Download luận văn đồ án tốt nghiệp với đề tài: Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH DƯỢC
MÃ SỐ: 52120401
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN
GÂY BỆNH TRỨNG CÁ
Probionibacterium acnes CỦA CAO CHIẾT TỪ
CÂY TRỨNG CÁ (Muntingia calabura L.)
Cần Thơ, năm 2017
SINH VIÊN THỰC HIỆN
LÊ PHƯỢNG HIỆP
MSSV: 12D720401113
LỚP: ĐH DƯỢC 7B
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. DƯƠNG THỊ BÍCH

2. i
LỜI CẢM ƠN
Qua quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, em đã học hỏi được rất nhiều kiến
thức, kỹ năng và kinh nghiệm quý báu từ quý Thầy, Cô và Bạn bè. Em xin gửi lời cảm
ơn sâu sắc đến:
Cô Ths. Dương Thị Bích - người hướng dẫn đề tài đã tận tình giúp đỡ, đóng
góp ý kiến cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Quý Thầy Cô Bộ môn Vi Sinh-Ký
Sinh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập
và làm việc tại trường.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Ths. Đỗ Văn Mãi, Thầy Nguyễn Văn
Hiền, Cô Quách Thị Thu Hằng, Cô Nghị Ngô Lan Vi đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và
truyền đạt những kinh nghiệm quý giá để em thực hiện tốt bài khóa luận.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp gồm Thầy
PGS. TS Trần Công Luận, Thầy PGS. TS Nguyễn Văn Bá, Thầy Ths. Đỗ Văn Mãi đã
nhận xét và đưa ra ý kiến giúp em hoàn thiện bài khóa luận.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cha mẹ và những người thân yêu đã
động viên, tiếp sức em trong suốt quá trình học tập.
Cảm ơn các bạn trong tập thể lớp ĐH Dược 7B và tất cả mọi người đã giúp đỡ
và đóng góp ý kiến cho mình trong suốt quá trình học tập.
Cuối lời, xin kính chúc quý Thầy, Cô, Cha, Mẹ, Anh, Chị và các bạn luôn khoẻ
mạnh và thành công trong cuộc sống.
Chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 7 tháng 7 năm 2017
Lê Phượng Hiệp

3. ii
LỜI CAM KẾT
Em xin cam đoan đây là nghiên cứu của bản thân tôi. Các số liệu, kết quả trình bày
trong bài khóa luận này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ khóa luận
nào trước đây.
Ngày 14 tháng 6 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Lê Phượng Hiệp

4. iii
TÓM TẮT NỘI DUNG
Kháng sinh tổng hợp được sử dụng trong điều trị bệnh trứng cá hiện nay thường dẫn
đến khả năng đề kháng thuốc. Trong những năm gần đây, cây Trứng cá (Muntingia
calabura L.) được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng
kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hoá cao. Vì vậy với mục tiêu đề tài là đánh giá và
so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes từ các bộ phận cây Trứng cá rất
cần thiết. Lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được chiết
xuất bằng hệ thống đun hồi lưu với dung môi ethanol 96 % thu được bốn loại cao chiết. Khả
năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Trứng cá được khảo sát bằng phương pháp khuếch
tán trên giếng thạch trên dòng vi khuẩn P. acnes 134N lưu trũ tại phòng thí nghiệm Vi sinh
trường Đại học Tây Đô. Kết quả thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tất cả các loại
cao chiết từ bộ phận cây Trứng cá đều có hoạt tính ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium
acnes 134N. Qua so sánh kích thước khoảng vô khuẩn, cao chiết từ lá Trứng cá có khả năng
ức chế dòng vi khuẩn P. acnes 134N cao nhất trong bốn loại cao khảo sát, ở nồng độ 200
mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082
mm. Giá trị MIC của cao chiết từ lá Trứng cá đối với dòng vi khuẩn P. acnes 134N là 10
mg/ml. Đồng thời tiến hành định tính các hợp chất sinh học trong cao chiết từ lá Trứng cá,
kết quả thu được cao chiết ethanol từ lá Trứng cá có chứa hợp chất sinh học như flavonoid,
saponin, tanin. Từ kết quả đề tài cho thấy, cao chiết ethanol từ lá, vỏ thân, quả chín và quả
non Trứng cá là một nguồn nguyên liệu tự nhiên, tiềm năng cho những nghiên cứu sâu hơn
trong điều trị bệnh trứng cá, đặc biệt là nguyên nguyên liệu từ lá Trứng cá.
Từ khóa: cây Trứng cá, Propionibacterium acnes, tính kháng khuẩn

5. iv
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................. i
LỜI CAM KẾT............................................................................................................... ii
TÓM TẮT NỘI DUNG................................................................................................. iii
MỤC LỤC..................................................................................................................... iv
DANH SÁCH BẢNG................................................................................................... vii
DANH SÁCH HÌNH................................................................................................... viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................ ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU...................................................................................................1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ...................................................................3
2.1.1. Phân loại bệnh trứng cá .........................................................................................3
2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá......................................................................................4
2.1.3. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay............................................5
2.2. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES .......................................................9
2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes.................................................9
2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes ...........................10
2.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ ...................................................................12
2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá ......................................................................................12
2.3.2. Phân loại cây trứng cá .........................................................................................13
2.3.3. Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá.......................13
2.3.4. Tác dụng dược lý cây Trứng cá...........................................................................15
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG
CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC..................................................................................18
2.4.1. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới........18
2.4.2. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam ........19
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................20
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .................................................................................20

6. v
3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ...........................................................................20
3.2.1. Nguyên vật liệu....................................................................................................20
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................................20
3.2.3. Hóa chất và môi trường.......................................................................................20
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................................21
3.3.1. Thiết kế nghiên cứu.............................................................................................21
3.3.2. Cỡ mẫu.................................................................................................................21
3.3.3. Phương pháp chọn mẫu .......................................................................................21
3.3.4. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................22
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................31
3.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ..........................................................................................31
3.6. VẤN ĐỀ Y ĐỨC....................................................Error! Bookmark not defined.
3.7. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ......................................................................31
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................32
4.1. KẾT QUẢ...............................................................................................................32
4.1.1. Chiết cao..............................................................................................................32
4.1.2. Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Propionibacterium acnes ................................32
4.1.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây
Trứng cá.........................................................................................................................36
4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn
Propionibacterium acnes...............................................................................................38
4.1.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá................40
4.2. THẢO LUẬN.........................................................................................................41
4.2.1. Chiết cao..............................................................................................................41
4.2.2. Phân lập và định danh vi khuẩn...........................................................................41
4.2.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây
trứng cá..........................................................................................................................42
4.2.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá trứng cá trên vi khuẩn
Propionibacterium acnes...............................................................................................43
4.2.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol lá Trứng cá....44

7. vi
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................46
5.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................46
5.2. ĐỀ NGHỊ................................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................47
PHỤ LỤC ......................................................................................................................56
Phụ lục 1: Tổng hợp số liệu thí nghiệm.........................................................................56
Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê...........................................................................57

8. vii
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá..................................9
Bảng 2.2. Sản phẩm ngoại bào P. acnes........................................................................11
Bảng 2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có chứa trong quả Trứng cá..........14
Bảng 3.1: Công thức môi trường TYEG agar ...............................................................21
Bảng 3.2. Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết trứng cá ........30
Bảng 4.1. Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá...................................................................32
Bảng 4.2. Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá.................................................32
Bảng 4.3. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của các loại cao ethanol cây trứng cá
bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch............................................................36
Bảng 4.4. Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá
đối với vi khuẩn P. acnes. .............................................................................................39
Bảng 4.5. Kết quả định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol của lá Trứng cá
.......................................................................................................................................40

9. viii
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn ........................................................................................5
Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes..........................................................................................10
Hình 2.3. Cây trứng cá...................................................................................................12
Hình 2.4. Quả non và quả chín cây Trứng cá................................................................13
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá ......................................23
Hình 3.2. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ
.......................................................................................................................................26
Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết.................29
Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm..................................................................31
Hình 4.1. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung
0,002 % bromocresol purple..........................................................................................33
Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn P. acnes dưới kính hiển vi ...................................33
Hình 4.3. Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn 134N.............................................34
Hình 4.4. Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn 134N ...............................34
Hình 4.5. Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn 134N .......................35
Hình 4.6. Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N...............35
Hình 4.7. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây
Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml...........................................37
Hình 4.8. Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ở
nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml...............................................................38
Hình 4.9. Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes..................39

10. ix
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BHI Brain Heart Infusion Broth
DMSO Dimethyl Sulfoxide
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
DPPH 2,2-diphenylpicrylhydrazyl
ED50 Effective dose 50
IC50 Inhibitory concentration
M. calabura Muntingia calabura L.
MIC Minimum inhibitory concentration
MBC Minimum bactericidal concentration
P. acnes Proipionibacterium acnes
TYEG Tryticase-Yeast extract-Heart extract-Glycerol
v/v Volume per volume
w/v Weight per volume

11. 1
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
Bệnh trứng cá là bệnh lý về da thường gặp ở lứa tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt
là giai đoạn dậy thì, có khoảng 80 % thanh niên Việt Nam bị bệnh trứng cá với mức độ
nặng nhẹ khác nhau (Phạm Văn Hiển, 1997). Bệnh trứng cá thường xuất hiện vùng da
mặt, lưng và ngực. Tuy ít ảnh hưởng sức khoẻ nhưng ảnh hưởng khá lớn đến tâm lý,
thẩm mỹ và giao tiếp xã hội của bệnh nhân. Nghiên cứu ở thanh thiếu niên bị bệnh
trứng cá cho thấy mức độ lo lắng, ngại giao tiếp cao hơn so với người bệnh động kinh
hay hen suyễn (Mallon et al., 1999). Có nhiều nguyên nhân gây bệnh trứng cá như mất
cân bằng nội tiết tố, nhiễm khuẩn, do căng thẳng, chế độ dinh dưỡng hay mỹ phẩm
(Park et al., 2004). Vi khuẩn P. acnes được xem là một trong các nguyên nhân chính
gây bệnh trứng cá (Jappe, 2002). Tại bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh khảo
sát 87 trường hợp bệnh nhân trứng cá có 42 trường hợp (chiếm 48,3 %) phân lập được
vi khuẩn P. acnes (Nguyễn Thanh Hùng, 2013)
Kháng sinh, retinoid và một số chất khác như benzoyl peroxid, acid salicylic,
acid azelaic và anpha-hydroxy cho tác dụng điều trị bệnh trứng cá thông thường
(Leyden, 2003). Tuy nhiên các thuốc này kèm theo các tác dụng phụ như kích ứng da,
lột da, sạm da (Kennedy et al., 1995) và thời gian điều trị kéo dài dẫn đến hiện tượng
kháng thuốc kháng sinh và thuốc trị mụn (Leyden, 2003). Vì vậy việc tiếp cận các liệu
pháp điều trị có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những dược liệu sử dụng phổ biến
trong dân gian điều trị bệnh trứng cá đang được nhiều nước trên Thế giới và Việt Nam
quan tâm. Mục đích nhằm tìm những thuốc mới có hiệu quả, không gây tác dụng phụ
so với các thuốc có nguồn gốc hóa dược và góp phần tận dụng nguồn dược liệu có sẵn
là rất cần thiết.
Cây Trứng cá hay còn gọi là Mật sâm trong những năm gần đây được các nhà
khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng
viêm và chống oxy hóa cao. Lá, vỏ thân, quả và rễ sử dụng như một phương thuốc dân
gian điều trị sốt, cảm lạnh, bệnh tiêu hoá, thuốc kháng khuẩn ở khu vực Đông Nam Á.
Các nghiên cứu đã chứng minh những hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu có khả năng
kháng vi sinh vật, kháng oxy hoá bao gồm tanin, flavonoid, phenolic (Chenwitheesuk
et al., 2005). Theo các nghiên cứu một số hợp chất phân lập từ cây Trứng cá như
flavonoid, tanin, phenolic (Keneda (1991), Su (2003), Chen (2005)) có khả năng
chống các tế bào ung thư và kháng khuẩn. Mặt khác cây Trứng cá là loại cây ven
đường được trồng khá phổ biến tại các nước Nam Mỹ và khu vực Đông Nam Á (Chin,
1989), dễ thu hái và rẻ tiền là nguồn nguyên liệu sẵn có dễ tìm.

