Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng - Dianthus Sinensis L._08315712092019

1. TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
*********
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Niên khoá: 2005 – 2010
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12 / 2010
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO
CÂY HOA CẨM CHƯỚNG (Dianthus sinensis L.)

2.
TÓM TẮT
Nhu cầu sử dụng hoa để trang trí trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc
sống. Hoa Cẩm chướng là loại hoa cắt cành phổ biến không kém hoa hồng, hoa cúc
trên thế giới. Hiện nay, trên thế giới có khoảng hơn 300 loài hoa này và có rất nhiều
giống lai khác nhau. Mục tiêu của đề tài này là nhân giống cây hoa Cẩm chướng
dựa trên việc khảo ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân chồi
và tạo rễ cây Cẩm chướng in vitro.
Môi trường muối khoáng cơ bản Murashige và Skoog (1962) được sử dụng để
nuôi cấy cây Cẩm chướng in vitro.
- Trong giai đoạn nhân chồi, chúng tôi khảo sát hai thí nghiệm:
Thí nghiệm (1) bổ sung nồng độ BA từ 0,5mg/l đến 2,0mg/l trong môi trường
nuôi cấy. Kết quả, ở nồng độ BA 1,5mg/l cho số chồi cây Cẩm chướng in vitro cao
nhất.
Thí nghiệm (2) bổ sung nước dừa với nồng độ từ 5% đến 20% trong môi trường
nuôi cấy. Kết quả thu được ở nồng độ 10% nước dừa cho chồi cây Cẩm chướng
in vitro nhiều nhất.
- Trong giai đoạn tạo rễ và tái sinh cây hoàn chỉnh, IBA được sử dụng để bổ
sung vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ từ 0,5mg/l đến 2,0mg/l. Kết quả là ở nồng
độ IBA 1,5 mg/l cho số lượng rễ cây Cẩm chướng in vitro nhiều nhất.

3. i
MỤC LỤC
Trang
Mục lục ................................................................................................................................i
Danh mục chữ viết tắt ........................................................................................................iii
Danh mục bảng ..................................................................................................................iv
Danh mục hình .................................................................................................................... v
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1
1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về cây hoa Cẩm chướng ............................................................................. 3
2.1.1. Phân loại thực vật ..................................................................................................... 3
2.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố ......................................................................................... 3
2.1.3. Giá trị thẩm mỹ và kinh tế ........................................................................................ 4
2.2. Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................ 4
2.2.1. Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô .......................................................... 5
2.2.2. Nhân giống in vitro ................................................................................................... 6
2.2.3. Các vấn đề liên quan đến nhân giống in vitro .......................................................... 9
2.3. Các nghiên cứu trước đây về cây Cẩm chướng in vitro ............................................ 23
2.4. Một số loài Cẩm chướng phổ biến ở Việt Nam ......................................................... 24
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm .............................................................. 28
3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................... 28
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 28

4. ii
3.2.2. Trang thiết bị .......................................................................................................... 28
3.2.3. Hóa chất và môi trường .......................................................................................... 28
3.3. Phương pháp thí nghiệm .......................................................................................... 29
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi của cây
Cẩm chướng in vitro.............................................................................. 29
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình phát sinh chồi cây
Cẩm chướng in vitro ............................................................................. 30
3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ của cây Cẩm
chướng in vitro ..................................................................................... 32
3.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 33
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 34
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 51

5. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
BA : benzyl adenin
IBA : acid indol-3-butyric
Môi trường
MS: môi trường Murashige và Skoog (1962)
ĐC: đối chứng

6. iv
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Môi trường phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro có bổ sung BA ở nồng độ
khác nhau ................................................................................................... 30
Bảng 3.2. Môi trường tạo chồi cây Cẩm chướng in vitro có bổ sung nước dừa với nồng
độ khác nhau ............................................................................................... 32
Bảng 3.3. Môi trường tạo rễ và tái sinh cây Cẩm chướng in vitro hoàn chỉnh có bổ sung
IBA ở nồng độ khác nhau ........................................................................... 33
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của BA lên thời gian hình thành chồi cây Cẩm chướng in vitro .. 34
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của BA lên quá trình hình thành cụm chồi cây Cẩm chướng in vitro
vào ngày thứ 15và 30 .................................................................................. 35
Bảng 4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa lên thời gian hình thành chồi cây Cẩm
chướng in vitro ........................................................................................... 38
Bảng 4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa lên số lượng chồi cây Cẩm chướng in vitro
..................................................................................................................... 39
Bảng 4.3.1. Ảnh hưởng của IBA lên thời gian tạo rễ cây Cẩm chướng in vitro ............. 42
Bảng 4.3.2. Ảnh hưởng của IBA quá trình hình thành rễ cây Cẩm chướng in vitro ....... 43

7. v
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Dianthus sinensis L. ........................................................................................ 3
Hình 2.2. Dianthus barbatus ...................................................................................... 25
Hình 2.3. Dianthus deltoides ...................................................................................... 25
Hình 2.4. Dianthus gratinanopolitanus ......................................................................... 26
Hình 2.5. Dianthus pavonius ......................................................................................... 26
Hình 2.6. Dianthus plumatus ......................................................................................... 27
Hình 4.1. Ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro sau
15 và 30 ngày sau cấy ................................................................................... 38
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa lên quá trình phát sinh chồi cây Cẩm
chướng in vitro 15 và 30 ngày sau cấy ........................................................... 42
Hình 4.3. Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ cây Cẩm chướng in vitro ............... 46
Hình 4.4. Sơ đồ quy trình nhân giống cây Cẩm chướng in vitro ................................... 47

8. 1
CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đã và đang có định hướng đáng kể
trong các nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật. Nhờ ứng dụng các thành tựu mới
mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi cấy mô, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền,
người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng không những có năng suất cao
mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn hán… Bên cạnh các nghiên cứu về sự
tăng trưởng và phát triển của cây, nuôi cấy mô thực vật mang lại nhiều lợi ích kinh
tế quan trọng trong nhân giống cây trồng.
Từ nhiều năm trở lại đây, khi khám phá ra rằng thực vật có thể nhân giống
nhanh chóng trong điều kiện in vitro thì rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã
tập trung vào nghiên cứu. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro cho phép giữ
nguyên đặc tính và cải thiện giống cây trồng. Bằng phương pháp in vitro người ta
có thể sử dụng tất cả các bộ phận của cây trong điều kiện vô trùng để nuôi cấy.
Ngày nay khi khoa học kỹ thuật phát triển, đời sống con người được nâng cao,
các nhu cầu thẩm mỹ ngày càng được chú trọng hơn. Nhu cầu sử dụng hoa để trang
trí trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống. Phương pháp nhân giống vô
tính in vitro đã mở ra cho ngành công nghiệp hoa cắt cành và hoa chậu cảnh ngày
một phát triển và đem lại một nguồn thu nhập đáng kể.
Từ những nghiên cứu về nhân giống vô tính in vitro, chúng tôi thực hiện đề tài
này trên đối tượng là cây hoa Cẩm chướng. Mục tiêu của đề tài này là nhân giống
cây hoa Cẩm chướng dựa trên việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc hình
thành chồi, rễ của cây Cẩm chướng in vitro.

9. 2
1.2. Mục đích-yêu cầu
1.2.1 . Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi, tạo rễ,
hình thành cây Cẩm chướng in vitro hoàn chỉnh.
1.2.2 Yêu cầu
- Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA thích hợp cho sự hình thành
chồi cây Cẩm chướng in vitro.
- Xác định nồng độ nước dừa thích hợp lên sự hình thành chồi cây Cẩm
chướng in vitro.
- Xác định nồng độ IBA thích hợp lên sự phát sinh rễ cây Cẩm chướng in vitro.

