Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34 s fmv

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN CÓ NGUỒN GỐC
THỰC VẬT DỰA TRÊN TRÌNH TỰ PROMOTER
34S-FMV
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Vũ Việt Dũng
Sinh viên thực hiện : Trần Quang Phát
MSSV: 1311100065 Lớp: 13DSH01
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

Đồ án tốt nghiệp
TP. Hồ Chí Minh, 2017
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không sao
chép dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân
thủ đúng nguyên tắc. Kết quả trình bày trong đề tài được thu thập trong quá trình
nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài nghiên cứu
này.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017
Sinh viên,
Trần Quang Phát

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô của trường Đại
học Công nghệ TP.HCM nói chung, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực
Phẩm - Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức, các
kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập.
Xin gửi đến TS. Nguyễn Tiến Dũng, ThS. Phạm Vũ Việt Dũng cùng với các anh
chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản
vùng 4 lời cảm ơn sâu sắc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu
dắt em trong suốt thời gian qua.
Xin ghi nhận công sức và những đóng góp quý báu, nhiệt tình của toàn thể các
bạn trong lớp 13DSH01 đã đóng góp ý kiến, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ đã nuôi dạy con đến ngày
khôn lớn và cho con ăn học thành tài.
Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian
ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự
góp ý của quý thầy cô để kiến thức của chúng em ngày càng hoàn thiện hơn, rút ra
được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập, làm việc sau này.
Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô của trường Đại học Công nghệ TP.HCM
dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình. Đồng kính chúc
quý thầy cô, anh chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học tại Trung tâm Chất lượng
Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thành công
tốt đẹp trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017
Sinh viên,
Trần Quang Phát

i
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU............................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................3
1.1. Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO)......................................................3
1.1.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO) .......................................3
1.1.2. Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen............................................4
1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay ..........5
1.2.1. Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới...................5
1.2.2. Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen..................................7
1.2.3. Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam 11
1.2.4. Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam..............12
1.3. Các phương pháp xác định cây trồng biến đổi gen......................................14
1.3.1. Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích...........................14
1.3.2. Phương pháp sử dụng DNA đích ........................................................14
1.3.3. Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc........15
1.3.4. Giới thiệu chung về phương pháp PCR ..............................................16
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................18
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................18
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ...........................................................................18
2.1.2. Thời gian nghiên cứu...........................................................................18
2.2. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................18
2.2.1. Nguồn mẫu ..........................................................................................18
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị...............................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................21
2.3.1. Phương pháp thu mẫu..........................................................................21
2.3.2. Phương pháp bảo quản mẫu ................................................................21
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA .............................................................21
2.3.4. Phản ứng PCR .....................................................................................24
2.3.5. Kỹ thuật điện di trên gel......................................................................28

ii
2.4. Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích GMO bằng kỹ thuật PCR.........31
2.5. Bố trí thí nghiệm ..........................................................................................32
2.5.1. Tách chiết DNA ..................................................................................32
2.5.2. Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR.....................................................32
2.5.3. Đánh giá các thông số kĩ thuật phương pháp ......................................34
2.6. Cải tiến phương pháp...................................................................................36
2.7. Khảo sát mẫu thị trường...............................................................................37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..........................................................38
3.1. Sản phẩm tách chiết DNA............................................................................38
3.2. Tối ưu hóa phản ứng PCR............................................................................39
3.2.1. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi................................................39
3.2.2. Khảo sát tối ưu nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR ..40
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA
trong phản ứng PCR .......................................................................................42
3.3. Đánh giá hiệu lực phương pháp...................................................................44
3.4. Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế bằng kĩ thuật PCR.........................46
3.5. Cải tiến phương pháp bằng phản ứng Realtime – PCR ...............................47
3.6. Kết quả khảo sát mẫu thực tế.......................................................................49
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................51
4.1. Kết luận........................................................................................................51
4.2. Kiến nghị......................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................53
PHỤ LỤC .............................................................................................................1

iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
g : microgam
M : micromole/lít
BĐG : Biến đổi gen
Bp : base pair
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
EDTA : Ethylene diaminetetra acetic acid
Elisa : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
EU : European Union
FMV : Virus dạng mosaic
GM : Genetically Modified
GMC : Genetically Modified Crop
GMO : Genetically Modified Organism
ISAAA : Tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học
trong nông nghiệp
IRRI : Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế
LOD : Limit of detection
mA : miliampe
mM : milimol/lít
PCR : Polymerase Chain Reaction
RNA : Ribonucleic acid
Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)
TBE : Tris-borate-EDTA
Tm : Temperature melting
U : Đơn vị tính hoạt tính của Taq polymerase
UV : Ultra Violet
V : Volt

iv
DANH SÁCH CÁC BẢNG SỬ DỤNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13] ...........................18
Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật..........................................................................19
Bảng 2.3. Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA.............................................22
Bảng 2.4. Chương trình phản ứng PCR...............................................................27
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR .........................................28
Bảng 2.6. Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành
phần phản ứng PCR.............................................................................33
Bảng 2.7. Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng............................................33
Bảng 2.8. So sánh kết quả thử khẳng định ..........................................................35
Bảng 2.9. Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR.................................36
Bảng 2.10.Chương trình phản ứng Realtime - PCR............................................37
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát..................................................................................42
Bảng 3.2. Chương trình nhiệt chạy phản ứng PCR sau tối ưu ............................43
Bảng 3.3.Thành phần hóa chất sau khi tối ưu hóa...............................................44
Bảng 3.4.Kết quả phân tích phát hiện promoter FMV trên mẫu chuẩn
MON89788 5% ...................................................................................44
Bảng 3.5. Kết quả giá trị đánh giá các thông số của phương pháp .....................45
Bảng 3.6. Diễn giải kết quả điện di .....................................................................46

v
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm.............4
Hình 1.2. Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo ISAAA
...............................................................................................................9
Hình 1.3. Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm..................10
Hình 1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18].........................11
Hình 2.1. Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus...................19
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No.
S1052...................................................................................................23
Hình 2.3. Các giai đoạn trong phản ứng PCR [1] ...............................................27
Hình 2.4. Các bước trong kỹ thuật điện di [1]....................................................29
Hình 3.1. Kết quả điện di tách chiết DNA từ mẫu thị trường .............................39
Hình 3.2. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện dương
tính GMO với các chủng vi sinh vật khác...........................................40
Hình 3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên
phản ứng PCR phát hiện GMO ...........................................................41
Hình 3.4. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên
phản ứng PCR phát hiện GMO ...........................................................41
Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA
.............................................................................................................43
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế được đề xuất.............46
Hình 3.7. Kết quả khuếch đại Realtime – PCR mẫu chuẩn.................................48
Hình 3.8. Đường xác định nhiệt độ nóng chảy của kết quả real-time PCR khoảng
80ºC.....................................................................................................48
Hình 3.9. Kết quả chạy điện di của sản phẩm Realtime – PCR ..........................49
Hình 3.10. Kết quả mẫu xét nghiệm GMO thị trường. .......................................50

1
LỜI MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học phát triển mở ra nhiều triển vọng cho cây trồng biến đổi
gen. Với những lợi ích mà cây trồng biến đổi gen mang lại (kháng sâu bệnh, tăng
năng suất, tăng giá trị dinh dưỡng...), cùng với những yêu cầu của con người ngày
càng tăng về vấn đề an ninh lương thực, nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng
và đặc biệt là đối phó với sự biến đổi của khí hậu... Cây trồng biến đổi gen được dự
báo sẽ tiếp tục tăng trong những năm tới [7]. Ở Việt Nam, để tạo đà cho phát triển
cây trồng biến đổi gen, nhiều cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long… đã có những
nghiên cứu cơ bản ban đầu như: sàng lọc các gen hữu ích, thiết kế vector chuyển
gen. Tới nay, đã có báo cáo kết quả ban đầu trong nghiên cứu cây chuyển gen đối
với cây ngô, đậu tương, lúa, bông ở Việt Nam nhưng còn rất hạn chế. Công tác
nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen ngày càng mạnh mẽ hơn, đặc biệt khi
việc khảo nghiệm đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của các
cây chuyển gen: ngô, bông vải và đậu tương với mục đích làm giống đã được Chính
phủ cho phép. Tại thị trường Việt Nam, một số hạt giống ngô chuyển gen đã được
cấp phép có nguồn gốc từ các công ty Syngenta, DEKALB, Pioneer Hi-bred đối với
tính trạng kháng sâu và thuốc trừ cỏ, bao gồm Bt11, GA21, bt11xGA21,
MON89034, NK603, MON89034xNK603, TC1507[28]. Các giống ngô này được
phép trồng khảo nghiệm trên diện rộng với mục đích làm thức ăn gia súc.
Mặc dù vẫn chưa có một khẳng định hợp pháp nào chứng minh thực phẩm biến
đổi gen có hại cho sức khỏe. Người tiêu dùng chúng ta có quyền lựa chọn việc sử
dụng hoặc không sử dụng thực phẩm biến đổi gen. Trước những tranh cãi như vậy,
có thể chọn mua các thực phẩm được chứng nhận là không chứa biến đổi gen (Non-
GMO) hoặc các thực phẩm hữu cơ - một loại thực phẩm hoàn toàn không chứa biến
đổi gen GMO có chứng nhận hữu cơ, hoặc tìm hiểu các cách nhận biết, hay phòng
tránh thực phẩm biến đổi gen trước khi có khẳng định chính thức từ loại thực phẩm
này. Sản phẩm GMO đã có mặt trên thị trường Việt Nam nhưng chưa được kiểm
soát chặt chẽ. Hiện nay GMO đã được quy định dán nhãn trên thị trường và được

2
phân tích phát hiện, định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau trong đó có
phương pháp khuếch đại DNA (PCR).
Hiện nay, đa số các phương pháp sàng lọc GMO dựa trên trình tự promoter 35S-
CaMV và terminator NOS. Để mở rộng thêm các trình tự sàng lọc GMO, chúng tôi
thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp phát hiện Genetically Modified Organism
- (GMO) dựa trên trình tự promoter 34S-FMV”. Đề tài được thực hiện tại Trung
tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4.
 Mục đích nghiên cứu:
Xây dựng hoàn chỉnh quy trình phát hiện GMO dựa trên trình tự promoter 34S-
FMV với các thông số về giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu đạt yêu cầu sử
dụng tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học của Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy
Sản vùng 4.
 Mục tiêu nghiên cứu:
Để hoàn thiện phương pháp đáp ứng yêu cầu đưa vào áp dụng thực tế, đề tài bao
gồm hai mục tiêu lớn:
- Tối ưu các thông số để thực hiện phản ứng PCR như nồng độ MgCl2, nồng
độ primer, nhiệt độ bắt cặp.
- Xác định các thông số của phương pháp: LOD50, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ
chính xác của phương pháp.
 Nội dung nghiên cứu:
- Tách chiết DNA từ mẫu thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen và kiểm tra
mức độ tinh sạch của sản phẩm tách chiết.
- Khảo sát và tối ưu nồng độ primer, nồng độ MgCl2, nhiệt độ bắt cặp của
mồi nhằm tối ưu hóa phản ứng PCR.
- Đánh giá hiệu lực sử dụng của phương pháp thông qua các thông số: LOD,
độ nhạy, độ đặc hiệu.
- Áp dụng quy trình để phân tích một số mẫu ngoài thị trường.
- Một số đề xuất cải tiến phương pháp.

3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO)
1.1.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO)
GMO (Genetically Modified Organism): sinh vật biến đổi gen, là một sinh vật
mà vật liệu di truyền của nó đã bị biến đổi theo ý muốn chủ quan của con người.
Công nghệ này thường được gọi là “công nghệ sinh học hiện đại” hoặc “công nghệ
gen”, đôi khi còn “công nghệ tái tổ hợp DNA” hoặc “kỹ thuật di truyền”. Nó cho
phép chuyển các gen riêng lẻ từ một loài này sang một loài khác, cũng như giữa các
loài không liên quan [16]. Ngoài ra cũng có thể có những sinh vật được tạo ra do
quá trình lan truyền của gen trong tự nhiên. Ví dụ quá trình lai xa giữa cỏ dại với
cây trồng biến đổi gen có cùng họ hàng có thể tạo ra loài cỏ dại mang gen biến đổi.
Sinh vật biến đổi gen có nhiều loại khác nhau. Nó có thể là các dòng lúa mỳ
thương mại có gen bị biến đổi do tia điện từ hoặc tia phóng xạ từ những năm 1950.
Nó cũng có thể là các động vật thí nghiệm chuyển gen như chuột bạch hoặc là các
loại vi sinh vật bị biến đổi cho mục đích nghiên cứu di truyền. Tuy nhiên hiện nay,
thông thường khi nói đến GMO người ta thường đề cập đến các cơ thể sinh vật
mang các gen của một loài khác để tạo ra một dạng chưa hề tồn tại trong tự nhiên.
GMC (Genetically Modified Crop) là loại cây trồng được lai tạo ra bằng cách sử
dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ thuật di
truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số
gene chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn [16].
Về mặt bản chất, các giống lai từ trước đến nay (hay còn gọi là giống truyền
thống) đều là kết quả của quá trình cải biến di truyền. Điểm khác biệt duy nhất giữa
giống lai truyền thống và giống chuyển gen là vật liệu di truyền (DNA) được chọn
lọc một cách chính xác dựa trên khoa học công nghệ hiện đại và chuyển vào giống
cây trồng để đem lại một tính trạng mong muốn một cách có kiểm soát. Công nghệ
gen có thể được sử dụng theo nhiều cách, ví dụ như kỹ thuật chống chịu stress(căng
thẳng) phi sinh học như hạn hán, nhiệt độ cực đại hoặc độ mặn, và các stress sinh
học, như côn trùng và mầm bệnh, thường có thể gây hại cho sự phát triển và tồn tại

4
của cây trồng. Công nghệ này cũng có thể được sử dụng để cải thiện hàm lượng
dinh dưỡng của cây, một ứng dụng có thể được sử dụng đặc biệt ở các nước đang
phát triển.
1.1.2. Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen
Cây trồng biến đổi gen được tạo ra lần đầu tiên vào năm 1982 bằng việc sử dụng
loại cây thuốc lá chống kháng sinh. Những khu vực trồng thử nghiệm cây thuốc lá
có khả năng chống thuốc diệt cỏ đầu tiên là ở Pháp và Hoa Kỳ vào năm 1986.
Năm 1987, Plant Genetic Systems (Ghent, Bỉ) là công ty đầu tiên phát triển cây
trồng thiết kế gen di truyền (thuốc lá) có khả năng chống chịu côn trùng bằng cách
biểu hiện các gen mã hóa protein diệt côn trùng từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis
(Bt), được thành lập bởi Marc Van Montagu và Jeff Schell. Trung Quốc là quốc gia
đầu tiên chấp nhận cây công nghiệp chuyển đổi gen với cây thuốc lá kháng virus
được giới thiệu lần đầu vào năm 1992, nhưng rút khỏi thị trường Trung Quốc vào
năm 1997 [25].
Hình 1.1. Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm
Cây trồng biến đổi gen đầu tiên được phê chuẩn bán ở Mỹ vào năm 1994 là cà
chua FlavrSavr, có thời gian bảo quản lâu hơn các loại cà chua thông thường. Năm
1994, Liên minh châu Âu phê chuẩn cây thuốc lá có khả năng chống thuốc diệt cỏ
bromoxynil. Năm 1995, khoai tây Bt đã được phê duyệt an toàn bởi Cơ quan Bảo vệ
Môi trường, trở thành cây nông sản kháng sâu đầu tiên được phê duyệt tại Hoa Kỳ.

5
Các loại cây trồng chuyển đổi gen sau đó cũng được chấp thuận giao dịch ở Mỹ
vào năm 1995: cải dầu với thành phần chuyển đổi (Calgene), ngô bắp có vi khuẩn
Bacillus thuringiensis (Bt) (Ciba-Geigy), bông kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil
(Calgene), bông kháng côn trùng (Monsanto), đậu nành kháng thuốc diệt cỏ
glyphosate (Monsanto), bí kháng virus (Asgrow) và cà chua chín chậm (DNAP,
Zeneca/Peto và Monsanto). Tính đến giữa năm 1996 đã có tổng cộng 35 phê chuẩn
được cấp cho 8 loại cây công nghiệp chuyển đổi gen và 1 loại hoa cẩm chướng, với
8 điểm khác nhau tại 6 quốc gia cộng thêm EU.
Năm 2000, lần đầu tiên các nhà khoa học đã biến đổi gen thực phẩm để gia tăng
giá trị dinh dưỡng bằng việc sản xuất ra hạt gạo vàng. Đây là giống lúa chứa hàm
lượng vitamin A cao hơn bình thường do Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) tạo
ra. Đặc điểm của loại lúa này chứa hàm lượng beta-caroten rất lớn. Mục đích của
các nhà khoa học khi tạo ra giống lúa siêu vitamin A chống bệnh về mắt hay thiếu
hụt vitamin A [12].
1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay
1.2.1. Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới
1.2.1.1. Cây trồng chống chịu thuốc diệt cỏ
Nhiều loại cây trồng đã được biến đổi gen nhằm kháng lại thuốc diệt cỏ phổ
rộng. Các cây trồng chuyển gen này chứa các gen giúp chúng phân hủy các thành
phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ, khiến chúng trở thành vô hại. Nông dân có thể
dễ dàng loại bỏ cỏ dại trong suốt vụ mùa và thoải mái chọn lựa thời điểm phun
thuốc. cây trồng kháng thuốc diệt cỏ không cần hoặc cần rất ít việc làm đất. Những
người phản đối cho rằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ có thể dẫn đến
tăng sử dụng thuốc diệt cỏ, kích thích sự kháng thuốc diệt cỏ ở cỏ dại và hủy hoại
đa dạng sinh học nông nghiệp.
Gần đây, hai hệ thống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được phát triển đối với đậu
nành, ngô, củ cải dầu và bông là: RoundupReady và Liberty Link. Một số sản phẩm
thương mại của nhóm này là:

6
- GA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang gen kháng thuốc trừ
cỏ).
- Bt11xGA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang tổ hợp 2 gen:
kháng sâu bộ cánh vảy và kháng thuốc trừ cỏ được tạo ra bằng phương
pháp lai truyền thống) [28].
1.2.1.2. Cây trồng kháng bệnh
Các cây trồng có thể bị bệnh gây ta bởi các loài nấm, vi khuẩn, virus, giun tròn
và các tác nhân khác. Nhiều các phương pháp công nghệ cao được đề xuất nhằm
bảo vệ thực vật khỏi các tác hại này. Đến nay, hầu hết các mối quan tâm tập trung
vào các thực vật chuyển gen kháng virus, nhưng việc sử dụng công nghệ sinh học
để kháng nấm, vi khuẩn hay giun tròn cũng được quan tâm.
Hai ví dụ về tăng trưởng cây GM thương mại trong lĩnh vực này là các cây
kháng côn trùng thể hiện gen Bt (từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis) và đu đủ GM
kháng virus [9].
1.2.1.3. Thực vật với thành phần thay đổi
Ngày càng nhiều giống cây trồng chuyển gen mới được khảo nghiệm với đặc
tính tăng giá trị và chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu công nghiệp và của
người tiêu dùng.
Các thực vật chuyển gen mới với thành phần biến đổi đem lại nhiều lợi ích cho
công nghiệp và người tiêu dùng. Chẳng hạn khoai tây với thành phần tinh bột biến
đổi và các hạt dầu được dùng để thay thế các sản phẩm dầu mỏ là mối quan tâm của
công nghiệp. Người tiêu dùng có nhiều lợi ích từ thế hệ cây trồng biến đổi gen tiếp
theo, thế hệ của gạo với mức độ tăng cường cao của sắt, vitamin A hay dầu thực vật
có thể làm giảm nguy cơ bệnh tim…
1.2.1.4. Cây trồng chống chịu áp lực
Các nhà sinh học thực vật sử dụng công nghệ sinh học để hoàn thiện cách thức
khiến các thực vật có thể thích nghi hơn với các thách thức môi trường như hạn hán,
mặn hay nhiệt độ thích hợp.

7
- Chịu hạn: Một cách tạo ra thực vật chịu hạn là lấy gen từ thực vật có khả năng
chịu hạn và chuyển vào cây trồng. Các thực vật hồi sinh (Xerophyta viscosa), nguồn
gốc từ vùng khô hạn phía nam châu Phi, chứa gen mã hóa duy nhất một protein
trong thành tế bào. Thực nghiệm chỉ ra rằng các thực vật nhận gen này có khả năng
chịu áp lực của hạn hán và độ mặn cao [21].
- Chịu mặn: Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng các thực vật có khả năng chịu mặn
cao chứa nồng độ cao chất glycinebetaine. Hơn nữa, thực vật có khả năng chịu mặn
trung bình có nồng độ trung bình và thực vật với khả năng chịu mặn thấp có ít hay
không chứa chất glycinebetaine. Khoai tây chuyển gen với khả năng sản sinh nhiều
glycinebetaine tăng khả năng chịu mặn.
1.2.1.5. Loại bỏ chất ô nhiễm
Thực vật và vi sinh vật có thể được cải biến để tăng khả năng hấp thu kim loại
nặng và phân hủy các sản phẩm dầu.
Các biện pháp công nghệ sinh học được áp dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm.
Thực vật biến đổi gen được biến đổi để tích lũy nồng độ cao các kim loại độc.
Một ví dụ của biện pháp này là sử dụng cây dương liễu với khả năng hút cadimi từ
đất ô nhiễm. Kim loại độc này được rễ cây hút nhanh chóng và sau đó được dự trữ
trong gỗ và lá để loại đi. Nhiều thực vật có khả năng hấp thu lượng nhỏ kim loại
nặng.
1.2.2. Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen
1.2.2.1. Tình hình thương mại hóa trên thế giới
Tỷ lệ canh tác cây trồng BĐG trong năm 2016 hồi phục lại mức cao với tổng
diện tích 185,1 triệu ha trên toàn cầu.
Năm 2016, sau hai thập kỷ thương mại hóa, 26 quốc gia đã trồng được 185,1
triệu ha cây trồng BĐG – tăng 5,4 triệu ha tương đương với 3% so với năm 2015.
Ngoại trừ sự sụt giảm trong năm 2015, đây là lần tăng thứ 20 liên tiếp về tỷ lệ canh
tác, trong đó đáng chú ý có 12 năm đạt mức tăng trưởng hai con số [11]. Cây trồng
BĐG cung cấp lựa chọn đa dạng hơn cho người tiêu dùng.

8
Các cây trồng BĐG đã được mở rộng ngoài 4 loại cây chính (ngô, đậu nành,
bông và cải dầu) nhằm mang tới nhiều lựa chọn hơn cho người tiêu dùng trên thế
giới. Những loại cây BĐG mới này gồm củ cải đường, đu đủ, bí, cà tím và khoai tây
cùng với sự xuất hiện của táo vào năm 2017. Khoai tây là giống cây trồng quan
trọng và chủ lực thứ tư trên thế giới; còn cà tím là loại rau được tiêu dùng số một tại
châu Á. Giống táo và khoai tây không thâm nâu có thể góp phần giảm lãng phí thực
phẩm. Thêm vào đó, nghiên cứu thực hiện bởi các tổ chức công cộng đã đưa các
cây trồng như gạo, chuối, khoai tây, lúa mì, đậu hồi, đậu triều, mù tạt và mía đường
vào các giai đoạn đánh giá nâng cao, có khả năng cung cấp nhiều lựa chọn cho
người tiêu dùng, đặc biệt tại các nước đang phát triển.
Các tính trạng và cây trồng BĐG mới đang được nghiên cứu và giới thiệu nhằm
mang thêm lợi ích cho nông dân và người tiêu dùng.
Đáng chú ý là các tính trạng và giống cây BĐG mới đang được thử nghiệm thực
địa để cung cấp tới nông dân và người tiêu dùng. Các loại cây này bao gồm các
giống trọng yếu như giống gạo vàng giàu beta-carotene đang được thử nghiệm tại
Philippines và Bangladesh; giống chuối BĐG kháng virus đầu buồng trồng tại
Uganda; giống chuối BĐG chống rầy nâu và giống lúa mì BĐG kháng bệnh, chịu
hạn, biến đổi lượng dầu và cấu thành hạt đang được thử nghiệm tại Úc; giống lúa
mỳ có sinh khối và sản lượng cao tại Anh; các giống khoai tây kháng bệnh mốc
sương Desiree và Victoria tại Uganda, cùng giống khoai tây kháng giun tròn và
bệnh mốc sương Maris Piper, giống khoai tây ít thâm và ít acrylamide canh tác tại
châu Âu; đậu triều và đậu hồi kháng sâu bệnh cùng mù tạt BĐG, vốn là các loại rau
và nguồn dầu chủ lực, được thử nghiệm tại Ấn Độ; giống mía đường chịu hạn trồng
tại Ấn Độ và Indonesia và cải camelina giàu omega-3 tại châu Âu [11].
Diện tích canh tác cây trồng BĐG toàn cầu tăng gần 110 lần, từ 1,7 triệu ha năm
1996 tới 185,1 triệu ha vào năm 2016 – khiến cây trồng BĐG trở thành công nghệ
cây trồng được ứng dụng nhanh nhất tại thời điểm hiện tại. Diện tích cộng dồn đạt
2,1 tỷ ha có được sau 21 năm (1996 – 2016) thương mại hóa cây trồng BĐG. Diện
tích canh tác cây BĐG tại các quốc gia đang phát triển chiếm 54% diện tích canh

9
tác toàn cầu (99,6 triệu ha); trong khi diện tích này tại các nước công nghiệp chiếm
46% (85,5 triệu ha) [11].
Hình 1.2. Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo
ISAAA
Bốn loại cây trồng BĐG chủ lực gồm: đậu nành, ngô, bông và cải dầu là các
giống BĐG được ứng dụng nhiều nhất tại 26 quốc gia. Diện tích canh tác đậu nành
BĐG đạt mức cao nhất 91,4 triệu ha, tương đương 50% diện tích canh tác của tất cả
các giống cây BĐG trên toàn cầu (185,1 triệu ha). Mặc dù có sự sụt giảm nhẹ tương
đương mức biên 1% so với năm 2015 (92,7 triệu ha), khu vực canh tác đậu nành
vẫn giữ mức bền vững 91,4 triệu ha. Xét trên diện tích canh tác toàn cầu của từng

10
loại cây trồng riêng lẻ, trong năm 2016 có 78% đậu nành, 64% bông, 26% ngô và
24% cải dầu là giống cây BĐG [11].
Tính trạng biến đổi gen đơn chống chịu thuốc trừ cỏ trên cây đậu nành, cải dầu,
ngô, cỏ linh lăng và bông hiện vẫn giữ ngôi vị thống trị với 47% diện tích canh tác
toàn cầu. Tuy vậy, tỷ lệ này có xu hướng giảm đi, cùng với sự tăng lên của cây
BĐG đa tính trạng (kết hợp tính trạng kháng sâu bệnh, chống cỏ dại và các tính
trạng khác). Diện tích canh tác cây trồng với tính trạng kháng cỏ dại là 86,5 triệu ha
năm 2016, chiếm 47% tổng diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha). Mặt khác,
diện tích canh tác cây trồng đa tính trạng đã tăng 29% trong năm 2016, đạt 75,4
triệu ha từ 58,4 triệu ha năm 2015. Theo đó, cây trồng đa tính trạng hiện chiếm 41%
diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha). Ví dụ ở Hoa Kỳ, ngô GM kháng côn
trùng được trồng trên diện tích 10,6 triệu ha và bao gồm 35% ngô (GM và không
GM) trồng ở cả nước [6].
Hình 1.3. Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm
1.2.2.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen tại Việt Nam
Ở Việt Nam, các sản phẩm từ cây trồng biến đổi gen được nhập khẩu về có kiểm
soát nhằm sử dụng chủ yếu trong sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Theo thống kê của Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong 9 tháng đầu năm
2015 nước ta nhập khẩu 2,59 tỷ USD thức ăn gia súc và nguyên liệu, trong đó thị
trường nhập khẩu chính là Argentina (42% thị phần), Mỹ (14% thị phần), Brazil
(7,8% thị phần) [22].

11
Hiện tại Việt Nam cho phép nhập khẩu những loại thực phẩm biến đổi gen và
được kiểm soát chặt chẽ đó là NK66 Bt; NK66 GT và NK66 Bt/Gt và Bt11, các
event MON89788, MON87705, 40-3-2, MON87705, MON87701, MON87708 của
đậu nành (Tham khảo tại phụ lục B, Danh mục cấp Giấy xác nhận thực vật biến đổi
gen).
Hình 1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18]
Đối với đậu tương, trong quý I năm 2017 đã nhập khẩu 137,1 nghìn tấn, trị giá
61,9 triệu USD, giảm 57,4% về lượng và giảm 52,1% về trị giá so với quý I năm
2016, tính riêng tháng 3/2017, nhập khẩu đậu tương tăng 27,8% về lượng và 28%
về trị giá so với tháng 2/2017, đây cũng là tháng tăng đầu tiên sau hai tháng suy
giảm liên tiếp đạt tương ứng 60,5 nghìn tấn, trị giá 27,3 triệu USD.
1.2.3. Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam
Trên thế giới có nhiều quốc gia cho phép nhập khẩu và sử dụng thực phẩm biến
đổi gen. Mỗi quốc gia đều đặt ra những quy định dán nhãn riêng. Mỹ là một trong
những quốc gia có yêu cầu cao về việc dán nhãn thực phẩm biến đổi gen GMO. Cụ
thể, từ ngày 01/07/2016 tất cả các sản phẩm GMO bày bán tại bang Vermont (Mỹ)
đều phải dán nhãn.
Brazil hiện là nước sản xuất cây trồng GMO lớn thứ hai trên thế giới cũng yêu
cầu dãn nhãn cho cả hai loại thực phẩm làm thức ăn cho người hoặc động vật nếu
có chứa hoặc được sản xuất từ GMO.

12
Trong khi đó tại một số nước, việc quy định dán nhãn dựa trên tỷ lệ GMO trong
một sản phẩm thực phẩm. Cụ thể, những nơi như Liên minh châu Âu, Ả-rập Saudi,
Thổ Nhĩ Kỳ và Úc tỷ lệ GMO ở ngưỡng 0,9%. Các nước khác cho phép đưa GMO
vào mức độ cao hơn như Hàn Quốc là 3% và Nhật Bản là 5% [27].
Theo thông tư liên tịch số 45 giữa Bộ Khoa học Công nghệ và Bộ Nông nghiệp
và Phát triển Nông thôn ban hành cuối tháng 11/2015 thì từ 08/01/2016, thực phẩm
GMO được đóng gói sẵn bắt buộc phải dán nhãn bằng tiếng Việt có ghi rõ “biến đổi
gen”. Bên cạnh đó, với sản phẩm đóng gói sẵn có ít nhất một thành phần nguyên
liệu GMO lớn hơn 5% tổng nguyên liệu được sử dụng đều phải ghi nhãn khi lưu
thông tại thị trường Việt Nam. Đối với những sản phẩm có diện tích để ghi nhãn
nhỏ hơn 10cm2
thì trên nhãn bắt buộc phải có tên hàng hóa và cụm từ “biến đổi
gen”; những nội dung bắt buộc còn lại không thể hiện trên nhãn thì phải được ghi
trong tài liệu kèm theo hàng hóa.
Theo thông tư 45, một số trường hợp được miễn ghi nhãn GMO bao gồm:
- Thực phẩm mang theo người nhập khẩu để tiêu dùng cá nhân trong định
mức được miễn thuế nhập khẩu; thực phẩm trong túi ngoại giao, túi lãnh sự;
thực phẩm tạm nhập tái xuất, thực phẩm quá cảnh, chuyển khẩu; thực phẩm
gửi kho ngoại quan; thực phẩm là mẫu thử nghiệm hoặc nghiên cứu; thực
phẩm là mẫu trưng bày hội chợ, triển lãm;
- Nguyên liệu, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, bao bì
chứa đựng thực phẩm, nhập khẩu về để sản xuất nội bộ không bán ra thị
trường, chỉ vận chuyển nội bộ giữa các kho từ tỉnh này qua tỉnh khác thuộc
cùng một hệ thống trong doanh nghiệp [5].
1.2.4. Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam
Công nghệ sinh học là một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam. Do đó, việc nghiên
cứu và ứng dụng GMO mới đang bước những bước đầu tiên trong quá trình phát
triển. Một vài nghiên cứu về GMO mới chỉ diễn ra trong quy mô phòng thí nghiệm
và tập trung ở một số viện nghiên cứu đầu ngành trong cả nước thuộc Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Trong đó,

13
tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các nghiên cứu tạo GMO chủ yếu trên
đối tượng vi sinh vật, thực vật, động vật và được tiến hành ở các phòng thí nghiệm
của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới. Tại Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn, các nghiên cứu thường được tiến hành trên đối tượng thực vật
tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng song Cửu
Long.
Nhìn chung, trong quy trình nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan
trọng đầu tiên được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý
có giá trị ứng dụng cao tiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên
những giống lý tưởng. Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao
gồm gen chịu hạn, lạnh, kháng bệnh ở lúa; gen cry và vip mã hóa các protein độc tố
có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gen mã hóa
protein bất hoạt hóa ribosome ở cây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây
đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng; gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh
đốm vòng ở cây đu đủ; gen mã hóa kháng nguyên vỏ của các chủng virus dại… Các
gen có giá trị y dược phải kể đến các gen mã hóa cho một số kháng nguyên của
virus và vi khuẩn như gen mã hóa kháng nguyên E của virus Dengue typ I và typ II
sử dụng trong chuẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue [23]. Song song với
những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị
chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng
thí nghiệm trên cả nước. Trên đối tượng thực vật, hướng nghiên cứu hoàn thiện các
phương pháp chuyển gen và các quy trình tái sinh cây khởi đầu cho những nghiên
cứu chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng cũng nhận được sự quan tâm
của nhiều nhóm tác giả. Gần đây, hướng nghiên cứu nuôi cấy tế bào động vật nhằm
hoàn thiện quy trình tiến tới sử dụng để biểu hiện gen trên tế bào động vật nuôi cấy
cũng bắt đầu được tiếp cận nghiên cứu.

14
1.3. Các phƣơng pháp xác định cây trồng biến đổi gen
1.3.1. Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích
Protein có thể phát hiện được bằng cách ứng dụng các kháng thể đặc thù. Trong
trường hợp này, một kháng thể đặc thù thường được tạo ra để phát hiện một protein.
Mức độ ái lực của các kháng thể đối với protein sẽ phụ thuộc vào cấu hình protein
sau khi tách chiết. Tính đặc trưng của kháng thể được sử dụng cần được chứng
minh (ví dụ: không có khả năng phản ứng chéo). Việc phát hiện sinh vật biến đổi
gen qua phân tích dòng đặc hiệu bằng định lượng protein không thể thực hiện được
chính xác nếu có nhiều hơn một sinh vật biến đổi gen có biểu hiện cùng một
protein.
Các phương pháp sàng lọc có thể có lợi cho việc đánh giá sản phẩm có chứa hay
không chứa các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen dựa trên sự có mặt
các protein biểu hiện. Các ví dụ về phương pháp sàng lọc là dạng mẫu que thử và
ELISA định tính. Việc định lượng sinh vật biến đổi gen trong một loại chất nền nhất
định có thể được thực hiện bằng các phương pháp dựa vào protein, chẳng hạn như
phương pháp dùng ELISA. Phương pháp này có thể phù hợp với chất nền cần phân
tích và các chất chuẩn có thể được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn để từ đó tính
được hàm lượng protein trong mẫu thử nghiệm.
1.3.2. Phương pháp sử dụng DNA đích
Đặc trưng của các phương pháp phân tích sử dụng DNA đích là để xác định sự
có mặt của các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, phụ thuộc vào các
tính chất cụ thể của trình tự DNA đích. Ứng dụng và phân loại khác của tính đặc
hiệu như sau:
Phương pháp dựa vào taxon đích: Tìm thấy các trình tự DNA trong một taxon
đích, thường là một loài nhưng có thể là cấp phân loại nhỏ hơn hoặc cao hơn. Các
phương pháp dựa vào taxon đích có thể dùng để đánh giá sự có mặt, chất lượng và
số lượng DNA có nguồn gốc từ taxon và đôi khi được sử dụng như là một điểm
chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen. Tính đặc hiệu
cần được xây dựng bằng các số liệu thực nghiệm.

15
Phương pháp sàng lọc tìm thấy: Các trình tự DNA đích trong một vài loài nhưng
không nhất thiết trong toàn bộ các dòng biến nạp. Các trình tự này cũng được tìm
thấy trong nguyên liệu không biến đổi gen, chẳng hạn do sự có mặt của virus và vi
khuẩn tự nhiên. Các phương pháp sàng lọc giúp cho việc đánh giá sự có mặt hay
không có mặt sản phẩm có chứa nguyên liệu có nguồn gốc biến đổi gen. Ví dụ,
phương pháp sàng lọc là định tính PCR để phát hiện đoạn khởi động 35S-CaMV
[3].
1.3.3. Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc
Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) 35S của
virus khảm súp lơ (CaMV): Do promoter 35S-CaMV có mặt trong một số thực vật
biến đổi gen. Đoạn DNA 195bp trong promoter 35S-CaMV được khuếch đại bằng
PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza sau khi tách (Phụ lục B,
TCVN 7605:2005).
Phát hiện trình tự kết thúc (terminator) trên gen nopalin synthaza (NOS) có
nguồn gốc từ Agrobacterium tumefaciens: Do nhiều thực vật biến đổi gen có chứa
trình tự NOS-terminator nên phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc sự
có mặt của thành phần từ thực vật biến đổi gen. Đoạn DNA có kích thước 118bp
nằm trong trình tự kết thúc (terminator) của NOS được khuếch đại bằng PCR và
được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza (Phụ lục B, TCVN 7605:2005).
Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) FMV 34S ở
cây cải dầu GM RT73. Do promoter 34S-FMV có mặt trong một số thực vật biến
đổi gen. Virus dạng mosaic (FMV) là một phân đoạn, virus RNA sợi đơn (mạch
âm) được xác định là tác nhân gây bệnh rêu mồi (Ficus carica) trên cây cải dầu.
FMV có thể gây ra một loạt các triệu chứng khác nhau ở mức độ nghiêm trọng,
trong đó có lá úa biến dạng và khảm hoặc đổi màu hoa văn, cũng như khảm trên hoa
quả non. Promoter FMV có chiều dài 196bp thường được chuyển các gen ở cây cải
dầu, đậu nành. Sự hiện diện của promoter 34S-FMV có trong nhiều cây biến đổi
gen, đặc biệt là trong hạt cải dầu, khoai tây, đậu nành, bông, cà chua, củ cải. Một số
event được phát hiện bởi promoter 34S-FMV RT73 cải dầu, MON1445, MON1698

16
và MON88913 của vải, MON89788 ở đậu nành, H7-1 ở củ cải đường. Một số event
không phát hiện được như đậu nành 40-3-3 và MON810, MON863, TC1507, giống
ngô Bt11, GA21, NK603, Bt176 (Phụ lục B, ISO 21569:2005/2013).
1.3.4. Giới thiệu chung về phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự
(Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các
nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.
 Nguyên tắc:
Đây là phương pháp invitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các
bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase.
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng
hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, đó
là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch
khuôn. Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA
polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba
giai đoạn:
 Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành dạng mạch đơn.
 Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.
 Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.
Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử
dụng máy giải trình tự tự động.
Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự
nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh
quang. Phương pháp này có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến trên các
phòng thí nghiệm thế giới.
Hiện nay có nhiều phương pháp PCR cải tiến như nested PCR, PCR đẳng nhiệt,
Realtime PCR.

17
Định nghĩa kỹ thuật Realtime PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc
kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu. Phương
pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát
huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết
quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.
Nguyên tắc thực chất hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối
với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR cho biết kết quả
lượng DNA hình thành ở từng thời điểm trong suốt tiến trình phản ứng Realtime
PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo
độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.
Multiplex PCR bao gồm nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất để tạo
ra bản sao kích thước khác nhau đặc trưng cho các trình tự DNA khác nhau. Với
nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc, nhiều thông tin thu được từ một lần
chạy mà không đòi hỏi nhiều hóa chất và thời gian thực hiện. Nhiệt độ gắn mồi phải
được tối ưu hóa cho từng cặp mồi để chúng có thể thực hiện chính xác trong một
cặp bazo phải khác nhau để tạo ra các băng có thể phân biệt bằng mắt thường khi
điện di [24].
Nested PCR làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu
do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu. Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng
PCR liên tiếp. Trong phản ứng đầu tiên, một cặp mồi được sử dụng để tạo ra các
sản phẩm DNA, bên cạnh đoạn DNA đích mà phản ứng hướng đến vẫn có thể bao
gồm các đoạn DNA khuếch đại không đặc hiệu. Các sản phẩm sau đó được sử dụng
tiếp phản ứng PCR thứ hại với cặp mồi mà vị trí gắn khác hoàn toàn hoặc khác một
phần từ vị trí 3 của mỗi mồi ở phản ứng đầu tiên. PCR lồng thường thành công hơn
phản ứng PCR thông thường, đặc biệt trong trường hợp khuếch đại các đoạn DNA
dài, nhưng nó cũng đòi hỏi thông tin chi tiết hơn về các trình tự đích [24].

18
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng Kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng
Nông Lâm Thủy Sản vùng 4.
Địa chỉ: 30 Hàm Nghi, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Nguồn mẫu
2.2.1.1. Nguồn mẫu xét nghiệm
Mẫu đối chứng dương do phòng Kiểm nghiệm Sinh học cung cấp được thực
hiện để đánh giá phương pháp.
Mẫu được thu bên ngoài với 10 nguồn mẫu ngẫu nhiên để phân tích thực nghiệm
bằng phương pháp.
2.2.1.2. Mồi phản ứng PCR
Kích thước sản phẩm khuếch đại là 196bp
Mồi xuôi FMV-F: 5-AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3
Mồi ngược FMV-R: 5-CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3
Bảng 2.1. Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13]
Tên
cặp
mồi
Mã số
Gen Bank
Trình tự oligonucleotide
Tm
cặp mồi
Kích
thước
khuếch
đại (bp)
FMV AR016589
5-AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3
5-CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3
52 - 65 196bp
2.2.1.3. Thang DNA
Để ước lượng kích thước các đoạn DNA được khuếch đại, trong nghiên cứu này
sử dụng loại thang 100bp Ladder Plus (Promega) bao gồm 11 vạch với kích thước
như:

19
Hình 2.1. Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus
2.2.1.4. Mẫu chuẩn GMO, chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
Mẫu sử dụng chính cho nghiên cứu và dùng làm đối chứng dương là các mẫu
chuẩn dương GMO. Các vi sinh vật gây bệnh lan truyền qua đường thực phẩm khác
cũng được sử dụng trong phần đánh giá hiệu lực sơ cấp của phương pháp và khẳng
định độ đặc hiệu, tính chọn lọc của cặp mồi đã chọn.
Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật
STT Tính thuần
của chủng
Tên chủng Nguồn gốc
Số
lượng
Ký hiệu
1
Thuần
chủng
Chứng dương GMO MON89788 01 GMO
2 Norovirus GI
Microbiologics
HE0013S
01 NoV-GII
3 Norovirus GII
Microbiologics
HE0013S
01 NoV-GI
4 Virus gây bệnh đốm trắng Kit IQ2000 01 WSSV
5 Virus gây bệnh đầu vàng Kit IQ2000 01 YHV
6 Mengovirus ATCCVR-2310 01 MeV
7 Vibrio parahaemotilycus ATCC 17802 01 V.para

20
8 Eschechiria coli ATCC 25922 01 E.coli
9 Salmonella Typhymurium ATCC 14028 01 S.typhi
10 Staphylococcus aureus ATCC 6538 01 S.aureus
*ATCC là chủng vi sinh vật chuẩn.
*Kit IQ2000 là bộ kit dùng để phát hiện các virus gây bệnh trên tôm, cá và đƣợc
cung cấp bởi hãng GeneReach Biotecnology Corp (Đài Loan) bao gồm: virus gây
bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus-WSSV); virus gây bệnh đầu vàng
(Yellow head virus-YHV).
2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.2.1. Hóa chất
- Lysis Buffer
- Protein K nồng độ ≥ 30U/mg
- Binding Buffer
- Pre - Wash Buffer
- Wash Buffer
- Ethanol
- Elution
- Nuclease - Free Water
- Buffer phản ứng (5X Colorless GoTaq Flexi Buffer)
- MgCl2 25mM
- dNTP thành phần (PCR Nucleotide Mix)
- Mồi xuôi (Upstream primer)
- Mồi ngược (Downstream primer)
- Gotaq G2 Hot Start Polymerase
- Đệm TAE 1X (4,48g Tris; 2ml Na2EDTA 0,5M pH 8; 1,14ml glacial acetic
acid; nước cất đủ 1000ml)
- Agarose phân tích sản phẩm sau phản ứng PCR
- Dung dịch nạp mẫu Blue/Orange Loading Dye 6X, thuốc nhuộm Dynamid
Nucleotid Dye 6X

21
- Bộ Kit TaKaRa EX Taq
2.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Cân kỹ thuật (d = 0,01gram)
- Cân phân tích (d = 0,0001gram)
- Tủ ấm 37ºC
- Bể ổn nhiệt
- Nồi hấp
- Tủ sấy
- Tủ bảo quản hóa chất 2 - 8ºC
- Tủ bảo quản chủng -30ºC
- Tủ an toàn sinh học Nuve MN120
- Máy vortex
- Máy PCR (Applied Biosystems ABI 2720 Thermal Cycler)
- Bộ điện di DNA liền nguồn Mupid-eXU
- Bộ chụp ảnh điện di (ATTO) và Video Graphic Printer
- Pipet, transferpipet các mức 1-10l; 10-100l; 100-1000l
- Máy đo OD
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu được thu và cắt đủ lượng tách chiết và đựng trong các ống falcon, lưu trữ
trong tủ lạnh -30ºC.
2.3.2. Phương pháp bảo quản mẫu
Mẫu dư sau khi phân tích được bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4ºC hoặc bảo
quản trong cồn.
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA
2.3.3.1. Hóa chất tách chiết
Tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No. S1052 tách chiết
DNA: Proteinase K, đệm ly giải (Lysis buffer), đệm gắn kết (Binding buffer), đệm

22
rửa 1 (Pre-Wash buffer), đệm rửa 2 (Wash buffer), đệm ly giải DNA (Elution
buffer).
Bảng 2.3. Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA
Hóa chất Tác dụng
Đệm ly giải
(Lysis buffer)
Dung dịch đệm phá vỡ cấu trúc tế bào
Proteinase K Thủy phân protein, đặc biệt là protein liên kết với DNA.
Đệm gắn kết
(Binding buffer)
Thu acid nucleic
Đệm rửa 1
(Pre-Wash buffer)
Rửa sản phẩm không mong muốn
Đệm rửa 2
(Wash buffer)
Rửa sạch sản phẩm tạp còn lại
Đệm ly giải DNA
(Elution buffer)
Tủa protein, đẩy lipit lên bề mặt dung dịch, tạo thuận lợi
cho việc thu nhận DNA
2.3.3.2. Cách thực hiện tách chiết
Bước 1: Chuẩn bị 50mg mẫu sau đó thêm vào 400l đệm ly giải và 20l
Proteinase K
Bước 2: Đem mẫu đi ủ ở nhiệt độ 65ºC trong thời gian 30 phút, ly tâm 12000
vòng/phút.
Bước 3: Bỏ cặn thu dịch DNA, sử dụng cột lọc Receiver Tube tiếp tục ly tâm
12000 vòng/phút
Bước 4: Bổ sung 200l đệm gắn kết ly tâm 12000 vòng/phút bỏ dịch thu lại cột
lọc
Bước 5: Thêm 550µl đệm rửa 1 rửa lần một, ly tâm 12000 vòng/phút
Bước 6: Thêm 550l đệm rửa 2 rửa lần hai, ly tâm 12000 vòng/phút loại bỏ
nước

23
Bước 7: Ủ 100l đệm ly giải DNA ở 65ºC, giữ ở nhiệt độ này. Cho vào cột lọc
ly tâm 10000 vòng/phút thu dịch DNA.
2.3.3.3. Quy trình chung tách và tinh sạch DNA bằng Kit SureFood PREP Basic
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic
Art. No. S1052
 Lưu ý:
- Cần ủ 100µl đệm ly giải DNA ở nhiệt độ 65ºC trước khi tách chiết DNA.
- Bật máy heat nhiệt (gia nhiệt) trước khi tách chiết.
- Lấy Proteinase K trong tủ đông khi sử dụng, tránh để môi trường ngoài.

24
2.3.3.4. Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích
Mẫu DNA ly trích được điện di trên gel Agarose 1% trong dung dịch đệm
TBE1X ở hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 400mA trong 30 phút.
Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA. Dưới tia UV,
Diamond Dye đã liên kết với sợi DNA sẽ phát quang và tạo thành các vạch trên gel.
Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích, có thể tiến hành tính tỷ lệ
OD260nm/OD280nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 thì mẫu ly trích
được xem là sạch. Nếu tỷ lệ < 1,8 là mẫu nhiễm nhiều protein, tỷ lệ > 2,0 thì cần
tiến hành pha loãng mẫu và thực hiện đo lại giá trị OD.
2.3.4. Phản ứng PCR
2.3.4.1. Khái niệm
Kỹ thuật PCR được phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học Mỹ Mullis và
cộng sự. Phát minh này đã đem đến cho Millis giải Nobel Hóa học năm 1993.
PCR là phương pháp khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc
hiệu invitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lượng DNA mẫu rất
nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và
hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được
thu nhận từ DNA mẫu.
2.3.4.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR
 Mẫu DNA:
Mẫu DNA sẽ được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên
cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau. Đối với DNA thực vật thường được ly
trích từ mô lá, DNA động vật thường được ly trích từ máu, lông, mô…
Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao, tuy
nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết.
Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR vào khoảng 5 - 10ng. Nồng độ DNA
có thể xác định được nhờ đo OD (mật độ quang) ở bước sóng 260nm. Khi DNA
tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức:
- 1 OD260nm = 50 ng/µl (đối với DNA sợi kép).

25
- 1 OD280nm = 40 ng/µl (đối với DNA sợi đơn).
 Primer (mồi):
Là một đoạn nucleotide có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch
đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi)
và R-primer (mồi ngược).
Cặp primer sẽ quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR, nếu primer được thiết
kế đúng thì đoạn DNA đích mới được khuếch đại chính xác.
 dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP):
Nồng độ dNTPs thường được sử dụng là 20 - 200µM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn
đến sự ức chế phản ứng. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs
cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Thông thường thì nồng độ của các dNTPs sẽ là
như nhau. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao
chép của DNA polymerase.
Nồng độ dNTPs thích hợp cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ
Mg2+
, nồng độ primer, số chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được
khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTPs tối ưu cho từng phản ứng phải được xác định
qua thực nghiệm.
 Dung dịch buffer:
Tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt động.
 Taq polymerase:
Ban đầu, khi chưa sử dụng enzyme Taq polymerase người ta phải thêm DNA
polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng
hợp DNA nhưng không chịu được nhiệt độ lớn hơn 90ºC ở giai đoạn biến tính tách
hai sợi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase được phát hiện, đây là một
loại DNA polymerase bền với nhiệt, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus
sống ở suối nước nóng. Với enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là
được.
Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,1 - 0,5 đơn vị/100µl
dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm không mong muốn có

26
thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ lượng
enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn.
Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide
loại A vào đầu tận cùng 3 của sản phẩm PCR, điều này rất quan trọng trong việc
tạo dòng (TA - cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng
là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq
polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu…
 Ion kim loại Mg2+
:
Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động.
2.3.4.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Phản ứng PCR thường được thực hiện qua 35 - 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm
các bước: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài).
Giai đoạn denature (biến tính DNA): thường được tiến hành ở nhiệt độ từ 94 -
98ºC, trong 40 - 60 giây (thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài của
DNA mẫu). Đây là bước làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn dưới tác
dụng của nhiệt độ bằng cách phá vỡ các liên kết hydro.
Giai đoạn annealing (gắn mồi): 50 - 60ºC trong 30 giây. Đây là bước primer gắn
đặc hiệu vào sợi DNA đích (lúc này ở dạng sợi đơn). Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc
vào độ dài của từng cặp primer.
Giai đoạn extension (kéo dài): 72ºC, 30 - 90 giây tùy thuộc độ dài DNA đích.
Đây là bước kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ở nhiệt độ 72ºC,
hoạt động của Taq polymerase sẽ đạt hiệu quả tối ưu.
Sau 25 - 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72ºC trong 5 - 20 phút để
hoàn thiện các sản phẩm PCR.

27
Hình 2.3. Các giai đoạn trong phản ứng PCR [1]
2.3.4.4. Chương trình phản ứng PCR
Bảng 2.4. Chương trình phản ứng PCR
Bƣớc Số chu kỳ
Nhiệt độ
(ºC)
Thời gian (giây)
1 1 95 300
2
40
95 30
3 55 - 65 30
4 72 60
5 1 72 420
6 1 4  (giữ lạnh cho tới chạy điện di)

28
2.3.4.5. Thực hiện phản ứng PCR
Các thí nghiệm phân tích FMV bằng phản ứng PCR đều được thực hiện với thể
tích phản ứng là 25µl trong ống eppendorf 0,2ml của bộ Kit TaKARa EX Taq với
thành phần hỗn hợp phản ứng chưa tối ưu hóa như trong bảng:
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR
STT Hóa chất Nồng độ một phản ứng Thể tích hút (µl)
1 Bufer 10X 1X 2,5
2 MgCl2 25mM 1 – 4 mM 1 – 4
3 dNTP 0,2mM mỗi dNTP 2,0
4 Mồi Xuôi 0,1 - 1µM 0,2 – 2,5
5 Mồi Ngược 0,1 - 1µM 0,2 – 2,5
6 Tag Polymerase 5U/µl 0,1
7 Nuclease-Free Water / Vừa đủ 25µl
Tiến hành nạp 3µl dịch DNA vào ống mastermix PCR. Nhẹ nhàng vortex bằng
pipet, tránh tạo bọt, ly tâm nhẹ (spin) để toàn bộ hỗn hợp này di chuyển vào đáy ống
eppendorf và tiến hành chương trình nhiệt cho phản ứng PCR.
2.3.4.6. Ưu nhiệt điểm của phản ứng PCR
 Ưu điểm:
Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA để thực hiện.
 Nhược điểm:
Do quá nhạy nên có thể cho kết quả dương tính giả: trong một số trường hợp cây
bị nhiễm bệnh hoặc ngoại nhiễm DNA từ môi trường thì phản ứng PCR vẫn cho kết
quả dương tính. Do đó, nếu cần thiết nên sử dụng thêm các phương pháp nhận dạng
sản phẩm PCR như: giải trình tự, dùng enzyme cắt hạn chế…
2.3.5. Kỹ thuật điện di trên gel
Nguyên tắc chung của kỹ thuật điện di: trong cùng một điện trường, các phân tử
sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau tùy thuộc vào kích thước và điện tích của chúng.

29
Nếu hai phân tử có cùng khối lượng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di
chuyển về điện cực trái dấu nhanh hơn.
Hình 2.4. Các bước trong kỹ thuật điện di [1]
Đối với DNA, việc điện di được thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi
trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleotide đi qua. Kích thước phân
tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel thường được sử
dụng tùy theo kích thước và mức độ phân tách của phân tử nucleotide: gel agarose
và gel polyacrylamide.
 Gel agarose: Lỗ có đường kính trung bình, cho phép phân tách các phân tử
DNA sợi đôi, kích thước 100 - 1000bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho
phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau.
 Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn
DNA có kích thước dưới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt đến 1 nucleotide.
Lưu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên
cần phải cẩn thận khi sử dụng.

30
Sau khi phân tích bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta
sử dụng một số phương pháp phát hiện sau:
 Đối với gel agarose: Nhuộm bằng Diamond Dye, chất này sẽ gắn xen vào giữa
các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại (UV). Điều
này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel.
 Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ và vị trí của nó sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự
ghi. Ngoài ra, các phân tử DNA còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm
chuyên biệt.
Trong nghiên cứu chỉ sử dụng phương pháp điện di trên agarose nhằm kiểm tra
kết quả tách chiết DNA và phân tích sơ bộ sản phẩm PCR.
Chuẩn bị gel agarose 2% bằng cách cân 2g agarose vào chai thủy tinh 250ml,
thêm vào 100ml đệm TAE 1X, đun bằng lò vi sóng (microware) trong 3 phút cho
đến khi agarose tan hoàn toàn, lắc đều. Để nguội đến khoảng 60ºC. Nhẹ nhàng cho
hỗn hợp gel này vào trong khay đổ gel đã chuẩn bị sẵn cùng với các lược tạo giếng.
Để yên trong khoảng 60 phút để cho gel được đông đặc hoàn toàn. Bề dày của gel
sau khi đông đặc đạt khoảng 0,7 - 0,8cm. Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel, đặt khuôn
gel vào bồn điện di. Cho dung dịch đệm điện di TAE 1X vào bồn cho đến khi ngập
gel.
Dùng pipet nhẹ nhàng trộn đều 3µl dung dịch nạp mẫu (Loading Buffer 6X) và
10µl sản phẩm PCR, nạp mẫu vào mỗi giếng trên gel điện di.
Gel agarose 2% chứa sản phẩm khuếch đại sau khi được điện di sẽ tiến hành
nhuộm với dung dịch TAE 1X chứa thuốc nhuộm DNA (Orange Loading Dye 6X)
với tỷ lệ 10:1. Thời gian nhuộm từ 15 - 25 phút.
Trong quá trình phân tích luôn dành một giếng cho thang DNA chuẩn (DNA
marker) hay mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Thực hiện điện di ở 100V
trong 40 phút. Sản phẩm khuếch đại được xem và chụp ảnh bằng bộ thiết bị ATTO
và Video graphic Printer (Sony).

31
2.4. Xác nhận hiệu lực phƣơng pháp phân tích GMO bằng kỹ thuật PCR
Mục tiêu khảo sát nhằm đánh giá, xác định đầy đủ các thông số kỹ thuật của
phương pháp định tính đã được xây dựng trong nghiên cứu này, bao gồm:
 Giới hạn phát hiện (LOD50)
 Độ chính xác
 Độ nhạy
 Tỷ lệ âm tính giả
 Tỷ lệ dương tính giả
Các thông số kỹ thuật này được xác định theo hướng dẫn xác nhận hiệu lực
phương pháp định tính vi sinh vật tại ISO/TS 16140:2003 và sổ tay hướng dẫn tính
toán các thông số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp sinh học phân tử do Cục
Quản lý Chất lượng Nông Lâm Thủy sản - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Việt Nam ban hành [2].
Một số khái niệm:
LOD: lượng tối thiểu hay nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có
thể phát hiện được nhưng không cần thiết phải định lượng, như đã được chứng minh
bằng thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác. LOD50 là
lượng tối thiểu của chất cần phân tích mà phương pháp có khả năng phát hiện 50%.
Độ chính xác: mức độ gần nhau giữa kết quả thử nghiệm và giá trị quy chiếu
được chấp nhận.
Độ nhạy (sensitivity): sự thay đổi kết quả do sự thay đổi tương ứng của nồng độ
trong đồ thị chuẩn.
Độ đặc hiệu (specificity) hay tỷ lệ âm tính thật là thương số của d với (b+d): số
trường hợp âm tính và kết quả test âm tính trên tổng số trường hợp âm tính.
Giá trị tiên đoán dương (positive predictive value, PPV) là thương số của d với
(b + d): số trường hợp dương tính và có kết quả test dương tính trên tổng số trường
hợp có kết quả test dương tính.

32
Giá trị tiên đoán âm (negative predictive value, NPV) là thương số của a với
(a+c): số trường hợp âm tính và có kết quả test âm tính trên tổng số trường hợp có
kết quả âm tính.
2.5. Bố trí thí nghiệm
2.5.1. Tách chiết DNA
Sử dụng mẫu bột thô làm đối chứng dương cho event FMV. Tiến hành tách chiết
theo quy trình tách chiết của hang SureFood PREP Basic, DNA sau khi tách chiết
được bảo quản trong tủ âm 30ºC.
Mẫu DNA ly trích được điện di bằng bộ điện di BIO-RAD trên gel agarose 2%,
trong dung dịch đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 400mA
trong 35 phút. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA để
kiểm tra sản phẩm. Các mẫu có nồng độ DNA quá cao sẽ được pha loãng bằng TE
và kiểm tra lại bằng điện di.
2.5.2. Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR
2.5.2.1. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi
Khảo sát nhằm mục đích khẳng định thêm tính chuyên biệt của cặp mồi bằng
cách chạy phản ứng với 9 mẫu tách chiết DNA của các chủng vi sinh vật khác và 1
mẫu dương GMO của FMV và 1 mẫu đối chứng trắng (không có khuôn DNA).
2.5.2.2. Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi
Với thí nghiệm này, sử dụng bộ Kit thành phần của TaKaRa EX Taq cho phép
khảo sát nồng độ MgCl2 tại các mức 1,0 - 1,2 - 1,5 - 1,8 - 2,0.
Bố trí thí nghiệm:
- Tiến hành pha mastermix phản ứng PCR khảo sát đồng thời MgCl2 và mồi.
Mỗi 1 ống phản ứng PCR chứa 1 nồng độ MgCl2 và 1 nồng độ mồi. Do đó, tổng số
phản ứng PCR cần cho việc tối ưu đồng thời MgCl2 và mồi là 20 phản ứng.
- Kết quả thí nghiệm được diễn giải dựa trên ảnh bảng gel điện di. Dựa vào sự
có mặt hay không, độ sáng rõ và vạch đặc trưng của sản phẩm tương đương kích
thước 196bp xuất hiện trên bảng điện di. Từ đó, tìm ra được thông số MgCl2 và mồi

33
tối ưu cho phản ứng PCR. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả đánh giá sự
ảnh hưởng của nồng độ mồi, nồng độ MgCl2 được tổng hợp vào Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành
phần phản ứng PCR
Khảo sát tối ưu 2 mục tiêu
Nồng độ MgCl2 (mM)
1,0 1,2 1,5 1,8 2,0
Nồng độ mồi
(M)
0,4
0,2
0,1
0,05
Chương trình phản ứng Bảng 2.4 và thành phần cho một phản ứng PCR 25µl ở
bảng 2.4
Nhiệt độ bắt cặp được sử dụng là 55ºC. Đây là nhiệt độ đảm bảo có sự bắt cặp
dễ dàng giữa primer và mạch khuôn DNA; nhưng hạn chế là có độ chuyên biệt giữa
primer và khuôn DNA thấp, dễ xuất hiện vạch không mong muốn.
Thang điểm đánh giá trong bảng khảo sát tối ưu cho nồng độ mồi và nồng độ
MgCl2 lên phản ứng PCR như sau:
- Không có vạch sản phẩm mục tiêu: (-)
- Độ sáng rõ của vạch sản phẩm mục tiêu:
Mờ (+) Sáng (++) Rất sáng (+++)
- Có vạch sản phẩm mục tiêu và có vạch tạp: (*)
2.5.2.3. Tối ưu hóa nhiệt độ phản ứng
Với thí nghiệm này thì chúng tôi sẽ thử nghiệm nhiều mức nhiệt độ khác nhau
trên cùng một cặp mồi với nồng độ MgCl2 đã tối ưu .
Tiến hành pha Master mix để khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu. Thực hiện khảo
sát các mức nhiệt độ 55ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 65ºC.
Bảng 2.7. Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng

34
Bƣớc Số chu kì Nhiệt độ (ºC) Thời gian (giây)
1 1 95 300
2 40
95 30
55 - 58 - 60 - 62 - 65 30
72 60
3 1 72 420
4 1 4 ∞
Ở thí nghiệm này nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi sẽ được cố định dựa trên kết
quả của thí nghiệm trước. Mỗi nhiệt độ sẽ khảo sát lặp lại 3 lần.
2.5.3. Đánh giá các thông số kĩ thuật phương pháp
2.5.3.1. Xác định giới hạn phát hiện (LOD50)
Dịch chuẩn mẫu trong ống chứa ban đầu khoảng 5% GMO (về khối lượng). Tiến
hành chuẩn bị dãy nồng độ pha loãng nhị phân từ ống chứa dịch chuẩn ban đầu.
Chuẩn bị nền mẫu cho thí nghiệm: nền mẫu sử dụng cho phân tích là mẫu âm tính
với GMO. Thực hiện 10 lần lặp lại cho một độ pha loãng, nhằm xác định tỷ lệ phát
hiện mật độ mà tại đó cho kết quả dương tính của phương pháp đã được xây dựng.
Kết quả sẽ được tính theo công thức Spearman-Karber như sau:
log(LOD50) = L - d(∑Pi – 0,5) = m
LOD50 = 10m
Với độ tin cậy 95%, LOD50 nằm trong khoảng:
(10m - 2SQRT (Um)
; 10m + 2SQRT(Um)
)
Trong đó:
LOD50: Giới hạn phát hiện của phương pháp
L: Log của nồng độ GMO thấp nhất mà tại đó 100% số lần lặp lại cho kết quả
dương tính
d: Hệ số của nồng độ pha loãng (d = 2)
Pi: Tỉ lệ mẫu cho kết quả phát hiện dương tính trong khoảng (50% ≤ Pi ≤ 100%)
tương ứng với nồng độ pha loãng thứ i

35
Um : ước lượng sai số của m, với Um = d2
∑(Pi(1- Pi)/(n-1))
n: Số lần lặp lại đối với nồng độ pha loãng thứ i (n = 10)
2.5.3.2. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ tương đồng giữa 2 kết quả thử nghiệm thu được bằng
phương pháp cần thẩm duyệt và phương pháp tham chiếu trên cùng một mẫu đã
được đồng nhất.
Số mẫu sử dụng cho phân tích thường là 60 mẫu và phải có ít nhất 20 kết quả
dương tính và 20 kết quả âm tính được phân tích bằng phương pháp tham chiếu.
Mỗi mẫu đều phải được phân tích bởi cả 2 phương pháp: phương pháp tham chiếu
và phương pháp cần thẩm duyệt.
Nguyên tắc chung là sử dụng 2 dòng vi sinh vật (dòng mục tiêu và dòng không
phải mục tiêu) ở 3 nồng độ cấy: L0 = mẫu chứng âm, L1 = mẫu chứa dòng mục tiêu
và L2 = mẫu chứa dòng không phải mục tiêu có nồng độ gấp 10 - 100 lần dòng mục
tiêu.
Độ chính xác (%)=
 
d
c
b
a
d
a




 100
2.5.3.3. Độ nhạy
Độ nhạy là khả năng phát hiện ra vi sinh vật đích của phương pháp cần thẩm
duyệt so với phương pháp tiêu chuẩn hoặc so mẫu dương tính biết trước.
Việc tính toán được thực hiện bằng cách dùng các dữ liệu thu được khi đo độ
chính xác sau khi khẳng định.
Độ nhạy (%) SE =
 
c
a
a

100
Giá trị chấp nhận được là > 95%
Bảng 2.8. So sánh kết quả thử khẳng định
Kết quả chuẩn bị mẫu
Phƣơng pháp
cần
Kết quả dương tính
(+/ )
Kết quả âm tính
(-/ )

36
thẩm duyệt Kết quả dương tính ( /+) +/+ (a) -/+ (b)
Kết quả âm tính ( /-) +/- (c) -/- (d)
(a): +/+ : Dương tính thật
(b): -/+ : Dương tính giả
(c): +/- : Âm tính giả
(d): -/- : Âm tính thật
2.5.3.4. Độ đặc hiệu
Là khả năng không phát hiện được vi sinh vật đích bằng phương pháp cần thẩm
duyệt khi chúng không bị phát hiện bằng phương pháp tham chiếu hoặc so với mẫu
âm tính biết trước.
Giá trị chấp nhận được là > 95%.
Độ đặc hiệu (%) =
)
(
)
100
(
d
b
b


2.5.3.5. Tỷ lệ Âm tính giả (False negative) và Dương tính giả (False positive)
Âm tính giả (FN) là kết quả khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa vi sinh vật
mục tiêu của phương pháp nhưng kết quả của phương pháp đó cho âm tính.
Dương tính giả (FP) là kết quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không
chứa vi sinh vật mục tiêu nhưng kết quả của phương pháp đó cho dương tính.
Tỷ lệ dương tính giả:
FP = (1 – Độ đặc hiệu) x 100%
Tỷ lệ âm tính giả:
FN = (1- Độ nhạy) x 100%
2.6. Cải tiến phƣơng pháp
Sau khi hoàn thành các bước khảo sát và tối ưu cho phản ứng ứng PCR. Chúng
tôi thử nghiệm cải tiến phương pháp bằng phản ứng Realtime – PCR.
Chúng tôi sử dụng bộ kit GoTaq® qPCR Master Mix, mỗi phản ứng có 25µl và
thành phần phản ứng như bảng 2.8
Bảng 2.9. Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR

37
Tên hóa chất Thể tích hút (µ)
MasterMix 2x 12.5
Nuclease-Free Water 8.5
Primer R 0.5
Primer F 0.5
Mẫu dương 3
Bảng 2.10. Chương trình phản ứng Realtime - PCR
Bƣớc Nhiệt độ Thời gian
1 95 5 phút
2 95 30 giây
3 60 1 phút
Đo phát quang sau mỗi lần kéo dài (bước 3), chạy với 45 chu kì ở bước 2, 3
2.7. Khảo sát mẫu thị trƣờng
Sau khi hoàn thiện và đánh giá phương pháp, tiến hành kiểm tra 10 mẫu thị
trường. Những mẫu thực phẩm này có nguồn gốc là các cây trồng đã được biến đổi
gen trên thế giới. Các mẫu được sử dụng như sau : cà chua, khoai tây, cám gia cầm,
ngô, gạo, đậu nành, bột bắp, bột khô… Các nguồn mẫu được lấy từ mẫu xét nghiệm
tại Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 và ở các chợ địa bàn thành
phố Hồ Chí Minh.

38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Sản phẩm tách chiết DNA
Tách chiết DNA là bước khởi đầu rất quan trọng, quyết định sự thành công của
phản ứng PCR sau này. Bước đầu trong quy trình tách chiết sử dụng Lysis Buffer là
chất tẩy rửa mạnh giúp phá vỡ thành tế bào và màng nhân, giải phóng nhiễm sắc thể
có chứa DNA. Kết hợp với Proteinase K giúp thủy phân protein liên kết với DNA
của nhiễm sắc thể, giải phóng DNA vào dung dịch. Tiếp theo sử dụng Binding
Buffer kết hợp với ly tâm nhẹ sẽ giúp tủa protein, đẩy lipid lên bề mặt dung dịch,
tạo thuận lợi cho việc thu nhận DNA ở khoảng giữa eppendoft. Bước sử dụng đệm
rửa Pre-Wash có pha cồn, kết hợp ly tâm và ủ ở nhiệt độ thấp sẽ giúp tủa DNA, rửa
lại với Wash Buffer kết hợp ly tâm sẽ giúp rửa sạch protein, polysaccharide và lipid
còn sót lại. Cuối cùng bảo quản DNA đã tinh khiết bằng dung dịch Elution ổn định
và tan đều trong dung dịch.
Với nồng độ OD đo được của mẫu chứng dương GMO được tách từ bộ Kit
SureFood PREP Basic Art. No. S1052 như sau:
 Độ tinh sạch
- Mẫu chứng dương (5% GMO): OD260/280 = 1,875
- Mẫu thị trường: OD 260/280= 2,032
 Giá trị OD 260 1mm:
+ Mẫu chứng dương (5% GMO):OD260= 0,5534
+ Mẫu thị trường: OD 260= 2,2344
 Giá trị OD 280 1 mm
+ Mẫu chứng dương (5% GMO): OD280= 0,295
+ Mẫu thị trường: OD 280= 1,0992
Với các mẫu thị trường là những mẫu thu thập nghi ngờ thực phẩm biến đổi gen.
 Nồng độ DNA đo được
- Mẫu chứng dương (5% GMO): 276,7ng/µl
- Mẫu thị trường: 1117,2ng/µl

39
Với kết quả đo được kiểm tra đại diện mẫu DNA tách chiết bằng phương pháp
điện di trên gel agarose, kết quả thể hiện ở hình 3.1
Hình 3.1. Kết quả điện di tách chiết DNA từ mẫu thị trường
L thang chuẩn 100bp, giếng 1 nồng độ DNA gốc, giếng 2 nồng độ DNA pha loãng 10 lần
Từ hình 3.1 cho thấy quy trình tách chiết theo mục 2.3.3.3 các giá trị thu được
đều nằm trong ngưỡng chấp nhận 1,8 - 2,0 và không tạp nhiễm protein. Trường hợp
mẫu ngoài thị trường có giá trị OD cao do nồng độ DNA sau tách chiết, được thể
hiện ở bảng điện di (giếng 1), do đó khi thực hiện phản ứng PCR cần thực hiện với
mẫu pha loãng và mẫu không pha loãng.
3.2. Tối ƣu hóa phản ứng PCR
3.2.1. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi
Khảo sát nhằm mục đích khẳng định thêm tính chuyên biệt của cặp mồi đã chọn
sau khảo sát in silico bằng các công cụ sinh tin học trên NCBI. Khảo sát được thực
hiện bằng thực nghiệm với 10 chủng vi sinh vật, bao gồm:
- 5 chủng virus là: hepatitis A virus, Norovirus GI, Norovirus GII, virus gây
bệnh đốm trắng (WSSV), virus gây bệnh đầu vàng (YHV), Mengovirus.

40
- 4 chủng vi sinh khuẩn là: Salmonella Typhymurium, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus. Thông tin chi tiết về các chủng vi
sinh vật này được trình bày trong Bảng 2.2.
- 1 mẫu GMO dương tính và 1 mẫu đối chứng không khuôn.
Tiến hành phản ứng PCR với mẫu là 10 chủng như Bảng 2.2. Các thông số về
điều kiện phản ứng PCR được trình bày tại bảng 2.3, 2.4, cụ thể như sau: nồng độ
các mồi trong phản ứng PCR tương ứng là 1,5mM và 0,4μM; nhiệt độ bắt cặp giữa
mồi và khuôn là 60ºC. Kết quả quả khảo sát thể hiện ở hình sau:
Hình 3.2. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện
dương tính GMO với các chủng vi sinh vật khác.
L: Thang chuẩn 100bp; 1: Dương GMO; 2: E.coli; 3: S.aureus; 4: V.para; 5: S.typhi;
6: NoV-GI; 7: NoV-GII; 8: WSSV; 9: YHV;10: HAV; (-): mẫu chứng trắng.
Kết quả Hình 3.2 thấy được cặp mồi sự dụng khuếch đại gen mục tiêu mẫu
chứng dương GMO và không có bất kì sản phẩm khuếch đại nào với các chủng vi
sinh vật khác. Cặp mồi có tính chuyên biệt phát hiện thực phẩm biến đổi gen có
chứa trình tự promoter 34S- FMV.
3.2.2. Khảo sát tối ưu nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR
Khảo sát nhằm mục đích xác định đồng thời 2 thành phần của phản ứng PCR là
MgCl2 và mồi. Hai thành phần này được khảo sát theo bộ Kit thành phần TaKaRa
Ex Taq. Nồng độ MgCl2 khảo sát tại các mức: 1,5 - 2 – 2,5 – 3 – 3,5mM. Nồng độ
mồi khảo sát tại các mức: 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,4μM.

41
Khảo sát được thực hiện trên dịch chiết DNA từ mẫu dương chuẩn có nồng độ
5%. DNA đã được tinh sạch và tiến hành bước phản ứng PCR với thành phần phản
ứng, chương trình phản ứng và nồng độ MgCl2 đã tối ưu ở mục 3.2.2
Thành phần phản ứng PCR như Bảng 2.6. Chương trình phản ứng PCR như
Bảng 2.4 với nhiệt độ bắt cặp mồi được chọn mặc định là 55ºC.
Hình 3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ
mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO
Với 1 MgCl2: 1,0mM; primer: 0,05μM, 2 MgCl2: 1,2mM; primer: 0,05μM, 3 MgCl2: 1,5mM;
primer: 0,05μM, 4 MgCl2:1,8mM; primer: 0,05μM, 5 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,05μM, 6 MgCl2:
1,0mM; primer: 0,4μM,7 MgCl2:1,2mM; primer: 0,4μM, 8 MgCl2: 1,5mM; primer: 0,4μM, 9
MgCl2: 1,8mM; primer: 0,4μM, 10 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,4μM, đối chứng âm (-).
Hình 3.4. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ
mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO
Với 1 MgCl2: 1,0mM; primer: 0,1μM, 2 MgCl2: 1,2mM; primer: 0,1μM, 3 MgCl2: 1,5mM;
primer: 0,1μM, 4 MgCl2: 1,8mM; primer: 0,1μM, 5 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,1μM, 6 MgCl2:

42
1,0mM; primer: 0,2μM, 7 MgCl2: 1,2mM; primer: 0,2μM, 8 MgCl2: 1,5mM; primer: 0,2μM, 9
MgCl2: 1,8mM; primer: 0,2μM, 10 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,2μM, đối chứng âm (-).
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát
Khảo sát tối ưu 2
mục tiêu
Nồng độ MgCl2 (mM)
1,0 1,2 1,5 1,8 2,0
Nồng độ mồi
(M)
0,05 - + + + +
0,1 +* +* ++* ++* +++*
0,2 ++ ++ +++ +++* +++*
0,4 ++ ++* ++* - -
Sau kết quả thí nghiệm ở nồng độ mồi 0,05μM, 0,1μM và nồng độ MgCl2
1,0mM, 1,2mM cho kết quả không ổn định, vạch dương mờ và có nhiều vạch tạp.
Kết quả Bảng 3.3 và Bảng 3.4 cho thấy nồng độ mồi 0,2μM và nồng độ MgCl2
1,5 – 2,0mM cho tín hiệu khuếch đại tốt nhất, tuy nhiên tín hiệu trong các lần có
xuất hiện vạch tạp (tại 1,5mM vạch tạp là mờ nhất). Ở nồng độ MgCl2 1,8 – 2,0mM
và nồng độ mồi 0,2µM cho kết quả âm tính vì ở nồng độ cao gây ức chế phản ứng.
Tương tự ở nồng độ mồi 0,05µM và nồng độ MgCl2 1,0mM cho kết quả âm tính vì
ở nồng độ thấp bị ức chế phản ứng. Nồng độ MgCl2 1,5mM và nồng độ 0,2µM cho
tín hiệu khuếch dại rõ và sáng nhất không chứa vạch tạp.
Từ kết quả của việc khảo sát đồng thời 2 thành phần của phản ứng PCR, chúng
tôi chọn nồng độ mồi 0,2μM và nồng độ MgCl2 1,5mM là nồng độ tối ưu trong
thành phần phản ứng PCR.
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA trong
phản ứng PCR
Khảo sát này nhằm xác định nhiệt độ tối ưu cho bước bắt cặp trong chương trình
phản ứng PCR phát hiện gen mục tiêu.
Khảo sát được thực hiện trên dịch chiết mẫu dương GMO có nồng độ DNA là
5%. Thành phần phản ứng PCR như Bảng 2.4. Chương trình phản ứng PCR như

43
Bảng 2.3 với nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA thay đổi ở các mức 55 ºC -
58ºC - 60ºC - 62 ºC - 65ºC. Kết quả khảo sát được thể hiện tại Hình 3.5.
Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA
L: Thang chuẩn 100bp; 1: Tm= 55ºC; 2: Tm= 58ºC; 3: Tm= 60ºC; 4: Tm= 62ºC; 5: Tm=
65ºC; 6:Tm= 55ºC; 7: Tm= 58ºC; 8: Tm= 60ºC; 9: Tm= 62ºC; 10: Tm= 65ºC; (-): Chứng âm
không chứa DNA.
Kết quả từ hình cho thấy ở các mức nhiệt độ đều cho thấy tín hiệu khuếch đại từ
gen mục tiêu. Ở các mức nhiệt độ 55, 58 và 65ºC xuất hiện vạch tạp. Nhiệt độ 60ºC
và 62ºC cho vạch mục tiêu rõ. Nhưng ở vạch 62ºC không có độ ổn định, vẫn có
vạch tập sau nhiều lần lặp lại. Nên chọn 60ºC là nhiệt độ tối ưu nhất cho cặp mồi sử
dụng.
Sau khi tối ưu hóa phản ứng PCR thành phần hóa chất trong phản ứng và
chương trình phản ứng được đề xuất như sau:
Bảng 3.2. Chương trình nhiệt chạy phản ứng PCR sau tối ưu
Bƣớc Số chu kì Nhiệt độ (ºC) Thời gian (giây)
1 1 95 300
2 40
95 30
60 30
72 60
3 1 72 420

44
4 1 4 ∞
Bảng 3.3.Thành phần hóa chất sau khi tối ưu hóa
STT Hóa chất Nồng độ một phản ứng
1 Bufer 10X 1X
2 MgCl2 25mM 1,5mM
3 dNTP 0,2mM mỗi dNTP
4 Mồi Xuôi 0,2µM
5 Mồi Ngược 0,2µM
6 Tag Polymerase 5U/µl
7 Nuclease-Free Water Vừa đủ 25µl
3.3. Đánh giá hiệu lực phƣơng pháp
 Giới hạn phát hiện LOD50 của promoter FMV
Bảng 3.4. Kết quả phân tích phát hiện promoter FMV trên mẫu chuẩn MON89788
5%
% GMO trong mẫu thử
Độ pha
loãng
Số lần
lặp lại
Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ dƣơng tính
5%
2 10
10 1
2,5% 9 0,9
1,25% 9 0,9
0,625% 8 0,8
0,3125% 4 0,4
LOD50 = 0,625%
Cận dưới: 0,815%
Cận trên: 0,479%

45
Bảng 3.5. Kết quả giá trị đánh giá các thông số của phương pháp
Kết quả chuẩn bị mẫu
Tổng
Phƣơng
pháp cần
thẩm duyệt
Dương
tính
Âm
tính
Kết quả dương tính a = 38 b = 0 a + b = 38
Kết quả âm tính c = 2 d = 20 c + d = 22
Tổng a + c = 40 b + d = 20 a + b + c + d = 60
Căn cứ kết quả từ bảng tổng hợp, thông số kĩ thuật của phương pháp được tính
như sau:
 Độ chính xác
  






d
c
b
a
d
a
AC
100
%
67
,
96
100
60
20
38



 Độ nhạy
SE = %
95
40
100
38
100





c
a
a
 Độ đặc hiệu
SP = %
100
20
100
20
100





d
b
d
 Tỷ lệ dƣơng tính giả, âm tính giả
Tỷ lệ dương tính giả - False possitive (FP)
FP = (1 – SP) x 100% = (1 –1) x 100% = 0%
Tỷ lệ âm tính giả - False Negative (FN)
FN = (1- SE) x 100% = (1 – 0,95) x 100% = 5%
Kết quả LOD50 đạt yêu cầu của các nước. Với các thông số đánh giá về độ
chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả đáp ứng yêu cầu
phân tích.

46
3.4. Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế bằng kĩ thuật PCR
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế được đề xuất
Bảng 3.6. Diễn giải kết quả điện di
Mẫu
Trường hợp
100
10-1
Mẫu âm
tách chiết
Mẫu âm
PCR
Chứng
dương
Kết quả
1 + + - - + Dương tính

47
2 + - - - + Dương tính
3 + + + - + Không kết luận
4 + + + - - Không kết luận
5 - - + - + Có thể Âm tính.
6 - - + + - Không kết luận
7 - - - - + Âm Tính
8 - + - - + Dương Tính
Trong tất cả các trường hợp, các mẫu kiểm soát âm phải cho kết quả âm tính,
các mẫu kiểm soát dương cho kết quả dương tính. Khi đó:
 Mẫu phân tích (pha loãng hoặc không pha loãng) cho kết quả dương tính thì trả
lời là “Phát hiện sản phẩm biến đổi gen (GMO) với sự hiện diện của trình tự
promoter 34S-FMV”.
 Mẫu phân tích cho kết quả âm tính thì trả lời là “Không phát hiện sản phẩm
biến đổi gen (GMO) với sự hiện diện của trình tự promoter 34S-FMV”.
Ngoài ra, với các trường hợp đặc biệt (trường hợp 3 – 4 – 5 – 6), đều cần thực
hiện phân tích lại, do có sự ngoại nhiễm ở mẫu chứng âm hoặc mẫu chứng dương bị
ức chế trong quá trình PCR (trường hợp 4 – 6).
Với trường hợp 5, mặc dù có sự ngoại nhiễm, nhưng mẫu phân tích cho kết quả
âm tính và mẫu chứng dương không bị ức chế trong quá trình PCR nên có thể nghi
ngờ là sản phẩm âm tính. Tuy nhiên, vẫn cần thực hiện lại quá trình phân tích để
xác định rõ hơn.
3.5. Cải tiến phƣơng pháp bằng phản ứng Realtime – PCR
Khảo sát nhằm mục đích thử nghiệm việc phát hiện gen mục tiêu trên mẫu
dương GMO từ đậu nành bằng kỹ thuật RT-PCR. Nằm trong hướng phát triển của
đề tài, kỹ thuật này giúp giảm thời gian thực hiện để cho ra kết quả phân tích sớm

Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34 s fmv

Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34 s fmv

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34 s fmv

Similar to Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34 s fmv (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34 s fmv