12. 2
Với những lí do trên đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn
trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia
calabura L.)” đã được thực hiện với mục đích cụ thể sau:
1) Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của
cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)
2) Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ Cây Trứng cá cho
hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

13. 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ
Bệnh trứng cá được mô tả sớm nhất trong các bài viết Hy Lạp cổ đại của bác sĩ
Byzantine Aetius Amidenus. Từ “acne” xuất phát từ acme trong tiếng Hy Lạp có nghĩa
là “điểm” hoặc “tại chỗ”, acme viết sai thành acne và được sử dụng đến ngày nay
(Humgara et al., 2013).
Bệnh trứng cá là bệnh về da phổ biến nhất đặc biệt ở lứa tuổi thanh thiếu niên.
Bệnh trứng cá không thể định nghĩa là bệnh truyền nhiễm vì vi khuẩn gây mụn không
chỉ hiện diện trên da người bệnh mà còn trên da người khoẻ mạnh. Bệnh trứng cá được
hình thành do sự tăng tiết chất nhờn, tế bào phễu bị sừng hoá làm tắc nghẽn cổ nang
lông, sự gia tăng mật độ vi khuẩn bên trong nang lông và sử dụng tế bào chết cùng với
chất nhờn phát triển tạo thành nhân mụn nhỏ (microcomedone) không thể phát hiện
bằng mắt thường (Plewig và Kligman, 2000)
2.1.1. Phân loại bệnh trứng cá
Theo Phạm Hoàng Khâm (2011) bệnh trứng cá được chia thành 2 dạng là tổn
thương không viêm như mụn đầu trắng (whitehead) và mụn đầu đen (blackhead) và
dạng viêm bao gồm sẩn, mụn mủ, mụn bọc, mụn nang.
- Mụn đầu đen hình thành do chất bã bài tiết và tế bào chết làm tắc lỗ nang lông nhưng
bề mặt da hở nên nhân mụn bị không khí oxy hoá tạo màu đen. Nhìn vào nang lông
thấy màu đen nên gọi là mụn đầu đen hay mụn có cấu trúc mở.
- Mụn đầu trắng hình thành khi có quá nhiều chất dầu và tế bào chết gây bít tắc lỗ
nang lông và không hở ra da, nên gọi là “nhân đóng”.
Theo Hayashi et al., 2008 sử dụng hình thái và số lượng tổn thương phân chia
bệnh thành 3 mức độ: nhẹ, trung bình và nặng
- Bệnh trứng cá nhẹ: từ 0 - 5 nốt viêm, thương tổn là một vài mụn đầu trắng, mụn đầu
đen.
- Bệnh trứng cá trung bình: từ 6 - 20 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn đầu trắng,
mụn đầu đen đồng thời có thêm sẩn, mụn mủ.
- Bệnh trứng cá nặng: từ 21 - 50 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn mủ, nang, nốt
sẹo.
Theo Tutakne (2003) phân loại bệnh theo bốn cấp độ:
- Cấp 1: mụn trứng cá (comedones, mụn đầu trắng, mụn đầu đen), sẩn (Papules)
- Cấp 2: mụn trứng cá, vài mụn mủ (pustule)
- Cấp 3: mụn mủ, nốt sần (nodules), áp xe (abscess)
- Cấp 4: các u nang (cyst), áp xe, sẹo (scar)

14. 4
2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá
Những yếu tố chính gây bệnh trứng cá là nội tiết tố kích thích tiết bã nhờn, sự
sừng hoá (Keratin hoá) bất thường của phễu nang lông, tăng số lượng vi sinh vật trên
da và phản ứng viêm của tế bào chủ. Trong đó sự tăng tiết bã nhờn được coi là điều
kiện cần, phản ứng viêm được xem là yếu tố then chốt, còn vi khuẩn P. acnes đóng vai
trò quan trọng gây ra bệnh trứng cá (Loveckova el al., 2002). Ngoài ra còn các yếu tố
khác như yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng, môi trường làm việc, khí hậu, lạm dụng
mỹ phẩm cũng có liên qua đến tình trạng bệnh trứng cá (Nguyễn Thanh Hùng và
Nguyễn Tất Thắng, 2013)
2.1.2.1. Sự tăng sinh tiết bã nhờn
Bã nhờn được sản xuất bởi tuyến nhờn, chúng có ở mọi nơi trên cơ thể đặc biệt
ở trán, cằm và lưng, có rất ít ở tay hoặc chân, không có ở lòng bàn tay và lòng bàn
chân. Có hai quá trình liên quan đến sự tổng hợp chất béo của bã nhờn: quá trình tổng
hợp triglycerid, acid béo tự do, wax ester, sterol ester và quá trình tổng hợp squalen và
cholesterol (Downie et al., 2004). Hầu hết các tuyến bã nhờn đổ vào nang lông trên bề
mặt da để giữ ẩm cho làn da. Những người bị bệnh trứng cá thường có tuyến bã nhờn
tiết nhiều chất nhờn trên mức cần thiết. Chất nhờn sẽ tích tụ trong lỗ chân lông dẫn
đến tắc lỗ chân lông hình thành nhân trứng cá. Thành phần chất nhờn trên da bệnh
nhân bệnh trứng cá thường có squalen và wax ester cao hơn bình thường và các acid
béo tự do (như linoleic) thấp hơn bình thường. Sự thiếu hụt acid linileic là yếu tố quan
trọng gây mụn trứng cá (Downie et al., 2004). Acid linoleic điều khiển quá trình tiết
của interleukin (IL-8), gây ra phản ứng viêm (Zouboulis, 2001)
2.1.2.2. Rối loạn bong sừng (sự sừng hoá bất thường ở lỗ chân lông)
Rối loạn bong sừng là hiện tượng lớp tế bào chết ngoài cùng khu vực gần
miệng lỗ chân lông kết chặt với nhau và không bong ra, dần dần tạo thành nhiều lớp tế
bào chết xếp chồng lên nhau. Lớp tế bào chết này sẽ gây hẹp lỗ chân lông dẫn đến bít
tắc lỗ chân lông tạo nên môi trường kỵ khí với nhiều chất nhờn thuận lợi cho vi khuẩn
phát triển gây ra mụn (Thiboutot et al., 2009)
2.1.2.3. Vi khuẩn gây bệnh trứng cá:
Các chủng vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium
granulosum, Propionibacterium avidum, Propionibacterium acnes đã được chứng
minh hệ vi sinh vật tham gia vào sự phát triển của bệnh trứng cá, trong đó P. acnes
được xem là tác nhân gây bệnh trứng cá chính (Hamnerius, 1996).
Propionibacterium acnes thuộc chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, khuẩn lạc màu
vàng nhạt hoặc vàng đậm (do khả năng sinh acid propionic) trên môi trường TYEG
agar (có bổ sung bromocresol purple), tế bào hình que, dương tính với catalase. Trong

15. 5
dòng vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium thì P. granulosum và P. avidum không
có khả năng sinh tryptophan, trong khi P. acnes cho kết quả dương tính. Đây là một
trong những đặc điểm quan trọng giúp phân lập được các dòng P. acnes (Kishishita et
al., 1980).
2.1.2.4. Phản ứng viêm
Tại các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase phân giải triglyceride thành các
acid béo tự do và glycerol. Các acid béo tự do khuyếch tán qua thành nang lông, thu
hút bạch cầu trung tính đa nhân, chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các
enzym thuỷ phân lysosom, gây ra phản ứng viêm ở lớp hạ bì (Weeks et al., 1977;
Pawin et al., 1998)
Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn (Degitiz et al., 2007)
A. Nang tuyến bã nhờn bình thường B. Nhân mụn C. Nang bị vỡ do viêm
2.1.3. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay
Bệnh trứng cá liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh nên điều trị phức tạp việc
điều trị phải dựa trên từng cá thể bệnh mức độ trầm trọng của bệnh, nguyên nhân gây
bệnh mà sử dụng thuốc tại chổ hay toàn thân hoặc kết hợp cả hai để đạt hiệu quả cao.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị bệnh trứng cá mang lại kết quả đáng kể
nhưng thời gian điều trị kéo dài và kèm theo tác dụng phụ không mong muốn.
2.1.3.1. Sử dụng kháng sinh
Theo một số phác đồ điều trị kháng sinh thường sử dụng là clindamycin,
erythromycin, tetracylin.
- Dung dịch clindamycin 1 % có hiệu quả trong việc làm giảm vi khuẩn P.acnes
(thường gặp ở vùng da nhờn), có tác dụng tốt đối với mụn mủ, sẩn mủ, nhưng với
nang mụn và nhân mụn thì thuốc ít có hiệu quả.
- Dung dịch erythromycin 4 % có tác dụng giống clindamycin. Sau khi dùng khoảng
12 tuần, khoảng 2/3 bệnh nhân có kết quả tốt.

16. 6
- Khi điều trị kháng sinh tại chỗ thất bại (6 - 8 tuần), nên phối hợp kháng sinh toàn
thân cùng với kháng sinh tại chỗ như: tetracyclin: 500mg x 2 lần/ngày; erythromycin
500 mg x 2 lần/ngày; roxithromycin 150 mg x 2 lần/ngày; levofloxacin 500 mg x 2
lần/ngày.
Các loại kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes làm giảm viêm
nhưng tác dụng trong điều trị bị giảm do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn
(Shimonart và Dramaix, 2005). Kháng sinh trong điều trị vi khuẩn mụn trứng cá P.
acnes đã có nhiều tác giả nghiên cứu. Năm 1976, Leyden chưa phát hiện sự kháng
kháng sinh của vi khuẩn P. acnes (Leyden, 1976). Năm 1979, Crawford cùng cộng sự
đã công bố kháng sinh kháng vi khuẩn P. acnes là erythromycin và clindamycin với tỷ
lệ mức 20 % .Tỷ lệ kháng kháng sinh 20 % năm 1978 và lên 68 % năm 1996. Theo
một số điều tra gần đây, các nước Địa Trung Hải có tỷ lệ đề kháng của P. acnes cao
nhất với erythromycin và clindamycin. Ở Tây Ban Nha tỷ lệ kháng với hai loại kháng
sinh này lần lượt là 91 % và 92,4 %. Ở Hy Lạp, tỷ lệ P. acnes đề kháng cả hai loại
erythromycin và clindamycin là 75,3 % và ở Italia là 59,5 % (Ross et al., 2002). Theo
Dreno et al., 2001 công bố tỷ lệ dòng vi khuẩn P. acnes phân lập từ bệnh nhân chủ yếu
là bị tổn thương kèm theo viêm, kháng lại erthromycin 52 %. Những loại kháng sinh
điều trị bệnh trứng như ampicilin, erythromycin, roxithromycin, clindamycin được
khuyến cáo không sử dụng điều trị dài hạn (quá 3 tháng) (Nishijima, 2000). Khả năng
kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn không chỉ lây lan giữa các dòng vi khuẩn trên da
người bệnh mà còn lây truyền qua người thân và những người mà họ tiếp xúc (Sheafer
et al., 2001). Khả năng đề kháng thuốc kháng sinh của P.acnes có liên quan đến đột
biến gen trên 16S và 23S-rRNA, được phân lập ở các nước Nhật Bản, Úc, Hoa Kỳ và
Châu Âu (Ross et al., 2002). Đột biến gen 23-rRNA kháng lại kháng sinh thuộc nhóm
macrolid- lincosamidestreptogramin B, đặc biệt là erythromycin và clindamycin (Ross
et al,. 2002). Tại Việt Nam, khảo sát 87 bệnh nhân tham gia nghiên cứu tạo phòng
khám bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ đề kháng kháng sinh như sau
lindamycin 88,1 %; azthromycin 16,7 %; tetracyclin 0 %, doxycylin 0 %; minocyclin
0 %; trimethroprim/sulfamethoxazol 95,2 % (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất
Thắng, 2013). Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá, các
loại kháng sinh thường gây một số tác dụng không mong muốn như kích ứng da, mẫn
ngứa, khô da, da mẫn cảm với ánh sáng (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Vì vậy việc lựa
chọn thuốc phải phù hợp với từng bệnh nhân, từng thể bệnh và tuân thủ theo điều trị
của thầy thuốc mới đạt kết quả mong muốn.