10. 3
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về cây Cẩm chướng
2.1.1. Phân loại thực vật
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Magnoliophyta
( ngành hạt kín)
Lớp: Magnoliosida
( lớp hai lá mầm)
Bộ: Caryophyllales
Họ: Caryophyllaceae
Tên khoa học: Dianthus sinensis L.
Hình 2.1. Dianthus sinensis L.
2.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố
Cẩm chướng là loại hoa đẹp với màu sắc phong phú, có thể được trồng làm
cảnh hay sản xuất hoa cắt cành. Đây là loại hoa cho giá trị kinh tế cao, nhưng tương
đối dễ trồng và dễ chăm sóc. Hoa thích hợp ở nhiều vùng sinh thái khác nhau.
Hoa có nguồn gốc từ Địa Trung Hải và chuyển vào Việt Nam từ nửa đầu thế kỷ 20.
Hoa cẩm chướng còn có tên gọi là hoa cẩm nhung là nhóm hoa cắt cành phổ
biến không kém hoa hồng, hoa cúc trên thế giới. Hoa cẩm chướng đặc điểm thân
mảnh, có các đốt ngắn mang lá kép, bé, thân gãy khúc nhiều, thân bò là chính, trên
mặt lá có ít phấn trắng, hoa nhiều màu sắc, hoa đơn nhiều hơn hoa kép, lông nhỏ, ít
bị sâu bệnh. Thân phân nhánh nhiều, có đốt dễ gãy giòn, lá Cẩm chướng mọc đối,
phiến lá nhỏ dày, dài, không có răng cưa, mặt lá thường nhẵn. Hoa mọc đơn từng
chiếc một ở nách lá, hoa kép có nhiều màu sắc ngay trên cùng một bông, mang
nhiều hạt, có từ 330 – 550 hạt. [14]

11. 4
Hiện nay, trên thế giới có khoảng hơn 300 loài và có rất nhiều giống lai khác
nhau. Hoa cẩm chướng có hai loại là loại hoa đơn và cánh kép, màu sắc rất đa dạng
như: màu trắng điểm pha sắc hồng, hường, đỏ, vàng và cam. Chúng thường ra hoa
vào mùa xuân hay mùa hè, có khi đến tận mùa đông nếu thời tiết không quá lạnh.
Hoa Cẩm chướng có mùi hương rất đặc trưng. [10]
2.1.3. Tính thẩm mỹ và giá trị kinh tế
Trước đây hoa Cẩm chướng được trồng làm cảnh trang trí. Từ năm 1975 đã có
sản xuất hoa cắt cành với những giống nhập trước 1975. Từ năm 1995 có nhiều
giống hoa Cẩm chướng được nhập nội có nguồn gốc từ Hà Lan, Trung Quốc với
màu sắc đa dạng phong phú. Vùng Vạn Thành – phường 5, Thái Phiên – phường 12,
7, 8 là nơi trồng nhiều hoa Cẩm chướng tại Đà Lạt. [12]
Hiện nay có khoảng 20 giống được trồng với mục đích cắt cành. Các giống
trồng trọt hiện nay được chia theo nhóm sau:
Nhóm hoa chùm: Màu đỏ, hồng, trắng, kem… Hoa nhỏ, chành thấp
30-40 cm. Thời gian sinh trưởng 18-24 tháng.
Nhóm hoa đơn: Màu đỏ, hoa lớn, cành cao 70-80 cm, mắt thưa, ít
chồi. Thời gian sinh trưởng 15-18 tháng.
Hoa Cẩm chướng có diện tích canh tác không lớn, chủ yếu trồng trong nhà có
mái che plastic. Hàng năm, Đà Lạt cung cấp khoảng 0,3-0,5 triệu cành hoa Cẩm
chướng các loại. [15]
2.2. Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các
phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm trên
môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường bao gồm các nhân tố thiết
yếu đa lượng và vi lượng, chất kích thích sinh trưởng, đường, vitamin và một số
hợp chất hữu cơ cần thiết khác.
Tế bào thực vật có tính toàn thế, tế bào đơn hoặc protoplast thực vật đều có khả
năng tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là điều kiện quan trọng để ứng dụng trong nuôi

12. 5
cấy mô thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các
mô như lá, thân, hoa hoặc rễ tạo thành cây hoàn chỉnh nhờ vào sự điều chỉnh môi
trường nuôi cấy in vitro. [13], [1]
2.2.1 . Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô
Ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in vitro)
đã được Haberlandt thử nghiệm từ năm 1902 nhưng do ông đã sử dụng các tế bào
của cây một lá mầm nên đã thất bại. Năm 1919, Carrel nuôi cấy thành công mô
động vật, nhưng cho đến năm 1934 mô thực vật mới được nuôi cấy.
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của các
tế bào rễ cà chua được nuôi cấy mô.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Ông đã thành công trong việc chuyển mô nuôi cấy thành cây con ở cây sen cạn và
cây White lupin trên môi trường nuôi dinh dưỡng nhân tạo. Tuy nhiên, việc nhân
giống thực vật in vitro vẫn chưa hoàn thiện. Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu đã khám
phá ra những thành phần quan trọng, cần thiết cho sự phát triển của tế bào được
nuôi cấy.
Năm 1951, Skoog và Miller phát hiện ra các hợp chất có khả năng điều khiển sự
nhân chồi.
Năm 1962, Murashige và Skoog đã thành công trong việc cải tiến môi trường
nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô.
Môi trường của họ đã được dùng làm môi trường cơ bản cho việc nuôi cấy nhiều
loại cây và cho đến nay vẫn còn được sử dụng rộng rãi. [2], [7]
Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đang được sử dụng rộng rãi để sản xuất
giống cây trồng tạo nguồn giống đồng nhất về di truyền, sạch bệnh, đồng đều về
sinh lý và phát triển bình thường. Những ứng dụng của vi nhân giống trong nghề
vườn nói riêng và nông nghiệp nói chung đã rộng khắp thế giới nhưng việc thương
mại hóa vẫn còn giới hạn do chi phí sản xuất lớn, giá thành sản phẩm cao.
Trong nuôi cấy mô người ta có xu hướng quan tâm đến các thành phần hóa học
như: chất vô cơ, chất kích thích sinh trưởng thực vật, đường, acid amin, vitamin, và

13. 6
các đặc tính sinh hóa của môi trường như chỉ số pH hơn là các yếu tố vật lý môi
trường (ánh sáng, thành phần khí, độ ẩm, trao đổi khí, nhiệt độ) trong hộp nuôi cấy.
2.2.2. Nhân giống in vitro
2.2.2.1. Ưu điểm
- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây mẹ ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra
một quần thể có độ đồng đều cao về số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất
thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công
nghệ vi nhân giống đáp ứng với tốc độ nhân nhanh, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có
thể tạo ra hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân
nhanh dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu
gene dị hợp hay đồng hợp.
- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm,
không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ
cây tạo ra trên một diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và
trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
- Nâng cao chất lượng cây trồng: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để
loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh
tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 – 30% so với giống gốc.
- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác
nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro hoặc trong bầu
đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ.
- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ
dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận
là sạch bệnh. Do vậy, đảm bảo an toàn, đáp ứng được các yêu cầu về vệ sinh thực
vật quốc tế.

