Генетическая инженерия сегодня
•Download as PPT, PDF•
2 likes•1,849 views
Генетическая инженерия сегодня Патрушев Лев Иванович, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Лаборатории биотехнологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН synbio2012.ru
Recommended
More Related Content
What's hot
What's hot (20)
Viewers also liked
Viewers also liked (20)
Similar to Генетическая инженерия сегодня
Similar to Генетическая инженерия сегодня (20)
Генетическая инженерия сегодня
- 1. Генная инженерия сегодня Л.И. Патрушев Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
- 2. План лекции Часть первая: •Введение •Полимеразная цепная реакция •Новые методы секвенирования ДНК – геном человека Часть вторая •Анализ геномов и экспрессии генов на уровне транскрипции •Олигонуклеотидные аптамеры, рибозимы и ДНКзимы. ДНК в наноконструкторе •Трансгенные животные, животные-клоны
- 3. «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов, а не новых концепций. Новые концепции объясняют известные явления по-новому. Новые методы открывают новые явления, которые необходимо объяснить.» Freeman J. Dyson
- 4. Что такое «генная инженерия»? Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем с использованием манипуляций генами на молекулярном уровне путем конструирования рекомбинантных ДНК или РНК Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма de novo по чертежам, разработанным в лаборатории - «синтетическая биология»
- 5. Генная инженерия облегчает обмен генами между природными генетическими системами В классической генетике и селекции – отбор среди потомства по определенным признакам ограничен репродуктивной изоляцией В генной инженерии при получении трансгенных организмов такие ограничения действуют слабее
- 6. Клонированная самка муфлона, родившаяся у овцы, использованной в качестве приемной матери Перенос ядра соматической клетки погибшего муфлона в энуклеированную яйцеклетку овцы Нормальные роды после 155 дней беременности Самец муфлона
- 7. Что такое «клонирование»? В генной инженерии: получение «клона»: препарата идентичных молекул ДНК или «идентичных» живых организмов В случае ДНК два пути решения задачи: 6.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 7.Рекомбинантные молекулы ДНК
- 8. Для чего нужны клоны ДНК? Для удобства проведения исследований Работать с индивидуальными молекулами ДНК трудно, но возможно
- 9. Клонирование ДНК Цель – получение клона идентичных последовательностей 1 – Объединение вектора со вставкой чужеродной ДНК 2 – Введение рекомбинантного вектора в клетки 3 – Размножение клеток (получение клона клеток) или амплификация молекул нуклеиновых кислот - ПЦР
- 10. Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерии Узнают специфические последовательности – сайты рестрикции Активны в виде димеров в присутствии ионов Mg2+
- 11. Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса II «Тупые» концы 5’-выступающие 3’-выступающие
- 12. Механизм действия T4-ДНК-лигазы Образование фосфодиэфирной связи между 3’- OH- и 5’-фосфатной группами одноцепочечных ДНК Лигирование фрагментов ДНК по «тупым» концам
- 13. Векторы Молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала в клетки живых организмов Клонирующие векторы (Cloning vectors) Экспрессирующие векторы (Expression vectors) Векторы для слияния генов (Gene fusion vectors) Бинарные (челночные) векторы (Shuttle vectors)
- 14. Свойства, которыми должен обладать любой вектор Способность к длительному существованию в клетках-хозяевах (репликация автономная или в составе хромосом) Наличие биохимических или генетических маркеров, которые позволяют обнаруживать его присутствие в клетках Должны допускать встраивание чужеродной ДНК без нарушения своей функциональной целостности
- 16. Плазмидный вектор pUC18 Полилинкер bla – Ген β-лактамазы, селектируемый маркер (устойчивость ампициллину) ori – Точка начала репликации (origin) lacZ ‘ – N-концевая часть гена β-галактозидазы (кодирует146 из 1021 АК- остатков), селектируемый маркер (хромогенный субстрат X-Gal) lacI – Ген Lac-репрессора (Индуктор – IPTG)
- 18. Искусственная хромосома дрожжей YAC (Yeast Artificial Chromosome) ura3 – ген оротидин- cen – центромера 5’-фосфатдекарбоксилазы tel – теломеры жизненноважный: ars – область начала позитивный отбор репликации 5-фтороротовая кислота (нетоксична) 5-фторурацил (токсичен) негативный отбор >2000 т.п.н.