17. 7
2.1.3.2. Các Peroxid
Là loại thuốc sát khuẩn có tác dụng chống vi khuẩn gây mụn, kháng viêm,
benzoyl peroxid làm giảm nhanh số lượng P. acnes tại vùng thương tổn đồng thời
thuốc làm giảm lượng acid béo trên bề mặt da và ức chế tạo nhân trứng cá. Benzoyl
peroxid có tác dụng tốt đối với trứng cá có viêm ở mức độ nhẹ hay trung bình. Nên
dùng thuốc có nồng độ từ 2,5 - 5 % bôi vùng mặt, vùng lưng có thể dùng thuốc với
nồng độ cao hơn từ 5 - 10 %, khởi đầu có thể bôi ngày 2 lần, khi bệnh giảm tuần bôi 1
- 2 lần. Nên sử dụng công thức có chất nền là nước (water-basedformulation) vì ít kích
ứng da hơn loại cồn. Thuốc này thường gây kích thích da và lột da. Cần tránh nắng
trong thời gian sử dụng thuốc vì ánh nắng làm cho da cháy đỏ, đen sạm (Simonart và
Dramaix, 2005). Nếu dùng đồng thời với kem chống nắng có chứa acid
paraaminobenzoic sẽ làm da sậm màu một thời gian (Lê Kim Duệ, 2000).
2.1.3.3. Dẫn chất vitamin A acid (tretionid, isoteinoin)
Trước đây vitamin A được xem là yếu tố dinh dưỡng thuần tuý. Ngày nay được
dùng như một liệu pháp điều trị các trường hợp bệnh trứng cá nặng hoặc trứng cá đề
kháng trị liệu thông thường. Thuốc bôi retinoid: tretionin, adapalene và isotretinoin là
loại thuốc có hiệu quả. Thuốc có tác dụng mềm da, ức chế sự phát triển vi khuẩn P.
acnes và tạo điều kiện cho các thuốc kháng khuẩn tại chỗ phát huy tác dụng tốt hơn.
Một số tác dụng không mong muốn của thuốc:
- Khả năng gây quái thai là tác dụng không mong muốn cần lưu ý nhất. Thuốc có
thể gây dị dạng trên hệ thống thần kinh trung ương, cơ quan thính giác, tuyến
ức và hệ thống tim mạch thai nhi (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Các thuốc retinoid
chống chỉ định cho phụ nữ mang thai và phụ nữ trong độ tuổi sinh sản (Yentzer
et al., 2009).
- Khô da và niêm mạc, làm da và niêm mạc dễ bị tổn thương và kích ứng, bệnh
nhân cảm giác bỏng rát da trở nên đỏ, bong vẩy
- Mụn mủ có thể xuất hiện sau khi bôi thuốc 1 đến 2 tuần do thuốc làm tăng sự
thẩm thấu các chất trung gian hoá học gây viêm do P. acnes tiết ra và tạo điều
kiện cho tụ cầu phát triển (Nguyễn Hữu Sáu, 2010).
2.1.3.4. Các phương pháp khác
- Acid azelic có tác dụng giống benzyol peroxid gây ức chế sự tổng hợp tế bào sừng,
có hoạt tính chống lại bệnh trứng cá. Tác dụng không mong muốn là gia tăng sắc tố da
sau viêm (Roebuck, 2006), dễ gây kích ứng da ngứa và có cảm giác bỏng tại chỗ
(Layton, 2006).

18. 8
- Điều trị bằng công nghệ ánh sáng tia laser: sử dụng liệu pháp quang, ánh sáng phổ
rộng. Tia laser cho thấy kết quả giảm mụn trong thời gian ngắn nhưng cần có thêm
nhiều nghiên cứu lâu dài và so sánh liệu pháp cũ (Sakamoto et al., 2010)
- Bên cạnh đó thảo dược được dùng điều trị mụn trứng cá không chỉ có khả năng như
một chất tiêu diệt vi sinh vật mà còn là những chất có khả năng ức chế sản sinh sản
phẩm ngoại bào của P. acnes. Thảo dược dùng điều trị mụn trứng cá cho thấy tác dụng
kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hoá và ức chế hormon androgen (Sasiing et al.,
2012). Một số nghiên cứu về hoạt chất từ thảo dược có tác dụng ức chế vi khuẩn P.
acnes:
+ Nghiên cứu kem trị bệnh trứng cá có chứa 2 % flavonoid chiết từ vỏ cây
Terminalia arjuna (họ Trâm Bầu) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn P. acnes (đường
đính vòng kháng > 17 mm) (Vijaylakshmi et al., 2011)
+ Theo Luangnarcumitchai (2007) khảo sát 19 loại tinh dầu cho kết quả có khả
năng ức chế vi khuẩn P. acnes, trong đó tinh dầu xả có hoạt chất kháng khuẩn cao
nhất, nồng độ ức chế tối thiểu 0,125 % v/v
+ Dịch chiết ethanol của lá sầu đâu Neem, trái nutmeg (họ Nhục Đậu Khấu), và
hạt tiêu đen (Black pepper) bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch, mỗi giếng
cho 0,5 ml dịch chiết. Đường kính vòng kháng vi khuẩn P. acnes lần lượt là 20 mm,
18 mm, 16 mm ở nồng độ 20 mg/ml (Charde et al., 2012)
+ Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, dịch chiết ethanol của lá cây Liễu
đỏ Excoecaria cochinchinensis Lour và lá cây Xô thơm Salvia officinalis Lour (Họ
hoa môi) nồng độ 5 % ức chế P. acnes với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 20,5
mm và 20,83 mm MIC lần lượt là 1,56 mg/ml và 6,25 mg/ml (Brovelli et al., 2005)

19. 9
Tác dụng của các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá được trình bày ở bảng 2.1
như sau:
Bảng 2.1. Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá
Bài tiết
chấtnhờn
Sừng hoá phễu
nang lông
Vi khuẩn
P. acnes
Phản ứng viêm
Benzoyl peroxid - + +++ +
Retinoid - ++ + +
Clindamycin - + ++ -
Antiandrogen ++ + - -
Azelic acid - ++ ++ +
Tetracycline - - ++ +
Erythromycin - - ++ -
Isotretinoin +++ ++ ++ ++
Ghi chú: (+++) tác dụng rất mạnh, (++) tác dụng mạnh, (++) tác dụng vừa, (+) tác
dụng yếu, (-) không tác dụng (Hywel et al., 2011)
2.2. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES
2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes
Theo Douglas và Gunter (1946) vi khuẩn Propionibacterium acnes gây bệnh trứng cá
phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Họ: Propionibacteriaceae
Chi: Propionibacterium
Loài: P. acnes
P. acnes là một trong những vi khuẩn thuộc hệ vi sinh vật tự nhiên của da,
chiếm khoảng 105
- 106
tế bào/cm2
ở những vùng có nhiều bã nhờn như: mặt, đầu, lưng
và khoảng 102
tế bào/cm2
ở các vùng khác trên cơ thể (Leyden et al., 1998). Chúng
sinh trưởng sâu bên dưới da, nhiều nhất trong các nang lông, nơi có nồng độ oxy thấp.
Vi khuẩn P. acnes phát triển chậm, khuẩn lạc xuất hiện sau 5 - 7 ngày trên môi
trường nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp 37 o
C, pH từ 5 - 8, trong điều kiện kỵ khí. Khuẩn
lạc P. acnes mô cao màu vàng đục trên môi trường TYEG agar có bổ sung
bromocresol purple. Khuẩn lạc có kích thước khoảng 0,5 - 4 mm tuỳ thuộc vào thời
gian và môi trường nuôi cấy (Kishishita, 1980)

20. 10
P. acnes thuộc vi khuẩn Gram dương, hình que, không sinh bào tử, các tế bào
có đường kính 0,5 - 0,8 m và dài 3 - 4 m, có khả năng sản xuất acid propionic,
nitrat, catalase và indol dương tính, dịch hoá gelatin. P. acnes được trữ trong môi
trường BHI có bổ sung 20 % glycerol, ở nhiệt độ -40 o
C (Jappe et al., 2002)
Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes
( Jappe et al., 2002)
(a) Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử; (b) Hình chụp dưới kính hiển vi quang học
P. acnes có nhiều dạng khác nhau. Dựa vào quá trình lên men, sử dụng đường
ribose, erythritol và sorbitol, quan sát được 5 type P. acnes khác nhau. Dựa trên xét
nghiệm huyết thanh và phân tích thành phần đường trên thành tế bào, chia P. acnes
thành hai dạng: type I (đường glactose tham gia cấu tạo thành tế bào) và type II (chỉ có
đường manose trong cấu tạo thành tế bào) (Johnson và Cummins, 1972). Theo
McDowel (2005) P. acnes được chia thành hai type I và II dựa vào khác biệt về kiểu
gen dựa trên biến thể về kiểu gen (reca, hly). Gần đây, một dạng mới được mô tả là
type III trên da người dị ứng.
2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes
P. acnes là một trong những thành phần của hệ vi sinh vật bình thường trên da
(Holdeman et al., 1977). Ở những người bệnh trứng cá, vi khuẩn này phát triển rất
mạnh do sự bít tắc lỗ chân lông tạo môi trường yếm khí, tạo điều kiện thuận lợi cho vi
sinh vật này tăng nhanh mật số. Vi khuẩn P. acnes sản xuất các enzym ngoại bào và
các sản phẩm có hoạt tính sinh học khác được xem là yếu tố quyết định độc lực và
tương tác với hệ miễn dịch gây ra phản ứng viêm tạo nhân mụn (Webster, 1995).
Theo Funke (1997) và Leyden (1998) P. acnes là nhân tố quan trọng gây bệnh
trứng cá đây là chủng vi khuẩn phổ biến nhất trên da bệnh nhân trứng cá. Tại các
tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase để tiêu hoá chất nhờn trong các nang lông sản
sinh ra các acid béo tự do và acid propionic. Vi khuẩn P. acnes tồn tại trên mô và có

21. 11
thể gây huỷ mô do các các sản phẩm chuyển hoá (acetat, propionat, indol, porphyrin),
enzym và các sản phẩm thoái dưỡng của glucose và fructose. Histamin, tryptamin và
những chuỗi acid béo ngắn được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P. acnes, các chất
này có thể gây ra tình trạng viêm (Csukas et al., 2004). Các enzym ngoại bào và các
sản phẩm có hoạt tính sinh học là hai yếu tố quyết định động lực của P. acnes.
Số lượng P. acnes bên trong nang lông tăng mạnh quá trình biến dưỡng diễn ra
sản sinh nhiều acid béo tự do, các chất này khuếch tán qua thành nang lông kích thích
hoạt động của hệ thống miễn dịch tự nhiên và chuỗi phản ứng viêm kích hoạt
(Loveckova và Halikova, 2002). Ngoài ra chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi
các enzym thuỷ phân lysosom gây ra phản ứng viêm hạ bì.
Vi khuẩn P. acnes có khả năng chống lại thực bào và có thể tồn tại trong đại
thực bào một thời gian dài do cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn này có thể tồn tại thời
gian dài trong mô, kích thích phản ứng viêm miễn dịch liên tục và lâu dài, gây viêm
(Wester et al., 1985). Coates et al., 2002 cho rằng thành tế bào P.acnes chúng được
bảo vệ bởi kháng sinh và hệ thống miễn dịch tế bào chủ (Coates et al., 2002)
Bảng 2.2. Sản phẩm ngoại bào P. acnes
Sản phẩm Cơ chế Vai trò
Lipase Triglyceride Dinh dưỡng, sản xuất acid
béo tự do, tăng kết dính với
tế bào
Phospholipase C Phospholipid Gây rối loạn chức năng
mang tế bào
Proteases Collagen, keratin Dinh dưỡng, tăng hoạt tính,
sản sinh chemotaxins, phân
huỷ protein, xâm lấn mô lân
cận
Hyaluronidase,
neruaminidase
Mucopolysaccharides Xâm lấn mô lân cận, xuất
huyết dưới da
Acid phosphatase Đường phosphat Dinh dưỡng
Bacteriocins Kháng vi khuẩn khác
Histamin, tryptamin Gây viêm cấp tính
Eady et al., 1994

22. 12
2.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ
2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá
Trứng cá có tên khoa học Muntingia calabura L., thuộc họ Trứng cá
(Muntingiaceae). Tên gọi Trứng cá được đặt dựa trên các hạt li ti như trứng cá bên
trong quả. Tại Việt Nam cây có nhiều tên gọi như: Trứng cá, cây Trứng cá, Mật sâm.
Tuỳ theo từng quốc gia, cây Trứng cá có nhiều tên gọi khác nhau. Tên khác: capolin,
palman, bersilana, jonote, puan (Mexico); capulin blanco (Costa Rica); chitató,
maguito, chiriador, acuruco, tapabotija, nigua (Venezuela). Cây Trứng cá có nguồn
gốc từ miền nam Mexico, Caribe, Trung Mỹ, miền tây Nam Mỹ về phía nam của Peru
và Bolivia và khu vực châu Á (Chin, 1989). Cây Trứng cá có thể phát triển tốt trên
vùng đất nghèo dinh dưỡng có khả năng chịu các điều kiện chua mặn và khô hạn.
Được trồng rộng rãi phổ biến là loại cây ven đường tại Việt Nam, Malaysia,
Phillipines. Hạt của cây được các loài chim và dơi ăn quả phát tán, giúp cải thiện các
điều kiện đất và góp phần giúp các loài thực vật khác có thể sinh sống được ở vùng đất
nghèo dinh dưỡng. Tuy nhiên, cây cũng có thể bị coi là loài xâm hại nguy hiểm do cây
Trứng cá có thể cạnh tranh với các loài cây bản địa khác.
Hình 2.3. Cây Trứng cá
2.3.2. Mô tả cây Trứng cá
Cây Trứng cá là loại cây thân gỗ nhỏ, cao khoảng 7 - 12 m, phân cành lớn mọc
ngang, các cành xếp chồng lên nhau và hơi rũ xuống. Vỏ thân hơi nhẵn, những cành
non có lông màu xanh sậm, cành già màu nâu đen. Lá hình trái xoan, phiến lá không
đều dài 7 - 12 cm, rộng 2 - 4 cm, đầu lá nhọn, mép kía răng cưa, hai mặt có lông, màu
trắng nhạt mặt dưới, gân gốc 4, cuống lá dài 3 - 5 cm, có lông; lá kèm hình kim, gấp
khúc. Hoa mọc đơn độc, tụ họp thành 2 - 3 cái ở kẽ lá, cuống hoa dài hơn cuống lá,
cánh hoa hình xoan màu trắng, đài có 5 răng có lông dày ở hai mặt, tràng 5 cánh hình
bầu dục, thắt lại ở móng; nhị nhiều đính trên trụ đĩa bao quanh bầu, chỉ nhị mảnh; bầu

23. 13
hình trứng có lông tuyến, 5 - 7 ô chứa nhiều noãn. Quả nạc tròn nhẵn, đường kính
khoảng 1 - 1,5 cm, khi còn non màu xanh chuyển vàng rồi ứng đỏ và bóng láng khi
chín, vị ngọt và mọng nước có mùi thơm đặc trưng, bên trong chứa nhiều hạt nhỏ (0,5
mm) màu vàng trong như trứng cá (Võ Văn Chi, 2004)
Hình 2.4. Quả non và quả chín cây Trứng cá
2.3.2. Phân loại cây Trứng cá
Trứng cá là loài duy nhất trong chi Muntingia, thực vật có hoa. Theo Vijayanand
(2015) cây Trứng cá được phân loại như sau:
Giới (kingdom): Plantae
Bộ (order): Mavales
Họ (family): Muntingiaceae
Chi (genus): Muntingia L.
Loài (species): M. calabura
2.3.3. Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá
2.3.3.1. Lá
Qua các tài liệu đã công bố từ năm 1997 cho tới nay về thành phần hoá học, các
nhà hoá học phân lập được rất nhiều các hợp chất từ dịch chiết lá Muntingia calbura
L. như sau:
Các hợp chất Flavonoid: Catechin, epigallocatechin gallate, acid gallic, acid
protocatechuic, acid ferulic, quercitrin-2’’-O-gallate, pentagalloyl-hexoside II,
kaempferol-3-O-galactoside, myricetin, acid isoferulic, quercetin, pinocembrin,
rhamnetin, kaempferol, chyrsin I, chyrsin II, kaempferide, ermanin I, pinostrobin,
(2R,3R)-3,5,7-trihydroxyflavanone, 7-hydroxyflavone, isokaemferide, 3,3’-
dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavone, 3,8-dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavone, 7-
hydroxyisoflavon, 7,3’,4’-trimethoxyisoflavone, (2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-
tetramethoxyflanvan (Mahmood et al., 2013).
Các hợp chất khác: acid 3,4,5-trihydrobenzoic, lupenon, acid 2,3-dihydroxy-olean-

24. 14
12en-28oic, -sitostenone, -sitosterol, -stimasterol, methy-4hydrobenzoat, acid
isovanillic, p-nitrophenol, trans-methyl-p-coumarate, -anyremone (Mahmood et al.,
2013).
Theo nghiên cứu Aruna (2014) hàm lượng phenolic và flavonoid chiếm tỷ lệ
cao trong dịch lá Trứng cá. Làm gia tăng khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa từ
lá Trứng cá.
2.3.3.2. Quả
Quả Trứng cá rất được trẻ em ưa thích có thể ăn quả ngay khi hái hoặc làm mứt với
mùi thơm đặc trưng.
Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần các chất có chứa trong quả Trứng cá theo nghiên
cứu của Vijayanand (2015) được thể hiện bảng 2.3
Bảng 2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có chứa trong quả Trứng cá
Dung môi
Hợp chất Ethanol Methanol Chloroform Nước
Terpeoid - - - +
Flavonoid + + - +
Saponin - - + -
Tanin + - + +
Alkaloid - - - -
Glucose + - + +
Anthraquinon - - - -
Glycosid tim - - - -
Steroid - - - -
Phenol + + - +
Lipid - - - -
Vijayanand (2015)
Theo nghiên cứu Preethi (2010) dịch chiết từ quả tươi Trứng cá hàm lượng phenol
tổng dao động từ 358  0,02 đến 1486  0,028 mg GAE/100 g khối lượng quả tươi.
Từng kết quả đó cho thấy lượng phenolic/flavonoid dồi dào trong quả Trứng cá là tiềm
năng nghiên cứu chất chống oxy hoá và kháng khuẩn.
Theo Gomathi (2013) dịch chiết quả Trứng cá định lượng bằng phương pháp quang
phổ cho kết quả chứa một lượng đáng kể vitamin C (33,6 AAE/g dịch chiết), vitamin
E (14,7 mg TE/g dịch chiết), anthocyanin (82,4 mg CGE/g dịch chiết), flavonoid
(173,2 mg RE/g dịch chiết). Ngoài ra một số chất khác như phytol (26,26 %), acid n-
hexanacetic (11,97 %), acid cyclopropaneotanoic (10,26 %), γ-sitosterol (11,15 %),
stigmasterol (7,20 %) và campesterol (4,47 %) là thành phần chính trong chiết
xuất. Kết quả cho thấy quả Trứng cá là nguồn bổ sung chất dinh dưỡng có tiềm năng

25. 15
kháng viêm và chống oxy hoá.
2.3.3.3. Vỏ thân
Qua các tài liệu đã công bố về thành phần hoá học các nhà khoa học phân lập được
rất nhiều các hợp chất từ dịch chiết vỏ thân Muntingia calbura L. như sau:
Flavonoid: 8-hydroxy-7’,3’,4’,5’-tetramethoxyflavon; 8,4’-dihydroxy-7,3’,5’-
trimethoxyflavon; 6,7-dimethoxy-5-hydroxyflavon; 5,7-dimethoxyflavon; 3,5-
dihydroxy-6,7-dimethoxyflavan; (2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-tetramethoxyflavan
Hợp chất khác: -sitistenon; 6--gydroxystigmast-4-en-3-one, -sitosterol; acid
syringic; acid vanillic, 3-hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)propan-1-on,
tetracosyl ferulate; hexacosanol (Mahmood et al., 2013)
2.3.4. Tác dụng dược lý cây Trứng cá
Trong suốt nhiều thập kỉ qua các nhà khoa học trên khắp thế giới cố gắn khám phá
và nghiên cứu nhiều tác dụng dược lí mà cây Trứng cá mang lại cho con người. Cây
Trứng cá đã cho thấy nhiều tiềm năng dược phẩm mới trong tươi lai. Theo kinh
nghiệm dân gian người dân Peru dùng lá sắc với nước sử dụng giảm đau dạ dày, sưng
tuyến tiền liệt và hạ sốt giảm đau đầu (Morton (1987), Zakaria (2007b). Vỏ thân sử
dụng như thuốc giảm sưng viêm (Zakaria, 2006). Tại Colombia hoa sử dụng như loại
thuốc an thần, chống co giật, trầm cảm. Ở Mexico, cây trồng sử dụng điều trị bệnh sởi,
nhọt miệng và đau dạ dày.
2.3.4.1. Độc tính cấp
Độc tính cấp của M. calabura được nghiên cứu năm 2011 theo Sridhar (2011), dịch
chiết methanol lá với liều 300 mg/kg, 500 mg/kg và 2000 mg/kg dùng theo đường
uống của chuột. Quan sát hiện tượng trong 2 - 3 giờ đầu, tỷ lệ tử vong bắt đầu ghi nhận
từ 24 giờ đến 14 ngày. Kết quả thu được không thấy có dấu hiệu độc tính cấp và tỷ lệ
tử vong liều 2000 mg/kg dịch chiết là 0 %. Nghiên cứu khác về độc tính cấp của lá M.
calabura thu hái tại Selangor, Malaysia thực hiện bởi Irahim (2012). Dịch chiết
ethanol lá liều thử nghiệm 2000 và 5000 mg/kg dùng đường uống ở chuột. Tỷ lệ tử
vong ghi nhận đến ngày 14 sau khi uống dịch chiết là 0 %, không nhìn thấy dấu hiệu
lâm sàng về sự suy yếu của động vật, quan sát cấp độ tế bào về mô học, sinh hoá máu,
công thức máu cho thấy không có sự bất thường nào ở chuột. Những phát hiện này cho
thấy dịch chiết lá M. calabura không gây ra ngộ độc cấp tính dù ở liều cao (5000
mg/kg).
Karthyaini và Suresh (2012) nghiên cứu độc tính cấp của quả M. calabura liều thử
nghiệm giới hạn 1000 mg/kg và 2000 mg/kg không có dấu hiệu độc tính cấp hoặc tử
vong ghi nhận cả hai mức liều.

26. 16
2.3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào
Những năm gần đây Chen et al., 2004 nghiên cứu độc tính tế bào của M. calabura,
trong đó 15 hợp chất phân lập từ dịch chiết methanol vỏ thân đã được kiểm tra bằng
các thí nghiệm gây độc tế bào. Hoạt động chống lại tế bào P-388, A549, và HT-29.
Trong số các hợp chất phân lập, các hợp chất 8-hydroxy-7,3’,4’,5’-
tetramethoxyflavane; 8,4’-dihydroxy-7,8’,5’-trimethoxyflanane; 5-dihydroxy-6,7-
dimethoxyflavone; -sitostenone; acid vanillic; 3-hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-
hydroxyphenyl) propran-1-on; tetracolsyl ferulate có hoạt tính chống lại tế bào P-388
với ED50 ghi nhận lần lượt là 3,56 g/ml; 3,71 g/ml; 9,39 g/ml; 6,28 g/ml; 10,72
g/ml; 15,62 g/ml và 3,27 g/ml đối chứng mithramycin (ED50 = 0,06 g/ml ).
2.3.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn
Hợp chất phenolic có trong các bộ phận cây Trứng cá có khả năng kháng khuẩn
cao. Theo nghiên cứu Yasunaka (2005) sử dụng cao chiết methanol lá và quả Trứng cá
thu hái tại Veraceuz, Mexico cho khả năng kháng hai chủng vi khuẩn Ercherichia coli
(C600) và Staphylococcus aureus (209P) ở nồng độ 100 mg/ml. Kết quả MIC thu
được hai loại cao chiết methanol lá và methanol quả là trên hai dòng vi khuẩn
Ercherichia coli, Staphylococcus aureus lần lượt là 512/1024 μg/ml và 128/256 μg/ml.
Một nghiên cứu khác của Zakaria (2006) về hoạt tính kháng khuẩn của cao
chiết lá Trứng cá với các dung môi methanol, nước và chloroform. Cao chiết pha
loãng các nồng độ khác nhau (10000, 40000, 70000 và 100000 ppm) thử nghiệm
chống lại Corneybacterium, S. Aureus, Bacillus cereus, Proteus vulgaris,
Staphylococcus epidermidis, Kosuria rhizophila, Shigella fleneri, E. Coli,
Aermonashydrophila và Salmonella typhi bằng phương pháp khuyếch tán đĩa thạch in
vitro. Kết quả cho thấy cao chiết chloroform ít hiệu quả hơn so với cao chiết nước và
methanol. Ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, dịch chiết nước ức chế sự phát triển của S.
aureus và K. rhizophila trong khi dịch chiết methanol kháng lại vi khuẩn S. flexneri, B.
cereus, S. aureus, P. vulgaris, A. hydrophila và K. rhizophila. Ở nồng độ 40000 ppm
trở lên, dịch chiết nước hoạt tính kháng khuẩn tác động đối với vi khuẩn C.
diphtheriae, P. vulgaris, S. epidermidis và A. hydrophila
Một nghiên cứu khác thực hiện bởi Zakaria et al., 2007a khảo sát khả năng
kháng dòng vi khuẩn Staphyloccocus aureus của 3 loại cao chiết từ lá trứng cá với các
dung môi nước, chloroform, methanol. Kết quả cho thấy cả 3 loại cao chiết từ lá Trứng
cá có hoạt tính kháng khuẩn các dòng S. aureus 29213, S. aureus 33591, S. aureus
700699. Giá trị MIC ứng với 3 loại cao chiết nước, chloroform, methanol lần lược là 5
μg/ml ; 1,25 μg/ml và 2,5 μg/ml. Năm 2010, Zakaria tiếp tục các nghiên cứu 3 loại
dịch chiết Trứng cá khảo sát khả năng kháng các chủng vi khuẩn khác như S. aureus

27. 17
ATCC 25923 [nhạy cảm methicilin], S. aureus ATCC 33591 [kháng methicilin], E.
coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC
10231, và Microsporum canis ATCC 36299 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
Kết quả thu được chỉ cao chiết methanol ức chế sự phát triển của S. aureus ATCC
25923 và S. aureus ATCC 33591 với giá trị MIC là 1250 μg/ml và MBC là 2500
μg/ml. Cao chiết nước và chloroform không ức chế các chủng vi khuẩn C. albicans,
M. canis, P. aeruginosa và E. coli. Cao chiết methanol lắc phân đoạn với các dung
môi từ không phân cực đến phân cực (ether, ethylacetat, nước) khảo sát khả năng
kháng khuẩn S. aureus ATCC 25923 và S. aureus ATCC 33591 các phân đoạn. Phân
đoạn ethylacetat cho thấy khả năng kháng hai dòng vi khuẩn này với giá trị MIC và
MBC ghi nhận được là 156 μg/ml và 313 μg/ml.
2.3.4.4. Hoạt tính chống oxy hoá
Gốc tự do là một sản phẩm tất yếu của các quá trình sinh lý sinh hoá trong cơ
thể. Trong cơ thể luôn có sự cân bằng mật độ gốc tự do. Khi nồng độ gốc tự do tăng
quá cao gây mất cân bằng, dẫn tới những tổn thương tế bào, phá huỷ protein, DNA đẩy
nhanh quá trình lão hoá và gây ung thư. Để xác định tiềm năng chống oxy hoá của M.
calabura được thực hiện bởi Zakaria et al., 2007b. Những lá Trứng cá thu hái từ
Selangor, Malaysia phơi khô và chiết với dung môi nước. Tiến hành thử nghiệm bằng
phương pháp DPPH và superoxid anion kết quả cho thấy dịch chiết nước có khoảng
94,8  1,14 % và 83,70  2,05 % khả năng chống oxy hoá khi đo bằng 2 phép thử.
Một nghiên cứu khác của Siddiqua (2010), dịch chiết methanol lá Trứng cá cho thấy
khả năng chống oxy hoá bằng phương pháp DPPH với nồng độ ức chế IC50 = 22
g/ml cao hơn so với acid ascorbic có giá trị IC50 = 12 g/ml
2.3.4.5. Hoạt tính kháng viêm
Lá Trứng cá có thể sử dụng như thức uống giống trà tác dụng điều trị giảm
sưng viêm. Theo nghiên cứu Zakaria, (2007b) để điều trị viêm cấp do carrageenan gây
ra sử dụng dịch chiết nước lá Trứng cá với nồng độ 10 %, 50 %, 100 % (tương đương
với liều 27 mg/kg, 135 mg/kg và 270 mg/kg tương ứng). Kết quả thu được chứng minh
rằng dịch chiết nước từ lá Trứng cá có hoạt tính chống viêm. Hoạt tính viêm ở mô do
carageenan gây ra mất hoàn toàn sau 7 giờ ở nồng độ 10 % và 50 % dịch chiết nước,
sau 6 giờ đối với nồng độ 100 %. Đặc biệt tại các nồng độ dịch chiết khả năng chống
viêm cao hơn nhiều so với thuốc đối chứng ASA (100 mg/kg).

28. 18
2.3.4.6. Hoạt tính bảo vệ tim mạch
Báo cáo khả năng bảo vệ tim mạch lá trứng cá thực hiện bởi Nivethetha (2009).
Dịch chiết lá Trứng cá với dung môi là nước có khả năng bảo vệ tim bằng cách làm
giảm nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim (AST, ALT, LDH, CK, acid uric) ở chuột.
Hoạt tính một số enzym giảm khi sử dụng dịch chiết nước lá Trứng cá ở nồng độ 200
và 300 mg/kg.
2.3.4.7. Hoạt tính chống bệnh đái tháo đường
Theo Sirdhar (2011) cao chiết methanol lá Trứng cá có khả năng chống lại bệnh
đái tháo đường với liều 300 mg/kg và 500 mg/kg. Liều 500 mg/kg cao methanol làm
giảm lượng đường huyết từ 83,19 mg/dl (lúc 0 giờ) xuống 62,62 mg/dl (cuối 6 giờ).
Hiệu quả đối với khả năng dung nạp glucose đường uống cũng được khảo sát. Kết quả
cho thấy liều 500 mg/kg làm giảm lượng đường huyết trong 1 giờ (116,46  6,94
mg/dl) trong khi nhóm chỉ sự dụng kẹo cao su (144,73  7,86 mg/dl). Nghiên cứu
khác về khả năng tăng đường huyết sau khi sử dụng Alloxan. Với liều 500 mg/kg cho
thấy khả năng giảm đường huyết 37 % so với thuốc đối chứng glipizide 5 mg/kg.
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY
TRỨNG CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
2.4.1. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới
Theo Zakaria (2006) tiến hành thử nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của
dịch chiết từ lá Trứng cá lần bằng 3 dung môi khác nhau nước, methanol, chloroform
bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả thu được dịch chiết nước có khả
năng chống lại Staphylococcus aureus, Kosuria rhizophila, dịch chiết methanol có khả
năng chống lại Shigella flexneri, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Proteus
vulgaris, Aeromonas hydrophila, Kosuria rhizophila; các khả năng kháng khuẩn này
không tìm thấy ở dịch chiết chloroform.
Theo Zakaria (2011), tiến hành thử nghiệm các hoạt động chống oxy hoá và
tăng sinh tế bào từ dịch chiết lá Trứng cá bằng 3 dung môi nước, chloroform,
methanol được thực hiện trong nghiên cứu này. Đánh giá bằng phương pháp thử MTT
((2,4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolim). Dịch chiết nước và methanol
cho kết quả ức chế sự phát triển các tế bào ung thư MCF-7, HeLa, HT-29, HL-60 và
K-562 trong khi dịch chiết chloroform chỉ ức chế phát triển tế bào ung thư MCF-7,
HeLa, HL-60 và K-562. Bên cạnh đó tất cả dịch chiết từ các dung môi không ức chế
sự gia tăng các tế bào bình thường 3T3, cho thấy sự an toàn khi sử dụng. Tất cả các
dịch chiết ở nồng độ (20 g/ml, 100 g/ml, 500 g/ml) đều có hoạt tính chống oxy
hoá, trong đó dịch chiết nước và methanol có hoạt tính chống oxy hoá cao hơn dịch
chiết chloroform. Tổng hàm lượng phenolic trong 3 dung môi nước, methanol,

29. 19
chloroform lần lượt là 2970,4  6,6; 1279  6,1; 2978,1  4,3 mg/100g acid gallic.
Theo Zakaria (2010) nghiên cứu xác định hoạt tính kháng khuẩn invitro của
dịch chiết toàn phần và phân đoạn của lá Trứng cá. Lá trứng cá được chiết với 3 loại
dung môi là nước, chloroform và methanol với tỷ lệ 1:20 (w/v) trong 72 giờ với quy
trình lặp lại ba lần. Các dòng vi khuẩn khảo sát là Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Cadida albicans và Microsporum canis. Dịch chiết
methanol ức chế Staphylococus aureus (MIC = 1250 g/ml, MBC = 1250 g/ml) và
được xem là dịch hiệu quả nhất trong cả ba loại dung môi. Tiến hành chiết phân đoạn
ethyl acetat hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus đạt giá trị MIC 156 g/ml.
2.4.2. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam
Trong nước, cây Trứng cá chủ yếu nghiên cứu về sinh thái, khả năng chống
chịu và thực trạng cây ven đường. Còn các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh
dược học của các hợp chất polyphenol khai thác từ cây trứng cá với mục đích phục vụ
lĩnh vực y dược còn rất ít. Các công bố nghiên cứu chủ yếu dựa vào thế giới và ứng
dụng dân gian. Thực tế cho thấy tìm năng điều trị bệnh tim mạch, tiểu đường, gout và
chống oxy hóa của các chất chiết từ cây Trứng cá là vô cùng phong phú nhưng vẫn
chưa khai thác mạnh mẽ trong nước. Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu đặc tính dược
liệu của chiết từ cây Trứng cá có ý nghĩa to lớn trong phòng và điều trị một số bệnh
hiện nay là rất cần thiết.

30. 20
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian : Thí nghiệm được thực hiện từ 12/2016 đến 4/2017
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, phòng thí nghiệm Dược liệu Khoa Dược-
Điều Dưỡng trường Đại học Tây Đô.
3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1. Nguyên vật liệu
- Mẫu vi khuẩn: Dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes 134N từ nghiên cứu “Khảo
sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium
acnes tại thành phố Cần Thơ” của Phạm Thị Tường Vy (2017) được lưu trữ tại phòng
thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô.
- Lá, vỏ thân, quả non, quả chín cây Trứng cá thu hái tại phường Thường Thạnh, quận
Cái Răng, thành phố Cần Thơ vào tháng 12 năm 2016. Lá và vỏ thân Trứng cá rửa
sạch, sấy khô, bảo quản ở nhiệt độ phòng trong túi nylon được xay nhỏ trước khi sử
dụng cho nghiên cứu. Quả non, quả chín được rửa sạch, nhặt bỏ cuống, để ráo nước
xay nhuyễn trước khi sử dụng cho nghiên cứu.
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Sử dụng các trang thiết bị hiện có tại Phòng thí nghiệm Vi sinh - Trường Đại
học Tây Đô, Phòng thí nghiệm Dược liệu - Trường Đại học Tây Đô.
Các dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn P. acnes: đĩa Petri, que cấy, tủ cấy vi sinh vật,
nồi hấp khử trùng, cân điện tử Ohaus (Mỹ), tủ sấy, tủ ủ vi sinh vật, tủ đông giữa mẫu
Hitachi (Nhật Bản), bộ micropipet, bếp điện, máy ly tâm, ống Eppendorf, bình hút ẩm.
Các dụng cụ thiết bị chiết mẫu: bếp điện, bình cầu, hệ thống sinh hàn, bếp đun
cách thủy, cân phân tích Shimidzu (Nhật Bản), phễu hủy tinh, đũa thủy tinh, tủ lạnh
bảo quản cao chiết, tủ sấy, cân hồng ngoại xác định độ ẩm.
Các thiết bị và dụng cụ khác: máy vi tính lưu trữ dữ liệu, máy chụp hình, kính
hiển vi Olympus CX - 21 (Nhật Bản)….
3.2.3. Hóa chất và môi trường
3.2.3.1. Hóa chất
Ethanol 96 % (Trung Quốc), DMSO (Trung Quốc)
Hoá chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn P. acnes : crystal violet, lugol, alcohol 95 %,
safranine (Bộ nhuộm Gram công ty TNHH Nam Khoa, Việt Nam).
Hoá chất kiểm tra catalase: dung dịch oxy già (H2O2, 3 %).
Thuốc thử Kovac’s dùng thử khả năng sinh indol (Mecrk).
Đĩa kháng sinh levofloxacin 5 g/ml (Công ty TNHH Nam Khoa, Việt Nam).

31. 21
Hoá chất cần thiết khác
3.2.3.2. Môi trường phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn P. acnes được nuôi cấy trong môi trường Trypticase - Yeast Extract -
Heart Extract - Glycerol Agar (Kishisita, 1980).
Bảng 3.1. Công thức môi trường TYEG agar (Kishisita, 1980)
Thành phần %
Trypticase 1,5
Yeast extract 0,5
Heart extract Nisui 0,5
Glycerol 1,0
NaCl 0,2
K2HPO4 0,2
L-cystein-HCl 0,03
Bromocresol purple 0,002
Agar
pH
1,5
6,8
- Môi trường Trypticase soyar broth dùng để kiểm tra khả năng sinh indol.
- Môi trường Trypticase soyar broth agar dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
và nồng độ ức chế tối thiểu.
- Môi trường pepton dùng để thử khả năng làm dịch hóa gelatin và khả năng
phản nitrat hóa
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Phương pháp thực nghiệm khoa học
3.3.2. Cỡ mẫu
Tổng số 4 mẫu thực vật từ các bộ phận Trứng cá (Muntingia calabura L.): lá, vỏ thân,
quả chín và quả non được sử dụng trong nghiên cứu.
3.3.3. Phương pháp chọn mẫu
Thu hái các bộ phận cây Trứng cá.
- Lá: chọn lá không quá già hay quá non, không bị sâu bệnh.
- Vỏ thân: chọn thân to không sâu bệnh và dùng dụng cụ bóc vỏ thân.
- Quả chín: chọn quả chín đỏ đều màu hái trực tiếp trên cây, không bị sâu bệnh
- Quả non: chọn quả non màu xanh lá hái trực tiếp trên cây, không bị sâu bệnh

32. 22
3.3.4. Nội dung nghiên cứu
3.3.4.1. Phương pháp chiết
Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kỹ
thuật chiết. Một phương pháp chiết xuất thích hợp có thể được hoạch định một khi đã
biết rõ thành phần hoá học của nguyên liệu, mỗi loại hợp chất có độ hoà tan khác nhau
trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung áp
dụng cho tất cả các hợp chất. Lựa chọn phương pháp chiết xuất có được cao toàn phần
là công việc quan trọng để tránh phân huỷ hợp chất , tránh phản ứng phụ và các loại
tạp sinh ra trong quá trình chiết.
Trong quá trình chiết các tiểu phân chất rắn chịu tác động của dung môi trong
điều kiện khác nhau. Các chất tan hoà tan trong dung môi thành dung dịch và tạo nên
dung dịch chiết, sự hoà tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan. Trong quá trình
chiết các chất từ các tổ chức sống (mô tế bào), các chất tan nằm bên trong các tế bào,
cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì thế các chất tan sau khi hoà tan thành dung
dịch còn phải vượt qua vách tế bào ra khỏi mô để đi vào dịch chiết. Quá trình chiết các
chất tan từ các tổ chức sinh học vì thế thường được gọi là quá trình “chiết xuất”.
Nguyên liệu thực vật thường được chia nhỏ thành các tiểu phân có thể tiếp xúc với
dung môi, trong khi các tế bào phía bên trong vẫn còn nguyên vẹn dung môi và chất
tan phải đi qua vách tế bào. Vì thế, trong chiết xuất có 3 quá trình quan trọng đồng
thời xảy ra là:
- Sự hoà tan
- Sự khuếch tán
- Sự thẩm thấu qua vách tế bào
Các quá trình này thực hiện liên tục cho đến khi quá trình chiết kết thúc. Nguyên liệu
phải được xay nhỏ đến mức thích hợp để dung môi có điều kiện tiếp xúc trực tiếp với
vách tế bào một cách dễ dàng, thúc đẩy quá trình chiết xuất nhanh chóng và nâng cao
hiệu suất chiết. (Nguyễn Trọng Tuân, 2007).
- Phương pháp chiết nóng đun hồi lưu
Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao kết hợp bộ phận gia nhiệt
và hệ thống sinh hàn. Do được chiết ở nhiệt độ cao nên khả năng hòa tan các chất tan
và dung môi thường là cao nhất và quá trình hòa tan xảy ra nhanh. Đun hồi lưu là sự
chuyển chất trở lại môi trường thông qua hệ thống ngưng tụ. Thiết bị chiết đun hồi lưu
gồm: Hệ thống sinh hàn, bình cầu, bếp điện
Ưu điểm: thiết bị đơn giản rẻ tiền, dễ thực hiện, phương pháp đơn giản
Nhược điểm: không chiết được lượng lớn mẫu cây, nên chỉ thích hợp nghiên

33. 23
cứu phòng thí nghiệm, trong suốt quá trình chiết mẫu cây luôn có nhiệt độ bằng nhiệt
độ sôi của dung môi nên không thích hợp cho các hợp chất kém bền nhiệt như
carotenoid hoặc tạo các tạp chất trong quá trình chiết. (Nguyễn Trọng Tuân, 2007)
- Tiến hành
Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá trình bày trong hình
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá
Lá, vỏ thân, quả non và quả chín cây trứng cá tươi thu hái về rửa sạch. Sau đó
lá và vỏ thân cây trứng cá làm khô bằng cách sấy khô đến khối lượng không đổi trong
tủ sấy ở điều kiện 60 o
C trong 6 giờ. Xay nhỏ lá và vỏ thân trứng cá bằng máy nghiền
để tạo bột khô thu được ml, mt (g)
Quả chín và quả sống để ráo nước, sau đó cân xác định khối lượng tươi ms, mc (g),
bảo quản tủ lạnh.
Chiết lá và vỏ thân khô: cho mẫu bột vào thau nhỏ làm ẩm dược liệu với một
lượng dung môi vừa đủ, để dược liệu trương nở trong 30 phút. Dược liệu sau khi làm
Bộ phận cây trứng cá
Lá, vỏ thân Quả sống, quả chín
Cắt nhỏ, sấy khô, xay
nhuyễn, xác định độ ẩm
Dịch
chiết lá
Xay nhuyễn
Ethanol 96 % trong 3 giờ ở 70 o
C
Dịch chiết
vỏ thân
Dịch chiết
quả chín
Dịch chiết
quả non
Cao lá Cao vỏ thân
Cao quả
chín
Cao quả
non

34. 24
ẩm cho vào bình cầu thủy tinh (được sấy khô), rót dung môi từ từ vào bình cầu tỉ lệ
1:20 (w/v) và lắp hệ thống sinh hàn. Dung môi ethanol 96 % cách mặt dược liệu 2 - 3
cm. Cho nước chảy liên tục trong ống sinh hàn. Điều chỉnh nhiệt độ bếp điện tương
đương 65 - 70 o
C. Sau khi thấy tim sôi trong bình cầu ta bắt đầu tính thời gian chiết 3
giờ. Sau 3 giờ tắt bếp để dich chiết nguội, lọc dịch chiết qua bông. Lặp lại 3 lần chiết,
gộp các dịch chiết cô dung môi bằng bếp cách thủy thu mẫu cao xác định độ ẩm cao,
khối lượng cao và hiệu suất chiết. Cao chiết bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4 - 8 o
C.
Quả non và quả sống: cho mẫu vào máy xay, bổ sung dung môi lượng vừa đủ,
xay nhỏ tốc độ (10000 vòng/phút) trong 5 phút. Quả sau khi xay cho vào bình cầu thủy
tinh (được sấy khô), rót dung môi từ từ vào bình cầu tỉ lệ 1:10 (w/v) và lắp hệ thống
sinh hàn. Dung môi ethanol 96 % cách mặt dược liệu 2 - 3 cm. Cho nước chảy liên tục
trong ống sinh hàn. Điều chỉnh nhiệt độ bếp điện tương đương 65 - 70 o
C. Sau khi thấy
tim sôi trong bình cầu ta bắt đầu tính thời gian chiết 3 giờ. Sau 3 giờ tắt bếp để dich
chiết nguội, lọc dịch chiết qua bông. Lặp lại 3 lần chiết, gộp các dịch chiết cô dung
môi bằng bếp cách thủy thu mẫu cao xác định độ ẩm cao, khối lượng cao và hiệu suất
chiết. Cao chiết bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4 - 8 o
C
- Chỉ tiêu theo dõi: độ ẩm nguyên liệu và hiệu suất chiết.
+ Độ ẩm nguyên liệu: độ ẩm là lượng nước tự do có trong nguyên liệu. Biết
được độ ẩm là điều quan trọng trong công tác phân tích xác định chất lượng nguyên
liệu. Dược liệu thường quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn
của dược liệu. Ở độ ẩm này hay thấp hơn dược liệu có thể được an toàn trong quá trình
lưu trữ. Để xác định độ ẩm ta có thể sử dụng nhiều phương pháp theo Trần Hùng
(2010) như sấy, chưng cất.
Nguyên tắc: dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong mẫu nguyên liệu ở
những điều kiện nhiệt độ và áp suất nhất định. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi
sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu nguyên liệu.
Tiến hành xác định độ ẩm:
Phương pháp sấy
Dùng tủ sấy: lấy một bình thủy tinh hình trụ có nắp mài, sấy đến khối lượng
không đổi ở nhiệt độ 105 o
C. Cân vào bình một lượng chính xác khoảng 3 g dược liệu
rồi đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 o
C trong 2 - 3 giờ. Dùng kẹp lấy bình trụ ra, để
vào bình hút ẩm, mở khóa hoặc hé mở nắp bình hút ẩm cho thông khí với bên ngoài
trong 1 phút rồi đóng kín bình hút ẩm. Để nguội trong bình hút ẩm 15 phút.

35. 25
Cân và ghi kết quả. Tiếp tục sấy trong 1 giờ, để nguội và cân mẫu như trên cho đến khi
kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 5 mg.
Tính kết quả độ ẩm theo công thức:
X =
𝑎−𝑏
𝑎
𝑥100 %
X: độ ẩm dược liệu, tính ra phần trăm
a: khối lượng dược liệu khi chưa sấy (g)
b: khối lượng dược liệu khi sấy đến khối lượng không đổi (g)
Dùng cân xác định độ ẩm: trải mỏng khoảng 1,5 g dược liệu đã được nghiền
mịn lên dĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng máy. Đọc kết
quả. Sau khi kết thúc thí nghiệm, phải để máy nguội khoảng 10 phút rồi mới thực hiện
mẫu kế tiếp.
+ Hiệu suất chiết: hiệu suất chiết (H %) được xác định tỷ lệ % khối lượng giữa
lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm khô so với khối lượng mẫu sử dụng .
Công thức hiệu suất:
H =
𝑚1
𝑚2
𝑥100 %
Trong đó :
H: hiệu suất chiết (%); m1: khối lượng bột dược liệu khô; m2: khối lượng cao
chiết sau khi cô dung môi

36. 26
3.3.4.2. Nuôi cấy và nhận diện dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes
Sơ đồ thí nghiệm
Tube Eppendorf chứa vi khuẩn P. acnes trữ ở nhiệt độ -40 o
C
Nuôi cấy dòng vi khuẩn trong môi trường TYEG broth
Nuôi cấy và phân lập dòng vi khuẩn trên môi trường TYEG agar có bổ sung
bromocresol purple 0,002 %
Nuôi cấy và phân lập dòng vi khuẩn P. acnes trên môi trường thạch nghiêng TYEG
Hình 3.2. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ
- Tiến hành (Kishisita et al., 1980)
Ống nghiệm chứa môi trường TYEG borth hấp tiệt trùng ở 121 o
C
Tube Eppendorf chứa vi khuẩn P. acnes trữ ở nhiệt độ 40 o
C được đặt nhiệt độ thường
15 phút sau đó cấy vào môi trường TYEG broth, ủ ở 37 o
C từ 5 - 7 ngày.
Hút 30 µl dòng vi khuẩn trong tube cho vào ống nghiệm chứa môi trường TYEG broth
Tiến hành cấy ria vi khuẩn từ môi trường TYEG broth lên đĩa thạch môi trường
TYEG agar có bổ sung bromocresol purple 0,002 % ủ kỵ khí ở 37 o
C từ 5 - 7 ngày
Chọn khuẩn lạc có màu vàng, đục, mô cao hoàn toàn trên môi trường và làm môi
trường từ tím chuyển sang vàng (do khuẩn lạc thuộc giống vi khuẩn Propionibacterium
phát triển sinh acid propionic làm giảm pH của môi trường). Tiến hành nuôi cấy trên
trên môi trường thạch nghiêng TYEG, ủ ở 37 o
C trong 48 giờ. Sau đó vi khuẩn được
định danh bằng các phản ứng sinh hóa.
Nhận diện dòng vi khuẩn bằng một số thử nghiệm hoá sinh
Nhuộm Gram
Tiến hành nhuộm Gram theo hướng dẫn sử dụng bộ nhuộm Gram công ty TNHH Nam
Khoa

37. 27
- Chuẩn bị vết bôi: làm sạch kính mang vật bằng cồn 70 %, nhỏ 1 giọt nước cất vô
trùng vào giữ kính mang vật, dùng que cấy chuyển một ít vi khuẩn vào giọt nước tán
nhẹ cho vi khuẩn hoà tan vào giọt nước, làm khô trong không khí.
- Cố định mẫu: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần.
- Nhuộm với dung dịch crystal violet, để 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
- Nhỏ cồn 95 % giữ khoảng 30 giây hoặc cho cồn chảy qua vết bôi vi khuẩn liên tục
đến khi nước cồn chảy không còn màu rửa lại nước và thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1 phút, rửa nước, để khô trong không
khí.
- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X.
Thử nghiệm catalase (Nguyễn Lân Dũng, 2009)
- Lấy sinh khối khuẩn lạc trên môi trường thạch TYEG sau 48 giờ ủ. Hoà tan sinh khối
vào giọt nước sẵn trên miếng lam.
- Thêm vào một hoặc vài giọt H2O2 3 %
- Quan sát sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả: Nếu dương tính thì có hình thành
bọt khí, nếu kết quả âm tính thì không có sự hình thành bọt khí.
Kiểm tra sự hình thành indol (John Harley and Lansing Prescott, 2002)
Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo indol từ việc phân giải acid amin
trytophan bởi enzym tryptophanase. Indol sinh ra kết hợp với andehyde có trong thuốc
thử Kovac’s tạo vòng màu hồng/đỏ trên bề mặt môi trường.
Tiến hành
- Cho vào ống nghiệm có nấp đậy 10 ml môi trường trypticase soyar broth (1 %), khử
trùng 121 o
C trong 15 phút, để nguội.
- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc cần kiểm tra chủng vào ống nghiệm chứa môi
trường, đậy nắp, ủ kỵ khí 48 giờ ở 37 o
C cho vi khuẩn phát triển.
- Mỗi ống nghiệm cho 0,5 ml thuốc thử Kovac’s.
- Đọc kết quả: Dương tính khi vòng Pellicle vàng của thuốc thử Kovac’s chuyển sang
màu hồng/đỏ trên bề mặt môi trường. Âm tính khi vòng Pellicle vàng của thuốc thử
Kovac’s không bị biến đổi.
Khả năng phản nitrat hoá (John Harley and Lansing Prescott, 2002)
Môi trường:
Nước thịt pepton 100ml
KNO3 1g
pH= 7,2 - 7,4
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 121 o
C trong 30 phút.

38. 28
Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá. Dùng vaselin bịt kín nút để ngăn oxy, đặt ở nhiệt độ thích
hợp trong 1 - 7 ngày và quan sát sự phát triển của vi khuẩn (tăng độ đục của dịch nuôi
cấy, sinh khí NH3). Vi khuẩn có phát triển là phản ứng dương tính, không phát triển là
phản ứng âm tính.
Khả năng làm dịch hoá gelatin (John Harley and Lansing Prescott, 2002)
Môi trường:
Pepton 5g
Gelatin 100 - 150g
Nước cất 1000 ml
pH= 7,2 - 7,4
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 115 o
C trong 20 phút.
Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18 - 24 giờ) chích sâu vào môi trường gelatin, giữ ống
không cấy làm đối chứng, nuôi ở 37 o
C trong thời gian 5 - 7 ngày.
Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 o
C trở xuống. Nếu bề
mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin vẫn ở trạng thái ổn định là phản ứng
âm tính (không sinh gelatinase); nếu một phần hay toàn bộ gelatin hoá lỏng là phản
ứng dương tính.
Vi khuẩn P. acnes là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que, catalase dương tính, có
khả năng sinh indol, tạo phản ứng phản nitrat và dịch hóa gelatin.
3.3.4.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết
cây Trứng cá
Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) tiến hành có những
điểm biến đổi phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm.

39. 29
Sơ đồ thí nghiệm
Môi trường dịch chiết tim TSB agar
Chủng 50 L huyền phù Propionibacterium acnes được nuôi 48 giờ, pha loãng đạt
mật số 108
tế bào/ ml, trải mẫu, để ráo
Tạo các giếng đường kính 6 mm
Bơm 30 l các cao chiết lần lượt vào các giếng, ủ mẫu nhiệt độ phòng trong 30
phút cho cao chiết trong giếng khuếch tán.
Ủ ở 37 o
C, 48 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn.
Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết
Tiến hành thí nghiệm
- Pha loãng cao chiết: các cao được pha lõang trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
thành các nồng độ khác nhau: cân 0,2 g cao cho vào 1ml DMSO ta được nồng độ 200
mg/ml, pha loãng thu được nồng độ 100 mg/ml, 50 mg/ml.
- Chuẩn bị đĩa môi trường dịch chiết agar, dày 4mm.
- Huyền phù P. acnes: các dòng vi khuẩn đã được nuôi cấy sau 48 giờ trong môi
trường lỏng tăng sinh khối, sao cho mật số vi khuẩn khoảng 108
tế bào/ml (tương
đương độ đục Mc Farland 0,5).
- Hút 50 l huyền phù P. acnes (mật số 108
tế bào/ ml), trải mẫu lên đĩa môi trường
TSB agar, để ráo. Đục 4 giếng đường kính 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng
2 - 3 cm.
- Bổ sung 30 l lần lượt các cao vào các giếng thạch. Đối chứng sử dụng levofloxacin
5 g/mL và đối chứng âm là DMSO. Tiến hành lần lượt ở các nồng độ khác nhau.
- Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra
môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Sau đó, ủ kỵ khí, ở 37 o
C trong 48 giờ.
- Đọc kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn theo công thức :

40. 30
ĐK (mm) = D-d
Trong đó ĐK: đường kính vòng vô khuẩn (mm).
D: đường kính vòng sáng xung quanh giếng thạch (mm).
d: đường kính giếng thạch (mm)
Thí nghiệm lặp lại 3 lần lấy giá trị đường kính trung bình.
3.3.4.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn
Propionibacterium acnes
Mục tiêu: xác định nồng độ nhỏ nhất của cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất,
có thể ức chế vi khuẩn P. acnes.
Nguyên tắc: xác định nồng độ thấp nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes của
cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
(agar well diffusion method) của (Đỗ Trung Đàm, 2006).
Tiến hành thí nghiệm
Tương tự như thí nghiệm trên nhưng ở các mức nồng độ khác nhau theo dãy sau 40
mg/ml; 20 mg/ml; 10 mg/ml và 5 mg/ml. Đối chứng âm là DMSO.
Đọc kết quả: nồng độ ức chế tối thiểu được xác định là nồng độ của cao chiết nhỏ nhất
mà ở đó không thấy sự phát triển của vi khuẩn P. acnes chính là giá trị MIC của cao
chiết trên vi khẩn P. acnes.
3.3.4.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết cho khả năng kháng
khuẩn cao nhất
Mục tiêu: xác định một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết có hiệu quả kháng
khuẩn cao nhất từ cây Trứng cá
Tiến hành thí nghiệm: tiến hành xác định một số hợp chất trong cao chiết Trứng cá
như: nhóm flavonoid, saponin, tanin. Các hợp chất flavonoid, saponin, tanin được định
tính bằng phương pháp trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết Trứng cá
Hợp chất Thực nghiệm Hiện tượng
Flavonoid 1 g cao chiết + 2 ml methanol + vài
hạt bột Mg + 0,5 ml HCl đđ
Dung dịch màu hồng tới đỏ
Saponin 5 g cao chiết + 5 ml nước cất, đun
ấm, lắc mạnh
Xuất hiện bọt bền
Tanin 1 g cao chiết + 20 ml nước cất, thêm
vài giọt NaCl và FeCl3 10 %
Xuất hiện tủa xanh lá cây,
xanh đen
Puguh et al., 2014

