1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28667
(51) A61K 39/10 (2006.01)
G01N 33/531 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1189.1
(22) 11.09.2013
(45) 15.07.2014, бюл. №7
(72) Кошеметов Жумагали Каукарбаевич;
Богданова Марина Ивановна; Матвеева Валентина
Михайловна; Строчков Виталий Михайлович;
Сансызбай Абылай Рысбайулы; Сандыбаев Нурлан
Тамамбаевич
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Научно-
исследовательский институт проблем
биологической безопасности" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Andrea Fakete, J.A. Bantle, Shirley M. Halling,
M.R. Sanborn. Preliminary development of a diagnostic
test for Brucella using polymerase chain reaction //
Journal of Applied Microbiology. MAR 2008. 69: 216-
227
(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ
МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ
РЕАКЦИИ (ПЦР)
(57) Изобретение относится к микробиологии и
молекулярной диагностике, и может быть
использовано в лабораторной диагностике
бруцеллезной инфекции.
Предлагаемый способ диагностики
предусматривает выделение ДНК Brucella, синтез
праймеров и постановку ПЦР с использованием
синтезированных специфических праймеров,
проведение электрофореза в агарозном геле и анализ
полученных электрофореграмм.
Способ позволяет обнаруживать ДНК Brucella с
довольно высокой степенью точности в короткие
сроки, что позволяет диагностировать данную
инфекцию за 3 часа, без предварительного
накопления тестируемого материала и может быть
использован для экспресс-идентификации.
(19)KZ(13)A4(11)28667

2. 28667
2
Изобретение относится к микробиологии и
молекулярной диагностике, и может быть
использовано в лабораторной диагностике
бруцеллезной инфекции.
Способ предусматривает проведение
полимеразной цепной реакции с праймерами к гену
BCSP31 рода Brucella, анализ реакционной смеси с
помощью электрофореза в агарозном геле и
выявление ДНК штаммов Brucella по результатам
анализа. Способ позволяет осуществлять экспресс-
идентификацию Brucella. Изобретение может быть
использовано для обнаружения Brucella,
основанного на детекции генетического материала
возбудителя и предназначено для массовых
анализов.
Бруцеллез до настоящего времени является
одним из наиболее распространенных зоонозных
инфекционных заболеваний, особенно в регионах с
интенсивно развитым животноводством. Успех
борьбы с бруцеллезом зависит от скорости
выявления всех инфицированных животных.
При диагностике бруцеллеза в ветеринарной
практике используют такие методы, как
бактериологический, серологический, реже
аллергический. Однако ни один из них
самостоятельно при однократном исследовании не
позволяет выявлять всех больных (Триленко П.А.,
1976; Сочнев В.В., 1984; Косилов И.А. и др., 1999;
Corbel M.J, 1997; Григорьева Г.И. и др., 1998;
Ощепков В.Г. и др, 2004).
Эффективность бактериологического метода
зависит от качества питательных сред,
концентрации возбудителя в исследуемом
материале, степени загрязненности последнего
посторонней микрофлорой и времени, прошедшего
с момента заражения животного. Срок
бактериологического исследования составляет 15-30
дней, а при постановке биологической пробы он
увеличивается вдвое (Журнакова М. А., 1959;
Штритер В. А. и др, 1937).
Диагностическая ценность серологических
методов снижается из-за перекрестных реакций
между Brucella abortus и Yersinia enterocolitica,
серовариант 0:9, Pasteurella, Vibrio и другими
бактериями. Положительные результаты отмечают
при серологическом исследовании здоровых
животных, вакцинированных против бруцеллеза
(Myers D.M., Varela-Diaz V.M.,1980; Желудков MM.,
1982; Гайдар Б., Желудков М.М., Чернышева М.И.,
1994; Cerri D., Ebani V.V., Pedrini A. et al, 2000).
Дифференциальная диагностика бруцеллеза
возможна при исследовании сыворотки крови
животных в реакции иммунодиффузии в геле агара с
0-ПС антигеном ИЭВС и ДВ. Однако по
чувствительности этот метод уступает комплексу
классических серологических реакций (Антонов Б.
И. и др., 1994).
