang lebih kecil. Berikut prosedur tersebut:
1) Suspensi kembali pelet bakteri dalam 0,35 mL Buffer STET.
2) Tambahkan 25 mL lisozim baru (10 mg/mL) dan campur dengan mengocok perlahan
selama 3 detik.
3) Tempatkan tabung dalam water bath mendidih (100 °C) selama 40 detik.
4) Sentrifugasi langsung pada 14.000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang (atau
sebagai alternatif pada 4 °C). Keluarkan pelet dari tabung menggunakan tusuk gigi.
5) Tambahkan 40 mL natrium asetat 3 M, pH 5,2, dan 420 mL isopropanol dan campur
dengan vortex secara singkat.
6) Tempatkan sampel dalam freezer 80 °C selama 30 menit.
7) Sentrifugasi sampel pada 14.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Buang
supernatan dan keringkan pelet dengan udara bebas.
8) Suspensikan kembali pelet dalam 50 mL TE yang mengandung DNase-free RNase
(50 mg/mL) dan inkubasi sampel selama 10 menit pada suhu 37 °C.
9) DNA plasmid sudah siap digunakan dalam aplikasi selanjutnya, misalnya, digesti
enzim restriksi atau PCR dan elektroforesis gel agarosa. Simpan DNA plasmid
miniprep pada 20 °C.
PERINGATAN
Isopropanol sangat mudah terbakar. Bahan kimia ini harus dijauhkan dari panas dan api.
Keracunan dapat terjadi akibat inhalasi, konsumsi, atau penyerapan kulit serta dapat
bertindak sebagai iritasi. Penggunaan bahan kimia diharapkan di area yang berventilasi dan
kenakan pelindung mata, wajah, tangan, dan tubuh saat handling isopropanol.
TIP
Keringkan pelet dengan udara terbuka dibandingkan menggunakan vacuum untuk
menghindari pengeringan berlebihan yang menyebabkan DNA sulit larut.
Perlakuan DNase-free RNase yang digunakan untuk menghilangkan RNA kemungkinan
dapat menutupi fragmen DNA kecil dalam gel agarosa.
Suspensikan kembali pelet dalam TE untuk penyimpanan jangka panjang atau dalam
Tris-HCl, pH 8,5 untuk menghindari inhibisi EDTA pada reaksi-reaksi selanjutnya.

4. KIT ISOLASI/EKSTRAKSI PLASMID KOMERSIAL
Semakin maju perkembangan teknologi, para peneliti berusaha untuk menemukan dan
menciptakan metode yang lebih mudah untuk melakukan penelitian plasmid. Dengan bantuan
industri bioteknologi komersialisasi, berbagai metode telah dirancang secara instan dengan
penggunaan kit ekstraksi plasmid komersial. Salah satu manufacture untuk kit ekstraksi
plasmid dan berbagai kit untuk analisis genetik lainnya, yaitu MAGEN (Angen Biotech Co.,
Ltd, Guangzhou, CH). Berikut daftar kit miniprep ekstraksi plasmid yang ditawarkan:
Tabel 1. HighPure Plasmid DNA Extraction dari MAGEN
Name of Product No. Catalogue
HiPure Plasmid Micro Kit (1~5mL) P1001
HiPure Plasmid Micro Kit C (1~5mL) P1001C
HiPure Plasmid Mini Kit (5~15mL) P1002
HiPure Plasmid Midi Kit (15~50mL) P1003
HiPure Plasmid Maxi Kit (50~200mL) P1004
HiPure Plasmid 96 Kit (1~1.5mL) P1005
HiPure Fast Plasmid 96 Kit (1~1.5mL) P1006
Tabel 2. Big Plasmid and Lambda DNA Extraction dari MAGEN
Name of Product No. Catalogue
HiPure BAC DNA Mini Kit (1~15ml) P1151
HiPure BAC DNA Maxi Kit (200~500ml) P1152
REFERENSI:
1. Lefkothea-Vasiliki Andreou. 2013. Isolation of Plasmid DNA from Bacteria. Methods
in Enzymology, 529:135-42. [link]
2. Aidan Casey, Olivia McAuliffe. 2021. Extraction and Analysis of Plasmid DNA from
Listeria monocytogenes. Methods in Molecular Biology, 2220:157-163. [link]
3. George Lezin, Yasuhiro Kosaka, H. Joseph Yost, Michael R. Kuehn, and Luca
Brunelli. 2011. One-Step Miniprep for the Isolation of Plasmid DNA and Lambda
Phage Particles, PLoS One. 6(8): e23457. [link]

5. ARTIKEL TERKAIT:
1. PCR Kit IVD untuk deteksi SARS-CoV-2 [link]
2. Wabah Monkeypox Non-Endemik Terbaru di Era Pasca Pandemi Covid-19: Definisi,
Diagnosis dan Manajemen [link]
3. Real Time PCR, Level Baru Amplifikasi DNA [link]
4. Eliminasi Endotoksin dalam Proses Ekstraksi Plasmid [link]
PT. INDOGEN INTERTAMA
Jl. Raya Cilangkap No. 111 RT 004/001
Cilangkap Cipayung Jakarta Timur 13870
Telp/Fax : 021-84310148
Mobile : +6281387927402
Email : marketing.indogen@gmail.com
Website : www.indogen.id