- 19. Евгений Витальевич Ананьев, 1970-е Искусственные хромосомы кукурузы Первооткрывател ь мобильных генетических элементов у дрозофилы
- 20. Емкости векторов разных классов Вектор Емкость (т.п.н.) Применение Плазмиды 15 Библиотеки кДНК Геномные библиотеки Бактериофаг лямбда 25 Библиотеки кДНК Космиды 30-45 Геномные библиотеки PAC 70-90 То же BAC 100-500 То же YAC 250-2000 То же MAC >2000 Генотерапия
- 21. ДНК-узнающий домен TAL-эффектора построен из повторяющихся пептидных модулей TAL - Transcription activator–like (effectors) у бактерий рода Xanthomonas, паразитирующих на растениях. Длина повторяющегося модуля – 33-35 а.о.
- 22. Рекомбинантный химерный белок TALEN для адресной доставки нуклеазы к ДНК дрожжей
- 24. Генная инженерия без клонирования – Полимеразная цепная реакция
- 25. ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс») После 6 циклов ПЦР образуется 64 идентичных копии исходного генетического локуса (ампликона)
- 26. Направленный мутагенез с использованием ПЦР и перекрывающихся праймеров Введение точечных мутаций
- 27. Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель полимеразной цепной реакции (ПЦР) Американский биохимик 1944 г.р. Патент - 1985 г., фирма Cetus Corp. California Нобелевская премия по химии – 1993 г.
- 32. Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time PCR Позволяет, не открывая пробирки, непрерывно следить за накоплением продуктов ПЦР в пробах
- 33. Устройство капиллярного амплификатора LightCycler Капилляры объемом 20 мкл обеспечивают высокое соотношение поверхности к объему и высокую скорость теплообмена. 30 циклов завершаются за 20-30 мин
- 34. Принцип действия зондов TaqMan 5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы Гаситель отщепляет Флуорофор флуоресценции флуоресцентный краситель, который начинает флуоресцировать в реакционной смеси
- 35. Принцип действия зондов – молекулярных маяков (molecular beacon probes) В растворе зонды образуют структуру «стебель-петля», что приводит к сближению флуорофора и гасителя флуоресценции
- 36. Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания реакции СT СT – пороговый цикл
- 37. Российские производители амплификаторов для проведения ПЦР в реальном времени •Институт аналитического приборостроения РАН, С-Петербург совместно с фирмой «Синтол», Москва •Фирма «ДНК-Технология», Москва •Флуоресцентно-меченые зонды – «ДНК-синтез», (ИБХ РАН), фирма «Синтол», Москва
- 38. Цифровая ПЦР (Digital PCR) (на основе эмульсионной ПЦР)
- 40. Фредерик Сенгер – духовный и крестный отец автоматических ДНК-секвенаторов первого поколения Дважды лауреат Нобелевской премии по химии 1958 г. – первичная структура инсулина 1980 г. – метод секвенирования ДНК Метод секвенирования ДНК по Сенгеру введен в научную практику в 1977 г.
- 41. Лерой Худ (Leroy Hood) – родной отец автоматических ДНК- секвенаторов первого поколения Современный автоматический ДНК- анализатор ABI 3730 фирмы Applied Biosystems •48 капилляров •Время анализа – 2 часа •Длина секвенируемого фраг-та ДНК - ~500 п.н.
- 42. Секвенирование генома человека – кульминация использования метода Сенгера Основные участники проекта «Геном человека»: •Международный консорциум ( 1990- 2000 г.г.) Университеты и исследовательские центры США, Англии, Японии, Франции, Германии, Китая, Канады и Новой Зеландии •Американская частная фирма Selera (1998-2000 г.г.) Затраты проекта: В каждом случае по ~3 миллиарда долларов
- 43. Френсис Коллинз (Francis Collins) – координатор международной программы «Геном человека» В 1993 г сменил Д. Уотсона на посту Национального центра по исследованию генома человека Становится координатором Международного консорциума по секвенированию генома человека В настоящее время директор Национального института здоровья, США
- 44. Крейг Вентер – основатель фирмы Selera Craig Venter: Цех секвенирования ДНК методом Сенгера «Геном человека – это Я!»