Уровень техники
Известны исследования по выявлению бруцелл
ПЦР (Ю. К. Кулаков, В.Н. Горелов, В.Л. Мотин и
др. Молекулярная генетика, микробиология,
вирусология. 7-8, 1992, с.23-27). Клетки бактерий В.
melitensis 565 дважды отмывали в
дистиллированной воде и кипятили 15 мин, затем
осаждали 5 мин при 14 тыс. об/мин. В реакции
амплификации использовали надосадочную
жидкость. Чувствительность метода составила 104
-
103
мкм/мл.
Описан метод диагностики бруцеллеза с
применением ПЦР, разработанный Andrea Fekete,
J.A. Bantle, Shirley M. Hailing, M.R. Sanborn
(Preliminary development of a diagnostic test for
Brucella using polymerase chain reaction// Journal of
Applied Microbiology. MAR 2008. 69:216-227).B
данной работе показано применение
диагностического теста для обнаружения бруцелл на
основе ПЦР. Были подобраны праймеры на
фрагмент 43 кДа гена внешнего белка мембраны, из
штамма Brucella abortus19. Пара праймеров BrFl и
BrR1 дает ПЦР-продукт размером 635 п.н.
Амплифицированная ДНК легко обнаруживается с
помощью электрофореза в агарозном геле.
Оптимальная специфическая амплификация
проведена при температуре отжига праймеров 60°С.
Фрагмент гена был амплифицирован в 25 различных
видах Brucella. Для проверки специфичности
реакции были протестированы пробы ДНК, которые
были выделены из 17 бактерий, взятых от крупного
рогатого скота, которые показали отрицательные
результаты. Чувствительность реакции определяли
при различных концентрациях геномной ДНК из
штамма Brucella 19. Предел обнаружения составил
0,1 мкг ДНК (менее 100 бруцелл в пробе).
Специфичность и чувствительность ПЦР в
сочетании с простотой и скоростью свидетельствует
о возможности применения этого метода для
рутинной диагностики бруцеллеза.
Известен способ лабораторной диагностики
бруцеллезной инфекции у людей (Патент Россия
№2001121392/14,опублик. 10.05.2003). Способ
обеспечивает повышение чувствительности и
достоверности лабораторной диагностики
бруцеллезной инфекции у людей с применением
селективного концентрирования проб на
магноиммуносорбентах, и последующим
генотестированием их методом ПЦР. Использование
в анализе бруцеллезных магноиммуносорбентов
приводит к увеличению специфичности и
чувствительности определения.
Признаками, отличающими предлагаемое
изобретение от перечисленных аналогов, являются
специфические компоненты реакции, методические
подходы и нуклеотидные последовательности
праймеров, приведенные в перечне
последовательностей.
Технической задачей изобретения является
создание способа экспресс-идентификации
возбудителя бруцеллеза на основе ПЦР. Способ
диагностики бруцеллеза высокочувствительный и
специфичный, позволяет точно и быстро (до 3
часов) выявлять ДНК бруцелл.
Предлагаемый способ диагностики
предусматривает выделение ДНК бруцелл, синтез
праймеров, постановку ПЦР, проведение
электрофореза в агарозном геле и анализ
полученных электрофореграмм.

3. 28667
3
Поставленная задача решается путем подбора
пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных
для рода Brucella. Для идентификации бруцеллеза
методом ПЦР в качестве мишени нами была
выбрана нуклеотидная последовательность гена
внешней мембраны бруцелл, кодирующего синтез
белка молекулярной массой 31 кДа. Сравнительный
анализ данного гена показал, что он имеет 100%
идентичность для разных видов рода Brucella.
Сущность изобретения заключается в том, что
разработан способ идентификации возбудителя
бруцеллеза с помощью ПЦР на участок гена BCSP31
внешней мембраны бруцелл. ДНК Brucella
выявляется, если после разделения части
реакционной смеси в агарозном геле, в
анализируемом образце выявляются фрагменты
ДНК размером 345 нуклеотидных пар для
праймеров, специфичных гену BCSP31 рода
Brucella.
Праймеры подбирали и анализировали с
использованием программы Primer-BLAST на сайте
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast.
Характеристики праймеров устанавливали с
использованием программы BLAST. Отсутствие
гомологии с ДНК других возбудителей являлось
основным критерием отбора олигонуклеотидов.
Подобранные пары праймеров для гена BCSP31
отличалась высокой генетической
консервативностью и присутствовали только у рода
Brucella и, в то же время, отсутствовали в ДНК
других возбудителей. Рассчитанные
олигонуклеотиды были синтезированы на
автоматическом синтезаторе Expedite 8909 (Applied
Biosystems (США)) по стандартной методике.
Синтез праймера проводили поэтапным
достраиванием нуклеотида, согласно его
нуклеотидной последовательности.
Предложенный способ включает в себя
одностадийную реакцию ПЦР с праймерами,
специфичными к участку гена BCSP31 внешней
мембраны бруцелл. Праймеры BrF1 (прямой):
TGCCTGCGCGAAGTGACGAT и BrRl (обратный):
AACCGCAAA-GCTCGCTCCCA, состоят из 20
нуклеотидов.
Реакционную смесь анализируют с помощью
электрофореза в 1% агарозном геле. Присутствие в
анализируемом образце фрагментов ДНК размером
345 нуклеотидных пар свидетельствует о наличии в
исходном материале ДНК Brucella.
Предложенный способ диагностики бруцеллеза
методом ПЦР является высокочувствительным и
специфичным и позволяет достоверно определять
наличие ДНК рода Brucella в биологических пробах
без предварительного накопления тестируемого
материала.
Техническим результатом изобретения является
повышение экономичности, сокращение времени
проведения диагностической идентификации рода
Brucella с помощью ПЦР. Изобретение может быть
использовано для обнаружения бруцелл,
основанного на детекции генетического материала
возбудителя и предназначено для массовых
анализов.
Способ выполняется следующим образом:
1. Выбор последовательности праймеров.
Данный этап работы представлял собой
аналитический процесс, который включал сбор
имеющихся нуклеотидных последовательностей,
как полных геномов, так и отдельных генов Brucella
из различных международных баз данных. Получить
подробную информацию можно из международных
компьютерных банков данных GenBank через сеть
Интернет. Были отобраны последовательности генов
наиболее консервативные для видов рода Brucella.
По данным литературы, наиболее консервативным
геном для рода Brucella является ген BCSP31,
кодирующий поверхностный белок с молекулярной
массой 31 кД. Сравнительный анализ данного гена
показал, что он имеет 100% идентичность для
разных видов рода Brucella.
Подбор праймеров проводили с помощью
программы Primer-BLAST на сайте NCBI
http://www.ncbi.nlm.riih.gov/tools/primer-blast.
Необходимо было подобрать фрагмент молекулы
ДНК рода Brucella таким образом, чтобы два его
концевых участка, находящиеся на расстоянии 200-
600 нуклеотидов друг от друга, отличались бы по
своей структуре генетической консервативностью и
присутствовали только у рода Brucella и, в то же
время, отсутствовали в ДНК других возбудителей.
При подборе праймеров учитывали все возможные
критерии, влияющие на дальнейшую
амплификацию, а именно:
- длина праймера в пределах 18-24 нуклеотидов;
- состав GC оснований не более 60% и не менее
40%;
- высокая специфичность на 3'-конце праймера;
- отсутствие димеров, повторов и вторичных
структур;
- разница не более 3-5°С между температурами
плавления праймеров;
- размер ПЦР продукта в пределах 200-600 п.н.
Важно отметить, что не совсем удачный выбор
праймера может привести к появлению
неспецифического продукта амплификации из-за
образования "праймерного димера". Этот побочный
продукт амплификации представляет собой
двунитевой фрагмент, возникающий за счет отжига
праймеров с их последующей достройкой Taq-
полимеразой. Праймеры должны быть специфичны.
Если их специфичность недостаточна, то вероятней
всего в пробирке с реакционной смесью будут
происходить нежелательные процессы, а именно
синтез неспецифической ДНК. При электрофорезе
неспецифическая ДНК выявляется в виде тяжелых
или легких дополнительных полос, иногда шмеров,
выглядящих сплошным мазком в агарозном геле.
Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез
неспецифической ДНК, что приводит к
значительной потере чувствительности.
Полученные праймеры были проверены на
специфичность с использованием программы BLAST.
В результате для данного гена были отобрана одна
пара праймеров, имеющая 100% гомологию со всеми
видами рода Brucella (таблица 1). Пара праймеров
BrF1 и BrR1 дает ПЦР-продукт размером 345 п.н.

4. 28667
4
Таблица 1
Основные характеристики специфических праймеров на ген BCSP31 для постановки ПЦР на
бруцеллез
Прай
меры
Последовательность (5'->3') Длина Начало Останов
ка
Тм ГЦ,% Комплементар
ность 1
Комплементарность
3
BrFl tgcctgcgcgaagtgacgat 20 301 320 59.82 60.00 6.00 2.00
BrRl aaccgcaaagctcgctccca 20 645 626 59.96 60.00 4.00 0.00
2. Синтез олигонуклеотидов.
Компьютерно - моделированные
последовательности праймеров в дальнейшем
синтезировали на синтезаторе олигонуклеотидов
«Expedite 8909» фирмы «Applied Biosystems».
Синтез ДНК проводили согласно протоколам,
прилагаемым к прибору. Полученные
олигонуклеотиды элюировали с колонок
концентрированным раствором аммиака и
выпаривали в вакуумном испарителе Centri Vap
Concentrator, LABCONCO. Преципитат праймеров
растворяли в ТЕ буфере и переосаждали этанолом.
Полученные таким образом синтезированные
праймеры используются для постановки ПЦР.
3. Выделение ДНК из образцов.
Выделение ДНК проводили с использованием
набора «QIAamp® Viral DNA Mini and Blood Mini
Handbooks в соответствии с наставлением по
применению данного набора.
1) В пробирку на 1,5 см3
добавляли 20 мкл
протеиназы К и 200 мкл исследуемого образца,
300 мкл лидирующего буфера (AL), 15 сек
перемешивали на вортексе.
2) Смесь инактивировали при 56°С (10мин),
добавляли 200 мкл 96% этанола и ресуспендировали
на вортексе 15 сек. Содержимое наслаивали на
колонку с фильтром, затем осаждали
центрифугированием в течении 1 мин при
8000 об/мин.
3) Добавляют 500 мкл промывочного буфера
№1(AW), а затем осаждают центрифугированием в
течении 1 мин при 8000 об/мин.
4) Добавляют 500 мкл промывочного буфера
№2(AW), а затем осаждают центрифугированием в
течение 3 мин при 14000 об/мин.
5) Осадок ресуспендируют в 200 мкл АЕ-буфера.
Инкубируют при комнатной температуре (15-25°С)
1 минуту. Центрифугируют при 8000 об/мин в
течении 1 мин.
4. Проведение ПЦР с праймерами,
специфичными к участкам гена BCSP31.
В отдельной пробирке готовят общую
реакционную смесь на N образцов, в число которых
входят положительный и отрицательный контроли.
Реактивы вносят в следующей последовательности.
Фермент добавляют в последнюю очередь.
Используется реакционная смесь следующего
состава (50 мкл): 5 мкл х10 ПЦР буфер, 0,5 мкл
MgCl, 0,5 мкл dNTP (10 мМ), по 0,5 мкл праймеров
(10 пмоль каждый), 40,5 мкл Н2О, 0,5 мкл Taq-
полимеразы.
Смесь перемешивают и раскапывают по 48 мкл в
пробирки. Затем в них вносят отдельным
наконечником по 2 мкл ДНК соответствующих
анализируемых или контрольных образцов (K+
и K-
).
Пробы вносят в амплификатор со следующим
температурным режимом:
5. Детекция продуктов амплификации.
Детекция продуктов амплификации проводится
методом электрофореза в 1,0 % растворе агарозы в
ТАЕ - буфере. Электрофорез проводят в течении 30
минут при напряжении 60V (3-5 вольт/см) на
аппарате DNA - 100 ("Pharmacia"). Визуализацию
полосы ДНК осуществляют с помощью бромистого
этидия.
Результаты электрофореза просматривают в
ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на
приборе "Трансиллюминатор". Результаты реакции
выявляются в виде светящихся полос.
