1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28485
(51) G01N 33/53 (2006.01)
G01N 33/569 (2006.01)
C12N 15/10 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/0522.1
(22) 18.04.2013
(45) 15.05.2014, бюл. №5
(72) Аленова Арике Хамзовна; Абилдаев Тлеухан
Шилдебаевич; Игликова Шолпан Кенбаевна;
Бісмілда Венера Лазарькызы; Альходжаев
Саруарбек Султанбекович; Туткышбаев Серик
Оспанович
(73) Республиканскoе государственное казенное
предприятие "Национальный центр проблем
туберкулеза" Министерства здравоохранения
Республики Казахстан
(56) Асемгалиев Д., Аленова А.Х.,
Аманжолова Л.Т. Клинико-иммунологические
показатели у больных костно-суставным
туберкулезом. // Центрально-Азиатский
медицинский журнал., 2003, Т9, приложение 2,
с.73-74
(54) СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ
МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
КОСТЕЙ И СУСТАВОВ
(57) Изобретение относится к медицине, а именно к
фтизиатрии, и может быть использовано для
диагностики мультирезистентного туберкулеза
костей и суставов.
Способ диагностики туберкулеза костей и
суставов включает исследование крови пациента с
определением титра противотуберкулезных антител
путем иммуноферментного анализа, при этом
дополнительно методом MTBDR Plus (Hain
LifeScience, Gmbh) исследуют «прямой» материал -
гной, взятый пункционно из места предполагаемого
туберкулезного поражения, при значениях ПТА
превышающих средние значения у здоровых лиц
(М±m=0,164±0,01) на 0,250 и более единиц
оптической плотности, выявлении ДНК
микобактерий туберкулеза и мутаций в одном или
комбинации генов rpoB, katG, inhА,
детерминирующих МЛУ ТБ, диагностируют
мультирезистентный туберкулез костей и суставов.
Предлагаемый способ позволяет осуществить
раннюю диагностику КСТ с одновременным
определением лекарственной устойчивости (МБТ), а
также значительно повышает эффективность
диагностики, сокращая время, затрачиваемое на
верификацию диагноза, с 25-30 до 2 дней. Способ
дает возможность уже в первые дни после
поступления больного начать этиотропную терапию
с учетом чувствительности МБТ к
противотуберкулезным препаратам.
(19)KZ(13)A4(11)28485
2. 28485
2
Изобретение относится к медицине, а именно к
фтизиатрии, и может быть использовано для
диагностики мультирезистентного туберкулеза
костей и суставов.
Мультирезистентный туберкулез вызывается
микобактериями, обладающими множественной
лекарственной устойчивостью к
противотуберкулезным препаратам (МЛУ ТБ) и
представляет собой одну из сложнейших проблем
фтизиатрии в связи с эпидемиологической
опасностью и сложностью его лечения. Лечение
МЛУ ТБ требует назначения резервных препаратов
с учетом чувствительности к ним микобактерий
туберкулеза (МБТ).
Проблема усугубляется тем, что больные костно-
суставным туберкулезом (КСТ), не выделяют
мокроту, и микобактерии туберкулеза
культуральным способом определяются у них в
малом проценте случаев - около 6%. При этом такие
больные поступают в медучреждения с
запущенными формами туберкулеза, с параличами и
парезами, так как у них зачастую отсутствуют
патогномоничные признаки заболевания. Не редко
диагноз ставится только после операции, когда
появляется возможность провести гистологическое
исследование. Но и оно не всегда отражает
истинную картину, так как в силу подавления
иммунитета, длительного лечения, отсутствуют в
стеклопрепарате характерные для специфического
туберкулезного процесса клетки Пирогова -
Лангханса.
Поэтому разработка быстрых и специфичных
способов диагностики костно-суставного
мультирезистентного туберкулеза является
архиактуальной особенно в контексте роста
внелегочных форм туберкулеза.
Известен способ диагностики туберкулеза костей
и суставов, включающий рентгенографическое
исследование.
(Ракишев Г.Б., Аленова А.Х., Дюсембаев К.А. и
др. «Современные методы диагностики и лечения
костно-суставного туберкулеза». - Метод.
Рекомендации. - Алматы.-2002. c.14)
Однако разнообразие клинической картины не
всегда позволяет своевременно распознать КСТ.
Кроме того при синовиальных формах туберкулеза
на рентгенограммах деструкция костной ткани
появляется лишь через 1,5-2 года после начала
заболевания.