14. 7
- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành ở bất kỳ thời gian
nào, không phụ thuộc mùa vụ. [13], [1], [7]
2.2.2.2. Hạn chế
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không
phải tất cả các cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống.
Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chứa thể nhân nhanh để đáp
ứng nhu cầu thị trương mại hoặc bảo quản nguồn gene. Nhiều vấn đề lý thuyết liên
quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
- Chi phí sản xuất cao: Vì nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành
thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống
như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai
khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con
không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn
đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng
hàm lượng các chất kích thích tăng trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý
khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền.
2.2.2.3. Các bước nhân giống in vitro
Nhân giống cây trồng in vitro gồm các bước cơ bản sau:
- Tạo thể nhân giống in vitro
- Nhân giống in vitro
- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
- Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
‫٭‬ Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống
in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống
in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với

15. 8
những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách
tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo). Trong môi trường nhân giống thường bổ sung
cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Trước khi tạo các thể nhân giống, các mẫu
ban đầu thường được khử trùng bằng hóa chất để loại bỏ những mầm bệnh gây hại
cho cây.
‫٭‬ Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng số lượng mẫu trong nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường
tạo thể chồi. Giai đoạn này cây cần có một lượng cytokinin ngoại sinh cao để kích
thích sự hình thành cụm chồi, đôi khi nồng độ chất kích thích sinh trưởng giảm thấp
làm cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp
giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ
hóa và được duy trì trong thời gian dài.
‫٭‬ Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị
chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi
trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các
chất kích thích quá trình tạo rễ thuộc nhóm auxin. Điều kiện nuôi cấy gần với điều
kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi tách ra khỏi điều kiện
in vitro.
‫٭‬ Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
Đây là một giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì nó quyết
định chi phí sản xuất cây giống. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định
dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên
hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ cao, nhiệt độ cao,
độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng
này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí
mát, ẩm độ cao. Cây con thường được trồng trong các luống ươm, trên các vĩ xốp

16. 9
hoặc trên các bầu đất cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong
những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10
ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi
và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun
lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ.
2.2.3 Các vấn đề liên quan đến nhân giống in vitro
2.2.3.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy lên khả năng phát sinh hình thái của cây
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển in vitro. Những ảnh hưởng có thể được tóm tắt như sau:
‫٭‬ Kiểu gen
Khả năng tái sinh trong giới thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thông
thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái
sinh (trừ khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầm: Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những loài dễ tái sinh nhất.
Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các giống lai
Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh
in vitro. Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của
Kalanchoe farinaceae hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo
nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các
chất kích thích sinh trưởng.
‫٭‬ Tuổi của cây
Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao, do đó ở Ngũ cốc người ta thường
dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của
chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây con dễ tái sinh hơn như trong trường
hợp cây bụi. Một vài ví dụ cụ thể chỉ sự khác nhau về khả năng tái sinh và phân
chia tế bào giữa cây già và cây in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và Britt, 1965),
Lunaria annua (Pierik, 1967) và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974).
Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ được
những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đôi

17. 10
khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do gia tăng
khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được Hackett (1985) chứng minh
trên những đối tượng như: Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonoca.
Sự hình thành chồi bất định là một trong những phương pháp giúp trẻ hóa.
‫٭‬ Tình trạng sinh lý
Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào
in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh
hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây Huệ tây ở giai đoạn sinh
dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi
của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi
của những cây đã trải qua giai đoạn ngủ đông.
‫٭‬ Tình trạng sức khỏe
Vào thời điểm tiến hành nuôi cấy in vitro, nếu sử dụng các bộ phận của cây
trong tình trạng khỏe mạnh thì khả năng nuôi cấy thành công cao hơn. Do đó, nên
chọn mẫu từ những cây khỏe mạnh và sinh trưởng bình thường nhất làm thí nghiệm
vì điều này ảnh hưởng đến phần trăm nhiễm và khả năng tái sinh của mẫu sau khi
được tách khỏi cây mẹ.
‫٭‬ Điều kiện phát triển
Các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong tự nhiên phản ứng khác với các mẫu cấy từ
nguồn mẫu trong nhà kính. Nhìn chung, những mẫu cấy ban đầu có nguồn gốc từ
nhà kính thường ít bị bệnh, dễ tái sinh hơn vật liệu bên ngoài ví dụ như cây
Rhododendron (Pierik và Steegmans, 1975). Điều kiện phát triển của những cây nở
hoa vào mùa đông như Begonia có ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành chồi và rễ
bất định trong nuôi cấy in vitro.
‫٭‬ Vị trí của mẫu cấy trên cây
Các mẫu cấy được lấy từ thân chính hoặc các chồi bên ở một số cây thân gỗ sẽ
giữ nguyên đặc tính di truyền này đối với cây con nuôi cấy mô nghĩa là đối với các
mẫu lấy từ thân chính thì cây cấy mô sẽ phát triển thành cây trưởng thành và tạo
nhiều cành ngang, ngược lại nếu mẫu cấy được lấy từ các cành ngang thì cây cấy

18. 11
mô cũng chỉ phát triển ở dạng cành ngang, không tạo được thân chính như cây gieo
hạt. Sự bảo lưu đặc điểm di truyền này thể hiện rất rõ ở các cây giâm cành.
Ever (1984) đã khảo sát hiện tượng bảo lưu di truyền ở cây Pseudotsuga menziesii,
ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển
trong môi trường in vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự
hình thành chồi bất định của các mẫu cấy lan Dạ hương được tách ra từ phần gốc
của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với lily
(Robb, 1957). Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có
nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng
in vitro giống nhau.
‫٭‬ Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng
trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi cây tự
nó cung cấp dự trữ chất dinh dưỡng và hormon, do đó mẫu cấy có kích thước càng
lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh
dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn
những cơ quan ít dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt dễ bị tổn
thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái
sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk chứng minh vào năm 1984.
‫٭‬ Vị trí của các mẫu cấy đặt trên môi trường nuôi cấy
Các mẫu cấy có thể đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực
(thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọn
xuống môi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu cấy được cấy
không cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ
oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy
không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuyếch tán vào trong thạch do nó
không tiếp xúc với môi trường. Như ở trường hợp tất cả cây thuộc họ
Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1985), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy
hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định
tốt hơn phương pháp cấy có cực. [2], [1], [13]

