1. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Новые аутоантигенные мишени
при воспалительных
заболеваниях кишечника
Prof. Dirk Roggenbuck

2. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Обзор
Идентификация GP2 в качестве
аутоантигена поджелудочной железы
при болезни Крона
GP2 – рецептор на поверхности М клеток
в кишечных бляшках Пейера
GP2 aнтитела, как серологический маркер
болезни Крона
Ассоциация анти-GP2 антител с клини-
ческим фенотипом при болезни Крона

3. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК)
хронические, рецидивирующие разрушения
тканей - идиопатические воспаления
кишечника
этиопатогенез не выяснен
могут играть роль аутоиммунные
заболевания
Нозологические формы
болезнь Крона (БК)
язвенный колит (ЯК)
неуточненный колит - colitis indeterminata

4. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Антитела при болезни Крона
PAB - аутоантитела к экзокринной части
поджелудочной железы (АТПЖ)
30% пациентов с болезнью Крона
непрямая иммунофлюоресценция, Stöcker et al.,
1984
Аутоантитела к гликанам специфичны для
болезни Крона
ASCA, Main et al., 1988
anti-chitobioside carbohydrate ab (ACCA)
anti-laminaribioside carbohydrate ab (ALCA)
anti-mannobioside carbohydrate ab (AMCA)
ИФА, Altstock et al., 2005
антитела к бактериальным антигенам
наружный мембранный протеин E.coli (OmpC),
флагеллин CBir1
Pseudomonas fluorescens ass. Sequence I2

5. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
АТПЖ, типа 1 и типа 2
массивное окрашивани
в просвете
панкреатических ацинус
тип 1
Крапчатое
окрашивани
е
цитоплазмы
в
ацинарных
клетках
поджелудоч
ной железы,
тип 2
Stöcker et al., 1987 Scand J Gastroenterol

6. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Открытие аутоантигена АТПЖ
Двумерный электрофорез и
иммуноблот
Roggenbuck et al., 2009 Gut

7. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Открытие аутоантигена для ПАТ
MALDI-TOF масс-спектрометрия :
GP2, гликопротеин 2 зимогеннывх гранул
Roggenbuck et al., 2009 Gut

8. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
НИФ - huGP2 в HEK293 клетках
Анти-GP2 IgG и IgA у пациентов с АТПЖ -
положительные и отрицательные БК, ЯК, и здоровые
доноры
Анти- GP2 были определены с помощью НИФ исползуя
GP2 трансфицированные HEK293 клетки
Число IgG IgA
пациентов
АТПЖ-позитивные БК 42 28 (66%) 18 (43%)
АТПЖ-негативные БК 31 0 0
язвенный колит 49 1 (2%) 0
здоровые доноры 69 1 (1%) 0
Roggenbuck et al., 2009 Gut

9. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
АТПЖ, типа 1 и типа 2
Тип 1
тип 2

10. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
GP2 в кишечнике человекa
Первое подтверждение
наличия GP2 в
человеческом кишечнике,
места воспаления при ВЗК
*
*
A БК, n=4
B ЯК, n=4
D контроль, n=5
* p<0.02
Roggenbuck et al., 2009 Gut

11. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
GP2 в кишечнике человекa
Физиологическая роль GP2
до конца еще не изучен
гомология с белком Тамма-Хорсфолла
(uromodulin)
первая линия защиты от микробных
агентов
Взаимодействие с фимбриями 1-го
типа E.coli (FimH)
Трансцитозный рецептор в М клетках -
регулирование врожденного и
приобретенного иммунитета

12. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
GP2 и THP
GP2 THP
Bogdanos D et al., 2012 Autoimmun Rev

13. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Экспрессия рекомбинантного GP2
Очистка рекомбинантного GP2 (baculovirus expression system)
A электрофорез - SDS-PAGE
B иммуноблот используя анти-HIS
C иммуноблот используя анти GP2
1 клеточный супернатант трасфицированных SF9 клеток
2 Ni-хилатная хроматография
3 ионообменная хротатография с помощью Mono Q
Roggenbuck et al., 2011 Clin Chim Acta

14. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
GP2 и THP
Hase et al., 2009 Nature
Ohno and Hase., 2010 Gut Microbes

15. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Взаимодействие с скэвенжер рецептором
Hölzl et al., 2010 Cell Immunol

16. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Бляшки Пейера
K Hase et al., 2009 Nature

17. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Физиологическая роль GP2
Roggenbuck et al., 2013 Advanc Clin Chem

18. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Экспрессия GP2 в лимфоцитах
unstimulated CD3 stimulated
50 GP2 expression
*
40 GP2
Percent expression
30
20
β actin
10
unstimulated CD3 stimulated
Werner et al., 2012 J Immunol

19. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
GP2 воздействие на эпителий
Апоптоз
Percent AnV+PI-
50
positive cells
40
30 * T84
20
** hIECs
10
0 10ug/ml 20ug/ml
GP2

20. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
GP2 воздействие на эпителий
Пролиферация
1
O.D. 0.8 *
* T84
0.6 **
hIECs
0.4
0.2
0 10ug/ml 20ug/ml
GP2

21. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
GP2 – фагоцитоз E.сoli
180 Эпителиялные клетки T84 **
Percent effect 170 *
160 моноциты
150
140
130
120
110
100
90
GP2: 0 5ug/ml 10ug/ml

22. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Удаление Treg – эффект GP2
Активация
Percent CD3+CD25+
positive cells 80
60 * PBMC
PBMC-Treg
40 *
PBMC-Treg+Treg
20
0 10 ug/ml
GP2

23. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Удаление Treg – эффект GP2
Апоптоз
Percent AnV+PI-
40
positive cells
30
20 PBMC
*
* PBMC-Treg
10
PBMC-Treg+Treg
0 10 ug/ml
GP2

24. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Anti-ФНО модулирует GP2
Апоптоз
20
Percent AnV+PI-
positive cells
*
10
*
Активация
Percent CD3+CD25+
50
positive cells
40 *
*
*
30
20
10 *
CD3 - + + + +
GP2 - - + - +
IFX - - - + +

25. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Anti-ФНО модулирует GP2
Untreated CD3 CD3 +IFX CD3 +ADA
GP2
β-Actin
120
120
120
120
13.6% 30.1% 21.7% 20.9%
Counts
60
60
60
60
Untreated
0
0
0
0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
GP2/SA-FITC
PBMCs (N=3) were stimulated with anti-CD3 and Caco2 cells
(N=3) with 10 µg/ml LPS. Cells were incubated either with or
without 10 µg/ml IFX or ADA. RNA levels were determined using
PCR. Surface expression was determined using flow cytometry.

26. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Anti-GP2 IgG ИФА
A: АТПЖ-положительные больные с БК (n = 72)
B: АТПЖ-отрицательные больные с БК (n = 106)
C: больные с ЯК (n = 100)
D: доноры крови (n = 162)
Roggenbuck et al., 2011 Clin Chim Acta

27. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Anti-GP2 IgA ИФА
A: АТПЖ-положительные больные с БК (n = 72)
B: АТПЖ-отрицательные больные с БК (n = 106)
C: больные с ЯК (n = 100)
D: доноры крови (n = 162)
Roggenbuck et al., 2011 Clin Chim Acta

28. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Фенотип БК
Montreal классификация* БК (n = 169) ЯК (n= 102)
Женский род, n (%) 102 (60.3) 57 (55.9)
Средний возрост (max,min) 36 (8,87) 47* (17,92)
Восрост при диагнозе
моложе 16 лет (A1), n (%) 31 (18.3)
от 17 ло 40 лет (A2), n (%) 19 (11.2)
старше 40 лет (A3), n (%) 119 (70.4)
Локализация
ileal (L1), n (%) – тонкая кишка 24 (14.,2)
colonic (L2), n (%) – тольстая кишка 32 (18.9)
ileocolonic (L3), n (%) 113 (66.9)
upper disease modifier (L4), n (%) 12 (7.1)
Bogdanos et al., 2012 BMC Gastroenterol

29. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Фенотип БК
БК (n = 169) ЯК (n= 102)
Behavior / проявление заболевания
non-stricturing, non-penetrating (B1), n (%) 86 (50.9)
stricturing (B2), n (%) – стенозируюший вариант 41 (24.3)
penetrating (B3), n (%) – пенетрируюший вариант 42 (24.8)
perianal disease modifier (p), n (%) покажение 62 (36.7)
ануса
non-stricturing, non-penetrating (B1p) ,n (%) 20 (11.8)
stricturing (B2p), n (%) 11 (6.5)
penetrating (B3p), n (%) 31 (18.3)

30. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Частота специ. антител при
БК
Все пациенты с ASCA отриц. ЯК
БК пациенты с БК
(n = 169) (n = 109) (n = 102)
Anti-GP2 IgA, (%) 22 (13.0) 9 (8.2) 2 (2.0)
Anti-GP2 IgG, (%) 48 (28.4) 25 (22.9) 8 (7.8)
Anti-GP2 IgA/ IgG, (%) 51 (30.2) 26 (23.9) 9 (8.8)
АТПЖ >= 1/20, (%) 74 (43.8) 45 (41.3) 24 (23.5)
АТПЖ >= 1/40, (%) 65 (38.5) 38 (34.9) 21 (20.6)
ASCA IgA, (%) 39 (23.1) - 3 (2.9)
ASCA IgG, (%) 48 (28.4) - 5 (4.9)
ASCA IgA / IgG, (%) 60 (35.5) - 7 (6.9)

31. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Частота специ. антител при
БК
Bogdanos et al., 2012 BMC Gastroenterol

32. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Клинический фенотип при БК
Aссоциация с локализацией заболевания
* * *
* *
Bogdanos et al., 2012 BMC Gastroenterol
Pavlides et al. 2012 Clin Dev Immunol

33. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Частота специ. антител при
БК
Aссоциация с проявлениями заболевания
*
* *
Bogdanos et al., 2012 BMC Gastroenterol

34. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Клинический фенотип при БК
Aссоциация с возростом больных
Bogdanos et al., 2012 BMC Gastroenterol

35. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Aссоциация с возростом больных

36. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Aссоциация с возростом больных

37. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Ассоциации с активностью заболевания
АТ к GP2 сравнимо с проявлением антитела к ASGPR при
аутоиммуном гепатите
At diagnosis
2 months on
immunosuppressive Tx
60 mo
3 mo 36 mo on Tx
on Tx 12 mo on Tx
on Tx
Rigopoulou et al., 2012 Autoimmun Rev

38. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Ассоциации с активностью заболевания
Корреляция проявления антител к GP2 с активностью
заболевания
Roggenbuck et al., 2012 Gut

39. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Патофизиологическая роль GP2
Roggenbuck et al., 2013 Advanc Clin Chem

40. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Take-home message
Заключение
GP2 – аутоантиген AТПЖ при БК
GP2 экспрессия находится в кишечнике,
трансциторный рецептор на поверхности М
клеток
IgA и IgG anti-GP2 квантифицированные с
помощью ИФА – специфичны при БК
Определение АТ к GP2 может помочь для
постановки дианоза БК

41. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Take-home message
Заключение
AТ к GP2 aссоциированы с клиническим
фенотипом при БК
Anti-GP2 IgA и IgG встречаются чаще :
у больных до 17 лет (A1),
у больных с локализацией L3,
у больных с клиническом проявлением стенозов
и с участием ануса (B2p)

42. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Cоавторы
Department of Rheumatology and Clinical Immunology, Charité
Universitätsmedizin Berlin
Lorena Martinez, Gert Hausdorf, Eugen Feist
Institute of Molecular and Clinical Immunology, Department of
Gastroenterology, University Magdeburg
Dirk Reinhold, Thomas Wex, Ulrike von Arnim, Peter Malfertheiner
Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin
Peter R. Jungblut
Division of Transplantation and Mucosal Biology, King’s College
London School of Medicine
Dimitrios Bogdanios, Alastair Forbes
Clinic of Pediatrics, Institute of Immunology, Technical University
Dresden
Martin W. Laaß, Jobst Henker, Karsten Conrad
Department of Gastroenterology, Hepatology, and Endocrinology,
Charité Universitätsmedizin Berlin
Carsten Büning

43. Roggenbuck D., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Спасибо за ваше
внимание!