- 45. Эмульсионная (эм)ПЦР на микрочастицах с иммобилизованным праймером эмПЦР Матрица оцДНК Синтезированная цепь ДНК Праймеры эмПЦР Начало 1-го цикла Начало 2-го цикла эмПЦР эмПЦР Гидрофобная фаза Начало 3-го цикла эмПЦР
- 46. Системы секвенирования ДНК второго поколения 1 Фрагментация ДНК 3 Получение полимеразных колоний - полоний 2 Лигирование адаптера Циклическое секвенирование 4 микроматрицы Фрагменты ДНК лигируют с олигонуклеотидными адаптерами, каждый фрагмент одновременно амплифицируют in vitro и секвенируют с использованием флуоресцентных красителей Полонии – полимеразные колонии
- 47. Секвенатор второго поколения фирмы Illumina Производительность – 600 Gb (6 x 1011 bp) за 11 дней; Макс. длина секвенируемого фрагмента – 2 x 100 bp; Секвенирование синтезом, молек. колонии - кластеры на стекле
- 48. Цех секвенаторов 2-го поколения в Китае Фирма BGI-Shenzhen, ноябрь 2011
- 49. Секвенатор третьего поколения PacBio RS фирмы Pacific Biosciences Система коммерциализирована и активно продается в течение последнего года
- 50. Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе Меченые dNTPs Включившийся dNTP Эмиссия Возбуждение Одна молекула ДНК-полимеразы иммобилизована на дне каждого волновода
- 51. Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипе Включающийся в ДНК меченый нуклеотид задерживается в объеме считывания флуоресценции в течение миллисекунд, свободно диффундирующий нуклеотид – в течение наносекунд. Включение обнаруживается в виде вспышки света определенной длины волны, характерной для конкретного нуклеотида..
- 52. Секвенирование через нанопоры Часть мембраны с нанопорой, через которую проходит одноцепочечная ДНК Изменения силы тока, проходящего через мембрану, под действием отдельных нуклеотидов ДНК Уникальная последовательность Гомополимер
- 53. Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании через нанопоры Время
- 54. Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2012 г) Производительность 1 млрд нуклеотидов Дэвид Димер (David Deamer) - за 6 часов Предложил принцип метода Десятки тысяч нуклеотидов/1 прогон секвенирования через нанопоры в Компьютер – ноутбук с USB-разъемом 1989 году Стоимость ~$900
- 55. Объем баз данных Человек: 2000 – 8 Gb 2010 – 278 Gb Всего: 1,8 триллиона п.н. Пиросеквенирование Roch 454 Автоматические Персональные секвенаторы геномы Сенгера Секвенирование $100 синтезом Illumina/Solexa $10 Третье поколение секвенаторов Секвенирование лигированием $1 -Полонатор
- 56. Современное состояние эталонной последовательности генома человека Сборка № 37, Опубликовано 9 октября 2009 г.
- 57. Международный проект «1000 геномов» Цель – оценка генетического разнообразия в популяциях человека и построение общедоступного исчерпывающего каталога генетических различий Основные участники: США, Китай, Великобритания Начало: январь 2008, завершение пилотной фазы – 2010. В завершающей фазе секвенирование 2500 дополнительных персональных геномов (перекрывание 4х). Идентификация всех вариантов с частотой ≥0.1%. Структура исследований в пилотной фазе: • Секвенирование с низким перекрыванием (2-4х) геномов 179 индивидуумов из трех популяций. Цель: выявление всех вариантов с частотой ≥1%. Обнаружено 14 089 000 SNP и 1 033 000 indels (соответственно 54 и 57% - новые) • Глубокое секвенирование (перекрывание ~40х) двух трио (отец, мать, ребенок) из популяций кавказоидов и Yoruban (Западная Африка). Частота спонтанных мутаций – 10―8/основание/поколение. • Глубокое секвенирование 8140 экзонов у 697 индивидуумов. Цель – выявление «нормальных» вариантов в кодирующих последовательностях. Выявлено 12 758 SNP и только 96 indels. 70% SNP – новые.
- 58. Сравнение SNP десяти персональных геномов Архиепископ Desmond Tutu, ЮАР Хойсан (Khoisan), ЮАР
- 59. Геном каждого человека уникален ~3 500 000 SNP и ~1000 больших (>500 bp) CNV отличают геном каждого человека от референсной последовательности Каждый персональный геном содержит 400 000-500 000 новых SNP, отсутствующих в dbSNP и ~. В среднем каждый геном содержит 20 000-25 000 вариантов кодирующих частей генов. Из них 9 000-11 000 – несинонимические замены Геном «нормального здорового» индивидуума содержит 40-100 вредных вариантов генов в гетерозиготном состоянии. Это число будет возрастать. У них обнаружены также вредные гомозиготные или гемизиготные мутации.