19. 12
2.2.3.2. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát sinh hình thái
của cây
‫٭‬ Độ ẩm tương đối trong bình
Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy là một nhân tố môi trường quan trọng, nó
ảnh hưởng đến mối quan hệ về nước của mẫu cấy bởi vì mối quan hệ này tác động
lên các quá trình sinh hoá và sinh lý. Tanaka và cộng sự (1992) đã thấy rằng có sự
liên hệ tích cực giữa việc giảm độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy với việc gia
tăng sự kháng của lá đối với sự thoát hơi nước của cây Khoai tây nuôi cấy in vitro.
Sự điều khiển độ ẩm tương đối thích hợp có thể góp phần vào việc cải thiện chất
lượng và năng suất của cây được nuôi cấy in vitro. Độ ẩm tương đối trong bình nuôi
cấy phụ thuộc rất nhiều vào số lần trao đổi khí trong một giờ và độ ẩm tương đối
của phòng nuôi cấy (Tanaka và cộng sự, 1992). Việc giảm độ ẩm tương đối trong
môi trường nuôi cấy sẽ cải thiện được chức năng của khí khổng (Ziv, 1991). Những
bằng chứng thu được cho thấy rằng độ ẩm tương đối đóng vai trò chính trong hiện
tượng thủy tinh thể (Debergh, 1987).
Hộp nuôi cấy kín gây điều kiện bất lợi cho sự tăng trưởng của cây in vitro do độ
ẩm trong hộp tăng cao so với độ ẩm ngoài hộp. Độ ẩm ảnh hưởng đến khả năng hấp
thu nước, các chất khoáng và khả năng sống của cây khi ra khỏi ống nghiệm. Độ ẩm
cao làm lá phát triển không bình thường, thay đổi về hình thái cấu trúc và chức năng
sinh lý, như hiện tượng thủy tinh thể, lớp cutin mỏng, chức năng đóng mở của khí
khổng giảm (Nguyễn Thị Quỳnh và Toyoki Kozai, 2001).
‫٭‬ Nồng độ khí CO2
Nồng độ CO2 trong bình thay đổi theo sự hô hấp và quang hợp của cây. Trong
tối, khi độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy là một nhân tố môi trường quan trọng,
nó ảnh hưởng đến mối quan hệ về nước của mẫu cấy bởi vì mối quan hệ này tác
động lên các quá trình sinh hoá và sinh lý. Tanaka và cộng sự (1992) đã thấy rằng
có sự liên hệ tích cực giữa việc giảm độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy với việc
gia tăng sự kháng của lá đối với sự thoát hơi nước của cây Khoai tây nuôi cấy
in vitro. Sự điều khiển độ ẩm tương đối thích hợp có thể góp phần vào việc cải thiện

20. 13
chất lượng và năng suất của cây được nuôi cấy in vitro. Độ ẩm tương đối trong bình
nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào số lần trao đổi khí trong một giờ và độ ẩm tương
đối của phòng nuôi cấy (Tanaka và cộng sự, 1992). Việc giảm độ ẩm tương đối
trong môi trường nuôi cấy sẽ cải thiện được chức năng của khí khổng (Ziv, 1991).
Những bằng chứng thu được cho thấy rằng độ ẩm tương đối đóng vai trò chính
trong hiện tượng thủy tinh thể (Debergh, 1987).
Hộp nuôi cấy kín gây điều kiện bất lợi cho sự tăng trưởng của cây in vitro do độ
ẩm trong hộp tăng cao so với độ ẩm ngoài hộp. Độ ẩm ảnh hưởng đến khả năng hấp
thu nước, các chất khoáng và khả năng sống của cây khi ra khỏi ống nghiệm. Độ ẩm
cao làm lá phát triển không bình thường, thay đổi về hình thái cấu trúc và chức năng
sinh lý, như hiện tượng thủy tinh thể, lớp cutin mỏng, chức năng đóng mở của khí
khổng giảm (Nguyễn Thị Quỳnh và Toyoki Kozai, 2001).
Nồng độ CO2 trong bình thay đổi theo sự hô hấp và quang hợp của cây. Trong
tối, khi cây hô hấp, nồng CO2 trong bình tăng lên nhưng khi chiếu sáng, cây quang
hợp thì nồng độ CO2 lại giảm đi.
Trong phương pháp vi nhân giống truyền thống, sự kém thông thoáng của môi
trường hộp nuôi cấy đã giới hạn việc trao đổi khí khiến nồng độ CO2 trong hộp nuôi
cấy giảm nhanh sau hai giờ chiếu sáng và tiếp tục giảm đến gần điểm bù CO2
(50 – 100 μmol mol-1
) theo nghiên cứu của Buddendorf và cs. (1994), do đó cây hầu
như không quang hợp được ở nồng độ CO2 này làm cho cây tích lũy sinh khối ít và
chậm phát triển. Cùng với sự giảm nồng độ CO2 trong hộp nuôi cấy là quá trình tích
lũy các khí như ethylen cũng làm giảm sự tăng trưởng của cây in vitro. Lin và cộng
sự (2009) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CO2 và độ ẩm tương đối của môi
trường không đường lên các cây Dã yên thảo, Cúc, Cà chua nuôi cấy trong hộp tăng
trưởng lớn. Cây Dã yên thảo sinh trưởng tốt ở nồng độ CO2 650 ± 50 μl/l và độ ẩm
70%; Cây cúc và cà chua sinh trưởng tốt ở nồng độ CO2 350 ± 50 μl/l. Suốt thời
gian chiếu sáng, thực vật sử dụng CO2 và sản xuất O2. Trong giai đoạn tối cây hô
hấp tiêu thụ O2, nồng độ CO2 sẽ tăng lên. CO2 trong giai đoạn tối sẽ được thực vật
cấy mô sử dụng hết sau 2 giờ được chiếu sáng. Gần đây, người ta đã chứng minh

21. 14
rằng sự chuyển động của không khí gây ảnh hưởng đến chất lượng cây giống
in vitro.
Chingwen Huang và Chiachung Chen (2005) nghiên cứu các đặc điểm vật lý:
tốc độ trao đổi khí, sự phân bố khí, quang phổ ánh sáng lên 7 loại bình nuôi cấy.
Kết quả cho thấy tốc độ trao đổi khí trong bình nuôi cấy dao động 0,0145-0,0811/h;
Sự phân bố khí trong bình đáy tròn đồng đều hơn bình nhiều góc cạnh; đặc điểm
của bình ảnh hưởng rõ rệt đến quang phổ ánh sáng. Thông thường việc đậy kín bình
nuôi cấy ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thoát hơi nước quá mức
từ môi trường và mẫu cấy. Dạng bình nuôi cấy kín làm ảnh hưởng đến thành phần
các khí (Lentini và cộng sự, 1988) cũng như ánh sáng. Blazkova và cộng sự (1989)
đã quan sát sự khác nhau về sinh trưởng và phát triển của cây Chenpodium rubrum
nuôi cấy in vitro trong những bình nuôi cấy khác nhau và lý do cho sự khác nhau
này là sự thay đổi thành phần môi trường khí trong bình nuôi cấy như hàm lượng
CO2 giảm và hàm lượng ethylene gia tăng (De Proft và cộng sự, 1985; Blazkova và
cộng sự, 1989).
Nồng độ CO2 cao có nhiều tác động có lợi lên sự kéo dài chồi và sự phát triển
của lá dựa trên sự tháo gỡ sự ngủ của chồi ngủ và đốt đơn cây Theobroma cacao,
một loài rất khó nhân giống bằng hệ thống vi nhân giống truyền thống. Woltering
(1990) đã chứng minh rằng nồng độ CO2 trên 10000 ppm rất có ích cho cây hoa
Hồng và cây cây hoa Đồng tiền trong việc giảm sự lão hóa của lá và sự rụng lá.
Figueira và Janick (1994) nhận thấy tính gia tăng của việc kéo dài chồi, số lá, diện
tích lá, khối lượng khô và tươi của chồi cây Theobroma cacao khi nồng độ CO2
xung quanh lên đến 24000 ppm. Fujiwara và cộng sự (1988) cho rằng tốc độ quang
hợp thấp và sự kém phát triển của cây in vitro là do nồng độ CO2 trong bình nuôi
cấy thấp trong suốt quá trình quang hợp. Nói cách khác nồng độ CO2 thấp trong
bình nuôi cấy trong gần hết quang kỳ sẽ ức chế khả năng quang hợp của cây, từ đó
buộc cây phải sinh trưởng theo phương thức dị dưỡng hay dị-tự dưỡng nhờ vào sự
hấp thu đường từ môi trường như là nguồn cacbon chủ yếu của cây (Kozai,1991).