Известен способ диагностики туберкулеза костей
и суставов, включающий компьютерно-
томографическое исследование (КТ).
(Ракишев Г.Б., Аленова А.Х., Дюсембаев К.А. и
др. «Современные методы диагностики и лечения
костно-суставного туберкулеза». - Метод.
Рекомендации. - Алматы .-2002. c.15)
КТ является более информативным
исследованием и дает возможность обнаружить
мелкие очаги деструкции, однако и в данном случае,
патология выявляется тогда, когда деструкция
тканей уже наступила. Кроме того дорогостоящая
аппаратура не всегда имеется в наличии, особенно в
областных и районных туб. диспансерах.
Наиболее близким к заявляемому является
способ диагностики туберкулеза костей и суставов,
включающий исследование крови пациента с
определением титра противотуберкулезных антител
(ПТА) путем иммуноферментного анализа (ИФА).
(Асемгалиев Д., Аленова А.Х., Аманжолова Л.Т.
Клинико-иммунологические показатели у больных
костно-суставным туберкулезом. // Центрально-
Азиатский медицинский журнал, 2003, Т 9,
приложение 2, с.73-74.)
Однако данный способ не позволяет определять
наличие лекарственной устойчивости (МБТ), и,
своевременно назначить соответствующее лечение
резервными препаратами.
Задача изобретения - разработка способа ранней
диагностики мультирезистентного туберкулеза
костей и суставов.
Технический результат - предлагаемый способ
позволяет осуществить раннюю диагностику КСТ с
одновременным определением лекарственной
устойчивости (МБТ), а также значительно повышает
эффективность диагностики, сокращая время,
затрачиваемое на верификацию диагноза с 25-30 до
2 дней. Способ дает возможность уже в первые дни
после поступления больного начать этиотропную
терапию с учетом чувствительности МБТ к
противотуберкулезным препаратам.
Указанный технический результат достигается
тем, что в способе диагностики туберкулеза костей
и суставов, включающем исследование крови
пациента с определением титра
противотуберкулезных антител путем
иммуноферментного анализа, отличительной
особенностью, согласно изобретению, является то,
что дополнительно методом MTBDR Plus (Hain
LifeScience, Gmbh) исследуют «прямой» материал -
гной, взятый пункционно из места предполагаемого
туберкулезного поражения, при значениях ПТА
превышающих средние значения у здоровых лиц
(М±m=0,164±0,01) на 0,250 и более единиц
оптической плотности, выявлении ДНК
микобактерий туберкулеза и мутаций в одном или
комбинации генов rpoB, katG, inhА,
детерминирующих МЛУ ТБ, диагностируют
мультирезистентный туберкулез костей и суставов.
Способ осуществляется следующим образом.
Иммуноферментный анализ проводят
следующим образом: у больного из локтевой вены
утром натощак забирают 3 мл крови в
центрифужную пробирку без гепарина.
Определение противотуберкулезных антител
проводят с тест-системой "АТ-Туб-Бест-стрип"
Новосибирского ЗАО «Вектор-Бест» (предназначен
для определения суммарного пула антител Ig А, М,
G к возбудителю туберкулеза). Реакцию проводят
строго в соответствии с прилагаемыми
инструкциями на иммуноферментном анализаторе.
Методика проведения ИФА тест-системой "АТ-
Туб-Бест-стрип" следующая: метод двух стадийный.
Антигены микобактерий туберкулеза А60
сорбированы на твердую фазу плашечного формата.
После внесения испытуемых сывороток поэтапно
добавляют пероксидазный конъюгат-POD, а затем
3. 28485
3
субстратный раствор с ТМБ-красителем. Результат
учитывается фотометрически по способности
красителя поглощать световой пучок и оценивается
относительно отрицательного контроля тест-систем.
Учет результатов в плашечном формате ведут на
иммуноферментном анализаторе «des» (Италия) по
величине оптического поглощения красителем
светового пучка с длиной волны 450 нм.
MTBDR Plus (Hain LifeScience, Gmbh)
осуществляют в 3 этапа: на первом этапе
осуществляют выделение ДНК. Для чего 500 мл
деконтаминированного гноя центрифугируют
15 мин при 10000xg в центрифуге с
аэрозольнепроницаемым ротором, удаляют
супернатант, добавляют 100 мкл воды,
ресуспензируют смесь с помощью вортекса,
инактивируют при температуре 95°С 20 минут в
водяной бане и инкубируют в ультразвуковой ванне
15 минут. После чего центрифугируют при 13000xg
5 минут и переносят супернатант, содержащий ДНК,
в новую пробирку.