- 60. Пангеном человека Каждый секвенированный геном человека содержит миллионы пар нуклеотидов некартированных последовательностей, отсутствующих в референсном или любом другом исследованном геноме. Среди них есть повторы, регуляторные последовательности и гены. По количеству нуклеотидов две гомологичных хромосомы из персональных геномов совпадают на 99,5% ( ранее считалось, что сходство составляет 99,99%)
- 61. Карта полных геномов двух раковых клеток опухоли человека A – кариотип B – GC-состав, 0-70% C и D – глубина E – плотность генов секвенирования генома в референсном двух клеток 0x-40x, 1Mb геноме 0-30/100 kb
- 62. Внутриопухолевый ландшафт генных мутаций у одного пациента с карциномой почек Гены, постоянно мутирующие у большого числа пациентов Полностью секвенированы экзомы 25 клеток одной опухоли и соседних с ней клеток Мутации, Мутации, представленные в одной представленные в большинстве клеток или в небольшом числе клеток
- 63. Анализ геномов и экспрессии генов на уровне транскрипции
- 64. Флуоресцентная гибридизация in situ FISH – Fluorescent In Situ Hybridization Подготовка Подготовка зонда клеток или хромосом
- 65. Физическое картирование YAC-ДНК с помощью FISH FISH – флуоресцентная гибридизация in situ Голубой цвет -индивидуальные цепи YAC-ДНК Красный и зеленый – меченые полинуклеотидные зонды Разрешение метода – от 3 до 5 т.п.н. Флуоресцентная микроскопия
- 66. Идентификация всех хромосом человека методом FISH (Chromosome Painting)
- 67. Хромосомные территории в интерфазных ядрах (многоцветная FISH) Хромосомы в интерфазном ядре Хромосомы 12, 14 и 15 в фибробластов человека интерфазном ядре лимфоцитов мыши
- 68. Три группы современных методов определения профилей глобальной экспрессии генов Global Gene Expression Profiling (GGEP) Использование гель-электрофореза: дифференциальный дисплей Использование секвенирования ДНК: серийный анализ экспрессии генов, NGS кДНК Использование гибридизации: биочиповые технологии
- 69. Гибридизация по Саузерну Гель Перенос фрагментов ДНК Результат авторадио- графии Edwin M. Southern (1938) Схема переноса фрагментов НК на мембрану Southern , 1975-1979
- 70. Обратный Северный блоттинг/Саузерн Клоны отдельных кДНК, уникальных для тестерной популяции мРНК, иммобилизовали на фильтре и гибридизовали с мечеными мРНК тестерной или драйверной популяций
- 71. Биочип с иммобилизованными кДНК
- 72. Схема сканирования ДНК-биочипа считывающим устройством
- 73. Олигонуклеотидный биочип после компьютерного псевдоокрашивания Соотношение интенсивности флуоресценции в каждой точке от двух флуорофоров (красного и зеленого) позволяет представлять данные в виде оттенков зеленого и красного цвета
- 74. Исследование транскрипции с помощью биочипов Количественный молекулярный фенотип клеток нет различий Транскрипция 4132 генов в клетках разных Клетки аденокарциномы, типов у человека. Выделены клетки эндотелия обработанные ингибитором
- 75. Выявление делеции длиной в 419 т.п.н. на хромосоме Xp21.1 человека с помощью биочипа Affimetrix SNP Array 6.0 Биочип содержит 1,8 млн маркеров, в том числе 900 000 зондов для индивидуальных SNP, равномерно распределенных вдоль генома человека
- 76. Технологии антисмысловых последовательностей Нуклеиновые кислоты как ферменты
- 77. Использование нуклеиновых кислот для изменения экспрессии генов в эукариотических клетках
- 78. Сферы применения синтетических олигонуклеотидов
- 79. Механизмы подавления трансляции антисмысловыми олигодезоксирибонуклеотидами (ODN) Трансляция в норме Разрушение РНК ODN РНКазой H Блок инициации Блок элонгации
- 80. Олигонуклеотидные аптамеры ДНК-аптамер ARC1172 в комплексе с доменом A1 фактора фон Виллебранда
- 81. Схема отбора олигонуклеотидных аптамеров из комбинаторной библиотеки Хроматография Капиллярный электрофорез
- 82. Автоматизированная система отбора аптамеров RNA-SELEX
- 83. РНК-аптамер, взаимодействующий с AMP 36 nt Контакты преимущественно с кольцом аденина, но не рибозой. Может связывать ATP, NAD
- 84. РНК-аптамер, взаимодействующий с GTP Лиганд погружен в связывающий карман КD ~75 nM Обнаруживает много третичных взаимодействий, объясняющих высокое сродство аптамера к лиганду 41 nt
- 85. РНК-аптамер, взаимодействующий с витамином B12 Лиганд взаимодействует с периферией аптамера 35 nt
- 86. РНК-аптамер, ингибирующий фактор транскрипции NF-kB Аптамер (зеленый) представлен в двух разных видах в комплексе с двумя молекулами фактора транскрипции Подавление реакции воспаления
- 87. Сравнение размеров молекул антитела и олигонуклеотидного аптамера 17 nt
- 88. Преимущества олигонуклеотидных аптамеров перед антителами
- 89. Области современного применения аптамеров
- 90. Глобальный рынок аптамеров медицинского назначения (млн $)
- 92. Томас Чех – первооткрыватель рибозимов Thomas Cech 1982 г. Аутосплайсинг интрона рибосомной 35S-РНК жгутикового простейшего Tetrahymena Нобелевская премия по химии 1989 г. совместно с Sidney Altman
- 93. Сидни Олтман (Sidney Altman) получает Нобелевскую премию за РНКазу P
- 94. Каталитический цикл рибозима Данные кинетического и РНК-субстрат (S) рентгеноструктурного анализа Рибозим (E) Фермент- Продукт P2 субстратный 5’-OH-конец комплекс (E-S) E-P2 Mg2+ Продукт P1 2’-3’-циклический Комплекс (в концевой фосфат переходно Комплекс м состоянии фермент-продукт (E-P1-P2)
- 95. Получение рибозима, обладающего РНК-полимеразной активностью методом CBT (Compartmentalized Bead-Tagging)
- 96. Исходный рибозим Окончательный вариант рибозима
- 97. Реакции, осуществляемые дезоксирибозимами Реакция Связь Ускор Реакция Связь Ускор Гидролиз РНК O-P 108 Реакция Diels-Alder С-С 4×105 Лигирование РНК O-P 105 Депуринизация ДНК С-N (3’-5’) Лигирование РНК Окислительный O-P 5×106 C-O 106 (ветвление) разрыв ДНК Лигирование РНК Фотореактивация O-P 105 С-С 3×104 (петля) тиминовых димеров Фосфорилирование Гидролиз O-P 109 N-P 103 ДНК фосфорамидата Введение металлов в Аденилирование ДНК O-P 2×1010 Cu-N 103 порфирины Нуклеопептидная Лигирование ДНК O-P 105 O-P 5×105 связь
- 99. Образование двумерных решеток из стабильных конструкций с липкими концами
- 100. Сложные ДНК- оригами оцДНК фага M13 (7240 nt) смешивали с 250 олигонуклеотидами-помощниками (32 nt) и охлаждали 2 ч до 20оС
- 101. Куб как сумма линейных катенанов ДНК Линейные тройные катенаны ДНК (в центре рисунка) спонтанно собираются с образованием куба (слева)
- 102. Усеченный октаэдр, построенный из ДНК Фигура построена из 14 кольцевых молекул оцДНК. Цветные точки – сахаро-фосфатный остов ДНК, белые точки – азотистые основания. Вид сверху.