22. 15
‫٭‬ Sự bổ sung của đường trong môi trường
Sự hiện diện của nồng độ đường cao trong môi trường nuôi cấy sẽ làm giảm
khả năng quang hợp của cây. Do hoạt động của diệp lục tố bị kiềm hãm bởi tác
động của các enzym Rubisco. Sự hiện diện của đường trong môi trường cùng với
cường độ ánh sáng thấp làm cho hoạt động biến dưỡng và tiêu thụ carbon hydrate
thấp khiến cây tăng trưởng chậm. Sự có mặt của đường làm tăng tỷ lệ nhiễm nấm
khuẩn, là nguyên nhân làm thất thoát một lượng cây lớn trong quá trình nuôi cấy
in vitro (Nguyễn Thị Quỳnh, Toyoki Kozai, 2002). Đồng thời, sự có mặt của đường
làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, cản trở quá trình hấp thu nước và chất
khoáng của hệ rễ. Vì vậy, Kozai đề nghị giảm hay loại bỏ hoàn toàn đường và
vitamin khỏi thành phần môi trường nuôi cấy, đồng thời tăng nồng độ CO2 và
cường độ ánh sáng (Kozai và cs, 1995).
‫٭‬ Ánh sáng
Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có dải bước
sóng từ 400-700 nm với đỉnh từ 600-680 nm. Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự
nảy mầm, kéo dài đốt thân,v.v.) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400-500 nm (xanh
lam), 600-700 nm (đỏ), 700-800 nm (siêu đỏ).
Nhu cầu ánh sáng của cây được phân tích ở những thông số khác nhau: độ sáng
bởi đơn vị diện tích (hoặc cường độ) thể hiện bởi w/m2
, thời gian chiếu sáng thể
hiện bằng giờ/ngày và chất lượng phổ của ánh sáng nhận được. Trước đây, cường
độ ánh sáng được đo bằng đơn vị lux, nhưng nó lại tùy thuộc vào sinh lý của mắt
người đo, mắt người lại nhạy với ánh sáng xanh lá cây hơn là xanh lam và đỏ nên
hoàn toàn không phù hợp với nhu cầu của thực vật. Do đó, hiện nay, trong các
nghiên cứu về thực vật người ta sử dụng đơn vị đo cường độ ánh sáng là PPF
(photosynthesis photon flux), tính bằng µmol m-2
s-1
, nghĩa là số lượng photon tham
gia trong quá trình quang hợp đồng thời cũng tham gia trong quá trình phát sinh
hình thái, tính trên đơn vị diện tích 1 m2
lá trong thời gian 1 giây. Chất lượng ánh
sáng (light quality), thời gian chiếu sáng (photoperiod) và hướng chiếu sáng cũng
đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô.

23. 16
Cường độ ánh sáng mà cây hấp thụ được là rất quan trọng và được tính toán ở
khoảng ngang với cây. Tuy nhiên, cũng có những báo cáo tính theo cường độ ánh
sáng bên ngoài, phía trên hộp nuôi cấy hoặc trên kệ trống của phòng sáng. Kozai và
cộng sự (1995) nhận định rằng, cường độ ánh sáng trên kệ trống xấp xỉ gấp 2 lần
cường độ ánh sáng ở mức ngang với cây trong bình, do đó loại vật liệu được dùng
để làm hộp và nút đậy bình phải đảm bảo cho những ánh sáng khác nhau đi qua.
Để sự quang hợp của cây là tối đa, trong nuôi cấy thoáng khí và quang tự dưỡng
người ta kết hợp nồng độ CO2 cao với cường độ ánh sáng cao
(từ 200-300 µmol m-2
s-1
). Tuy nhiên khi cường độ ánh sáng cao sẽ làm tăng nhiệt
độ trong những bình nuôi cấy, làm thay đổi môi trường xung quanh cây, ảnh hưởng
lên sự tăng trưởng và phát triển của cây. Do đó, khi sử dụng ánh sáng cao, cần có
biện pháp để giảm tối đa sự tăng của nhiệt độ (Nguyễn Thị Quỳnh và Kozai, 1998).
‫٭‬ Nhiệt độ
Nhiệt độ phòng nuôi cây thường được điều chỉnh ổn định từ 24 – 25o
C, vì nhiệt
độ bên trong bình nuôi cấy thường cao hơn 2o
C so với nhiệt độ của phòng nuôi do
tác động của hiệu ứng nhà kính.
‫٭‬ Giá thể
Việc sử dụng thạch hay gelrite trong môi trường nuôi cấy có thể kìm hãm sự
phát triển rễ của cây in vitro do môi trường thiếu thông thoáng khiến hệ rễ và hệ
thống bó mạch kém phát triển, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn thuần hóa khi đưa cây
ra vườn ươm. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc thay thế thạch bằng các loại
giá thể có cơ cấu xốp như vermiculite, sợi cellulose, rockwool sẽ giúp môi trường
xung quanh hệ rễ được thông thoáng, nhờ vậy rễ phát triển mạnh hơn giúp cây hấp
thu nước và muối khoáng trong môi trường dễ hơn (Fujiwara và Kozai, 1995).
Yulan Xiao và Toyoki Kozai (2006) sử dụng hộp Magenta nuôi cấy chồi cây
Limonium latifolium trên môi trường MS không đường với số lần trao đổi khí trong
bình là 3,8 lần/h, cường độ ánh sáng là 100 μmol m-2
s-1
và nồng độ CO2 trong
phòng nuôi cấy là 1500 μmol mol-1
. Bố trí thí nghiệm với 3 nồng độ BA 0; 0,25 và
0,5 mg/l và sử dụng hai loại giá thể là thạch và Florialite. Hai ông đã nhận thấy rằng

24. 17
diện tích lá, hàm lượng Clo-rô-phin, cường độ quang hợp của các cây trong môi
trường không đường bổ sung 0,25 mg/l BA và giá thể Florialite tăng rõ rệt. Khi tăng
nồng độ BA thì số lượng chồi tăng nhưng diện tích lá, khối lượng khô, cường độ
quang hợp của cây giảm.
‫٭‬ Ảnh hưởng của nhân tố khoáng
Chất khoáng là một trong những nhóm chất dinh dưỡng quan trọng cần cho sự
phát triển của cây in vitro. Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ thuộc
nhiều vào loại cây thí nghiệm. Môi trường Murashige và Skoog (1962) là môi
trường phổ biến nhất vì hầu hết các loài cây có thể thích nghi được. Tuy nhiên,
chúng ta cần lưu ý rằng dung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp
cho sự sinh trưởng và phát triển vì nồng độ muối khoáng trong dung dịch quá cao.
Ví dụ cây Đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro (Pierik và Seger,
1972). Lloyd và McCowm (1980) đã tìm ra môi trường thích hợp cho một số loài
thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium).
Khi lựa chọn sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng cần chú ý những vấn
đề sau:
- Nồng độ tổng cộng đôi khi rất quan trọng. Môi trường Knop (1884) là môi
trường nghèo muối và môi trường Murashige và Skoog là môi trường giàu muối.
- Trong một số trường hợp nitrogen được cung cấp dưới dạng hữu cơ nhưng
thông thường nó được cung cấp ở dạng NH4
+
và NO3
-
. Tổng lượng N cần thiết từ
12-60 mM l-1
, trong đó hàm lượng NH4
+
từ 6-10 mM l-1
và hàm lượng NO3
-
từ 6-40
mM l-1
. Hầu hết các cây ưa thích NO3
-
hơn NH4
+
tuy nhiên cũng có một số trường
hợp ngoại lệ. Chúng ta cần tìm ra tỷ lệ NO3
-
/NH4
+
thích hợp cho sự sinh trưởng phát
triển in vitro.
- Nếu cây hấp thụ ion NH4
+
, pH của môi trường bị giảm xuống và thạch trở nên
lỏng. pH của môi trường giảm xuống do cây giảm hấp thụ NH4
+
dẫn đến sự hấp thu
NO3
-
tăng lên.
- Hàm lượng K+
cần thiết nằm trong khoảng 2-26 mM. Trong khi nồng độ các
ion khác như H2PO4
-
, Ca2+
, Mg2+
rất thấp. [3], [13], [4]

25. 18
2.2.3.3. Ảnh hưởng của các chất kích thích tăng trưởng lên sự hình thành
và phát triển của thực vật
Chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển
của cây ở nồng độ rất thấp, ngược lại ở nồng độ cao chúng trở nên độc hoặc ức chế
sự sinh trưởng và phát triển của cây. Ví dụ 2,4-D dùng ở nồng độ thấp có tác dụng
kích thích sự tạo rễ nhưng ở nồng độ cao thì có thể sử dụng như các chất diệt cỏ dại.
Chất kích thích sinh trưởng tác động vào các hoạt động sinh lý của cây như kéo
giãn các thành tế bào và kích thích sự phân hóa tế bào. Các chất kích thích sinh
trưởng nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bào nên chúng
được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất kích thích sinh trưởng
tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong
thực tế.
● Auxin
‫٭‬ Tác dụng sinh lý của auxin
Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của
tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật,
sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt…Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn
của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra. Hiệu quả đặc trưng của
auxin là tác động lên sự giãn của thành tế bào: IAA gây ra sự giảm pH trong thành
tế bào, hoạt hóa enzim phân hủy các polysacarit liên kết giữa các sợi xenluloz làm
cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kện cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp
suất thẩm thấu không bào trung tâm. Ngoài ra auxin cũng kích thích lên thành tế
bào đặc biệt là xenluloz, pectin, hemixenluloz. Bên cạnh đó auxin còn ảnh hưởng
lên sự phân chia của tế bào. Tuy nhiên các ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và phân
chia của thành tế bào trong mối tác động tương hỗ với các phytohoocmon khác
(Giberelin, cytokinin).
Auxin gây ra tính hướng động của cây, auxin gây ra hiện tượng ưu thế ngọn,
auxin kích thích sự hình thành rễ: trong sự hình thành rễ đặc biệt là rễ phụ hiệu quả
của auxin là rất đặc trưng. Sự hình thành rễ phụ có thể chia ra làm 3 giai đoạn:

26. 19
giai đoạn đầu là phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh; tiếp theo là xuất hiện
mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài.
Để khởi xướng sự phản phân hóa của tế bào mạnh mẽ thì cần hàm lượng auxin khá
cao. Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin hơn nếu hàm lượng auxin cao sẽ
có tác dụng gây ức chế sự phát triển của rễ. Vai trò của auxin trong sự phân hóa rễ
thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô, trong kỹ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng
auxin để kích thích sự ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc. Auxin kích thích sự
hình thành, sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt. Auxin kiềm hãm sự rụng lá,
tăng sự tạo quả và phòng rụng nụ, quả non, làm tăng năng suất cây trồng. Auxin ảnh
hưởng lên sự vận động của nguyên sinh chất, tăng tốc độ lưu động của nguyên sinh
chất, ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất: kích thích sự tổng hợp các polyme
và ức chế sự phân hủy của chúng, ảnh hưởng đến các hoạt động như quang hợp, hô
hấp, sự vận chuyển các chất trong cây. Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc
nội sinh được thực vật tổng hợp và auxin tổng hợp do con người tạo ra.
‫٭‬ Cơ chế tác dụng của auxin lên sự sinh trưởng của cây
Cơ chế tác dụng của auxin chủ yếu là tác dụng lên sự giãn của các tế bào: sự
giãn của các tế bào thực vật xảy ra do hai hiệu ứng: sự giãn của thành tế bào và sự
tăng thể tích, khối lượng nguyên sinh chất. Đã từ lâu người ta phát hiện ra hiện
tượng “sinh trưởng acid” tức là trong điều kiện pH thấp (pH=5) thì sự sinh trưởng
của tế bào và mô được kích thích. Điều này do ion H+
đã hoạt hóa enzim phân giải
các cầu nối ngang polysacarit giữa các sợi xenluloz với nhau làm cho các sợi
xenluloz tách rời nhau và rất dễ trượt lên nhau. Dưới ảnh hưởng của sức trương tế
bào do không bào hút nước vào mà các sợi xenluloz đã mất liên kết, lỏng lẻo rất dễ
trượt lên nhau làm cho thành tế bào giãn ra. Vai trò của auxin ở đây là gây nên sự
thay đổi pH cho thành tế bào, bằng cách hoạt hóa bơm proton (H+
) nằm trên màng
sinh chất.
Các loại auxin tổng hợp thông dụng thường dùng: IAA, IBA, NAA, 2,4-D.
Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng
một sự phóng thích ion H+
. Ion này gây ra một hoạt tính axit có trách nhiệm làm
giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+
.

27. 20
Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình
thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi
nách và sự hình thành phôi soma trong môi trường nuôi cấy mô sẹo.
Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng.
Chúng được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa và ở trên
các quả còn non. Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự
phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong
quá trình vận chuyển này, chúng bị oxi hóa do hoạt động của auxin – oxydase, điều
này cho thấy các nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng.
Như vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc
ở phát hoa để đảm bảo cho sự nhân giống và kéo dài tế bào.
Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ từ các đoạn cắt
(Erwin và cộng sự, 1997).
● Cytokinin
Cytokinin là nhóm phytohoocmon thứ ba được phát hiện sau auxin và giberelin.
‫٭‬ Tác dụng sinh lý của cytokinin
Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự
phân chia tế bào mạnh mẽ. Có được hiệu quả này là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ
sự tổng hợp acid nucleic và protein.
Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực
vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng
tỷ lệ giữa auxin và cytokinin có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình
thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn. Nếu tỷ lệ auxin cao
hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích
sự xuất hiện và phát triển của chồi. Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ
cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro.
Cytokinin có khả năng kiềm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây nguyên
vẹn. Cytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và củ .

28. 21
Vì vậy nếu xử lý cytokinin cũng có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ và
chồi.
Ngoài ra trong mối tương tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn
của cây. Cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều. Chính vì
vậy mà từ rễ (cơ quan tổng hợp cytokinin) lên chồi ngọn (cơ quan tổng hợp auxin)
thì hiện tượng ưu thế ngọn càng tăng dần tương ứng với sự tăng hàm lượng auxin và
giảm hàm lượng cytokinin.
Cytokinin còn ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất như quá trình sinh tổng hợp
acid nucleic, protein, clorophin và do đó ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của
cây.
‫٭‬ Cơ chế tác dụng của cytokinin lên sự sinh trưởng của cây
Cytokinin tác động lên quá trình phân hóa tế bào, đến các quá trình phát sinh cơ
quan, kìm hãm sự hóa già, có lẽ ở mức độ phân tử. Nhưng cơ chế tác động của nó
chưa sáng tỏ một cách hoàn toàn. Khi thiếu cytokinin thì tế bào không phân chia
được mặc dù ADN có thể tiếp tục được tổng hợp nhưng quá trình tổng hợp protein
không xảy ra. Vì vậy, cytokinin kiểm tra sự tổng hợp protein ở giai đoạn từ dịch mã
(mARN).
Hiệu quả của cytokinin trong việc ngăn chặn sự hóa già có liên quan nhiều đến
khả năng ngăn chặn sự phân hủy protein, acid nucleic và clorophin hơn là khả năng
kích thích tổng hợp chúng. Có lẽ cytokinin ngăn chặn sự tổng hợp mARN điều
khiển sự tổng hợp nên các enzim thủy phân.
Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào
và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi
cấy in vitro. [8], [9], [13]
2.2.3.4. Các chất gây độc từ mẫu cấy
Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng
của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các
hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non.

29. 22
Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là acid Eucomic và Tyramine. Có vài
phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:
- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,
đặc biệt có hiệu quả trên các loài Phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với
nồng độ thường dùng 0,1-0,3%. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình
phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác.
- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua
vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau.
- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi
trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như acid
ascorbic, acid citric, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và
mecaptoethanol.
Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác
trên mẫu:
- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non
- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng
- Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic, acid citric vài giờ trước khi cấy
- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần
2.2.3.5 Hiện tượng thủy tinh thể
Những cây thân thảo và thân gỗ nhân giống in vitro thường xuyên bị ảnh hưởng
bởi sự dư thừa của nhiều nhân tố nuôi cấy. Điều này dẫn đến sự rối loạn biến dưỡng
và hình thái. Những bất thường về hình thái giải phẫu và sinh lý trong nuôi cấy mô
đã được miêu tả bằng rất nhiều thuật ngữ: hiện tượng thủy tinh thể, sự tích lũy nước
quá mức, sự mọng nước và hiện tượng trong vắt như thủy tinh. Mặc dù vậy, thuật
ngữ “Vitrification” là thuật ngữ chính vì nó đề cập được một quá trình sinh lý chứ
không phải là một quá trình sinh học, nó là thuật ngữ được dùng nhiều nhất để diễn
tả sự thay đổi của lá dẫn đến hiện tượng thủy tinh thể. Một vài đặc điểm có thể thấy
rất rõ trên lá của cây Cẩm chướng: sự rối loạn mà nó biểu hiện chủ yếu trên lá, tác

30. 23
động lên hai quá trình chính được thực hiện bởi lá, đó là sự quang hợp và sự trao
đổi khí (CO2, hơi nước) (Ziv, 1991). Sự bất thường về hình thái giải phẫu cũng
được biểu hiện với mức ít phổ biến hơn trên thân và rễ. Những rối loạn tiếp tục
ngăn cản những cây vi nhân giống có thể phát triển trong điều kiện ex vitro.
Các điều kiện đặc biệt cần thiết cho việc nhân nhanh chồi in vitro như độ ẩm
cao, dư thừa chất dinh dưỡng, có mặt các chất khoáng, đường và các chất kích thích
sinh trưởng ở nồng độ cao, cường độ ánh sáng thấp là nguyên nhân chính được
chứng minh là có khả năng cảm ứng việc hình thành những chồi biến dị. Những
bằng chứng hiện nay xác định rằng độ ẩm tương đối và thế nước là những nhân tố
chủ yếu tham gia vào quá trình phát sinh hình thái bất thường trong điều kiện
in vitro (Ziv, 1991).
Hiện tượng thủy tinh thể có thể xảy ra cả ở trong môi trường rắn cũng như môi
trường lỏng (Debergh, 1983). Hiện tượng này đặc biệt phổ biến nếu cây có quá
nhiều lượng nước sẵn có, điều này thường thấy ở trường hợp nuôi cấy trong môi
trường lỏng hay môi trường có hàm lượng thạch thấp (Debergh và cộng sự, 1981).
Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều
người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi
cấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh
sáng, trao đổi khí) thích hợp. [13], [1], [2]…
2.3. Các nghiên cứu trước đây về cây Cẩm chướng
Các tác giả Lê Đức Thảo, Nguyễn Thị Kim Lý (Viện Di truyền nông nghiệp),
Hoàng Ngọc Thuận (Trường ĐH Nông nghiệp I) ( năm 2008) đã thực hiện nghiên
cứu quy trình nhân giống hoa Cẩm chướng SP1 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào nhằm nhân nhanh, đưa giống cây này phát triển ra sản xuất.
Nghiên cứu tiến hành với mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh và chồi nách của giống
cẩm chướng SP1 (Dianthus caryophyllus Topaz), được cấy vào môi trường MS
(Murashige & Skoog) có bổ sung 2% đường, 6,5g/l agar.

31. 24
Môi trường tái sinh chồi và nhân nhanh là MS, pH 5,8-60, 10% nước dừa,
6,5g/l agar, 2% đường. Điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 25-280
C, ánh sáng
1500-2000 Lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày.
Môi trường MS có bổ sung NAA được sử dụng để ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh.
Cát sạch, hạt perlite, đất sông, đất màu, rễ bèo phơi khô được dùng để làm giá
thể khi đưa ra vườn ươm.
Kết quả cho thấy, mẫu được khử trùng với HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút
cho tỷ lệ sống sau 3 tuần cao nhất (78%).
Môi trường MS + 10% nước dừa +6,5 g/l agar + 3% đường bổ sung BAP
1mg/l + Kinetin 0,5 mg/l đạt hệ số nhân cao nhất 7,52 lần.
Môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS/2 +6,5 g/l agar +2% đường bổ sung NAA
0,2 mg/l cho tỷ lệ cây sống ra rễ cao nhất đạt 93,11% sau 1 tháng.
Tỷ lệ cây sống sau khi đưa ra vườn ươm với giá thể hỗn hợp gồm hạt perlite
30% + cát sông 10% + đất màu 10% + rễ bèo phơi khô xay nhỏ 50% đạt cao nhất
51,56% sau 3 tuần.. Với giá thể B khi phun Pomior 0,3%, sau 3 tuần tỷ lệ cây đạt
tiêu chuẩn xuất vườn là 64,81%. Pomior là loại Phân bón lá cung cấp đầy đủ các
chất dinh dưỡng đa lượng, trung lượng, vi lượng và các axit amin quan trọng nhất
trong cây, tăng hiệu suất quang hợp, tiết kiệm 10% phân hữu cơ và các loại phân
khoáng đa lượng nhằm bảo vệ môi trường nông nghiệp bền vững. [12]
2.4. Một số loài hoa Cẩm Chướng trồng phổ biến ở Việt Nam
Hiện nay, ở nước ta đã tiến hành trồng được 3 loài Dianthus làm hoa cảnh tại
Đà Lạt là Dianthus barbatus L., D.sinensis L. và D.caryophyllus L.. Cây hoa Cẩm
chướng phát triển ở vùng có độ cao khác nhau tuy nhiên chất lượng hoa khác nhau.
Vì vậy, tùy thuộc nên phổ biến cho người trồng hoa biết thêm những đặc điểm về
các loài hay giống Cẩm chướng này để trồng cho phù hợp. Cụ thể là các loài sau:

32. 25
● Loài Sweet William, D.barbatus.
Thân cứng cáp, cao 25-50cm. Lá dẹp,
màu xanh lợt hay xanh đậm, dài 3-7cm.
Hoa mọc thành chùm khít nhau, rộng 1-
2cm, màu trắng, hồng đỏ, tím hay hai màu,
mùi thơm nhẹ.
Hình 2.2. Dianthus barbatus
● Loài Hồng trinh nữ Maiden Pink, D.deltoides.
Đây là loài cẩm chướng duy nhất mọc tốt
được khi ít ánh nắng mặt trời, nửa ngày bóng
râm; cũng chịu lạnh khá giỏi và là loài đa
niên. Thân có hoa cao chừng 12-30cm, lá
ngắn. Hoa rộng 2cm, mọc ở thân xẻ nhiều
cành, bìa cánh hoa răng cưa nhọn, màu sắc
hồng lợt đến hồng đậm, có khi màu tím hay
trắng lốm đốm màu sắc lợt khác.
Hình 2.3. Dianthus deltoides

33. 26
● Loài cheddar Pink, D.gratinanopolitanus (D.caesius)
Là loài đa niên, mọc như ụ nhỏ,
dày, lá màu xanh dương xám, thân chia
nhánh yếu đuối, dài 30cm, mọc thẳng
đứng. Hoa thơm ngào ngạt, màu hồng,
cánh hoa răng cưa.
Hình 2.4. Dianthus gratinanopolitanus
● Loài hồng đá – Rock Pink, Dianthus pavonius (D.neglectus),
Đây là cây cẩm chướng vườn đá
nhỏ nhất, đa niên. Lá hẹp, xanh lục, dài
2-5cm, kết thành cụm nhỏ. Hoa đơn
trên thân cao 15cm, màu hồng đỏ thắm
tươi, rộng khoảng 2-3cm
Hình 2.5. Dianthus pavonius

34. 27
● Loài hồng thôn dã- Cottage Pink, Dianthus plumatus đa niên.
Đây là loài cẩm chướng diễm
kiều, đã trồng nhiều ở thế kỷ ở Âu Mỹ
và được chọn làm giống để lai thành
nhiều giống khác nhau. Điển hình là
một thảm lá nhỏ rời rạc xanh lục. Thân
cho hoa cao 25-50cm, hoa thơm mùi
gia vị, đơn hay kép, cánh hoa tua viền,
hồng hay trắng tâm đậm.
Hình 2.6. Dianthus plumatus

35. 28
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 21/9/2009 đến 30/12/2009, tại phòng Công
Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Tôn Đức Thắng TPHCM.
3.2. Vật liệu thí nghiệm
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Vật liệu dùng trong thí nghiệm này là hạt của cây Cẩm chướng.
Hạt được rửa với nước xà phòng loãng, sau đó rửa lại bằng nước máy 3 lần.
Bằng thao tác vô trùng trong tủ cấy, ngâm hạt 1 phút trong ethanol 70%. Rửa hạt
sạch ethanol bằng nước cất. Sau đó ngâm hạt 10 phút trong dung dịch javel
(Mỹ Hảo) với tỉ lệ Javel: nước (3:1). Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3-4 lần.
Hạt sau khi khử trùng, tiến hành cho nảy mầm trong ống nghiệm. Các cây trong
ống nghiệm có nguồn gốc từ hạt được dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau
này.
3.2.2. Trang thiết bị thí nghiệm
Thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH.
Dụng cụ: pince, dao cấy, lọ thủy tinh, erlen, đèn cồn, pipette, ống đong, petri.
3.2.3. Môi trường
Môi trường muối khoáng cơ bản Murashige và Skoog (1962) bổ sung thêm các
thành phần:
- Vitamin Morel
- Chất điều hòa tăng trưởng thực vật (BA, IBA) với nồng độ nhất định tùy theo
mục đích thí nghiệm.
- Đường Saccarose: 30 g/l.
- Agar: 8,5 g/l

36. 29
Môi trường được chỉnh về pH 5,8.
Môi trường được hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm trong 20 phút.
3.3. Phương pháp thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi nghiệm thức được lặp lại
3 lần.
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi
cây Cẩm chướng in vitro
3.3.1. Mục đích thí nghiệm
Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA thích hợp cho sự hình thành
chồi cây Cẩm chướng in vitro.
3.3.1.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm
Cây Cẩm chướng in vitro được tiến hành cắt để lấy phần gốc ( 1-1,5 cm) có
mang 2 lá mầm và cấy trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ từ 0,5 đến
2,0 mg/l (Bảng 3.1.) .
Bảng 3.1. Môi trường phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro có bổ sung
BA ở nồng độ khác nhau
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l)
C0 (ĐC) 0,0
C1 0,5
C2 1,0
C3 1,5
C4 2,0

37. 30
Thể tích chai: 100 ml
Thể tích dung dich/ chai: 20 ml
Số mẫu cấy/ chai: 1 mẫu
Số chai/ nghiệm thức: 2
Tổng số chai: 30
3.3.1.3. Chỉ tiêu theo dõi
Thời gian xuất hiện chồi
Tỉ lệ mẫu cấy hình thành chồi
Số chồi / mẫu cấy
3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước dừa lên quá trình
phát sinh chồi cây Cẩm chướng
3.3.2.1. Mục đích thí nghiệm
Xác định nồng độ nước dừa thích hợp cho sự hình thành chồi cây Cẩm chướng
in vitro.
3.3.2.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm
Cây Cẩm chướng in vitro được tiến hành cắt để lấy phần gốc ( 1-1,5 cm) có
mang 2 lá mầm và cấy trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 1mg/l và
nước dừa từ 5% đến 20% (bảng 3.2) .

38. 31
Bảng 3.2. Môi trường tạo chồi cây Cẩm chướng in vitro có bổ sung nước
dừa với nồng độ khác nhau
Nghiệm thức Nồng độ nước dừa
D0 (ĐC) 0%
D1 5%
D2 10%
D3 15%
D4 20%
Thể tích chai: 100 ml
Thể tích dung dich/ chai: 20 ml
Số mẫu cấy/ chai: 1 mẫu
Số chai/ nghiệm thức: 2
Tổng số chai: 30
3.3.2.3. Chỉ tiêu theo dõi
Thời gian xuất hiện chồi
Tỉ lệ mẫu cấy hình thành chồi
Số chồi / mẫu cấy

39. 32
3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ trong
ống nghiệm
3.3.3.1. Mục đích thí nghiệm
Xác định nồng độ IBA thích hợp lên sự phát sinh rễ cây.
3.3.3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm
Các chồi cây có kích thước 1-1,5cm được nuôi cấy trong ống nghiệm ở thí
nghiệm nhân chồi được dùng làm nguyên liệu thí nghiệm . Các chồi cây này được
nuôi cấy trên môi trường MS và có bổ sung nồng độ IBA như (bảng 3.3.).
Bảng 3.3. Môi trường tạo rễ và tái sinh cây Cẩm chướng in vitro hoàn
chỉnh có bổ sung IBA ở nồng độ khác nhau
Nghiệm thức Nồng độ IBA (mg/l)
R0 (ĐC) 0,0
R1 0,5
R2 1,0
R3 1,5
R4 2,0
Thể tích chai: 100 ml
Thể tích dung dich/ chai: 20 ml
Số mẫu cấy/ chai: 1 mẫu
Số chai/ nghiệm thức: 2
Tổng số chai: 30

40. 33
3.3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi
% Cây tạo rễ
Số lượng rễ/ mẫu cấy
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu sau khi được đo đạc ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được xử lý
bằng chương trình thống kê Mstatc . Các giá trị trung bình và sai số có ý nghĩa được
tính theo phương pháp thống kê mô tả. So sánh sự tương quan của các giá trị trung
bình được tính theo phương pháp LSD.

41. http://bit.ly/KhoTaiLieuAZ