1. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Супрессорные клетки
миелоидного происхождения
(Myeloid-derived suppressor cells,
MDSC)
И.В. Лядова
IV Школа по клинической иммунологии,
Пушкинские Горы, 27 января – 2 февраля
2013

2. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
С момента открытия опухолевых антигенов и
противоопухолевого иммунитета иммунологи
пытаются понять, почему противоопухолевый
иммунитет оказывается неэффективным и не
подавляет роста опухоли.
Одним из объяснений является образование в
организме большого количества миелоидных
клеток, подавляющих противоопухолевый Т-
клеточный иммунитет.
Состав и фенотип
Механизмы супрессии Т-клеточного ответа
Факторы, стимулирующие образование
MDSC при туберкулезе

3. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Схема
кроветворения
Моноцит Базофил Лимфоцит
Нейтрофил Эозинофил

4. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC: общая характеристика
MDSC:
Большая и гетерогенная группа миелоидных клеток,
состоящая из незрелых макрофагов (моноцитов),
гранулоцитов и дендритных клеток, а также
миелоидных клеток, находящихся на более ранних
стадиях дифференцировки (промиелоцитов,
миелоцитов, метамиелоцитов, незрелых ДК).

5. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC: общие свойства
Основные характеристики, общие для всех MDSC,
позволяющие объединять их в одну общую группу:
 Миелоидные (фенотип)
 Незрелые
 Супрессорные
Содержание MDSC невелико в норме и значительно
увеличивается при различных патологических
состояниях, сопровождающихся хроническим
воспалением и/или иммуносупрессией:
 Новообразования
 Трансплантационная толерантность
 Травмы
 Некоторые инфекции

6. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC: первые исследования
Уже в 1980-х годах отмечена корреляция между
накоплением незрелых миелоидных клеток и
супрессией иммунного ответа.
Young M. et al., 1987. Клетки КМ мышей с карциномой
легких Льюис супрессируют пролиферацию Т
лимфоцитов.
Young R. et al., 1997. Карцинома шеи и головы. В ткани
опухоли содержатся клетки CD34+ (“естественные
супрессоры”), которые оказывают супрессорное
воздействие на противоопухолевый Т клеточный
иммунитет и способны дифференцироваться в
моноциты (IFN-, TNF-).

7. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Фенотип MDSC: экспрессия CD11b и Gr-1
CD11b M интегрин,
экспрессирован на моноцитах, гранулоцитах,
макрофагах, NK клетках
Gr-1 антитела клона RB6-8C5 (1987)
антиген присутствует на двух молекулах
Ly-6G – гранулоциты
Ly-6C - моноциты, гранулоциты
(экспрессия увеличивается по мере созревания клеток)
MDSC Моноциты Гранулоциты
Ly-6G + - ++
Ly-6C + + /++ +
Фенотип CD11b+Gr-1+ CD11b+Gr-1+ CD11b+Gr-1+
Фенотип CD11b+ CD11b+ CD11b+
Gr-1int Gr-1low Gr-1hi

8. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Фенотип MDSC: экспрессия CD11b и Gr-1
CD11b+ Gr-1+
CD11b+ Gr-1int

9. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по+клинической иммунологии, 2013г.
Накопление клеток CD11b Gr-1 при опухолях
+
Модель: мыши C57BL/6, AKR; Т-лимфомы EL-4, EG7, BW-Sp3
CD11b+Gr-1+
Youn et al.,J Immunol 2008; 181:5791

10. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Накопление клеток CD11b+Gr-1+ при опухолях
Модель: мыши C57BL/6, карцинома легких Льюиса CD11b+Gr-1+
Контроль
Df
Srivatsava et al., PLOS ONE, 2012, 7(7): e40677.

11. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа + клинической иммунологии, 2013г.
по
Накопление клеток CD11b Gr-1 при хроническом
+
воспалительном процессе
Модель: мыши, многократное введение Porphyromonas gingivalis
CD11b+Gr-1+
Контроль P. gingivalis
Селезенка
Gr-1
Лимф. узлы
CD11b
Ezernitchi et al., The Journal of Immunology, 2006, 177: 4763–4772.

12. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Накопление клеток CD11b+Gr-1+ при инфекции T. cruzi
Модель: мыши Sv 129, инфекция T. cruzi
CD11b+Gr-1+
Контроль T. cruzi
Goni et al., Intern. Immunol. 2002, 14: 1125

13. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Накопление клеток CD11b Gr-1 при травме
+ +
Модель: мыши C57BL/6, лапаротомия
CD11b+Gr-1+
Makarenkova et al., The Journal of Immunology, 2006, 176: 2085–2094

14. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по+клинической иммунологии, 2013г.
Накопление клеток CD11b Gr-1 при старении
+
Модель: мыши BALB/c в возрасте 3 и 20 мес. CD11b+Gr-1+Ly-6Gint
Молодые Старые Молодые Старые
(3 мес) (20 мес) (3 мес) (20 мес)
CD11b Ly-6G Селезенка
1% 8%
3% 9%
30% 80% 9% 9% К. мозг
Ly-6C
Gr-1
Enioutina et al., The Journal of Immunology, 2011, 186: 697–707.

15. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Общие свойства MDSC
 Гетерогенность
• Разные популяции
Моноцитарные
Гранулоцитарные
Незрелые предшественники
+
• Разная степень зрелости
 Низкая степень зрелости
Df

16. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа-по клинической иммунологии, 2013г.
Две популяции MDSC гранулоцитарная и
моноцитарная
Модель: мыши C57BL/6, AKR;
Т-лимфома EG7, BW-Sp3
CD11b
GR-1hi
PMN
GR-1low
MNC
Movahedi et al., Blood. 2008;111:4233-4244

17. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Фенотип MDSC: другие маркеры
Моноцит. Гранулоц.
Gr-1 int hi
Ly-6G -/low hi
F4-80 ++ +/-
CD115 + -
CD49d +++ -
CD31 + -
CD62L ++ ++
CD44 +++ +++
IL-4Ra + +
CD11c - -
Sca/c-kit - -

18. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по +
клинической иммунологии, 2013г.
Фенотип MDSC: Gr-1 CD115 F4-80 + +
Модель: мыши BALB/c, карцинома кишечника MCA26
Гейтированы клетки Gr-1+:
Контроль Опухоль CD11b+Gr-1+
CD115, F4-80
2% 5%
CD115 Селезенка
9% 24%
К. мозг
F4-80
Huang et al., (Cancer Res 2006; 66(2): 1123-31

19. Морфология ядер: гетерогенность и низкая степень
Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
дифференцировки MDSC
Модель: мыши C57BL/6, иммуносупрессия, вызванная введением циклофосфамида
(клетки селезенки)
Контроль Циклофосфамид
Бласты,
незрелые гранулоциты и моноциты
Angulo et al., Blood. 2000;95:212-220

20. MDSC могут «дозревать» in vitro, например,
Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
в присутствии GM-CSF
Ly-6GintCD11c-F4/80- Ly-6GlowCD11c+F4/80+
Gr-1
Модель: мыши
C57BL/6, AKR; Т-
лимфома EG7, BW-Sp3
GM-CSF
CD11c
IL-4 + GM-CSF
TNF-α + GM-CSF
(Bronte, 2000; Li, 2004).
F4/80
MO-MDSC
CD11b Youn et al.,J Immunol 2008; 181:5791

21. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Идентификация MDSC у людей
MDSC у людей
 Экспрессия CD11b
 Экспрессия CD33 (общий маркер миелоидных клеток)
 Отсутствие экспрессии маркеров зрелых миелоидных и
лимфоидных клеток
В цельной крови:
CD11b+ CD33 + CD3 - CD19 - CD56 - HLA-DR -
В моноцитарной фракции крови:
Моноцитарные CD11b + CD33 + CD14 + HLA-DR -
Гранулоцитарные CD11b + CD33 + CD14-(CD15 +)

22. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
+ + -
CD33 CD11b CD14 клетки у онкологических больных
Пациенты с раковыми образованиями шеи и головы (анализ
мононуклеаров крови)
Здоровый Больной
Мононуклеары (фиколл)
CD11b+CD14-CD33+
CD11b
CD14
FSC
CD33
Corzo et al., The Journal of Immunology, 2009, 182: 5693–5701

23. Лядова И.В.,IV CD14 HLA-DR клетки у больных с
CD33 Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
+ + -
трансплантатом почки
Больные: Пациенты с трансплантатом почки, Мононуклеары (фиколл)
хроническими заболеваниями почек, сквамозным CD33+HLA-DR-
раком кожи
Здоровый Пациент 1 Пациент 2 Пациент3
Hock et al., Nephrol Dial Transplant (2012) 27: 402–410

24. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической почки.
MDSC у пациента с трансплантатом иммунологии, 2013г.
Морфология ядер
Фракция низкой плотности Клетки, обогащенные MDSC
Пациент с трансплантатом почки и повышенным содержанием клеток
MDSC CD14-. Цитоспин (клеточная фракция низкой плотности, May-
Grunwald-Giemsa).

25. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Общие свойства MDSC
Фенотип (CD11b+Gr-1+; CD11b+CD33+CD14-/HLA-DR-).
Низкая степень зрелости.
Гетерогенность по популяционному составу и степени
зрелости.
Потенциальная способность к дифференцировке (МО-
MDSC).
Отсутствие в норме и накопление в больших
количествах при разных патологических состояниях.
Способность к супрессии Т-клеточного ответа
Df

26. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC супрессируют ответ Т лимфоцитов
Эффекты:
Подавление пролиферации
Подавление продукции IFN-γ, IL-2
Снижение экспрессии TCR
Индукция апоптоза Т-клеток
Активация Treg
Подавление активности NK клеток

27. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Оценка пролиферации in vitro с использованием CFSE
CFDA‐SE (Carboxyfluorescein
diacetate succinimidyl ester)
R‐NH2 +
активированныеT клетки‐CFSE
число клеток
27
флуоресценция CFSE

28. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC: Подавление пролиферации Т-лимфоцитов
Модель: мыши BALB/c, C57BL/6, 3-кратное введение LPS (толерантность)
Оценка пролиферации – метод дилюции CFSE
Т клетки (CFSE) + анти - CD3/CD28
Т клетки (CFSE) + анти-CD3/CD28 + CD11b+
CD11b : T = 4 : 1
CD11b : T = 1 : 1
CD11b : T = 1 : 8
De Wilde et al., American Journal of Transplantation 2009; 9: 2034–2047

29. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC: подавление продукции IFN-
Модель: мыши BALB/c, C57BL/6, 3-кратное введение LPS (толерантность)
Выявление ИФНг- продуцирующих клеток методов внутриклеточного
окрашивания
Т клетки + Т клетки +
Т клетки
анти- CD3/CD28 анти- CD3/CD28 +
CD11b+
De Wilde et al., American Journal of Transplantation 2009; 9: 2034–2047

30. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC: подавление продукции IFN-
Модель: мыши BALB/c, C57BL/6, 3-кратное введение LPS (толерантность)
Анализ продукции ИФН-г методом ИФА
De Wilde et al., American Journal of Transplantation 2009; 9: 2034–2047

31. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
MDSC: подавление активации Т лимфоцитов
Модель: мыши BALB/c, C57BL/6, 3-кратное введение LPS (толерантность)
Анализ активации Т-лимфоцитов (CD25, CD69, CD44)
Т клетки
без стимула
Т клетки +
анти- CD3/CD28
Т клетки +
анти- CD3/CD28 +
CD11b+
De Wilde et al., American Journal of Transplantation 2009; 9: 2034–2047

32. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Механизмы супрессии
 Продукция низкомолекулярных соединений,
влияющих на активность и жизнеспособность Т
клеток
• NO
• АФК
• Пероксинитрит
 Создание в среде недостатка аминокислот,
незаменимых для Т лимфоцитов (L-аргинина,
цистеина)

33. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Механизмы супрессии: NO
NO (iNOS, MO-MDSC)
• Ингибиция Jak3/STAT5
(IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-15R)
• Окисление TCR
• Снижение экспрессии MHC класса II
• Индукция апоптоза
• Ингибиторы iNOS (L-NMMA) - увеличение Т-ответа

34. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Механизмы супрессии: АФК, пероксинитрит
•АФК (O2-, H2O2, NOX2, аргиназа, PMN-MDSC)
• Окисление TCR
• Апоптоз
• Подавление дифференцировки
•Пероксинитрит (ONOO-)
• Нитрование и нитрозилирование TCR, CD8, MHC,
разрушение комплекса TCR-CD3 (цис, мет, три, тир)
• Нарушение распознавания антигена и активации Т
клеток
• Высокие уровни пероксинитрита в местах скопления
воспалительных клеток и MDSC

35. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Механизмы супрессии: аргиназа
Аргиназа 1 (PMN-MDSC, MO-MDSC)
совместно с транспортером катионных АК CAT-2B
создает дефицит аргинина в микроокружении клетки
• Снижение экспрессии TCR
• Снижение экспрессии cyclin D3
• Остановка клеточного цикла (G0/G1)
• Ингибиторы аргиназы - MDSC,  роста опухоли
• Истощение аргинина – имитация эффекта MDSC

36. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Механизмы супрессии: цистеиновое голодание
Цистеиновое/цистиновое голодание
• Цистеин необходим для пролиферации Т клеток
• АПК экспортируют цистеин и обеспечивают его
наличие в микроокружении Т клеток
(«фидерный» эффект)
• MDSC потребляют цистин, не обеспечивая
образования цистеина и приводя к
цистеиновому/цистиновому голоданию Т клеток
(эффект частично снимается β2-МЕ)
цистин цистин
цистеин MDSC
Srivatsava et al., 2010

37. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Другие механизмы супрессии
•IL-10, TGF-β
• М2
• Th2
• iTreg
• Блок цитотоксической активности
•Гемоксидаза (HO-1)
• Шеддинг CD62L, необходимого для нормального
развития иммунного ответа (модель и опыты)

38. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Механизмы супрессии
Gabrilovich, Nagaraj, 2009

39. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Особенности супрессорной активности MDSC
• Межклеточный контакт
(отмена супрессии при ко-культивировании MDSC и
Т-лимфоцитов в плэйтах Transwell):
• (Bingisser et al., JI 1998)
• Контакты не нужны (Highfill et al., 2010)
• Супрессия носит неспецифический характер
• In vitro: ConA, PMA/Ion, CD3/CD28
• In vivo: супрессия антиген-специфична?
(Kutsmatzev et al., 2005; Willimsky et al., 2007).

40. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Особенности супрессорной активности MDSC
• Соотношение MDSC:T лимфоциты,
необходимое для супрессии: 1 : 1 или выше.
Насколько это физиологично?
• De Wilde et al., 2009 (ЛПС) 8:1, 4:1, 1:1
• Highfill et al., 2010 (in vitro generated) 1:10 (50-60%)
• Ezernitchi et al., 2006 (P. gingivalis) 2:1
соотношение,
наблюдаемое в селезенке
= 2:1 (35-45% и 13-22%)
• Enouitina et al., 2011 (aged mice) 0,25:1, 0,5:1, 1:1

41. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Регуляция образования и активности MDSC
Накопление большого количества клеток MDSC при различных
патологических состояниях контролируется на разных уровнях:
 Стимуляция образования MDSC из ГП предшественников
 Подавление дифференцировки MDSC в зрелые клетки
 Стимуляция миграции в периферические органы/ткани
 Активация супрессорной функции

42. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Образование MDSC
GM-CSF, G-CSF, IL-6, IL-10, VEGF
(клетки опухоли,
строма КМ в условиях хр. воспаления)
C/EBPβ
STAT3
 C/EBP α
Bcl-xL, c-myc, survivin, cyclin D1 Экстренный гемопоэз
Стимуляция пролиферации,
Защита от апоптоза
Подавление дифференцировки
Транскрипция NOX2 (p47phox, gp91phox)
Образование ROS подавление дифференцировки
Снижение экспрессии PKCβII
Нарушение дифференцировки ДК Ингибиция Jak2/STAT3 стимулирует
образование ДК, оказывает
противоопухолевый эффект (JSI-
Синтез белков острой фазы
124, cucurbitacin I)
Активация STAT3

43. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Активация MDSC
IFN-, IL-1β
STAT1
IFN-,
iNOS, Arginase I IL-1β
STAT1
IL-4, IL-13
STAT6
Arginase I •Нейтрализация IFN-  - потеря
супрессорной активности
•STAT1-/- : MDSC не обладают
супрессорной активностью

44. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии,и
2-сигнальная модель регуляции образования 2013г.
активности MDSC
GM-CSF, IL-6…
STAT3 IFN- , IL1β, PGE
MDSC
Экспансия Активация
MC
iMC MDSC
незрелые супрессорные
миелоидные миелоидные
клетки клетки
Острое Хроническое
воспаление воспаление

45. Лядова И.В.,IV Всероссийская школа по клинической иммунологии,и
2-сигнальная модель регуляции образования 2013г.
активности MDSC
Gavrilovitch et al