- 103. Трансгенные животные Кролик, экспрессирующий зеленый флуоресцирующий белок (GFP)
- 104. Трансгенез: введение генов в эукариотический организм путем генетической трансформации, трансфекции или переносом ядер соматических клеток (неполовым путем)
- 105. Первый «клон», полученный путем пересадки ядра соматической клетки Овца Долли (1997-2003) и ее первый ягненок Бонни (1998) Рослинский институт в Шотландии близ Эдинбурга
- 106. Три способа получения трансгенных животных 1. Прямая инъекция ДНК в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток 2. Использование рекомбинантных вирусов для заражения эмбриональных клеток зародыша 3. Использование эмбриональных стволовых клеток (ES)
- 107. Прямая инъекция ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши Оплодотворенная яйцеклетка фиксирована удерживающей пипеткой. Справа игла, содержащая ДНК Инъекция раствора ДНК в пронуклеус сопровождается увеличением его объема
- 108. Трансгенные игрунки (Callithrix jacchus), экспрессирующие EGFP в конечностях. Использован ретровирусный вектор Инъекция в бластоцист NATURE, 459, 523, 2009
- 109. Экспрессия GFP, интегрированного в X- хромосому Трансгенные самцы Обычные самцы Трансгенные самки Демонстрация случайной инактивации X-хромосомы у самок
- 110. Технологии, основанные на использовании эмбриональных стволовых (ES) клеток
- 111. Этапы технологии, основанной на использовании эмбриональных стволовых клеток Создание трансгенных Генетическая Получение линий ES зародышей модификация ES
- 112. Химерный эмбрион трансгенной мыши, экспрессирующий β-галактозидазу E.coli Окрашены потомки эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующие β- галактозидазу, после окраски X-gal
- 113. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) и их трансплантация в целях терапии
- 115. Стадии процесса клонирования млекопитающих Энуклеация Традиционный метод переноса ядер соматических клеток Перенос ядра соматической клетки Активация SrCl2 или экстракт спермы Дробление бластомеров Приемная Клон мать SCNT – somatic cell nuclear transfer Зародыш
- 116. Стадии клонирования млекопитающих вручную (Handmade cloning - HMC) 1 •Сбор яичников, •Выделение ооцитов из фолликулов, • Созревание, •Отделение сопутствующих клеток, •Разрушение микротрубочек демеколцином •Разрушение zonae pellucidae проназой •Фитогемагглютинин, индивидуал. •Ядро в выпячивании удаляется лезвием прикрепление к цитопласту • Кариопласт удаляется, цитопласт - акцептор •Электрослияние •Культивирование соматических клеток •Химическая активация
- 117. Клоны поросят, полученные вручную и традиционным методом HMC HMC TC
- 118. Основные патологические фенотипы, отмеченные у клонированных животных Organ Cattle Sheep Goats Pigs Mice Cloning 0–5 0.4–4.3 0.7–7.2 0.1–0.9 0.2–5.8 efficiency (%) Placenta Impaired development, Reduced – – Placentomegal oedematous cotyledons, vascularity y enlarged umbilical vessels, hydrallantois BW Higher – – Lower – Heart RV enlargement Hypertrophy – RV – enlargement Lungs Hypertension¶ Hypertension, Pneumonia – Pneumonia MPV CNS – Pathology – – – Kidneys Abnormalities (including size Defects, – – – abnormalities) hydronephrosis HLS Lymphoid hypoplasia, – – – Immune anaemia impairment Endocrine Diabetes – – – – Liver Fibrosis, fatty liver Enlargement, – – Hepatic BDP, fibrosis necrosis MS Limb deformities Body-wall – – – defects
- 119. Программирование генома в нормальном развитии
- 120. Перепрограммирование генома соматических клеток после пересадки ядер
- 122. Нерепродуктивное (терапевтическое ) клонирование человека
- 123. У Сук Хван приносит извинения за допущенные фальсификации и прощается с Сеульским университетом Хван У Сук с клонированным Снаппи (афганская борзая) За последние годы в Южной Корее удалось клонировать корову, кота, свинью, волка и койота
- 124. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) и их трансплантация в целях терапии
- 125. Резюме С появлением генной инженерии начался новый этап эволюции биосферы Земли, все последствия которого мы не в состоянии предвидеть Руками человека Природа пытается познать и усовершенствовать самою себя Синтетическая биология – венец генной инженерии. Виртуальный отбор наилучших вариантов Сверхразум и сверхчеловек vs катастрофы Жизнь на Земле бессмертна
- 126. Трансгенные растения
- 127. В основе искусственного трансгенеза у растений как и у животных лежит концепция эмбриональных стволовых клеток
- 128. Основные этапы получения трансгенных растений Эксплантат Каллус Введение ДНК Растение, чувствительное к гербициду Отбор с гербицидом
Editor's Notes
- Ридли Скотт «Бегущий по лезвию бритвы» Совокупность методов – неправильно Вентер – искусственная бактерия: 1.08–mega–base pair Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 полностью синтезированный genome , собранный в клетках дрожжей, введен в клетки M. capricolum .
- Сила классической селекции очень велика: породы собак, сорта растений. Генно-инженерными методами возможно получение трансгенных животных
- Интермедиат фермент- AMP
- Вовлечен в синтез пиримидиновых рибонуклеотидов. Наличие гена ura3 позволяет до того ауксотрофным клеткам расти без добавления в среду урацила или уридина (позитивный отбор на наличие вектора). 5- FOA при наличии гена ura3 превращается в токсичный 5-фторурацил – клетки гибнут
- Transcription activator–like (TAL) effectors recognize DNA in an apparently modular fashion . Found as yet only in plant pathogenic bacteria, particularly members of the genus Xanthomonas . Позитивные факторы транскрипции, длина повторяющейся АК-последовательности – 33-35 а.о.
- TAL effector–based sequence-specific mutagens or chromatin-modifying proteins created by fusing TAL effectors to domains such as cytidine deaminases, histone acetyltransferases or deacetylases, or DNA methyltransferases can also be envisioned.
- В начале своего доклада я хотел бы определить два термина, поставленных в название своего доклада
- Не вдаваясь глубоко в историю секвенирования, отдадим дань Фредерику Сенгеру, метод которого лег в основу автоматических секвенаторов первого поколения
- Геномные войны
- Синтетическая биология
- Куда ты скачешь, грозный конь, и где опустишь ты копыта?
- Pacific Biosciences is a biotechnology company founded in 2004 [1] that develops and manufactures systems for gene sequencing and some novel real time biological observation. [2] They describe their platform as single molecule real time sequencing (SMRT), based on the properties of zero-mode waveguides. Their first commercial product, the PacBio RS, has been sold to a limited set of customers in 2010 and is expected for public release in early 2011
- 4 MAY 2012 VOL 336 SCIENCE, 534
- Lupski et al, Ann Rev Med 2012
- This estimate is based only on the coding regions and the approximately 5%–10% of genes and diseases that we currently understand; it might be that we all carry many more deleterious changes or potentially pathogenic variants than we now predict. One explanation is that owing to an uneven distribution of reads throughout the genome, there might be fewer reads to accurately call the variants in these positions and these variants may actually be heterozygous. Another possibility is that these are rare polymorphisms that were identified in a disease-affected patient andmistakenly reported to be the disease-causing mutations. Alternatively, penetrance of Mendelian disease-associated variants may be lower than anticipated, as they have often not been studied in unaffected individuals.
- Пангеном – геном всего человечества
- Hou et al Cell 148, 873–885, March 2, 2012, 873 Драйверные мутации и мутации-пассажиры
- Чрезвычайная гетерогенность опухоли, выявлена конкретная драйверная мутация, что позволяет думать о персонализированной терапии
- Визуализация экспрессии генов (флуоресцирующие белки) в стебле проростков арабидопсиса
- Все 23 хромосомы человека могут быть идентифицированы на одной метафазной пластинке с помощью многоцветной FISH
- DNA probes specific to regions of particular chromosomes are attached to fluorescent markers and hybridized with a chromosome spread. The picture shows a computer-generated "false colour" image, in which small variations in fluorescence wavelength among probes are enhanced as distinct primary colours. The combination of probes that hybridize to a particular chromosome produces a unique pattern for each chromosome. This makes it particularly easy to detect segmental deletions and translocations among chromosomes. These fragments (BAC) are on the order of 100 thousand base-pairs, and are the basis for most FISH probes. Each "paint" is actually a collection of hybridization probes for sequences that span the length of a particular chromosome.
- В желтой рамке гены, транскрипция которых повышена в клетках эндотелия. Перечислены гены этого кластера. Синим обозначены гены, со специальной функцией, характерной для эндотелия. Клетки аденокарциномы обработаны ингибитором киназы фосфатидилинозитола.
- ДНК человека после выделения флуоресцентно метили, гибридизовали с биочипом и количественно определяли флуоресценцию в каждой точке биочипа. Требуется 500 нг ДНК и работа в течение 3-х дней. Биочип содержит 906,600 зондов для целевых SNP и 945,826 зондов для неполиморфных последовательностей Affimetrix Santa Clara, CA, USA
- Aptamer transcription factor inhibition, molecular model. This is an RNA (ribonucleic) aptamer (green), inhibiting the effect of a transcription factor (blue and yellow). Nucleic acid aptamers are structures engineered to affect genetic and biochemical processes. The aptamer is shown both as a ribbon and ball-and-stick structure and as a surface (solid) structure. This is the NF-kB transcription factor, which mediates the response to inflammation. It is part of the response to both inflammatory cytokines, as well as inflammation caused by pathogens or the response to pathogens.