На втором этапе вначале приготавливают
амплификационную смесь: 35 мл PNM, 5 мкл
10×PCR буфер (содержит 15 mMMgCl2), 2 мкл
MgCl2 (25 mMMgCl2) 3 мклН2O,
0,2 мклTaqpolymerase (= 1 часть). Переносят по
45 мкл смеси в ПЦР-пробирки, добавляют по 5 мкл
выделенной ДНК и помещают их в ПЦР-машину с
применением специальной программы GenoType®
(Hot40).
На третьем этапе используют программу
P1TwinCubator® для гибридизации, для чего 20 мкл
DEN соединяют с 20 мкл амплификационной смеси
и инкубируют 5 мин при комнатной температуре.
Добавляют 1 мл. предварительно подогретого HYB
и аккуратно смешивают, затем кладут DN A-Strip®
в лунки лотка. Инкубируют 30 мин при 45°С, затем
удаляют полностью HYB. Добавляют 1 мл STR и
инкубируют 15 мин при 45ºС. Удаляют полностью
STR. Добавляют 1 мл RIN. Инкубируют 1 минуту
при комнатной температуре. Удаляют полностью
RIN. Добавляют 1 мл (10 мкл CON-C + 990 мкл
CON-D = 1 мл разведенного конъюгата)
разведенного конъюгата и инкубируют 30 мин при
комнатной температуре. Удаляют полностью
конъюгат. Добавляют 1 мл RIN. Инкубируют
1 минуту при комнатной температуре. Удаляют
полностью RIN. Процедуру проводят дважды. Далее
добавляют 1 мл дистиллированной воды и
промывают один раз водой в течении 1 мин.
Добавляют 1 мл (10 мкл SUB-C + 990 мкл SUB-D =
1 мл разведенного субстрата) разведенного
субстрата и инкубируют 2-10 мин. при комнатной
температуре. Удаляют полностью субстрат.
Останавливают реакцию промыванием дважды
водой в течение 1 мин. Переносят DNAStrip® из
лотка и высушивают его на адсорбирующей бумаге,
считывают результат.
При значениях ПТА превышающих средние
значения у здоровых лиц (М±m=0,164±0,01) на
0,250 и более единиц оптической плотности,
выявлении ДНК микобактерий туберкулеза и
мутаций в одном или комбинации генов rpoB, katG,
inhА, детерминирующих МЛУ ТБ, диагностируют
мультирезистентный туберкулез костей и суставов.
В отличии от существующих классических
методов диагностики МЛУ ТБ, позволяющих
выявить его только через 2 и более месяцев,
предлагаемый нами экспресс способ диагностики
мультирезистетного туберкулеза (МЛУТБ)
позволяет выявить мутации, ответственные за
резистентность к изониазиду и рифампицину, в
течении 2 дней и, соответственно, сразу изолировать
больных и назначить адекватную терапию. Он
активно внедряется в Казахстане и позволяет быстро
и точно выявить ДНК микобактерий туберкулеза и
установить ряд генов (rpoB, katG, inhА),
детерминирующих МЛУ ТБ. Нами впервые
предложен и апробирован способ диагностики
мультирезистентного туберкулеза костей и суставов
с использованием «прямого» патологического
материала - гноя из места поражения.
Для решения поставленной задачи нами
осуществлено исследование по предлагаемому
способу «прямого» материала - гноя, взятого
пункционно из места предполагаемого
туберкулезного поражения. Параллельно с
проведением Хайн теста исследовали уровень
противотуберкулезных антител в периферической
крови. Контролем молекулярно-генетического
метода служил культуральный метод определения
туберкулеза и МЛУТБ на жидких средах: (золотой
стандарт - Бактек MGIT 960).
Всего для этой цели обследовано 25 больных с
подозрением на: туберкулезный спондилит (15 чел.),
милиарный туберкулез (1чел.), туберкулезный
лимфаденит (9 чел.).
Результаты исследования показали, что у всех
больных имеет место туберкулез согласно данным
MTBDR Plus (Hain LifeScience, Gmbh), так как во
всех случаях имелись четкие положительные
полоски. У части этих больных клинически был
заподозрен мультирезистентный туберкулез.
При дальнейшем диагностическом исследовании
выяснилось, что у 17 больных была сохранена
чувствительность к рифампицину (R) и изониазиду
(Н), а у 8-ми - выявлен мультирезистентный
туберкулез, так как были определены
соответствующие мутации на рифампицин в гене
rpoB MUT3 S531L и на изониазид в гене katG MUT1
S315T1. Важно отметить, что средний уровень
противотуберкулезных антител у этих больных по
данным иммуноферментного анализа составил
0,498±0,05 ед.о.пл, в то время как в контроле у
здоровых лиц он был равен 0,164±0,03 ед.о.пл.
Результаты MTBDR Plus (Hain LifeScience,
Gmbh) и ИФА были получены уже на второй день
после взятия материала и свидетельствовали о
наличии туберкулеза у всех больных, в том числе
мультирезистентного процесса - у 8 обследованных.
Через 18-25 дней были получены данные
культурального исследования патологического
материала, включая данные теста на лекарственную
чувствительность (ТЛЧ), совпавшие в 100% случаев,
и подтвердившие туберкулезный процесс у всех 25
больных с внелегочным туберкулезом и
4. 28485
4
мультирезистетную форму заболевания у 8 из
обследованных пациентов.
Вышеизложенное позволяет использовать
предлагаемый способ для выявления МЛУТБ у
больных с внелегочной формой туберкулезного
процесса путем одновременного тестирования
патологического материала (гноя, пунктата)
методом MTBDR Plus (Hain LifeScience, Gmbh ) и
исследования периферической крови методом ИФА.
Своевременная экспресс диагностика тяжелейшей
формы - мультирезистенного туберкулеза позволяет
начать этиотропное лечение уже на 2-ой день после
получения результата, против 20 - 25 дней при
диагностике другими способами (золотой стандарт -
Бактек MGIT 960).
Приводим клинический пример использования
предлагаемого способа.
Больной Д., 06.07.1981г.р., обратился в
Национальный центр проблем туберкулеза 22.02.12.
с жалобами на боли в поясничном отделе
позвоночника и коленном суставе слева,
невозможность сгибания в суставе, слабость.
Анамнез заболевания: Ранее туберкулезом не
болел, туб. контакт не известен. Считает себя
больным с 2006г, когда появились боли в пояснице
и коленном суставе слева. Лечился в течение 2 лет с
диагнозом: Ревматоидный артрит коленного сустава
слева. В области коленного сустава слева появился
функционирующий свищ с гнойным отделяемым. В
январе 2012г боли в пояснице усилились, больной
перестал ходить. Консультирован у нейрохирурга,
рекомендована МРТ позвоночника. 08.02.12г
произведена МРТ позвоночника, заподозрен
туберкулезный процесс и больной направлен
вНЦПТ РК
Анамнез жизни: Болезнь Боткина, кожно-
венерические и онкологические заболевания
отрицает. Аллергии к медикаментам не отмечает.
Последние 6-месяцев гемотрансфузии не
проводились.
Общее состояние: средней тяжести, за счет
болевого синдрома. Сознание ясное, адекватен.
Кожные покровы и видимые слизистые обычной
окраски. В легких дыхание везикулярное, хрипы не
выслушиваются. Сердечные тоны ясные, ритм
правильный АД-120/80 мм.рт.ст. PS-78 уд/мин.
Язык влажный, чистый. Живот не вздут, мягкий,
безболезненный, перистальтика прослушивается.
Печень и селезенка не увеличены. Симптом
поколачивания отрицателен с обеих сторон. Стул и
мочеиспускание не нарушены.
Статус локалис: Положение вынужденное,
нуждается в постороннем уходе. В проекции L2-3
гиббус. Левая нижняя конечность атрофирована,
имеется укорочение на 2,0 см, отмечается анкилоз в
коленном суставе.
Обследован: 22.02.12г. R=грамма органов
грудной клетки: без очаговой патологии.
OAK: от 24.03.12 эритроциты - 3,7×1012
,
гемоглобин - 108г/л, лейкоциты - 5,3×109
,
эозинофилы - 2, сегментядерные - 56×109
,
лимфоциты -33×109
, моноциты - 8×109
,
СОЭ - 8-10 мм/час.