41. 31
Cao chiết
3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu thí nghiệm được xử lý và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS
Satistics 20, phân tích ANOVA với độ tin cậy 95 %, các giá trị trung bình được so
sánh bằng Duncan, các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU
Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm được trình bày trong hình 3.4
Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm
3.6. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ
- Đưa ra các tiêu chí chọn mẫu.
- Hiệu chỉnh các thiết bị trước khi sử dụng
- Sử dụng các thiết bị độ chính xác cao
- Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình
Nuôi cấy/ TYEG agar
Bốc hơi trên bếp cách thủy
Dịch chiết
Đun hồi lưu Ethanol 96 % trong 3
giờ ở 70 o
C
Bộ phận cây Trứng cá Vi khuẩn P. acnes
Nhận diện
Kháng khuẩn
Định tính bộ phận kháng
khuẩn cao nhất

42. 32
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ
4.1.1. Chiết cao
Sử dụng phương pháp chiết nóng đun hồi lưu và dung môi ethanol 96 % thu được
các loại cao chiết với kết quả thể hiện như sau
Bảng 4.1. Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá
Cao chiết Độ ẩm (%) Độ ẩm cao (%)
Lá
Vỏ thân
Quả chín
Quả non
12,8
13,0
-
-
17,38
15,00
19,05
18,82
Nhận xét: độ ẩm nguyên liệu khô lá và vỏ thân cây Trứng cá dưới 13 % đạt theo mô tả
độ ẩm dược liệu theo DĐVN IV. Độ ẩm trung bình của cao ở các bộ phân đều không
quá 20 %, cao thu được ở dạng cao đặc theo PL1.1 DĐVN IV. Độ ẩm trong cao quả,
chín là cao nhất trong bốn loại cao khảo sát (19,05 %).
Bảng 4.2. Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá
Cao chiết Khối lượng
khô (g)
Khối lượng
tươi (g)
Khối lượng
cao toàn phần
(g)
Hiệu suất
chiết (%)
Lá
Vỏ thân
Quả chín
Quả non
207,75
212,65
-
-
-
-
300
300
90,04
70,74
102,16
74,45
43,34
33,27
34,05
24,82
Nhận xét: khối lượng cao thu được cao nhất là ở quả chín (102,16 g) hiệu suất chiết
các lá, vỏ thân, quả non và quả chín với dung môi ethanol 96 % bằng phương pháp
đun hồi lưu lần lượt là 43,34 %; 33,27 %; 34,05 % và 24,82 % (so với khối lượng
khô). Hiệu suất chiết cao từ lá Trứng cá cao nhất trong bốn loại cao (43,34 %)
4.1.2. Nuôi cấy và nhận diện vi khuẩn Propionibacterium acnes
4.1.2.1. Kết quả đặc điểm hình thái của dòng vi khuẩn nuôi cấy
Đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N trên môi trường TYEG agar có bổ
sung 0,002 % bromocresol purple cho thấy: dòng vi khuẩn sinh trưởng chậm, khuẩn
lạc xuất hiện rõ sau 5 - 7 ngày nuôi cấy, kích thước khuẩn lạc nhỏ. Dòng vi khuẩn
134N có màu vàng đậm, tròn, mô cao hoàn toàn trên bề mặt môi trường, bìa nguyên.

43. 33
Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn, mô cao hoàn toàn trên bề mặt môi trường, bìa nguyên.
Màu sắc khuẩn lạc: khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N trên môi trường TYEG agar có
bổ sung bromocresol purple đều có màu vàng nhạt đến đậm.
Kích thước khuẩn lạc: đường kính khuẩn lạc của dòng vi khuẩn 134N có kích thước
dao động 0,8 - 1,3 mm sau 5 - 7 ngày nuôi cấy.
Hình 4.1. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung
0,002 % bromocresol purple.
a. Dòng vi khuẩn 134N màu vàng đậm
b. Dòng vi khuẩn 134N chụp nghiêng
Đặc điểm tế bào vi khuẩn
Quan sát hình thái của các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở vật
kính 100X (độ phóng đại 1000 lần) cho thấy dòng vi khuẩn có dạng que ngắn.
Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn P. acnes dưới kính hiển vi
a

44. 34
4.1.2.2. Kết quả đặc điểm sinh hoá dòng vi khuẩn nuôi cấy
Dòng vi khuẩn 134N thuộc vi khuẩn Gram dương (bắt màu tím xanh của crystal
violet), catalase dương tính (khuẩn lạc làm sủi bọt H2O2 3 %)
Hình 4.3. Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn phân lập
Dòng vi khuẩn 134N được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường trypticase soyar
borth trong 24 giờ ở 37 o
C, sau đó kiểm tra khả năng sinh indol bằng thuốc thử
Kovac’s. Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng vi khuẩn tạo được indol từ môi trường
nuôi cấy chứa trytophan vì làm biến đổi màu thuốc thử Kovac’s từ vàng sang đỏ.
Trong khi dòng đối chứng Staphylococcus aureus không có khả năng này.
Hình 4.4. Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn
a. Dòng vi khuẩn 134N tạo indol
b. Đối chứng không tạo indol

45. 35
Dòng vi khuẩn 134N được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường pepton và
KNO3 ở 37 o
C, sau đó kiểm tra khả năng phản nitrat hóa. Kết quả thí nghiệm cho thấy,
dòng vi khuẩn phân lập có khả năng khử NO3
-
môi trường sinh khí NH3 và vẫn phát
triển bình thường.
Hình 4.5. Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn phân lập
a. Dòng vi khuẩn 134N tạo phản ứng phản nitrat hóa
b. Đối chứng âm
Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 o
C trở xuống. Dòng vi
khuẩn 134N làm một phần bề mặt môi trường gelatin hoá lỏng lõm xuống phản ứng
dương tính, đối chứng âm môi trường gelatin không chứa dòng vi khuẩn 134N.
Hình 4.6. Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N
a. Dòng vi khuẩn 134N làm dịch hóa gelatin
b. Đối chứng âm

46. 36
4.1.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết
cây Trứng cá.
Khả năng ức chế vi khuẩn của cao chiết ethanol lá, vỏ thân, quả chín và quả
non cây Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol được xác định dựa trên khả năng ức
chế sự phát triển của vi khuẩn, thể hiện qua kích thước khoảng vô khuẩn được trình
bày bảng 4.3. Hiệu quả kháng khuẩn của các loại cao được khảo sát ở các nồng độ 200
mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả cho
thấy các loại cao lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá có khả năng ức chế
dòng vi khuẩn P. acnes.
Bảng 4.3. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của các loại cao cây trứng cá bằng
phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.
Ghi chú: số liệu đường kính vô khuẩn là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng
một cột, có số liệu có ít nhất 1 chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở ý
nghĩa 5%. Đối chứng (-): DMSO cho đường kính kháng khuẩn bằng 0.
Loại cao Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Đối chứng
dươngNồng độ cao chiết bằng ethanol (mg/ml)
50 100 200
DMSO
Levofloxacin
Vỏ thân 10,33 ± 0,577a
11,67 ± 1,155a
16,67 ± 2,309a
0 0
Quả chín 11 ± 0,000a
13,33 ± 1,528a
20 ± 1,000a
0 0
Quả non 11,67 ± 0,577b
18 ± 1,000b
20,67 ± 1,155b
0 8,67 ± 0,577b
Lá 16,33 ± 2,082c
19 ± 0,000b
23 ± 1,732b
0 8,67 ± 0,577b
p 0,032 0,000 0,010 0,000

47. 37
Hình 4.7. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây
Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml.
Ghi chú: (1) nồng độ 200 mg/ml; (2) nồng độ 100 mg/ml; (3) nồng độ 50 mg/ml;
(4) đối chứng âm DMSO; (5) đối chứng dương levofloxacin
Quả chín Quả sống

48. 38
Hình 4.8. Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ở
nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml
a. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 200 mg/ml
b. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 100 mg/ml
c. Nồng độ cao chiết từ lá Trứng cá 50 mg/ml
Nhận xét: qua kết quả thí nghiệm ở bảng 4.3 cho thấy cao Trứng cá chiết bằng dung
môi ethanol 96 % ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml đều có khả năng
ức chế dòng vi khuẩn 134N với kích thước khoảng vô khuẩn dao động từ 10,33 mm
đến 23 mm. Các nồng độ cao Trứng cá đều có khoảng vô khuẩn lớn hơn so với kháng
sinh đối chứng levofloxacin, cho thấy khả năng ức chế dòng vi khuẩn 134N của cao
Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96 % cao hơn kháng sinh đối chứng.. Khi so
sánh giữa các nồng độ, ở nồng độ 200 mg/ml tạo khoảng vô khuẩn cao nhất trong 3
nồng độ khảo sát đạt giá trị 16,67 ± 2,309 mm ở vỏ thân, 20 ± 1,000 mm ở trái chín,
20,67 ± 1,155 mm ở trái non và 23 ± 1,732 mm ở lá (mức ý nghĩa p = 0,032). Ở nồng
độ 200 mg/ml cao Trứng cá chiết bằng dung môi ethanol 96% tạo khoảng vô khuẩn
trên dòng P. acnes 134N từ 16,67 mm đến 23 mm trong đó ức chế mạnh nhất ở cao
chiết lá (khoảng vô khuẩn 23 mm) kế đến là trái non, trái chín và vỏ thân. Ở nồng độ
100 mg/ml, cao lá cho khoảng vô khuẩn lớn nhất 19 ± 0,000 mm. Ở nồng độ 50
mg/ml, cao lá cho khoảng vô khuẩn lớn nhất 16,33 ± 2,082 mm. Kết quả phân tích cho
thấy cao lá Trứng cá ở các nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml hiệu quả ức chế
dòng vi khuẩn 134N cao nhất, kích thước khoảng vô khuẩn trung bình ở từng nồng độ
200 mg/ml; 100 mg/ml; 50 mg/ml cao lá lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm;
16,33 ± 2,082mm. Từ đó sử dụng cao lá cho các thí nghiệm tiếp theo tìm MIC và định
tính một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trong cao lá Trứng cá.
4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn
Propionibacterium acnes
Dựa trên kết quả thí nghiệm trên, cao chiết từ lá Trứng cá được chọn để xác
định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn P. acnes và nồng độ được khảo sát lần
lượt là 40 mg/ml; 20 mg/ml; 10 mg/ml và 5 mg/ml. Đối chứng sử dụng: đối chứng âm

49. 39
là DMSO và đối chứng dương là levofloxacin (5µg/ml). Nồng độ ức chế tối thiểu là
nồng độ thấp nhất mà tại đó xuất hiện vòng vô khuẩn nên nồng độ ức chế tối thiểu
càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao.
Bảng 4.4. Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá
đối với vi khuẩn P. acnes.
Nồng độ cao chiết
(mg/ml)
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
40 11 ± 1
20 9 ± 1
10 6 ± 0
5 -
Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. (-) là không kháng khuẩn
Hình 4.9. Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes
Ghi chú: (1) nồng độ 5 mg/ml; (2) đối chứng dương levofloxacin; (3) nồng độ 10
mg/ml; (4) nồng độ 20 mg/ml; (5) nồng độ 40 mg/ml; (6) đối chứng âm DMSO.
Nhận xét: ở nồng độ 40 mg/ml cao chiết có khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes với
vòng vô khuẩn đạt 11 ± 1 mm. Nồng độ 20 mg/ml vòng vô khuẩn đạt 9 ± 1 mm Nồng
độ 10 mg/ml vòng vô khuẩn đạt 6 ± 0 mm. Nồng độ 5 mg/ml không quan sát thấy hiệu
quả kháng khuẩn của cao chiết lá trứng cá vòng vô khẩn bằng 0 mm.
Từ kết quả ta thấy nồng độ 10 mg/ml là nồng độ thấp nhất của cao chiết lá trứng cá có
khả năng ức chế vi khuẩn P.acnes.