- Двухвалентный катион, атакует фосфодиэфирную связь и обеспечивает правильный фолдинг рибозима
- i – К магнитным микрочастицам, покрытым стрептавидином, присоединяли биотинилированные 1) ген рибозима под контролем промотора T7 -РНК-полимеразы (в среднем один ген на одну частицу), 2) олигонуклеотиды в виде шпильки (6 х 10 4 олигонуклеотидов/частицу) биотин к олигу присоединен дисульфидной связью; ii – Такие шарики помещали в реакционную смесь с Т7-РНК-полимеразой и Т4-РНК-лигазой 2 и создавали микроэмульсию, в каждой капле которой происходила транскрипция гена рибозима, его иммобилизация на олигонуклеотиде-шпильке и лигирование к олигонуклеотиду. iii – Эмульсию разрушали и к микрочастицам присоединяли через биотин олигонуклеотидные праймер и матрицу; iv – Создавали вторую эмульсию, каждая капля которой содержала все для транскрипции матрицы рибозимом, проводили инкубацию (и транскрипцию); v – После разрушения эмульсии, транскрипт, ковалентно привязанный к праймеру в процессе его элонгации, амплифицировали по типу катящегося кольца с использованием искусственной кольцевой оцДНК в качестве матрицы; vi – Амплификат метили с помощью флуоресцентных зондов; vii – Меченые микрочастицы отделяли FACS -сортировщиком viii – Гены отделяли от микрочастиц и исследовали.
- The circular single-stranded viral DNA is combined with the 250 helper strands, each 32 bases long. This is accomplished by taking the equivalent of well-calibrated eye-dropper, known as a pipette, and combining a 5 microliter drop of solution from each of 250 tubes. Once the scaffold and helper strands are combined, a little buffer (to control pH) and a magnesium salt are added. (Magnesium Mg++ ions neutralize negative charges on the DNA and allow the single-stranded DNA to come together and form the double helix). The mixture of strands is then heated to near boiling (90 C) and cooled back to room temperature (20 C) over the course of about 2 hours.
- В 277 энуклеированных яйцеклеток были внесены ядра из замороженных клеток вымени уже умершего донора, 1/10 часть развилась до зародыша, из 29 эмбрионов выжил только один. Назвали в честь американской певицы Долли Парсон. Родилась в 1997 г. – усыпили в 2003 г. Обычно овцы живут 10-12 лет. 1999 г – родила двойню, затем тройню. В 2001 г. развился артрит. Причина смерти - прогрессирующее заболевание легких, вызванное ретровирусом JSRV , и тяжелый артрит.
- Одна из X -хромосом самок содержит конститутивно экспрессирующийся трансген GFP
- 2001 г. Пять клонированных поросят (самки), у которых нокаутирован ген, белок которого вызывает агрессивную иммунную реакцию у человека. Работы по трансплантации органов животных человеку.
- Sr – активация у мышей, экстракт спермы – крупные животные, После слияния гамет в ооплазму попадает фосфолипаза С, которая отщепляет втор. мессенджеры: диацилглицерол и инозитолтрифосфат
- Удаляется 1 /3 цитоплазмы под стереомикроскопом, полярное тельце недостаток – гетероплазмия (митохондрии). ФГА стимулирует бласттрансформацию и деление лимфоцитов
- Перезагруженный геном первичных зародышевых клеток
- До Хвана единственным способом получения ЭСК были человеческие эмбрионы, созданные методом искусственного оплодотворения. Этическая проблема. В работе, которая была опубликована в журнале Science (2005) группой У Сук Хвана, описывалась технология, позволяющая обойти обе эти проблемы, и представлялись результаты ее применения — 11 линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые были якобы получены путем пересадки ядер соматических клеток пациентов в неоплодотворенные донорские яйцеклетки. Поскольку яйцеклетка не оплодотворялась, удавалось обойти этическую проблему получения ЭСК, а благодаря использованию собственного генетического материала потенциального пациента решалась проблема иммунного отторжения. Суд вменил ученому фальсификацию результатов исследований с использованием стволовых клеток и злоупотребление немалыми средствами, выданными государством на изыскания. В итоге южнокорейский биолог был приговорен к двум годам условно с отсрочкой приговора на три года и был лишен всех университетских и научных званий и степеней. В декабре 2010 года апелляционный суд снизил продолжительность наказания до 18 месяцев.
- Эксплантат - ткань или орган, культивируемый вне организма. Гербициды (от лат. herba — трава и caedo — убиваю) — химические вещества, применяемые для уничтожения растительности. По характеру действия на растения делятся на гербициды сплошного действия, убивающие все виды растений, и гербициды избирательного (селективного) действия, поражающие одни виды растений и не повреждающие другие.