Положительными считают пробы, полосы в которых
располагаются в геле на уровне полосы
положительного контроля. Исследуемые пробы
считают отрицательными, если в них не выявлено
никаких полос или полосы не соответствуют по
размеру фрагменту в контрольной пробе (т.е.
располагаются на другом расстоянии от старта). В
отрицательном контроле не должно выявляться
никаких полос. Присутствие в отрицательном
контроле окрашенных фрагментов на уровне полос
положительного контроля свидетельствует о
перекрестной контаминации в процессе анализа.
Результаты аннулируется. Анализ необходимо
провести заново.
Фиг.1 и 2 демонстрируют конечный результат
предлагаемого способа диагностики. Номера 1, 12-
16 пробы гетерогенные (отрицательные пробы),
номера 2-11 пробы гомогенные (положительные
пробы).
При определении специфичности ПЦР в
исследованиях использовали ДНК гомогенных и
гетерогенных проб. Результаты данных опытов
представлены на фиг.1.
1 - деионизированная вода, 2- штамм 19 В.
abortus, 3- штамм 544 В. abortus, 4- штамм 16М В.
melitensis, 5- штамм 63/290 В. ovis, 6- штамм 1066
B.canis, 7- штамм 1330 B.suis, 8-ДНК из сыворотки

5. 28667
5
морской свинки на 7 сутки после заражения
штаммом 544 В. abortus, 9-ДНК из сыворотки
морской свинки на 14 сутки после заражения
штаммом 544 В. abortus, 10 - ДНК из
лимфатического узла морской свинки на 21 сутки
после заражения штаммом 544 В. abortus, 11 - ДНК
из селезенки морской свинки на 21 сутки после
заражения штаммом 544 В. abortus, 12 - ДНК из
нормальной сыворотки морской свинки, 13 - ДНК из
нормального лимфатического узла морской свинки,
14 - эпизоотический изолят «Сайгачий»
пастереллез, 15-штамм Saigas/2011/ZKO/KZ
Pasteurella multocida, 16-штамм BL21 E.coli.
Фиг.1 - Электрофореграмма продуктов
амплификации при определении специфичности
ПЦР
Для определения чувствительности реакции
использовали штамм Br. abortus 544 в виде
клеточных лизатов с концентрацией микробных
клеток от 3 до 100000 м-к/см3
. Результаты данных
опытов представлены на фиг.2.
М - маркер ДНК, 1-100000 м.к/см3
, 2-10000
м.к/см3
, 3-1000 м.к/см3
, 4-100 м.к/см3
, 5-10 м.к/см3
,
6-9 м.к/см3
, 7-8 м.к/см3
, 8-6 м.к/см3
, 9-5 м.к/см3
, 10-4
м.к/см3
, 11-3 м.к/см3
, 12-отрицательный контроль.
Фиг.2 - Электрофореграмма продуктов
амплификации при определении чувствительности
ПЦР
Предложенный способ диагностики бруцеллеза
методом ПЦР специфичен и высокочувствителен.
Специфический ПЦР - продукт нарабатывается
только в присутствии ДНК бруцелл, предел
обнаружения составил 9 микробных клеток бруцелл
в пробе.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ идентификации бруцелл методом
полимеразной цепной реакции, предусматривающий
проведение реакции амплификации на общеродовой
ген BCSP31 внешней мембраны бруцелл, анализ
реакционной смеси с помощью электрофореза в
агарозном геле и выявление ДНК разных видов рода
Brucella по результатам анализа, отличающийся тем,
что в качестве праймеров для проведения реакции
амплификации в ПЦР, используют
олигонуклеотиды из 20 звеньев, BrF 1 (прямой):
TGCCTGCGCGAAGTGACGAT и BrR 1 (обратный):
AACCGCAAAGCTCGCTCCCA, комплементарные
не менее чем на 100% гену BCSP31 внешней
мембраны бруцелл, при этом присутствие в
анализируемых образцах продуктов ПЦР
(фрагментов ДНК) размером 345 нуклеотидных пар
специфичных к гену BCSP31, свидетельствует о
наличии в исходном материале ДНК бруцелл.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч