красовская

Красовская О.Э., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

Анализ
иммуноглобулинов
методами масс-
спектрометрии

2013

Лидеры продаж 2012 г.
среди лекарственных средств
№ Торговое название Молекула Ожидаемая сумма
лек. средства активного вещества продаж по итогам 9
месяцев 2012
1 Humira Моноклональное антитело $ 9,48 млрд
Adalimumab - иммунодепрессант

2 Enbrel Белок - ингибитор ФНО $ 8,37 млрд
3 Advair/Seretide
4 Remicade Моноклональное антитело $ 7,67 млрд
Infliximab - иммунодепресснт

5 Rituxan Моноклональное антитело $ 6,94 млрд
rituximab – иммунодепрессант, противоопу-
(Mab Thera) _ холевый препарат

6 Crestor
7 Lantus Белок – инсулин длительного $ 6,12 млрд
действия
8 Herceptin Моноклональное антитело $ 6,08 млрд
trastuzumab - противоопухолевый препарат

9 Avastin Моноклональное антитело $ 5,98 млрд
bevacizumab - противоопухолевый препарат

10 Lipitor
Рост доли биофармацевтических лекарственныех средств
J.D. Carroll, Editor-in-Chief, FiercePharma


Эволюция технологий
получения моноклональных антител

Мышиные Химерные Гуманизированные Человеческие

0% человеческие 60 – 70% 90 - 95% 100 %

Muromomab Rituximab Trastuzumab Adalimumab
(Ortoclone) (Rituxan) (Herceptin) (Humira)

Иммуногенность


Сложная структура

o МM ~ 150 000 Да
o Многоуровневая
Гликан
_ структура
MM аспирина – 180 Da C9H8O4
o Пост-трансляцион-
MM статина – 400 Da
_ ные модификации MM инсулина - 5 808 Da
ММ IgG 1 - 149 000 Da
o Гетерогенность
C6450H9916N1714O2023S38


Естественная гетерогенность
гликоформ моноклональных антител
ВЭЖХ-профиль олигосахаридов Библиотека нейтральных двухантенных
естественного IgG Fc олигосахаридов человеческого IgG Fc

Профиль гликоформ рекомби-
нантного IgG из клеток CHO F- фукоза, G - галактоза, GN – ацетилглюкозамин, M - манноза


Искусственное изменение профиля
гликоформ улучшает эффективность
mAb
mAb (13F6)
против
гликопротеина
вируса Эбола

ED50

11 µg
3 µg
33 µg

Тип гликозилирования Fc-фрагмента mAb существенно влияет
на антивирусную защиту.
L.Zeitlin et al. PNAS 20 (2011) 108: 20690-20694


Другие причины
гетерогенности моноклональных антител
Влияние на активность mAb:
- Циклическая форма N-концевого глутамина (ата)

Glu
Gln N-концевой пироGlu

Влияют на стабильность mAb:

- Окисление (Met252 Met-cульфоксид)
- Гликозилирование лизинов Asn
297

- Дезаминирование
Без С-концевых лизинов
- Asn315 Asp 1 С-концевой лизин
Asn384 Asp 2 С-концевых лизина
Asn389 Asp
- Агрегация
- Протеолитическое удаление С-концевых лизинов


Ожидаемая гетерогенность из-за С-концевого лизина

Неприемлемая гетерогенность
Фрагментация

Дезаминирование


Европейское медицинское агенство

EMEA/CHMP/BWP/157653/2007
18 декабря 2008

Руководство по разработке, производству, определению параметров и
подробному описанию моноклональных антител и родственных продуктов

4.3 Определение параметров моноклональных антител
4.3.1. Физико-химические параметры
Молекулярная масса
Профиль изоформ
Следует определить углеводороды (нейтральные сахара, аминосахара, сиаловые кислоты),
профиль олигосахаридов, структуру углеводных цепей, места гликозилирования.
Необходимо подтвердить наличие или отсутствие дополнительных олигосахаридов.
Особое внимание следует уделить степени специфического гликозилирования.
4.3.4. Чистота, примеси, контаминация
Качественное и количественное определение примесей (модификации С- и N-концов,
дезаминирование, окисление, фрагментация, и т.д.).


13. КОНЕЧНЫЙ ПОЛУФАБРИКАТ
13.1. Моноклональные антитела
Необходимо дать тщательную характеристику очищенных моноклональных антител…
Необходимо определить следующие параметры: класс, подкласс и строение лёгких цепей,
точки гликозилирования, целостность молекулы, микрогетерогенность, молекулярную массу,
N- и С-концевые последовательности…Достаточная информация для адекватной характе-
ристики… особенно генно-инженерных и гуманизированных антител может быть получена
путём пептидного картирования или установления аминокислотной последовательности
13.2. Чистота Необходимо представить данные о контаминантах….
14.2. Рутинный контроль серии
14.2.1. Подлинность (Идентичность)
Необходимо подтвердить подлинность продукта каждой серии… Генно-инженерные
антитела требуют постоянного подтверждения пептидной последовательности с помощью
адекватных методов.
14.2.2. Чистота
Необходимо определять чистоту каждой серии, показатели чистоты должны находиться в
установленных пределах. Особое внимание следует уделять определению степени
агрегации или молекулярной фрагментации иммуноглобулина.


Что означает контроль чистоты серии?

Разделение с помощью
ВЭЖХ позволяет
идентифицировать
продукты путём сравнения
со стандартами.
Наличие неожиданных
пиков заставляет прово-
дить дальнейший масс-
спектрометрический анализ
с целью идентификации.
Время


Масс-спектрометрия (MS) –
аналитический метод измерения масс заряженных молекул

• Точность – ppm – миллионные доли (parts per million)
5ppm = 0,0005%
ppb - миллиардные доли (parts per billion) -
в сложных биологических образцах
-15 -18
• Чувствительность – фемтомоли (10 М) и аттомоли (10 М) _
милли -3, микро -6, нано –9, пико -12, фемто -15, атто –18
• Воспроизводимость – от хорошей до отличной


Новое поколение
гибридных квадруполь-
времяпролётных
масс-спектрометров
- Широкий диапазон масс
QTOF

- Высокое разрешение
- Высокая чувствительность
Q
“Мягкая” - Количественный анализ
неразрушающая
ионизация - Быстрота анализа
электроспреем
Аналитический
квадруполь

Камера для Детектор
фрагментации

Квадруполь масс-фильтр

Квадруполь-времяпролётная масс-спектрометрия (QTOF-MS)
– стратегический метод анализа гетерогенности
терапевтических рекомбинантных mAbs
Анализ интактных белков независимо от их размера
_ Не требует дополнительной обработки протеолитическими
_ ферментами
Контроль серии
- Идентичность - точное значение массы IgG и субъединиц
- Чистота - примеси, денатурация
- Безопасность и эффективность – профиль гликоформ
Подробная характеристика mAb
- Идентичность по фингерпринту – MS и MS/MS
- Денатурация - аминокислотная последовательность N- и
С-концов
Автоматический отчёт по заданным параметрам
Метод официально включен в перечень методов
_ контроля качества терапевтических mAbs


Масс-спектр интактного
моноклонального антитела

Изотопное
распределение

Y. Lyubarskaya et al, Anal Biochem 348 (2006) 24-39


Проверка идентичности
субъединицы IgG

• Изотопное распределение
• Точность < 1ppm

• Быстро обнаружено
Clone B _ изменение
• Без обработки
_ трипсином


Анализ MS-профиля
гликоформ интактного IgG

Быстрая
проверка профиля
интактного IgG
позволяет
оптимизировать
производственный
процесс

Определение
аберрантных форм:
наличие галактозы
связано с
иммуногенностью


Проверка стабильности

Быстрая идентификация продуктов денатурации


Разные механизмы денатурации mAbs
Quanzhou L. et al, JBC 2011, 286, No 28: 25134-25144

Фактор Химические Локализация Условия хранения
модификации
Температурны (агрегатное
Дезаминирование Asn Tемпература
й состояние) хранения
Агрегаты и фрагменты +2 – 8 оС;
Не замораживать

Химический Окисление В защищённом
Met, Trp, His от света месте;
Не встряхивать
(пузырьки воздуха)
Механический Окисление Met/Trp Не встряхивать
при
Агрегаты приготовлении
раствора


BioPharma Compass
Превратить данные в информацию помогает программное
обеспечение, которое должно быть простым, автоматическим,
с предоставлением отчётов в различных форматах.

Доля выявленных последовательностей Быстрый контроль качества

Аннотация пиков хроматограммы Массы белков


Быстрый просмотр
результатов

• Выделение цветом образцов,
не удовлетворяющих критериям
• Связь этой страницы
с индивидуальными
отчётами Чистота
Общий отчёт в табличном виде
Гликоформы

• Сравнение образца со ст.
Отчёт индивидуального • Гликоформы
образца • Чистота


Анализ последовательности
по данным пептидного картирования (Bottom-up)
Susana Cristobal

Пептиды в рез-
Интактный белок те протеолиза MS

2DE

Компьютерный
поиск

Теоретический MS
Теоретические
ДНК-база База данных пептиды протеолиза
данных сиквенса белков

Не 100% перекрывание


Подтверждение аминокислотной
последовательности по пептидным фрагментам

Поиск по базам данных пептидов,
на основе точного значения массы
и времени удерживания (ВЭЖХ)

Подтверждение аминокислотной
последовательности -
94% перекрывание после одной
обработки протеазой.
Возможны форматы MS и MS/MS


Детальный MS/MS анализ
интактных150 кДа антител
с использованием ETD-фрагментации

Определение аминокислотной последовательности -
_ секвенированием интактных белков
_ (АнализTop-down)
Определение N- и C- концов
Посттрансляционные модификации

Масс-спектрометр MaXis 4G


Новое поколение
квадруполь-времяпролётных масс-спектрометров

ISСID:
Фрагментация CID: фрагментация
соударением _ соударением
внутри источника Рвутся наиболее слабые
связи (PTMs)

Аналитический
квадруполь

Камера для Детектор

ETD: фрагментация при переносе электрона
Фрагментация аминокислотной последовательности.
Сохраняются PTMs


Определение аминокислотной
последовательности с помощью MaXis-ETD
CID - фрагментация

ETD - фрагментация

Пептид CID ETD
Мелкие пептиды Да Нет
Крупные пептиды Нет Да
Наличие основных остатков Нет Да
Модификации (PTM) Нет Да


Анализ С- и N-концов
Тяже-
лые
ионы
Лёгкие ионы

Тяжелые ионы

C-концевая (21)
последовательность

Последовательность
Tsybin et al, HUPO 2010 между 81 и 124 аминокислотами с С-конца


Возможности
различных масс-спектрометров

• Подлинность продукта

MaXis 4G • Примеси

ESI Q-TOF • Профиль гликоформ
• 100% аминокислотная _
_ последовательность (15-60 мин)

UltrafleXtreme • Секвенирование < 1 минуты
MALDI TOF/TOF • Автоматическое определение
_структуры углеводов - минуты

AmaZon speed • Локализация модификаций
ESI Trap & ETD


Масс-спектрометры Bruker
на биофармацевтических производствах в Европе


Масс-спектрометры Bruker
на биофармацевтических производствах в США и Канаде


Аналитические методы в лабораториях фармпроизводств

Метод 1990 1998 2000 2006
ВЭЖХ
(с УФ- и флуорес- 75% 50-60% 20% 2%
центной
детекцией)
ГХ/MС 12% 3% 2% 0

ВЭЖХ-MС/MС 3% 40-50% 60-75% 98%


СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !

Наш телефон: 495 258 39 47
Моб.: 8 903 220 20 83


Немного терминологии

Биофармацевтические Препараты пограничные и
препараты (400+) небиофармацевтические

Продукты генетической Синтетические -
инженерии (111):
rDNA – белки _ пептиды
rDNA – моноклональные
Антисмысловые iRNA
_ антитела (mAbs)
Антибиотики
Коллаген
Нуклеозиды
Продукты нерекомби-
нантной ДНК (300+): Гиалуроновая к-та
Не- rDNA mAbs
Растительные
Вакцины
Токсины _ препараты
Ферменты
……………..
Компоненты крови
- человека и животных

R.A. Rader - президент Института Биотехнологической информации, США
BioExecutive International, 2005, 60-65


Белковый полиморфизм
ПРИЧИНЫ:
Полилокусность (40 генов в геноме человека кодируют миозиновые белки)
Полиаллелизм (SNPs)
Существование множественных промоторов
Альтернативный сплайсинг, как минимум,15% генов человека
Редактирование мРНК
Постсинтетические модификации:
- гликозилирование - образование дисульфидных связей
- фосфорилирование - удаление N-концевого метионина
- ацетилирование - удаление сигнального пептида
- метилирование
Образование олигомеров (гомо- и гетерополимров)
Изменение третичной структуры белков (шапероны)
Ограниченный протеолиз


Части масс-спектрометра

Ионизация Разделение Детекция ионов
Источник ионизации ионов Масс-анализатор
Детектор
Matrix-Assisted Laser
desorption/ Ionisation (MALDI) Time-Of-Flight (TOF) Electron Multiplier

Electrospray Ionisation (ESI) Quadrupole Multichannel plate
Electron Transfer Ionisation (ETD) Ion Trap
Chemical Ionisation (CI)
Удаление/добавление протона (-ов)
M + (Matrix)-H MH+ + (Matrix)-


Производственный контроль серий и
подробный анализ на уровне белков

Модели ESI-Q TOF производства Bruker

разрешение

разрешение разрешение


Квадрупольный анализатор

Детектируется ион со стабильной траекторией

Детектор

Источник
ионов


Разрешение масс-спектрометров

783.455
QTOF

784.465

785.475

783.6
Q


ETD – electron transfer dissociation
мягкая фрагментация пептидной связи
без повреждения модификаций

Накапливание ионов при
электроспрее

Изоляция ионов-
предшественников

Накапливание анионов для
Транспорт катионов
взаимодействия

ETD –фрагментация

Транспорт
Сканирование
анионов
ETD – альтернативный метод
фрагментации пептидов для
исследования сайтов фосфо-
рилирования, гликозилирования,
метилирования, ацетилирова-
ния, сульфатирования


Сравнение
методов
Collision Induced Dissociation - CID
• При столкновении с Ar или He
• Рвутся наиболее слабые связи (PTMs)

• Тип ионов - b & y

Electron Transfer Dissociation - ETD
• При переносе электрона
• Фрагментация аминокислотной после-
_довательности в разных местах
• Сохраняются PTMs
• Тип ионов - c & z


Схема ETD-фрагментации


Анализ тяжёлых цепей IgG
после восстановления и алкилирования
Intens. +MS, 4.6-4.8min, Deconvoluted (MaxEnt)

*
3000 *
* Артефакты + 57Da
57

51124.9852
2000

*
51068.7806
1000

0
51000 51100 51200 51300 51400 51500 51600 m/z

qTOF способны анализировать интактные белки без использования реакций
_ восстановления и алкилирования
Восстановление и алкилирование может привести к появлению артефактов


Анализ гликопептида
с помощью ETD-фрагментации
Фрагменты образуются при разрыве пептидных связей
[M+2H]2+

1301.6
Обработка трипсином IgG3

2603.2
z9 z8 z7 z6 z5 z4 z3 Side chain cleavage of N-glyc Asn
Glu-Gln-Gln-Phe-Asn-Ser-Thr-Phe-Arg CH3
C=O
NH
z9.

2560.1 2587.1
x5

z4. z5.
z3. As
1099.4
n z8.
408.2

z6. z7.

2458.0
2330.0
2201.9
708.4
495.2

1041.4

2054.9
687.5

927.4

2403.1
516.3

400 800 1200 1600 2000 2400 m/z
Manfred Wuhrer Leiden University Medical Center


Использование qTOF MS/MS для
фрагментации и анализа N-гликопептидов

Низкие энергии соударения Высокие энергии соударения

N-ацетилглюкозамин Манноза фукоза ксилоза

M.Wuhrer et al Glycoproteomics based on tandem mass spectrometry of glycopeptides J Chrom B 2007, 849 115-1289


Определение относительного количества изоформ

Интенсивность

Множественные гликаны
на одном пептиде
1 2 3 4 5 11

100 % 74 % 69 % 29 % 28 % 3%

Автоматическое определение, идентификация и относительная количественная оценка


Количественная оценка гликоформ
человеческого IgG в сравнении со стандартом


Программное обеспечение

- Compass – управление наиболее распространёнными системам HPLC и U-HPLC

- Compass/ Data Analysis SW, включая:
SmartFormula (3D) для автоматического определения формулы
QuantAnalysis для количественных определений

LibrarySearch модуль для поиска спектров MS, MS/MS
c оптимальным алгоритмом

- ProfileAnalysis – проведение статистической обработки данных LC-MS и
сравнительного анализа

- TargetAnalysis – для одновременного скрининга множества (сотен) соединений

- ProteinScape - для поиска гликанов (полисахаридов) в базе данных


MaXis impact
квадруполь-времяпролётный
масс-спектрометр высокого разрешения

• Большая скорость анализа при совмес-
_тимости с разными системами ВЭЖХ
_(50 спектров/сек)
• Широкий диапазон масс 20 – 40 000 m/z
_от низкомолекулярных соединений до __
_интактных белков
• Одновременный анализ широко представ-
_ленных соединений и веществ в следовых
_количествах в сложных образцах (5 порядков)
• Определение брутто-формулы соединения
• Качественные и количественные
_результаты при одной постановке ВЭЖХ-МС
• Разрешение 40 000; точность 1 ppm (внутр.
_ калибровка)


TargetAnalysis

Программное обеспечение для скрининга большого числа метаболитов

• Cкрининг множества
_мишеней одновременно
_в одной постановке

• Число мишеней
_ не ограничено (возможность _
_ отслеживать сотни соединений)

• Количественная оценка

• Возможность создавать
_собственную базу данных

красовская

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Viewers also liked

Viewers also liked (14)

Similar to красовская

Similar to красовская (20)

More from pasteurorg

More from pasteurorg (9)

красовская