ОАМ: 23.02.12г. удельный вес - 1,025, белок -
aвs, реакция кислая, прозрачность полная, цвет с/ж,
плоский эпителий 0-2, лейкоциты 1-4 в поле зрения.
Биохимический анализ крови: от 24.02.12г.
билирубин - 12,8, АлаТ -22,8, тимоловая проба -
0,94, сахар - 5,1, общий белок - 64, мочевина - 2.3
ЭКГ: Синусовый ритм ЧСС 76 уд. в минуту.
Нормальное положение ЭОС.
Диагностика проведена по предлагаемому
способу: для верификации диагноза и выявления
наличия резистентности (МЛУТБ), взят
патологический материал из псоасабсцесса на
молекулярно-генетическое обследование (MTBDR
Plus Hain LifeScience, Gmbh) и периферическая
кровь для определения уровня
противотуберкулезных антител в крови методом
ИФА. Параллельно взят материал на
бактериологическое исследование (Бактек MGIT
960).
Через 2 дня 24.02.12 были получены данные
молекулярно - генетического исследования
патологического материала методом MTBDR Plus,
свидетельствующие об устойчивой форме
туберкулеза, так были выявлены мутации в генах
rpoB MUT3 S531L и в гене katG MUT1 S315T1. По
данным иммуноферментного анализа установлен
повышенный титр противотуберкулезных антител в
крови - 0,450 ед.о.пл.
На ВКК от 24.02.12г. на основании полученных
данных молекулярно-генетического и
иммунологического исследования было решено
начать лечение по схеме IV категории: Cs - 0.75
№43, Lfx - 0.75 №43, Pto - 0.75 №43, Cm - 0.75 №43,
PAS - 0.75 №86, дополнительно назначен глицин по
1 таб. № 43, омегаст по 1 таб. 2рхд №8, алмагель по
1 ст.л. 3р. в день № 7, инфузионная терапия: натрий
хлорид 0,9% - 400мл №3, глюкоза 5% - 400мл №3.
Данные бактериологического исследования на
Бактек MGIT 960, полученные через 25 дней
подтвердили результаты молекулярно-
генетического метода и ИФА, посев гноя из свища
коленного сустава на микобактерий туберкулеза
положительный от 04.04.12г. ТЛЧ от 16.04.12г -
устойчивость к препаратам первого ряда.
Больному 20.06.2012г произведена операция -
Псоасабсцессотомия, некрэктомия тел L2-3,
дренирование. Послеоперационный период
протекал гладко, послеоперационная рана зажила
вторичным натяжением. Гной на МТ от 31.05.12г
отрицательный №1373. Гистологическое
исследование №700-709 от 26.06.12г:
Туберкулезный спондилит. Некротический тип
воспаления. На фоне проводимой терапии
наблюдалась хорошо выраженная положительная
клинико-рентгенологическая динамика, в виде
улучшения общего состояния, уменьшения боли в
позвоночнике, вплоть до полного купирования, на
контрольной рентгенографии позвоночника - также
положительная динамика.
Больной выписан с заключительным диагнозом:
Туберкулезный спондилит L2-3, ограниченно-
деструктивная форма, активная стадия.
Туберкулезный гонит слева, активная стадия,
5. 28485
5
осложненный анкилозом. МЛУ ТБ. IV категория.
Состояние после операции - абсцессотомии,
некрэктомии тел L2-3 позвонков.
Таким образом, применение предлагаемого
способа позволило сократить время верификации
диагноза до 2 дней, а ранняя диагностика МЛУ ТБ
позволила сразу назначить больному этиотропное
лечение резервными препаратами, быстро добиться
значительного клинического улучшения, и
соответственно снизить срок стационарного
лечения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ диагностики туберкулеза костей и
суставов, включающий исследование крови
пациента с определением титра
противотуберкулезных антител путем ИФА,
отличающийся тем, что дополнительно методом
MTBDR Plus исследуют гной, взятый пункционно
непосредственно из места предполагаемого
туберкулезного поражения, и, при значениях ПТА,
превышающих средние значения у здоровых лиц
(М+т = 0,164 ± 0,01) на 0,250 и более единиц
оптической плотности, выявлении ДНК
микобактерий туберкулеза и мутаций в одном или
комбинации генов rpoB, katG, inhA,
детерминирующих множественную лекарственную
устойчивость к противотуберкулезным препаратам,
диагностируют мультирезистентный туберкулез
костей и суставов.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч