Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã
nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và
bạn bè.
Trước hết, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. NGUYỄN THỊ
XUÂN SÂM – Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh
học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã định hướng
nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học – Đại
học Lâm nghiệp cùng các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng
thí nghiệm Vi sinh- Hóa sinh - Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Xin cảm ơn các thầy cô và bạn bè thân thiết đã động viên, giúp đỡ em trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Những lời cảm ơn chân thành nhất của em xin được gửi đến các thành viên trong
gia đình, những người đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho
em trong cuộc sống.
Chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 09 năm 2016
Học viên
Nguyễn Thị Kim Dung

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi. Các
kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán là hoàn
toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào.
Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều
được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.
Hà Nội, ngày 21 tháng 09 năm 2016

Luận văn thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU..............................................................................................................................1
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN...........................................................................................3
1.1. Prebiotic và Pectic oligosaccharide (POS) ........................................................... 3
1.1.1. Prebiotic............................................................................................................ 3
1.1.2. Pectic oligosaccharide (POS) ......................................................................... 4
1.2. Cơ chất pectin........................................................................................................... 5
1.3. Thu nhận Pectic oligosaccharide (POS) ............................................................... 7
1.3.1. Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme thu POS trong hệ thống có
tích hợp màng lọc .....................................................................................................10
1.3.2. Cô đặc, tách, tinh sạch POS..........................................................................13
1.3.3. Sấy tạo sản phẩm ...........................................................................................17
1.3.4. Bao gói và điều kiện bảo quản sản phẩm ...................................................19
1.4. Đánh giá pectic oligosaccharide (POS) ..............................................................20
1.4.1. Phân tích định tính.........................................................................................20
1.4.2. Phân tích định lượng .....................................................................................21
1.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học..........................................................................23
1.5. Ứng dụng POS sản xuất nước bí đao chức năng ...............................................25
1.5.1. Tiềm năng ứng dụng của POS .....................................................................25
1.5.2. Ứng dụng sản xuất nước bí đao bổ sung POS............................................26
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................28
2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị.................................................................................28

2.1.1. Vật liệu............................................................................................................28
2.1.2. Môi trường và các dung dịch sử dụng.........................................................28
2.1.3. Hoá chất chính................................................................................................29
2.1.4. Thiết bị ............................................................................................................30
2.1.5. Màng lọc .........................................................................................................31
2.2. Phương pháp phân tích..........................................................................................33
2.2.1. Phương pháp vi sinh......................................................................................33
2.2.2. Phương pháp hoá lý - hoá sinh.....................................................................34
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................36
2.3.1. Thu nhận dịch thủy phân ..............................................................................36
2.3.2. Cô đặc dịch thủy phân...................................................................................37
2.3.3. Loại muối khỏi dịch thủy phân bằng kết tủa ethanol................................37
2.3.4. Sấy phun..........................................................................................................37
2.3.5. Tính toán hiệu suất thu hồi POS ..................................................................37
2.3.6. Lựa chọn bao bì và điều kiện bảo quản chế phẩm POS............................38
2.3.7. Nghiên cứu sản xuất nước bí đao bổ sung POS.........................................38
2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan .........................................................................38
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................42
3.1. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm POS.....................................................42
3.1.1. Cô đặc dịch thủy phân...................................................................................42
3.1.2. Loại muối đệm khỏi sản phẩm POS............................................................44
3.1.3. Sấy phun thu chế phẩm POS ........................................................................47
3.2. Nghiên cứu bảo quản chế phẩm POS..................................................................52
3.3. Đánh giá chế phẩm POS bột.................................................................................57
3.3.1. Đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS.57
3.3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm POS ........................................61
3.4. Nghiên cứu ứng dụng POS để sản xuất nước bí đao chức năng......................64
3.4.1. Nghiên cứu sản xuất nước bí đao bổ sung POS.........................................64
3.4.2. Phân tích thành phần nước bí đao có bổ sung POS...................................68

3.4.3. Xây dựng quy trình sản xuất nước bí đao bổ sung POS ...........................70
3.4.4. Đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm nước bí
đao bổ sung POS.......................................................................................................72
KẾT LUẬN .......................................................................................................................74
KIẾN NGHỊ......................................................................................................................75
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................76
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................86

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Chú thích
AX Arabinoxylan
AXOS Arabinoxylooligosaccharides
CFF Cross flow filtration (Lọc dòng ngang)
Da Dalton
DE Degree of esterification(Mức độ ester hóa)
DP Degree of polymerization (Mức độ trùng hợp)
FOS Fructo oligosaccharide
G1 Monomonogalacturonic
G2 Dimonogalacturonic
G3 Trimonogalacturonic
GalA D-monogalacturonic
GalOS Galacto oligosaccharide
GOS Galacto oligosaccharide
HGA Homogalacturonan
HM High methyl ester (Pectincó mức độ methyl hóa cao)
HPAEC-PAD High performance anion exchange chromatography
(HPAEC) with pulsed amperometric detection (PAD) (Sắc kí
trao đổi anion hiệu năng cao với detector điện hóa)

HPLC High performance liqiquid chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao)
kDa kilo Dalton
LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm
LM Low methyl este (Pectincó mức độ methyl hóa thấp)
MOS Mannooligosaccharide
MPa Mega Pascal
MWCO Molecular weight cutoff
NMWL Nominal molecular weight limit (Giới hạn khối lượng phân
tử đại diện)
PE Polyethylene
POS Pectic Oligosaccharide
RG I, II Rhamnogalacturonan I, II
TLC Thin layer chromatography (Sắc ký bản mỏng)
v/v volume/volume (Thể tích/thể tích)
v/v/v volume/volume/volume (Thể tích/thể tích/thể tích)
w/v weight/volume (Khối lượng/thể tích)
XOS Xylo – oligosaccharide

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thông số kỹ thuật của màng 50 kDa (GE Healthcare, Mỹ)............................31
Bảng 2.2. Thông số kỹ thuật của màng 1 kDa (GE Healthcare, Mỹ) ..............................31
Bảng 2.3. Thông số kĩ thuật màng nano spiral wound 0.3 kDa (Model: DL2540F1072)
...................................................................................................................................................32
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp......................................................................34
Bảng 2.5. Phép thử tam giác .................................................................................................40
Bảng 3.1. Xác định hiệu suất thu hồi của bước cô đặc bằng lọc nano.............................43
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol : dịch đến hiệu quả kết tủa và khả năng loại
muối (kết tủa ở 4˚C trong 4 giờ)...........................................................................................45
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện kết tủa đến hiệu suất thu hồi POS ...................46
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô dịch POS trước khi sấy phun ...............49
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của chế độ sấy đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm ................51
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của loại bao bì đến các thông số của bột POS..............................53
Bảng 3.7. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong POS thành phẩm....58
Bảng 3.8. Bảng theo dõi trọng lượng chuột khi cho ăn POS ............................................60
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại............62
Bảng 3.10. Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS bột .........................................63
Bảng 3.11. Xác định công thức nước bí đao bổ sung POS ...............................................65
Bảng 3.12. Hàm lượng POS trong nước bí đao bổ sung POS ..........................................66
Bảng 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan bằng phép thử tam giác......................................67
Bảng 3.14. Thành phần dinh dưỡng trong nước bí đao (tính trên 100 mL) ....................69
Bảng 3.15. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong nước bí đao bổ sung
POS...........................................................................................................................................73
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu tạo của D - Monogalacturonic và một pectic oligosaccharide [21] ..........4
Hình 1.2. Cấu trúc pectin [11] ................................................................................................6
Hình 1.3. Sơ đồ sản xuất POS theo phương pháp thủy phân pectin bằng enzym ............9
Hình 1.4. Sơ đồ mô hình phản ứng thủy phân có tích hợp bộ phận lọc dòng ngang.....10
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn monogalacturonic ..............................................................35
Hình 3.1. Sắc ký của các dung dịch thử nghiệm với màng 0.3kDa .................................43
Hình 3.2. Kết tủa POS (A) sau kết tủa cồn và Phổ sản phẩm POS (B) trong kết tủa...47
Hình 3.3. Chế phẩm POS bột sau sấy phun ........................................................................52
Hình 3.4. Chế phẩm POS bảo quản trong túi PE và túi thiếc ...........................................54
Hình 3.5. Quy trình thu nhận chế phẩm POS dạng bột .....................................................55
Hình 3.6. Một số hình ảnh của quá trình thu nhận POS trên quy mô pilot .....................57
Hình 3.7. Kiểm tra độ bền của POS sau thanh trùng .........................................................65
Hình 3.8. Sản phẩm nước bí đao bổ sung POS...................................................................69
Hình 3.9. Quy trình thu nhận nước bí đao bổ sung POS ...................................................71
Hình 3.10. Sản phẩm nước bí đao chứa POS 2%...............................................................72

1
MỞ ĐẦU
Cuộc sống hiện đại mang lại cho chúng ta nhiều tiện nghi, thoải mái nhưng hệ
lụy của nó mang lại cũng không hề nhỏ. Với sự bận rộn của cuộc sống ngày nay,
những bữa ăn nhanh đang dần thay thế những bữa ăn với đầy đủ chất dinh dưỡng làm
cho số lượng người mắc các căn bệnh như: béo phì, tiểu đường, bệnh tim mạch, ung
thư… đang dần tăng lên. Nhận thức được những nguy cơ này, con người ngày càng
quan tâm hơn đến sức khỏe của mình, đặc biệt là trong việc phòng chống bệnh tật. Xu
hướng và nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng để bổ sung dưỡng chất cho cơ thể
đồng thời giúp phòng chống bệnh ngày càng phổ biến. Điều này đã thúc đẩy mạnh nhu
cầu sử dụng prebiotic và nghiên cứu sản xuất các thế hệ prebiotic mới.
Pectic oligosaccharide (POS) là một trong những prebiotic thế hệ mới được
nghiên cứu trong thời gian gần đây. POS là một hợp chất carbohydrate, bao gồm từ 2 –
10 đơn phân D - monogalacturonic nối với nhau bằng liên kết α (1 – 4) glucoside và có
nhiều đặc tính quý.
Là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên POS có tính acid tương tự
như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây
bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại
oligosaccharide trung tính. Bên cạnh đó, POS được các vi sinh vật có trong đường ruột
sử dụng và sản phẩm của quá trình lên men này có những ảnh hưởng tích cực đối với
cơ thể vật chủ. POS được chứng minh là thúc đẩy quá trình tự chết apoptosis của các tế
bào ung thư ruột ở người, có khả năng bảo vệ tim mạch, làm giảm tổn thương của cơ
thể dưới tác dụng của các kim loại nặng, chống béo phì, chống nhiễm trùng, chống
nhiễm khuẩn và chống oxy hóa. Từ những lợi ích rất thiết thực trên, oligosaccharides
prebiotics nói chung và POS nói riêng có tiềm năng làm thực phẩm bổ sung trong công
nghệ chế biến các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

2
Hiện nay POS được sản xuất bởi một số phương pháp như tổng hợp hóa học,
phân cắt pectin bằng chiếu xạ và sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin. Trong đó,
hướng nghiên cứu sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin được quan tâm hơn cả do
cho hiệu quả tốt nhất với điều kiện phản ứng enzyme êm dịu, thân thiện với môi
trường, cường lực xúc tác của enzyme mạnh và đặc hiệu.
Trên thế giới hiện nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về quá trình thủy phân
giới hạn pectin thu POS bằng phương pháp thủy phân gián đoạn [17, 55, 56, 59] và
phương pháp thủy phân có tích hợp màng lọc [21, 36, 38, 40] cho hiệu quả cao. Tuy
nhiên, có rất ít công trình trên thế giới và trong nước nghiên cứu thu hồi POS từ hệ
thống thủy phân trong bình phản ứng thông thường cũng như vẫn chưa có công trình
nào công bố về quy trình sản xuất, thu hồi POS từ hệ thống thủy phân có tích hợp
màng lọc và ứng dụng POS vào sản xuất thực phẩm chức năng. Xuất phát từ những lí
do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu nhận Pectic Oligosaccharide (POS)
từ dịch thủy phân pectin và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”
Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng quy trình thu nhận POS có chất lượng và hiệu suất cao từ dịch thủy
phân pectin ứng dụng vào sản xuất nước bí đao chức năng.
Nội dung nghiên cứu
 Xây dựng quy trình thu nhận và tinh sạch Pectic oligosaccharide (POS) từ dịch
thuỷ phân pectin thu từ hệ thống thủy phân có tích hợp màng lọc.
 Hoàn thiện sản phẩm và đánh giá các chỉ tiêu chất lượng, vệ sinh an toàn thực
phẩm của chế phẩm POS.
 Nghiên cứu ứng dụng POS vào sản xuất nước bí đao chức năng, đánh giá chất
lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm. Xây dựng quy trình sản xuất nước bí đao
bổ sung POS.

3
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN
1.1. Prebiotic và Pectic oligosaccharide (POS)
1.1.1. Prebiotic
Prebiotic là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm cacbonhydrate mà cơ thể vật chủ
không tiêu hóa được (oligosaccharides), kích thích sự phát triển và hoạt động của vi
khuẩn có lợi trong ruột [27]. Như vậy, nhờ có prebiotic mà vi sinh vật hữu ích có điều
kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do đó cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ. Tinh bột bền
(resistant starch), Xylo oligosaccharide (XOS), Fructo oligosaccharide (FOS), Inulin và
Pectic oligosaccharides (POS) là những ví dụ đại diện cho các dòng sản phẩm dạng
này.
Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có một số cơ sở trong nước nghiên cứu
và đưa vào sản xuất một số sản phẩm prebiotic. Tại Viện Công nghiệp thực phẩm,
Trịnh Thị Kim Vân, Nguyễn Hoàng Anh đã thực hiện các đề tài nghiên cứu sản xuất
Fructooligosaccharide (FOS) bằng enzyme để ứng dụng sản xuất một số thực phẩm
chức năng [6]. Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã sử dụng enzyme endo-1,4-β-mannosidase
từ Aspergillus niger BK01 để thủy phân bã cơm dừa, thu chế phẩm đường chức năng
Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng và dược
phẩm [2]. Với các đặc tính ưu việt của enzyme tái tổ hợp, cùng hiệu suất biểu hiện cao,
quá trình ứng dụng enzyme tái tổ hợp này trong sản xuất chế phẩm MOS cao độ đang
được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn nuôi tôm,…[3].

4
1.1.2. Pectic oligosaccharide (POS)
Pectic oligosaccharides là các oligosaccharide có nguồn gốc từ pectin, cấu tạo từ
2 - 10 đơn phân D - Monogalacturonic nối với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside
[21] (hình 1.1).
Hình 1.1. Cấu tạo của D - Monogalacturonic và một pectic oligosaccharide [21]
Pectic oligosaccharide có phân tử lượng không lớn lắm và chúng có một số tính
chất của một acid hữu cơ, mang điện tích âm, có độ nhớt thấp và ít ngọt hơn đường
sucrose [8].
Là một oligosaccharid dễ tan trong nước và khi thủy phân bằng acid hoặc enzyme
sẽ làm đứt các liên kết glucoside, giải phóng các đơn phân Monogalacturonic và các
oligosaccharide mạch ngắn hơn.
Các nghiên cứu về pectic oligosaccharide cho thấy POS có hoạt tính của một
prebiotic, POS được các vi sinh vật có trong đường ruột sử dụng và sản phẩm của quá
trình lên men này có những ảnh hưởng tích cực đối với cơ thể vật chủ. Một số ảnh
hưởng có lợi của POS cho sức khỏe của con người như:
- Bảo vệ các tế bào đường ruột chống lại tác dụng của của độc tố Shiga [63];
- Ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh đường tiết niệu [30];
- Thúc đẩy quá trình tự chết apoptosis của các tế bào ung thư ruột ở người [62];

5
- Có khả năng bảo vệ tim mạch [47], làm giảm tổn thương của cơ thể dưới tác
dụng của các kim loại nặng, chống béo phì, các bệnh về da, chống độc, chống nhiễm
trùng, chống nhiễm khuẩn và chống oxy hóa.
Hoạt tính prebiotic của POS phụ thuộc vào đặc điểm hóa học và hóa lý của
chúng. Mức độ methyl hóa của pectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong các thuộc
tính lên men của POS. Người ta đã chứng minh được rằng POS có mức methyl hóa
thấp được vi khuẩn lên men tốt hơn POS có mức methyl hóa cao [26].
Năm 2003, Olano-Martin, Rimbach và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu khả
năng thúc đẩy quá trình apoptosis của tế bào ung thư ruột ở người [62].
Một nghiên cứu khác về hoạt tính prebiotics của POS có nguồn gốc từ pectin
táo gai được Li và cộng sự công bố năm 2010 [47] cho thấy POS có khả năng làm giảm
nồng độ cholesterol và triglyceride tổng số giúp ức chế sự tích tụ chất béo của cơ thể.
Năm 2004 và 2007, Holchkiss và cộng sự cũng công bố nghiên cứu chứng tỏ
rằng POS có khả năng làm tăng số lượng các loài vi khuẩn có lợi trong đường ruột như
bifidobacteria, lactobacilli [32, 33].
Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu khác ở môi trường in vivo và in vitro
cho thấy POS có tính acid không độc hoặc gây đột biến, thích hợp bổ sung vào thực
phẩm dành cho trẻ em và trẻ sơ sinh [25].
1.2. Cơ chất pectin
Pectin là polysaccharide phân nhánh phức tạp có trục chính bao gồm các phân tử
D-monogalacturonic (GalA) liên kết với nhau theo liên kết α-1,4-glucoside, trong đó
một số gốc cacboxyl -COOH có thể bị acetyl hóa và/hoặc methyl hóa ngẫu nhiên.

6
Pectin được tìm thấy trong tế bào của tất cả các thực vật bậc cao và chiếm khoảng
22 - 35% khối lượng khô của tế bào [15]. Pectin giữ nhiều vai trò quan trọng của thành
tế bào và của thực vật [57].
Pectin có cấu trúc khá phức tạp và gồm ba phần chính:
Homogalacturonan (HGA) và Rhamnogalacturonan (RG) I và II [11]. Cấu trúc pectin
được biểu diễn trên hình 1.2
Hình 1.2. Cấu trúc pectin [11]
Trong 3 loại trên, HGA là thành phần chiếm tỷ lệ lớn và có mặt ở nhiều loại thực
vật nên được nghiên cứu sâu rộng hơn các thành phần khác.
Một vài nhóm carboxyl -COOH của phân tử monogalacturonic trong chuỗi pectin
bị este hóa bởi nhóm methyl và phần trăm các nhóm carboxyl bị este được gọi là mức
độ este hóa, ký hiệu là DE (Degree of esterification). Mức độ este hóa ảnh hưởng lớn
đến các tính chất của pectin, đặc biệt là tính hòa tan và khả năng tạo gel.
Dựa vào mức độ este hóa, pectin được chia thành 2 nhóm chính:
- Pectin este metyl hóa cao (High methyl este - HM) với số gốc acid của pectin được
metyl hóa lớn hơn 50%.

7
- Pectin este metyl hóa thấp (Low methyl este - LM) với số gốc acid của pectin được
methyl hóa nhỏ hơn 50% [69].
Khả năng este hóa cao nhất có thể đạt được ở các dịch chiết nguyên liệu thô
tự nhiên khoảng 75%.
1.3. Thu nhận Pectic oligosaccharide (POS)
Pectic oligosaccharide là một prebiotic có nguồn gốc từ pectin. Hiện nay, có một
số phương pháp sản xuất POS như: tách chiết từ thực vật [48], tổng hợp và phân cắt
pectin tạo POS [34].
Thu nhận POS từ nguồn cơ chất pectin đang được nghiên cứu nhiều với các
phương pháp khác nhau:
 Phương pháp hoá học:
- Tổng hợp hóa học: tiến hành glycosyl các mono và disaccharide thích hợp, sau
đó thực hiện phản ứng nối các trihexagalacturonate đã được methyl este hóa chọn lọc
[50].
- Xử lý hóa chất: sử dụng acid pha loãng hoặc acid cô đặc (đến 2M) như
hydrochloric acid, sulfuric acid, trifloacetic acid, formic acid hoặc nitric acid đun nóng
từ 50 - 90˚C để phân cắt pectin tạo POS [19].
 Phương pháp vật lý:
Một số tác nhân vật lý được sử dụng như nhiệt, vi sóng, bức xạ γ và sóng siêu
âm [31, 37]. Ví dụ, chiếu xạ pectin thu được các mảnh oligosaccharide với hiệu suất
cao. Tuy nhiên, khi chiếu xạ sẽ làm tăng nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng lên đến hơn
100˚C, điều này sẽ làm lượng protein hoặc peptide còn lại trong mẫu có thể gây ra
phản ứng Maillard, do đó có thể hình thành các phân tử không mong muốn và độc hại
[37].

8
 Phương pháp sinh học
Pectin có thể được phân cắt thành các pectic oligosaccharide nhờ endo-
polygalacturonase [21, 38]. Phương pháp thủy phân bằng enzyme có nhiều ưu điểm
như: phản ứng được thực hiện dưới các điều kiện êm dịu, môi trường thủy phân không
gây ăn mòn thiết bị, không có chất độc hoặc hóa chất tồn dư, quá trình thủy phân có
mức độ chọn lọc cao, enzyme chỉ xúc tác cho các liên kết hoặc đơn vị cơ chất đặc biệt
của riêng nó, sản phẩm thu được nhiều hơn so với phương pháp hóa học và tránh được
sự hình thành của các hợp chất không mong muốn. Từ những ưu điểm trên cho thấy
phương pháp thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme là phương pháp đơn giản, hiệu
quả và khắc phục được nhược điểm của phương pháp vật lý và hóa học.
Hình 1.3 là sơ đồ chung sản xuất POS theo phương pháp thuỷ phân pectin bằng
enzym. Sơ đồ gồm các bước chính sau:
- Thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme ở các điều kiện thích hợp diễn ra trong
bình phản ứng thông thường hoặc trong bình phản ứng có tích hợp màng lọc.
- Từ dịch thuỷ phân thu được, tiến hành cô đặc, tách, tinh sạch bằng các phương
pháp lọc nano, kết tủa ethanol, hoặc lọc gel để tách riêng các thành phần POS
phục vụ cho các mục đích nghiên cứu và phân tích khác.
- Hoàn thiện sản phẩm: bao gồm công đoạn sấy phun thu chế phẩm dạng bột,
nghiên cứu các điều kiện bao gói và bảo quản sản phẩm.
- Đánh giá, ứng dụng: tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về chất lượng, an toàn vệ
sinh thực phẩm và hoạt tính prebiotic. Ứng dụng POS vào sản xuất một số sản
phẩm thực phẩm chức năng.

9
Hình 1.3. Sơ đồsản xuất POS theo phương pháp thủy phân pectin bằng enzym
Pectin
Thuỷ phân giới hạn pectin
(Nồng độ pectin, enzyme, pH, to...)
thời gian)
Enzyme
Cô đặc, tách, tinh sạch
(lọc nano, kết tủa, sắc ký, ...)
Hoàn thiện sản phẩm
(sấy, bao gói, bảo quản)
Sản phẩm POS
(đánh giá, ứng dụng)

10
1.3.1. Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme thu POS trong hệ thống có
tích hợp màng lọc
Một số nghiên cứu về động học phản ứng của quá trình thủy phân pectin bởi endo
polygalacturonase cho thấy tốc độ phản ứng bị kìm hãm bởi sản phẩm thủy phân của
chúng [38, 41]. Để tránh hiện tượng này, một số nhóm nghiên cứu đã áp dụng hệ thống
bình phản ứng dạng màng [9, 21]. Với hệ thống này, các sản phẩm thủy phân có kích
thước nhỏ hơn lỗ màng có thể qua màng dễ dàng và được loại ra khỏi hệ thống, trong
khi các phần tử có khối lượng và kích thước lớn (cơ chất và enzyme) được giữ lại. Tuy
nhiên hệ thống thủy phân này là hệ thống lọc màng truyền thống (dead-end filtration)
nên có thể gặp trở ngại trong quá trình vận hành do hiện tượng tắc màng bởi thành
phần phức tạp và độ nhớt của dịch phản ứng.
Một trong những cách tiếp cận có thể đồng thời giải quyết được các vấn đề này là
sử dụng hệ thống bình phản ứng tích hợp với bộ phận lọc dòng ngang.
Hình 1.4. Sơ đồmô hình phản ứng thủy phân có tích hợp bộ phận lọc dòng ngang
Lọc dòng ngang (Cross flow filtration - CFF) là một kỹ thuật lọc trong đó
dung dịch ban đầu chuyển động tiếp tuyến dọc theo bề mặt màng lọc. Do có sự chênh
lệch áp suất qua màng nên các phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ màng sẽ đi qua, những
Màng 1 Màng 2

11
thành phần lớn hơn bị giữ lại, dịch chuyển dọc theo bề mặt màng và quay trở lại bình
chứa ban đầu.
Dung dịch chuyển động định hướng đến bề mặt màng gọi là dòng cấp (feed).
Dung dịch chuyển động dọc theo bề mặt màng và quay trở lại bình chứa ban đầu gọi là
dòng hồi lưu (retentate). Dòng hồi lưu thường được bơm trở lại bình chứa ban đầu và
được tuần hoàn. Dung dịch đi qua màng được gọi là dòng ra (permeate).
Kỹ thuật lọc dòng ngang khác với kỹ thuật lọc truyền thống ở chỗ:
- Màng lọc sử dụng cho CFF được thiết kế riêng trong khi lọc truyền thống sử dụng rất
nhiều loại màng khác nhau, giấy hoặc các vật liệu khác như bi thủy tinh để phân đoạn
các thành phần có dòng cấp.
- CFF là một hệ thống tuần hoàn khép kín của dòng hồi lưu. Đối với lọc truyền thống,
dòng cấp thường chỉ đi qua màng lọc một lần.
- Trong hệ thống CFF, dòng hồi lưu được giữ lại như một dung dịch và có thể được tái
sử dụng một cách trực tiếp [75].
Rất nhiều các công trình nghiên cứu đã thành công khi ứng dụng kỹ thuật màng
cho quá trình thủy phân pectin bằng enzyme [36, 38, 40]. Bình phản ứng có tích hợp hệ
thống lọc dòng ngang chủ yếu sử dụng màng siêu lọc (ultrafiltration) và màng lọc nano
(nanofiltration). Mô hình phản ứng này có nhiều ưu điểm: (1) enzyme có thể được giữ
lại cho quá trình thủy phân liên tục trong thời gian dài; (2) màng cho phép lọc tại chỗ
các sản phẩm có kích thước nhỏ hơn lỗ màng và (3) cho phép loại bỏ một cách liên tục
sản phẩm để hạn chế tối đa quá trình ức chế phản ứng bởi sản phẩm, từ đó giúp làm
tăng sản lượng và tỷ lệ chuyển hóa [60]. Bên cạnh đó, mô hình thủy phân dạng này còn
tiết kiệm năng lượng, dễ dàng theo dõi và điều chỉnh các thông số hoạt động như áp
suất, nhiệt độ, tốc độ dòng vào, tốc độ khuấy và dễ dàng nâng cấp lên các quy mô sản
xuất lớn hơn [54].

12
K. Be´lafi-Bakó (2007) đã thủy phân pectin bằng enzyme polygalacturonase
trong hệ thống bình phản ứng dạng màng siêu lọc cut off 30kDa. Hệ thống thủy phân
hoạt động ổn định trong hơn 50 giờ và giúp nâng hiệu suất chuyển hóa pectin lên
40.6% so với mô hình thủy phân mẻ truyền thống do các phân tử cơ chất có khối lượng
phân tử thấp như D-monogalacturonic được giải phóng ra từ quá trình phân cắt pectin
liên tục được loại bỏ khỏi hệ thống [38]. A. Lama-Munoz và cộng sự sử dụng nhiều
loại màng kích thước khác nhau: 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa và 1 kDa để thu nhận POS từ
LM – pectin oliu. Kết quả nghiên cứu cho thấy POS chủ yếu nằm ở phân đoạn 1 – 3
kDa và chiếm 23% đường tổng số [7]. Nhóm các nhà nghiên cứu José M. Rodriguez-
Nogales và cộng sự (2008) đã sử dụng mô hình bình phản ứng lọc màng với enzyme tự
do để thủy phân pectin táo bằng hỗn hợp enzyme thô polygalacturonase và pectin
lyase. Mô hình này vận hành tốt nhất dưới điều kiện tỷ lệ enzyme/cơ chất 23.3, nhiệt
độ 48˚C, tốc độ hồi lưu 36 l/h và áp suất qua màng 34.5 kPa với màng có khối lượng
phân tử giới hạn (NMWL) 10 000. Độ nhớt của dịch thủy phân giảm đến 88% chỉ sau
15 phút và tỷ lệ chuyển hóa đạt 68% sau 2.5 giờ tương đương với khoảng 1.6 mg
monogalacturonic/ mL [36]. Cũng với hệ thống thủy phân dạng màng K. Kiss (2009)
lắp đặt thêm một máy hút chân không sau màng 30 kDa nhằm làm tăng tốc độ phân
đoạn sản phẩm khỏi hệ thống phản ứng khi thử nghiệm thủy phân pectin từ nhiều
nguồn khác nhau để thu các sản phẩm POS. POS thu được nhiều hơn, 24.3; 21.5 và
19.4 g sản phẩm/h.g enzyme lần lượt với pectin bã nho đen, củ cải đường và pectin nho
đỏ so với 9.7g sản phẩm/h.g enzyme với pectin họ citrus [40].
Trong sản xuất và tinh sạch POS, phương pháp siêu lọc và lọc nano thường
được ứng dụng để thu nhận các oligo có mức độ trùng hợp DP < 30 (3.8 kDa). J. Holck
và cộng sự đã sử dụng màng cellulose 3 kDa cho mục đích này [35], trong khi K.
Iwasaki và Y. Matsubara tinh sạch POS (thủy phân từ pectin bột cam quýt) bằng màng

13
50 kDa để giữ lại các hợp chất có khối lượng phân tử lớn và sau đó lọc tiếp tục qua
màng 15 kDa [39].
1.3.2. Cô đặc, tách, tinh sạch POS
Các nhà khoa học mô tả rằng các monome monogalacturonic không có tác dụng
ngăn chặn sự bám dính của các tác nhân gây bệnh lên các tế bào, đặc biệt là các tế bào
biểu mô đường tiêu hóa và đường sinh dục, trong khi tỷ lệ ngăn chặn lên đến 91.7%
hoặc 84.6% tương ứng với digalacturonic và trimonogalacturonic, và hiệu quả ngăn
chặn mong muốn giảm cùng với trọng lượng phân tử ngày càng tăng của các
galacturonic [14]. Như vậy, việc loại bỏ các thành phần không mong muốn như đường
monosaccharide, muối đệm là cần thiết để cải thiện hoạt tính prebiotic của chế phẩm
POS. Hơn nữa, việc tinh sạch giúp mở rộng khả năng ứng dụng của POS tinh khiết
trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Vì vậy, tùy theo mục đích sử
dụng mà POS được thu hồi từ dịch thủy phân dưới các dạng chế phẩm khác nhau nhờ
một số phương pháp khác nhau.
Quy trình thu nhận của đề tài nhằm thu được chế phẩm POS tinh sạch cho ứng
dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng. Các phương pháp chính được sử dụng trong
quy trình thu nhận này bao gồm: phương pháp lọc nano, phương pháp kết tủa và
phương pháp sắc ký. POS sau khi tách và tinh sạch được tạo chế phẩm dạng bột bằng
phương pháp sấy phun để bảo quản lâu dài và thương mại hóa.
 Lọc nano
Các phương pháp lọc màng nói chung cho phép đồng thời thực hiện các quá
trình tinh sạch và cô đặc dung dịch. Trong đó lọc nano là một phương pháp có nhiều
tiềm năng trong tinh sạch và cô đặc POS ở quy mô công nghiệp. Màng kích thước nano
có giới hạn khối lượng phân tử (MWCO) trong khoảng 200 – 1000 Da. Đường kính lỗ
của hầu hết các màng kích thước nano trong khoảng 0.6 – 2.0 nm, trung bình 0.8 – 0.9

14
nm. Đường kính của monosaccharides là 0.6 – 0.8 nm. Bên cạnh đó, màng nano có thể
tách riêng ion đơn (monovalent ions) ra khỏi hỗn hợp chất đa ion (multivalent ions). Vì
vậy, màng kích thước nano có thể phân riêng monogalacturonic ra khỏi digalacturonic
và oligogalacturonic.
Có nhiều báo cáo về việc sử dụng phương pháp lọc nano trong tinh sạch các
oligosaccharide. Pruksasri và cộng sự sử dụng một màng NF (NP030) để tinh sạch
GOS cho độ tinh khiết của sản phẩm đạt 85% (dựa trên hàm lượng monosaccharide) và
hiệu suất thu hồi oligosaccharide đạt 82% [67].
Feng và cộng sự đánh giá ảnh hưởng của áp suất vận hành (0.2-0.8 MPa) và
nồng độ thấp (5-60 g/l) trong tách GOS sử dụng màng lọc nano cellulose acetate. Một
màng NF-3 với giới hạn trọng lượng phân tử 0.8-1 kDa đã được chọn để phân tách một
chế phẩm GOS thương mại có hàm lượng oligosaccharide thấp bằng phương pháp lọc
pha loãng (diafiltration) ở 50˚C và áp suất 6 bar. Theo đó, 90.5% monosaccharide và
52.5% lactose trong hỗn hợp đã được loại bỏ, năng suất thu hồi oligosaccharides đạt
70.0% [24].
Bốn loại màng NP010, NP030 (Microdyn Nadir, Germany), Desal-5 DL và
Desal-5 HL đã được Kuhn sử dụng trong thí nghiệm để lựa chọn loại màng thích hợp
trong tinh sạch fructooligosaccharide (FOS) từ hỗn hợp với glucose, fructose và
sucrose [42]. Kết quả cho thấy màng NP030 cho khả năng giữ các loại đường khác
nhau khác biệt nhất: FOS (0.66), glucose (0.18), fructose (0.15), và sucrose (0.24). Các
kết quả đã chứng minh tiềm năng của phương pháp lọc pha loãng (diafiltration) sử
dụng màng NP030 trong việc tinh sạch FOS từ hỗn hợp chứa mono và disaccharide.
Phương pháp lọc nano cũng đã được nghiên cứu trên quy mô pilot được thực
hiện bởi Zhang và cộng sự để nghiên cứu khả năng giữ disaccharide (lactulose và
lactose) và chất xúc tác (NaCl và H3BO3) trong chế phẩm xi-rô lactulose. Kết quả thu
được cho thấy khả năng được giữ lại trên màng khác biệt lớn và giảm dần theo thứ tự:

15
disaccharide (94.7–98.5%) > NaCl (9.0–20.0%) > H3BO3 (−19.9–0.0%). Ngoài ra, một
mô hình đã được sử dụng để mô phỏng độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi disaccharide
trong quá trình diafiltration liên tục. Theo mô phỏng, 25 bar đã được chọn làm áp suất
vận hành tối ưu cho quá trình diafiltration liên tục. Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng
hơn 96.5% NaCl và H3BO3 đã được loại bỏ khỏi xi-rô lactulose với chỉ một tỉ lệ thất
thoát disaccharide nhỏ (11.0%) và hệ số pha loãng là 5.0 cho màng sử dụng [74].
K. Manderson và cộng sự tiến hành lọc dịch POS (sản xuất từ pectin vỏ cam bởi
acid HNO3) bằng màng lọc nano DS-5-DL để làm giảm khoảng 5 lần hàm lượng muối
và loại monosaccharide. Sau đó POS sau lọc được sử dụng để nghiên cứu hoạt tính
prebiotic trên các vi khuẩn đường ruột [53].
Lọc nano có nhiều lợi thế hơn so với các kỹ thuật sắc ký khác như tiết kiệm
năng lượng, chi phí vận hành và bảo dưỡng thấp, đơn giản trong hoạt động và mở rộng
quy mô.
Đối với quá trình cô đặc bằng lọc nano, các yếu tố ảnh hưởng chính đến hiệu
suất thu hồi bao gồm áp suất, nhiệt độ và nồng độ dịch ban đầu. Goulas và cộng sự đã
nghiên cứu ảnh hưởng của 3 yếu tố này trong một thí nghiệm tinh sạch chế phẩm
oligosaccharide. Kết quả cho thấy khả năng loại fructose tăng từ 0.1 đến 0.42 khi tăng
áp suất lọc bằng cách tăng vận tốc dòng dung môi, tuy nhiên khả năng tách loại
glucose giảm từ 0.58 xuống 0.43 nếu nồng độ các chất này trong dung dịch cao hoặc
khi tăng nhiệt độ lọc thì khả năng loại fructose giảm từ 0.72 xuống 0.48. Việc lựa chọn
nhiệt độ lọc cũng phải dựa vào thông số kỹ thuật của từng loại màng [29].
 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Việc bổ sung các dung môi hữu cơ vào các dung dịch làm giảm khả năng hòa tan
của một số thành phần trong dung dịch do làm giảm hằng số điện môi của môi trường.
Các dung môi hữu cơ thường dùng bao gồm ethanol, acetone và iso propanol. Trong số
đó, ethanol là dung môi thông dụng nhất và thường được sử dụng để kết tủa POS.

16
C. Onumpai và cộng sự đã sử dụng ethanol với nồng độ cuối 64% kết tủa POS ở
4oC trong 18 giờ để nghiên cứu khả năng sử dụng POS của vi khuẩn đường ruột [13].
Dịch POS thu từ bã ép quả oliu được A. Lama-munoz và cộng sự kết tủa phân
đoạn bằng ethanol 20%, 40%, 60%, 80% và 90% [7]. Kết quả cho thấy kết tủa bằng
ethanol trên 80% thu được POS có kích thước 0.3 - 1 kDa.
Dịch sau thủy phân bằng phương pháp thủy phân tích hợp màng lọc đã loại bỏ
phần lớn cơ chất dư và enzyme, tuy nhiên vẫn còn chứa các thành phần không mong
muốn như monosaccharide và muối đệm trinatri citrate. Do đặc tính của muối trinatri
citrate không tan trong ethanol nên phương pháp kết tủa bằng ethanol cũng được kì
vọng để loại bỏ muối.
Swennen và cộng sự sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn ethanol để nghiên
cứu tách arabinoxylooligosaccharides (AXOS) từ dịch thủy phân arabinoxylan (AX).
Các phân đoạn kết tủa bao gồm: F0-60% , F60-90% và F>90% (trên 90%) được để qua đêm ở
4˚C, thu hồi kết tủa bằng cách ly tâm 10 000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, sau đó hòa
tan kết tủa trong nước khử ion và đông khô. Các mẫu được được phân tích bằng GC,
HPSEC và HPAEC- PAD. Kết quả phân tích cho thấy phân đoạn F0-60% chứa thành
phần AX với DP trung bình là 53. Phân đoạn F60-90% chứa AXOS phân tử trung bình
với DP trung bình là 23. Phân đoạn F>90% chứa AXOS phân tử trung bình với DP trung
bình là 5 và khối lượng phân tử trong khoảng 300-2000 Da, phân tích HPAEC cho thấy
phân đoạn này chứa arabinose, xylose, xylobiose và xylooligosaccharides (XOS) với
DP 3-6 [68].
Sen và cộng sự đã sử dụng nồng độ ethanol cao (>70% v/v) để kết tủa chọn lọc
galacto oligosaccharide (GOS) từ hỗn hợp GOS, lactose, glucose và galactose [20].
Hàm lượng GOS đã được tăng lên 2.3 lần trong kết tủa ở nồng độ ethanol 90% v/v,
trong khi hàm lượng GOS tăng 2.4 lần với phương pháp hấp thụ bởi than hoạt tính, 1.3
lần khi lên men chọn lọc monosaccharide bởi nấm men hay 1 lần với sắc ký loại trừ

17
theo kích thước, tuy nhiên kết tủa là phương pháp đơn giản và thuận tiện hơn cả.
Phương pháp kết tủa có thể sử dụng thay thế hoặc kết hợp với các phương pháp này.
Hơn nữa, thực hiện 2 lần kết tủa liên tiếp ở nồng độ ethanol 90%, hàm lượng
monosaccharide giảm từ 48% (w/w) tổng lượng đường xuống còn 4% (w/w), như vậy
khả năng loại monosaccharide của phương pháp này là rất cao.
Trong thí nghiệm kết tủa của mình, Sen và cộng sự cũng đã nghiên cứu những
ảnh hưởng của nồng độ ethanol sử dụng để kết tủa, nồng độ saccharide trong dung dịch
ban đầu và nhiệt độ kết tủa [20]. Theo đó, tại nồng độ 70% ethanol, kết tủa tạo ra là
chưa rõ ràng, kết tủa tạo ra thấy rõ bằng mắt ở nồng độ 85% tại tất cả các mức nhiệt độ
(10; 25 và 40˚C) và hàm lượng saccharide khảo sát (60 và 81 g/l) và tại 90% ethanol
thì kết tủa tạo ra tại tất cả các phương án thí nghiệm. Báo cáo cũng chỉ ra rằng việc
tăng nồng độ saccharide tổng trong dung dịch ban đầu làm giảm khả năng hòa tan của
từng loại saccharide riêng biệt, do đó lượng saccharide kết tủa được nhiều hơn. Nhiệt
độ được biết là ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các loại saccharide, nhiệt độ càng
thấp thì khả năng hòa tan càng giảm dẫn đến hiệu suất kết tủa càng cao. Tuy nhiên ở
nồng độ ethanol cao, ảnh hưởng của sự biến đổi về nhiệt độ đến quá trình tinh sạch
POS là không đáng kể.
Như vậy, phương pháp kết tủa có thể được sử dụng như là một bước để làm giàu
và cô đặc POS trước khi sắc ký. Ngược lại, lọc nano có thể được sử dụng để cô đặc các
dung dịch đường trước một bước kết tủa cuối cùng. Và vì vậy, phương pháp này có
tiềm năng lớn để áp dụng trong công nghiệp vì sự đơn giản trong vận hành và hiệu quả
tinh sạch cao.
1.3.3. Sấy tạo sản phẩm
Công nghệ sấy phun ngày nay phát triển mạnh mẽ, đã và đang được áp dụng rộng
rãi trên thế giới từ lĩnh vực y tế, sinh học cho đến sản xuất thực phẩm. Sấy phun là một

18
phương pháp tiên tiến, tạo nên những sản phẩm dạng bột có chất lượng cao, tốc độ sấy
nhanh, thích hợp để tạo sản phẩm bột từ các nguyên liệu nhạy cảm với nhiệt độ, cần
giảm thiểu thời gian sấy [10]. Mặc dù sấy ở nhiệt độ cao nhưng do sự tách nước diễn ra
nhanh trong một thời gian ngắn nên vẫn giữ nguyên được tính chất của sản phẩm. Điều
này làm cho sấy phun phù hợp để sấy nhiều sản phẩm có yêu cầu về đặc tính cao như
enzyme, protein, sữa…Trong công nghiệp thực phẩm việc ứng dụng sấy phun để sấy
các loại đường chức năng đã được áp dụng rộng rãi, trong công nghệ sinh học sử dụng
để sấy các chế phẩm vi sinh, men vi sinh, protein…
Năm 2006, Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
sấy phun trong sản xuất bột chanh dây với hàm lượng khô dịch quả trước sấy là 8%,
nhiệt độ không khí đầu vào là 165oC, áp lực khí nén là 4.25 bar và tốc độ bơm nhập
liệu là 22.5 mL/phút, lượng matodextrin bổ sung là 15% so với lượng dịch quả trước
sấy. Hiệu suất thu hồi sản phẩm của quá trình sấy phun đạt 75-78%, độ ẩm sản phẩm
thấp hơn 5% [5].
Sấy phun cũng đã được áp dụng trong sản xuất POS. Trong sáng chế của Canada
số CA 2 428 473, Kunz và cộng sự đã thủy phân dịch pectin tạo POS có DP 2 - 10
chiếm 93%, DP>10 chiếm 4% sau đó sấy phun tạo chế phẩm có hàm ẩm 4.4% [14].
Đối với quá trình sấy phun cần lưu ý các thông số như sau [18]:
+ Nồng độ chất khô của dịch trước sấy phun: Nồng độ chất khô của dịch trước
sấy phun có ý nghĩa quan trọng trong vấn đề tiết kiệm chi phí và chất lượng sản phẩm.
Tăng nồng độ chất khô có nghĩa là tăng độ nhớt của dịch vào, từ đó làm tăng kích
thước của hạt sản phẩm. Nếu một sản phẩm được sấy với nồng độ dịch vào thấp, kích
thước hạt sẽ mịn và tính hoàn nguyên kém, việc thu hồi bột từ cyclon và thiết bị lọc
cũng thấp dẫn đến làm tăng giá thành của quá trình sấy phun. Nồng độ dịch vào quá
cao lại sản sinh ra các giọt và sợi lớn dẫn đến cần thời gian sấy dài và tính chất bột có

19
nhiều tác dụng bất lợi. Thông thường nồng độ chất khô của dịch vào ở khoảng 20-50%
tùy thuộc vào tính chất của dịch và loại vòi phun sử dụng.
+ Nhiệt độ không khí sấy: Nhiệt độ không khí sấy liên quan trực tiếp đến độ
nhạy của sản phẩm với nhiệt và cấu tạo máy sấy. Khi nhiệt độ không khí sấy thấp, độ
ẩm của các hạt vật liệu sấy sẽ còn khá cao nên bám nhiều lên thành buồng sấy, làm
giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm sau sấy. Khi nhiệt độ cao, các hạt vật liệu đạt độ ẩm
khá tốt nhưng dễ làm cháy vật liệu, gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Quá trình
sấy thực phẩm thường sử dụng khoảng nhiệt độ từ 120-300˚C.
+ Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu: Tốc độ bơm nhập liệu ảnh hưởng lớn
đến lưu lượng dòng nhập liệu, năng suất thiết bị và nhiệt độ không khí đầu ra. Tốc độ
bơm tăng khiến thời gian lưu của vật liệu sấy trong buồng sấy giảm, hạt không đạt
được độ ẩm mong muốn, phần hạt ẩm bám lại trên buồng sấy dẫn đến hiệu suất thu hồi
giảm.
Như vậy, quá trình thu hồi POS phụ thuộc vào rất nhiều thông số khác nhau
như áp suất lọc, nhiệt độ lọc, nồng độ dịch lọc ban đầu, nồng độ ethanol kết tủa, nhiệt
độ kết tủa, nồng độ dịch đem kết tủa, nồng độ chất khô dịch trước sấy phun, nhiệt độ
không khí sấy, tốc độ bơm nhập liệu, ... Do vậy cần dựa vào các đặc tính hóa lý của
POS cùng với các mục tiêu về kinh tế - kỹ thuật để khảo sát và lựa chọn tối ưu các
thông số sao cho hiệu suất và chất lượng của quá trình thu hồi đạt tốt nhất.
1.3.4. Bao gói và điều kiện bảo quản sản phẩm
Bao bì phải có tác dụng phòng ngừa sự biến đổi các thành phần hóa học và
các tính chất cơ lý của sản phẩm trong thời gian nhất định, bảo tồn được tính chất cảm
quan nguyên vẹn từ ban đầu cho đến khi sản phẩm được sử dụng. Bao bì phải đảm bảo
cho sản phẩm không bị lây nhiễm những chất khác hoặc vi sinh vật từ môi trường hoặc

20
từ chính bao bì, đặc biệt là những chất gây độc hại hoặc những chất làm giảm giá trị
cảm quan của sản phẩm.
Bao bì có rất nhiều chức năng như chức năng bảo vệ, chức năng thông tin, chức
năng marketing, chức năng môi trường, chức năng văn hóa,... Tuy nhiên trong khuôn
khổ đề tài chỉ nghiên cứu chọn lựa loại bao bì thích hợp để bảo vệ sản phẩm khỏi
những tác động làm thay đổi tính chất hóa lý và cảm quan của sản phẩm.
Về nguyên tắc, vật liệu làm bao bì phải phù hợp với từng loại sản phẩm, càng dễ
gia công càng tốt. Giá trị của bao bì phải tương ứng với giá trị của sản phẩm cần chứa
đựng, không làm tăng giá thành của sản phẩm một cách quá mức. Vật liệu làm bao bì
phải không làm thay đổi các tính chất hóa lý và đặc biệt là tính chất cảm quan của sản
phẩm, không gây nhiễm độc cho thực phẩm.
Yêu cầu chính đối với việc lựa chọn loại bao bì cho sản phẩm dạng bột phải
đảm bảo mục đích chính là ngăn ngừa ô nhiễm từ các nguồn bên ngoài, chống thấm
nước, thấm khí, môi trường bao bì phải làm chậm hoặc ngăn chặn sự tăng trưởng của
các vi sinh vật không mong muốn bằng cách sử dụng phương pháp hút chân không
hoặc sử dụng khí trơ, và nhất là đối với việc ứng dụng POS trong ngành dược phẩm thì
bao bì đựng POS và dược phẩm nói chung phải đảm bảo được tính tiện lợi, nhanh
chóng và hiệu quả cho người sử dụng lẫn chi phí cho nhà sản xuất. Vì vậy hiện nay các
nhà sản xuất đang đi theo xu hướng sử dụng các loại bao bì bằng chất dẻo, nhất là các
loại bao bì nhiều lớp.
Với sản phẩm POS dạng bột sẽ được nghiên cứu bảo quản ở điều kiện thường
trong 6-12 tháng tương tự các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm dạng bột khác hiện
nay.
1.4. Đánh giá pectic oligosaccharide (POS)
1.4.1. Phân tích định tính

21
Trong nghiên cứu về các sản phẩm POS, sắc ký lớp mỏng được sử dụng trong
việc kiểm tra thành phần POS trong dịch thủy phân và sau khi thu hồi, tinh sạch POS
[22, 46, 61, 65, 66].
Li S. và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để khẳng định sự có
mặt của monomonogalacturonic, các pectic oligosaccharide và hiệu quả của phản ứng
thủy phân pectin từ quả sơn tra bằng endopolygalacturonase được tách từ A. niger. Các
tác giả đã sử dụng hệ dung môi n-butanol: acetic acid: nước với tỷ lệ 4: 6: 3 (v/v/v),
hiện màu ở 100˚C bằng dung dịch acid sulfuric có 99.5% ethanol với tỷ lệ 1:1 [46].
Trong khi đó, Nikolic M.V. và Mojovic L. sử dụng hệ dung môi ethyl acetate:
acetic acid: nước tỷ lệ 4:2:3 (v/v/v), hiện màu bằng dung dịch amonium 10% trong
bromophenol blue khi nghiên cứu quá trình thủy phân pectin táo bằng
polygalacturonase từ A. niger [61].
Esquivel J.C.C. và cộng sự cũng dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ
dung môi n-butanol: axit acetic: nước là 9: 4: 7 để phân tích thành phần dịch thủy phân
polygalacturonic bởi enzyme tổng hợp từ A. kawachii [22].
1.4.2. Phân tích định lượng
Hiện nay, có một số phương pháp khác nhau để định lượng POS, chủ yếu gồm
phương pháp HPLC và theo kit thử D – monogalacturonic.
 Phương pháp HPLC
Dịch POS sau khi thủy phân pectin là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần với
DP 2 - 10 nên để định lượng POS cần thiết phải tách riêng sau đó định lượng từng
thành phần riêng rẽ. Các phương pháp phân tách thường được sử dụng gồm phương
pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion.

22
Bằng cột chứa gel Superdex Peptide HR 10/30 (30x1cm) của Pharmacia
Biotech, Thụy Điển, từ dịch thủy phân pectin bã oliu Lama-Munoz A. và cộng sự phân
tách monosaccharide ra khỏi POS và thu được POS với nồng độ 10 mg/ml [45].
Laere V. và cộng sự đã sử dụng Bio-Gel P2 cho việc tách POS với DP 5 – 9
[44]. Trong khi Yu L. và cộng sự đã phân tách được 5 phân đoạn POS khi cho dịch
thủy phân lần lượt qua ba cột Sephadex G-25, Sephadex G-75 và Sepharose CL-6B
[73].
Olano-Martin E. và cộng sự đã sử dụng cột TSK G6000 PWXL nối tiếp với cột
TSK G4000 PWXL để phân tách và xác định được khối lượng phân tử của POS sản xuất
từ HM pectin và LM pectin [21]. Hệ thống sắc ký lọc gel TSK-Gel (cột G3000 PW nối
với cột thứ hai G4000PW nối với cột thứ ba G6000 PW) của Tosoh cũng được
Mandalari G. và cộng sự sử dụng để phân tách thành phần mono và oligosaccharide có
trong dịch thủy phân pectin từ vỏ cam [52].
Phương pháp sắc ký trao đổi ion HPAEC có thể định lượng
monomonogalacturonic và các oligosaccharide có trong sản phẩm phản ứng thủy phân
pectin. Trong nghiên cứu của nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp này để phân tách
và định lượng các thành phần POS có trong dịch thủy phân từ pectin bằng enzyme [16,
28].
Combo A.M.M. và cộng sự sử dụng hệ thống HPAEC-PAD (Dionex ICS-3000
model, USA) đã phân tách được các oligosaccharide DP 1 – 9 ra khỏi nhau [16].
Manderson K. và cộng sự sử dụng HPAEC-PAD để phân tách POS tạo ra từ
pectin vỏ cam. Khi so sánh với sản phẩm thủy phân polymonogalacturonic nhận thấy
có sự tương ứng với các oligosaccharide chuẩn [53]. POS tạo ra từ pectin cam cũng
được Ramachandran C. và cộng sự sử dụng hệ thống sắc ký này để phân tích thành
phần trước khi nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch [64].

23
Hiện nay có nhiều loại detector sử dụng trong định lượng các loại prebiotic như:
detector khúc xạ - RID, UV/VIS, PAD (pulsed amperometric detection) ... tuy nhiên
các tài liệu công bố cho thấy POS chỉ được phát hiện và định lượng bởi detector PAD.
 Theo kit thử D – monogalacturonic
Khi xử lý với acid H2SO4, POS sẽ bị thủy phân hoàn toàn thành dạng mono là
monogalacturonic. D-monogalacturonic giải phóng ra được xác định bằng kit đo D-
galacturonic (Megazyme, Ireland). Dựa vào phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng để
định lượng monogalacturonic có trong mẫu trước và sau khi xử lý với H2SO4.
Nguyên tắc của kit: D - Monogalacturonic bị oxy hóa bởi enzyme uronate
dehydrogenase với sự có mặt của nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) để
chuyển thành D - Galactarate và tạo thành nicotinamide adenine dinucleotide dạng khử
(NADH).
(2) 𝐷 − 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑢𝑟𝑜𝑛𝑖𝑐 𝑎𝑐𝑖𝑑 + 𝑁𝐴𝐷+
+ 𝐻2 𝑂 → 𝐷 − 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑟𝑎𝑡𝑒 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻+
Lượng NADH hình thành trong phản ứng này tương đương với lượng D -
Monogalacturonic có trong mẫu thử. NADH được xác định bằng cách đo độ hấp thụ
ánh sáng ở bước sóng 340 nm.
1.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học
 Khả năng được lên men chọn lọc (với chủng thuần khiết)
Một hợp chất prebiotic phải được lên men chọn lọc bởi các vi sinh vật có lợi
trong hệ tiêu hóa. Tiêu chuẩn này được đánh giá trong phòng thí nghiệm bằng cách
nuôi cấy các chủng thuần khiết của một số loài vi khuẩn có lợi điển hình (thường là
Lactobacillus và Bifidobacterium) và vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh (như E. coli,
Enterococcus) trong môi trường có chứa hợp chất kiểm tra như nguồn carbon duy nhất
và xác định sự tăng sinh của vi khuẩn so với môi trường có chứa nguồn carbon là

24
glucose. Có khá nhiều nghiên cứu đã tiến hành đánh giá, sàng lọc các hợp chất
prebiotic tiềm năng theo cách này [43].
Theo M.J. Hopkins và cộng sự, trên môi trường chứa Galactooligosaccharides
(GOS) các chủng Bifidobacterium phát triển với tốc độ mạnh hơn đáng kể so với các
gluxit khác. Ở nồng độ 1% (w/v), sau 24 giờ GOS thúc đẩy sự tăng sinh của hàng loạt
các chủng Bifidobacteria và Lactobacilli [49]. GOS cũng hỗ trợ cho quá trình phát
triển của một số Enterobacteriaceae và Streptococci.
 Khả năng không bị tiêu hóa
Một hợp chất prebiotic phải có khả năng không bị tiêu hóa ở phần trên của hệ
tiêu hóa mà còn nguyên vẹn để đi đến ruột già. Tiêu chuẩn này có thể đánh giá trong
điều kiện in vitro bằng cách kiểm tra độ bền của hợp chất khảo sát trong môi trường
pH acid và môi trường có mặt enzyme tiêu hóa của động vật (nước bọt, tụy tạng, ruột
non).
Các mô hình in vivo cũng được sử dụng để đánh giá khả năng không bị tiêu hóa
bằng xác định lượng prebiotic còn lại trong phân chuột bị nhiễm chủ động mầm bệnh
và chuột đã được tiền xử lý với kháng sinh để tiêu diệt bớt một phần vi sinh vật đường
ruột.
Để kiểm tra khả năng được lên men chọn lọc và cân bằng hệ vi sinh đường ruột,
Y. Wang và cộng sự đã chứng minh rằng khi chuột ăn thức ăn có bổ sung 2.5%
alginate oligosaccharide, số lượng Bifidobacteria và Lactobacilli trong phân tăng [72].
Kết quả oligosaccharide này cho hiệu quả prebiotic cao hơn so với FOS, một
oligosaccharide đã được chứng minh là prebiotic.

25
1.5. Ứng dụng POS sản xuất nước bí đao chức năng
1.5.1. Tiềm năng ứng dụng của POS
Từ những đặc tính sinh học thiết thực, prebiotic nói chung và POS nói riêng có
tiềm năng làm thực phẩm bổ sung trong công nghệ chế biến các sản phẩm thực phẩm.
POS là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên mang tính acid
tương tự như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác
nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn
các loại oligosaccharide trung tính, ví dụ dimonogalacturonic ngăn ngừa sự bám dính
của các tế bào vi khuẩn E. coli trong điều kiện in vitro [32]. Đây sẽ là một lợi thế cho
dòng sản phẩm này để tăng cường hiệu quả cho các loại sữa bột trẻ em khi chúng được
bổ sung cùng với các prebiotic trung tính thông dụng khác như FOS, GOS, MOS...
Người ta thử nghiệm bổ sung 15-25% POS vào sữa của trẻ sơ sinh cho thấy
POS giúp trẻ tiêu hóa tốt hơn, hệ vi sinh đường ruột thay đổi và hạ thấp pH phân [23,
51]. Năm 2010, Westerbeek đã thử nghiệm bổ sung hỗn hợp 80% GOS/FOS và 20%
POS với hàm lượng 1.5 g/kg/ngày cho 113 trẻ sơ sinh. Kết quả cho thấy những trẻ này
có khả năng hấp thụ và tiêu hóa tốt hơn, giảm mắc các bệnh do nhiễm khuẩn đường
tiêu hóa hơn nhóm đối chứng [71]. Như vậy, bổ sung prebiotic vào sữa công thức cho
trẻ sơ sinh cũng là một hướng phát triển mạnh. Phân tích cho thấy rằng thị trường sữa
công thức cho trẻ sơ sinh được dự kiến sẽ tăng trưởng với tốc độ 11.3% từ năm 2012
đến 2018.
POS mang điện tích âm do đó có thể kết hợp với các oligosaccharide điện tích
dương khác như chitosan oligosaccharide để tạo ra sự tương tác tĩnh điện ứng dụng
trong sản xuất bản film y tế, túi phân hủy sinh học hoặc trong điều trị vết thương,… [8]
POS có độ nhớt thấp nên thuận lợi trong việc bổ sung vào thực phẩm, ví dụ như
kết cấu của sữa chua có thể được cải thiện. Do độ nhớt thấp nên POS cũng có thể được
sử dụng như là chất giữ ẩm.

26
Ngoài ra, POS ít ngọt hơn đường saccharose và hàm lượng calo thấp nên thường
được sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cần độ ngọt thấp và ít béo, hay
thịt và các sản phẩm ăn nhẹ... [8, 76]. Thêm nữa, các ứng dụng mới nhất của prebiotics
trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi cũng trở thành một thị trường sinh lợi cao. Nhu cầu
prebiotic cho các ứng dụng thức ăn chăn nuôi dự kiến sẽ vượt qua 70 000 tấn vào năm
2018.
Ở Việt Nam trong những năm gần đây, prebiotic được ứng dụng trong sản xuất
một số sản phẩm thực phẩm như Fructooligosaccharide (FOS) và arabinoxylan được
ứng dụng trong sản xuất một số thực phẩm chức năng như rau má FOS, sữa bột, kẹo,
bánh bích quy bổ sung FOS, bột đậu nành bổ sung Arabinoxylan [1, 6],
Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi tôm [2, 3]. Tuy
nhiên với nhu cầu trong nước ngày một gia tăng, sản lượng và chủng loại prebiotic
không đủ cung cấp cho thị trường [4]. Do đó, việc nghiên cứu các sản phẩm mới không
chỉ để cung cấp dinh dưỡng thiết yếu mà còn có thể đồng thời phòng chống bệnh tật
được khuyến khích và tăng cường.
1.5.2. Ứng dụng sản xuất nước bí đao bổ sung POS
Hiện nay các prebiotic nói chung được các nhà khoa học khuyến cáo sử dụng
với hàm lượng 3 – 13 g/người/ngày với người trưởng thành. Ở Châu Âu, GOS được sử
dụng với hàm lượng 12 g/người/ngày, FOS là 7 g/người/ngày, IMO là 8 g/người/ngày,
XOS là 5 g/người/ngày. Inulin được sử dụng ở Châu Âu với hàm lượng 3 - 11
g/người/ngày nhưng ở Mỹ là 1 – 4 g/người/ngày [77, 78].
Với chế phẩm POS vẫn đang trong giai đoạn thử nghiệm chưa thấy có sản
phẩm lưu hành trên thị trường cũng như chưa có các công bố chính thức về liều lượng
sử dụng. Nhóm nghiên cứu của đề tài cũng đã bước đầu ứng dụng chế phẩm POS trong
sản xuất bánh bích quy chức năng. Bổ sung 2% POS, bên cạnh việc làm tăng sinh vi
khuẩn có lợi, giảm số lượng vi khuẩn gây hại, bánh vẫn giữ được các tính chất cảm

27
quan đặc trưng về mùi vị, cấu trúc, việc bổ sung POS vào bánh cũng không cần thay
đổi quy trình và trang thiết bị sản xuất. Dựa trên kết quả này, POS tiếp tục được nghiên
cứu ứng dụng trong sản xuất nước bí đao chức năng nhằm làm đa dạng hóa các sản
phẩm thực phẩm chức năng để phù hợp cho mọi đối tượng và mọi lứa tuổi.
Sản phẩm nước bí đao bổ sung POS được đánh giá cảm quan và đánh giá các
chỉ tiêu về thành phần và hoạt tính prebiotic. Xây dựng quy trình hoàn chỉnh để sản
xuất sản phẩm nước bí đao bổ sung POS tại nhà máy, kiểm tra và đánh giá chất lượng,
an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm nước bí đao sản xuất theo quy trình tại nhà
máy.

28
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
- Pectin tách chiết từ vỏ chanh dây bằng phương pháp axit có mức độ este hoá (DE):
30%, hàm lượng pectin: 95%
- Maltodextrin (Trung Quốc)
- Các nguyên liệu sản xuất trà bí đao: Nước, đường hòa tan, nước cốt bí đao cô đặc
(25 g/L), hương bí đao, màu caramen nhóm IV (150d), chất điều chỉnh độ acid, natri
hydro carbonat (500ii).
- Chủng vi khuẩn đánh giá hoạt tính sinh học của POS: Lactobacillus rhamnosus
GG (L1), L. amylovorus DSM16698 (L2), L. acidophilus NCFM (L3), L. reuteri DSM
17938 (L4), L. casei Shirota (L5), L. bulgaricus CH-3 (L6), L. fermentum PCC (L7), L.
plantarum 299V (L8), L. johnsonii La1 (L9), Bifidobacterium lactis Bb12 (Bif),
Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi ATCC
19430 (S. typhi ATCC) và Staphylococcus aureus ATCC 25923 được lưu giữ tại bộ
sưu tập giống của Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học Phân tử, Đại học Bách Khoa
Hà Nội.
2.1.2. Môi trường và các dung dịch sử dụng
- Môi trường nuôi cấy Lactobacillus (MRS - Man Rogosa Sharpe) (g/l): Pepton
(10), cao nấm men (5), cao thịt (5), glucose (20), amonicitrat (2), CH3COONa (5),
K2HPO4 (2), MgSO4.7H2O (0.1), MnSO4.4H2O (0.05), Agar (15), pH 6.5.
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí tổng số (TGA - Trypton Glucose
Agar) (g/l): trypton (5), glucose (4), cao nấm men (2.5), agar (15), pH 7.0.

29
- Môi trường nuôi cấy nấm men, nấm mốc (YGC - Chloramphenicol glucose
yeast extract agar) (g/l): cao nấm men (5), glucose (20), agar (18), Chloramphenicol
(0.1), pH 6.6.
- Môi trường nuôi cấy E. coli (VRBL - Violet Red Bile Lactose Agar) (g/l):
Peptone (7), cao nấm men (3), muối Bile (1.5), natri chloride (5), đỏ trung tính (0.03),
tím tinh thể (0.002), Lactose (10), Agar (12), pH 7.4.
- Môi trường nuôi cấy Samonella (BSA - Bismuth Sulphite Agar) (g/l):
bismuth sulfite Bi2(SO3)3 (16), pancreatic casein (10), pancreatic mô động vật (10),
cao thịt bò (10), glucose (10), natri phosphat (8), sulfate sắt (0,6), pH 7.7.
- Môi trường nuôi cấy S. aureus (TSA - Trypton casein Soy Agar) (g/l):
Tryptone (15), peptone đậu tương (5), natri chloride (5), agar (15), pH 7.3.
- Dung dịch đệm citrate pH = 4 (0.1M)
+ C6H8O7.H2O: 13.86 g/l
+ C6H5O7.Na3.2H2O: 10.2 g/l
+ Nước cất
- Dung dịch chạy sắc ký TLC:
+ Dung môi: butanol: acid acetic: nước tỷ lệ 9 : 4 : 7 (v/v/v)
+ Dung dịch hiện màu: H2SO4 10% trong ethanol tuyệt đối
2.1.3. Hoá chất chính
- Cơ chất và các đường chuẩn: Polymonogalacturonic, Mono monogalacturonic,
Dimonogalacturonic, Trimonogalacturonic (Sigma, Mỹ);
- Enzyme thủy phân pectin thu nhận POS: Pectinex Ultra SP-L (Novozymes);
- Bản mỏng silica TLC, Butanol, Acetic acid (Merck, Đức);

30
- Acid perchloric;
- Kit D - galacturonic (Megazyme, Ireland);
- Gel Toyopearl GigaCap Q-650M (Tosoh, Nhật Bản)
- Ethanol thực phẩm 96˚
2.1.4. Thiết bị
- Bể ổn nhiệt (Pharmacia Biotech, Thụy Điển)
- Máy vortex (Bio Cote, Đức)
- Máy khuấy từ (RotoLab, Thụy Sĩ)
- Máy ly tâm Micro Centrifuge II (Daihan Labtech, Đức)
- Máy ly tâm lạnh siêu tốc Sorvall Evolution RC (Thermo, Mỹ)
- Máy ly tâm nhỏ Minispin plus (Eppendorf AG, Đức)
- Cột trao đổi ion Q-sepharose fast flow HitrapTM (GE Healthcare, Anh)
- Máy so màu quang phổ UV-VIS Ultrospec (Pharmacia Biotech, Thụy Điển)
- Bản mỏng sắc ký 20x20 (Merk, Đức)
- Máy đo pH, cân điện tử (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)
- Hệ thống lọc dòng ngang (QuyxStand Benchop- GE Healthcare).
- Thiết bị phân tích độ ẩm (Sartorius, Đức)
- Hệ thống lọc màng OSMOS (Germany)
- Thùng chứa thể tích 150 lít
- Máy đo độ Brix
- Máy sấy phun li tâm tốc độ cao LPG5 (Trung Quốc)

31
- Nồi hấp tiệt trùng (Hirayama, Nhật)
- Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật)
- Tủ ấm (Memment, Đức)
- Tủ lạnh, tủ đông (Sanyo, Nhật)
2.1.5. Màng lọc
Trong phạm vi đề tài sử dụng các màng lọc với các thông số kỹ thuật như sau:
Bảng 2.1. Thông số kỹ thuật của màng 50 kDa (GE Healthcare, Mỹ)
Thông số kỹ thuật Giá trị
Diện tích lọc 110 cm2
pH 2 ÷ 13
Nhiệt độ hoạt động khuyến cáo 5 ÷ 40°C
Nhiệt độ tối đa 50°C
Khả năng chịu chlorine 5 ÷ 50 ppm
Kích thước (đường kính x chiều dài) 0.9 x 31.7 cm
Giới hạn khối lượng phân tử 50 kDa
Áp suất đầu vào tối đa 0.67 barg (10 psig)
Bảng 2.2. Thông số kỹ thuật của màng 1 kDa (GE Healthcare, Mỹ)
Diện tích lọc 140 cm2
pH 2 ÷ 13

32
Nhiệt độ hoạt động khuyến cáo 5 ÷ 40°C
Nhiệt độ tối đa 50°C
Khả năng chịu chlorine 5 ÷ 50 ppm
Kích thước (đường kính x chiều dài) 0.9 x 31.7 cm
Giới hạn khối lượng phân tử 1 kDa
Áp suất đầu vào tối đa 1 barg (15 psig)
Bảng 2.3. Thông số kĩ thuật màng nano spiral wound 0.3 kDa
(Model: DL2540F1072)
Diện tích hoạt động 1.7 m2
Dài 101.6 cm
Đường kính ống trong B 1.9 cm
Đường kính ống trong C 6.1 cm
Trọng lượng 1.8 kg
Vỏ bọc ngoài sợi thủy tinh
Tốc độ lọc tối đa 650 m3 /ngày
Giới hạn khối lượng phân tử 300-400Da
Nhiệt độ cao nhất 50 °C
pH sử dụng 2-9
Áp suất sử dụng 15 psi cho 1 cấu tử.

33
60 psi cho hỗn hợp nhiều cấu tử
2.2. Phương pháp phân tích
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Xác định hoạt tính sinh học của POS
Nguyên tắc: Hoạt tính prebiotic của một chất phản ánh khả năng hỗ trợ sự phát
triển của một vi sinh vật nhất định so với các vi sinh vật khác và so với khả năng phát
triển trên môi trường không có hoạt tính prebiotic như glucose. Do đó, cacbohydrate có
hoạt tính prebiotic nếu nó được chuyển hóa tương tự như glucose bởi các chủng
probiotic và được chọn lọc chuyển hóa bởi các chủng probiotic thay vì bởi các vi sinh
vật đường ruột khác [37].
Tiến hành: Cấy 1% (v/v - 3x105 cfu/ml) canh trường chứa các chủng thử nghiệm
(nuôi riêng rẽ hoặc kết hợp) vào các ống nghiệm chứa môi trường MR bổ sung 1%
glucose (w/v) hoặc 1% POS (w/v). Nuôi ở 37oC. Cấy trang các mẫu canh trường trên ở
thời điểm ban đầu và sau 24 giờ vào môi trường thạch đĩa để đếm số lượng khuẩn lạc.
2.2.1.2. Xác định vi sinh vật tổng số hiếu khí
TCVN 9977 : 2013. Thực phẩm - Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng
phương pháp sử dụng đĩa đếm petrifilm.
2.2.1.3. Xác định Lactobacillus
TCVN 5522 : 1991. Sản phẩm thực phẩm - Phương pháp xác định số vi khuẩn
chủng Lactobacillus.
2.2.1.4. Xác định Escherichia coli
TCVN 6505 : 2005. Sữa và sản phẩm sữa - Định lượng Escherichia coli giả định
2.2.1.5. Xác định Staphylococcus aureus

34
TCVN 4830 : 2005. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương
pháp định lượng Staphylococcus trên đĩa thạch.
2.2.1.6. Thử nghiệm độc tính cấp của pectic oligosaccharide
Thử nghiệm được tiến hành tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương trên 50
con chuột nhắt trắng giống Swiss với cân nặng 18 – 22 g. Tất cả chuột thử nghiệm
được để ổn định 3 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm và theo dõi cân nặng trong quá
trình thử nghiệm.
Tiến hành thử nghiệm sơ bộ trên 10 con chuột và chính thức trên 40 chuột,
chia thành 4 nhóm gồm 1 nhóm đối chứng dùng nước đun sôi để nguội và 3 nhóm thử
nghiệm theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử nghiệm được dùng các hỗn dịch thử ở
các mức liều và số lần đưa mẫu thử như bảng 2.4.
Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống, trong vòng 2 giờ, 24
giờ đầu và theo dõi hoạt động của động vật thí nghiệm trong thời gian 7 ngày sau khi
uống.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghi ệm thử độc tính cấp
Nhóm chuột Liều dùng (ml hỗn dịch
thử/20g chuột)
Liều dùng (ml
mẫu thử/kg
chuột)
Số chuột thí
nghiệm
Đối chứng 0.4 ml nước x 3 lần --- 10
Mức liều 1 0.4 ml hỗn dịch thử x 1 lần 20 10
2.2.2. Phương pháp hoá lý - hoá sinh

35
2.2.2.1. Định lượng đường khử theo monogalacturonic bằng phương pháp DNS
Đường khử được xác định theo phương pháp của Miller. Bổ sung 1 ml thuốc thử
DNS vào 0.2 ml mẫu đường, đun sôi trong 10 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ ở
bước sóng 575 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn Monogalacturonic suy ra hàm lượng
monogalacturonic có trong mẫu [40, 41].
Kết quả xây dựng đường chuẩn monogalacturonic được biểu diễn trong đồ thị
dưới đây:
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn monogalacturonic
2.2.2.2. Xác định thành phần POS bằng sắc ký bản mỏng (TLC)
Thành phần các oligosaccharide của dịch thủy phân được phân tách bằng kỹ
thuật sắc kí bản mỏng với hệ dung môi butanol: acid acetic: nước = 9: 4: 7 (v/v/v) và
hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy ở 120oC trong 5 phút
[38].
2.2.2.3. Xác định hàm lượng pectic oligosaccharide theo kit D-monogalacturonic
(Megazyme)
Cân 100 mg mẫu vào ống thủy tinh có nắp đậy. Thêm 5 mL H2SO4 2M vào mỗi
ống và đậy kín nắp rồi ủ ở 100°C trong 6 giờ. Lắc đều ống trong quá trình ủ. Tiếp theo,

36
làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 7 mL NaOH 2M. Chuyển dung dịch trong ống sang
bình định mức 100 mL và điều chỉnh đến vạch bằng nước cất. Lắc đều dịch và lọc qua
giấy lọc Whatman No.1. Lượng đường khử trong dịch lọc được xác định bằng kit D-
monogalacturonic (Megazyme) theo quy trình chuẩn kèm theo của nhà sản xuất và
được phân tích trên máy đo Nanodrop 2000C (Thermo, Mỹ).
Hàm lượng POS trong mẫu được xác định theo công thức sau:
POS = (a – b) x 0.9
Trong đó
a: hàm lượng monogalacturonic của dịch sau khi thủy phân bằng acid
b: hàm lượng monogalacturonic của dịch trước khi thủy phân
0.9: hệ số chuyển từ monogalacturonic sang oligosaccharide.
2.2.2.4. Xác định hàm lượng muối trinatri citrate
Hàm lượng muối trinatri citrate được xác định theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc
gia về phụ gia thực phẩm - Chất điều chỉnh độ acid (phụ lục 12), QCVN 4-11:
2010/BYT.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thu nhận dịch thủy phân
- Xử lý nguyên liệu pectin bằng cách rửa bằng cồn 70o nhằm loại bỏ đường tan có
trong nguyên liệu hay một số tạp chất không mong muốn. Pectin được hòa tan trong
đệm citrate phosphate pH 4 ở nồng độ 1% (w/v)
- Bổ sung enzyme vào dịch với tỷ lệ enzyme/cơ chất là 36 U/g
- Tiến hành thủy phân trong hệ thống có tích hợp màng lọc được thiết kế với 2 bình
phản ứng 1, 2 tích hợp tương ứng với màng lọc 1 (50 kDa) và màng lọc 2 (1 kDa)

37
với các điều kiện phản ứng và thông số vận hành hệ thống như sau: nhiệt độ 42 oC,
tốc độ khuấy 225 vòng/phút, thời gian tiền thủy phân cơ chất (bình 1): 90 phút; thời
gian lưu dịch trên hệ thống: 30 phút (bình 1) và 60 phút (bình 2); vận tốc dòng
vdòng= 2 mL/min
2.3.2. Cô đặc dịch thủy phân
Sử dụng cột lọc nano RO 0.3 kDa (Model: DL2540F1072) áp suất qua cột duy
trì ở 15.0-20.5 bar. Tốc độ lọc 170-180 lít/h. Xác định lượng POS thu được trong dịch
và đánh giá hiệu suất thu hồi POS (H1).
2.3.3. Loại muối khỏi dịch thủy phân bằng kết tủa ethanol
Kết tủa POS từ dịch thủy phân bằng ethanol được thực hiện ở các tỷ lệ ethanol:
dịch thủy phân là 1:1; 2:1; 3:1; 4:1, khảo sát ở các mức nhiệt độ -20, 4, 20oC, trong các
khoảng thời gian 0.5; 2; 4; 6 giờ. Kết tủa được rửa với ethanol 96˚ sau khi ly tâm 10
000 vòng/phút trong 15 phút. Hiệu suất H2 (%) của quá trình kết tủa được tính toán,
đồng thời xác định lượng muối loại bỏ được trong bước này.
2.3.4. Sấy phun
Kết tủa POS sau công đoạn loại muối được tái hòa tan tới hàm lượng 70 mg/ml
và được phối trộn với các lượng maltodextrin khác nhau đến hàm lượng chất khô 10;
12; 14; 16% và sấy thử nghiệm với ba chế độ:
- Chế độ 1: nhiệt độ đầu vào 200oC, tốc độ tiếp liệu 2.5 lít/giờ;
- Chế độ 2: nhiệt độ đầu vào 170oC, tốc độ tiếp liệu 2.5 lít/giờ;
- Chế độ 3: nhiệt độ đầu vào 150oC, tốc độ tiếp liệu 2 lít/giờ.
Sản phẩm bột được đánh giá cảm quan và hiệu suất thu hồi H3 (%).
2.3.5. Tính toán hiệu suất thu hồi POS

38
Hiệu suất quá trình thu hồi chế phẩm POS từ dịch thủy phân pectin đến chế
phẩm dạng bột được xác định theo công thức sau:
Hthu hồi = H1 *H2 *H3 *100 (%)
Với H1, H2, H3 là hiệu suất thu hồi POS tương ứng với các công đoạn cô đặc,
kết tủa ethanol và sấy phun, 100 là hệ số tính về phần trăm.
2.3.6. Lựa chọn bao bì và điều kiện bảo quản chế phẩm POS
Chế phẩm POS dạng bột được nghiên cứu bảo quản trong 2 loại bao bì túi PE 2
lớp và túi thiếc hàn kín với khối lượng 3 gram/gói, bảo quản ở nhiệt độ thường trong
12 tháng đồng thời tiến hành đánh giá thông qua hàm lượng POS và số lượng vi sinh
vật hiếu khí tổng số sau từng tháng bảo quản.
2.3.7. Nghiên cứu sản xuất nước bí đao bổ sung POS
Tiến hành sản xuất nước bí đao bổ sung POS nồng độ 1 - 3% như sau: 5 - 10%
siro bí đao (cốt bí đao), thêm 10 - 15% đường, bổ sung chất điều chỉnh độ acid natri
hydro carbonate (E500i) đến pH = 6, phối trộn thêm phụ gia thực phẩm, hương bí đao,
màu caramen nhóm IV (E150d). Bổ sung POS với tỷ lệ 1 - 3% (w/v), hoà tan đều rồi
đóng chai, tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó để
chai ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày để chất lượng sản phẩm ổn định.
2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan
Tiến hành đánh giá cảm quan bằng phương pháp phép thử tam giác (ISO
4120:2004).
 Điều kiện thử nếm:

39
- Phòng đánh giá: thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm cảm quan tuân thủ
đúng các điều khoản ISO 8589:2007.
- Mẫu đánh giá: Mẫu nước được bảo quản ở nhiệt độ thường. Mẫu được thử sau khi lấy
ra khỏi chai 10 phút. Các mẫu được mã hoá bằng số có 3 chữ số và được bố trí về trật
tự xuất hiện như trong bảng 2.5.
 Cách tiến hành: người thử được nhận lần lượt 3 mẫu thí nghiệm (được chuẩn
bị từ 2 sản phẩm: nước bí đao thông thường và nước bí đao có bổ sung 2% POS).
Người thử nghiệm được yêu cầu chỉ ra mẫu khác biệt so với 2 mẫu còn lại. Ba mươi
người thử tham gia thí nghiệm.

40
Bảng 2.5. Phép thử tam giác
Nước bí đao thông thường, mã số sử dụng: 333; 734; 536; 423; 743; …
Nước bí đao bổ sung 2% POS, mã số sử dụng: 835; 896; 944; 243; 634;…
Người thử
Trình bày
mẫu
Mã số mẫu
Câu trả lời
nhận được
Nhận xét
1
BBA
333 536 835
2 734 423 896
3 743 765 855
4 321 543 875
5 154 752 956
6
ABA
846 944 968
7 753 243 524
8 335 769 640
9 685 162 412
10 234 900 841
11
BAA
634 647 283
12 330 298 332
13 912 846 577
14 520 411 544
15 466 295 389
16 BAB 459 677 608

41
17 886 811 335
18 214 563 216
19 356 706 313
20 279 957 317
21
AAB
953 762 541
22 757 430 346
23 454 543 875
24 374 895 453
25 335 743 351
26
ABB
652 895 444
27 523 643 122
28 908 521 649
29 313 431 708
30 738 876 437

42
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm POS
Sản phẩm dịch thủy phân thu được từ hệ thống thủy phân có tích hợp màng
lọc đã được loại bỏ cơ chất và enzyme dư tuy nhiên vẫn chưa loại được mono
monogalacturonic, muối và vẫn chứa nhiều nước. Vì vậy để thu được một chế phẩm
POS tinh sạch dạng bột cho ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, các công
đoạn chính được sử dụng trong quy trình thu nhận này bao gồm công đoạn cô đặc dịch
để loại bớt nước, kết tủa ethanol để loại muối và mono monogalacturonic, POS sau khi
tách và tinh sạch được tạo chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun để bảo quản
lâu dài và thương mại hóa.
3.1.1. Cô đặc dịch thủy phân
Dịch thủy phân sử dụng để thu nhận POS được lấy ra từ hệ thống thủy phân
tích hợp màng lọc nên có nồng độ khá loãng (ít hơn 1%). Do đó để đảm bảo hiệu suất
và tiết kiệm chi phí cho các công đoạn kết tủa và sấy phun sau này, dịch thủy phân cần
phải được cô đặc để đạt nồng độ chất khô cao hơn.
Như trong phần tổng quan đã đề cập, kích thước của các thành phần POS có
khối lượng phân tử nằm dưới 1 kDa. Hơn nữa, dịch thủy phân lấy thí nghiệm trong
nghiên cứu này đã được lọc lần lượt qua hai màng 50 và 1 kDa, vì vậy, màng nano kích
thước 0.3 kDa được lựa chọn để cô đặc POS.
Thử nghiệm được tiến hành với 100 lít dịch thủy phân, cô đặc 5 lần sử dụng cột
lọc 0.3 kDa, áp lực lọc trên cột được duy trì ở 15 – 20 bar thông qua điều chỉnh lưu
lượng dòng ra và dòng hồi lưu, tốc độ lọc 170 – 180 lít/giờ. Hàm lượng POS được xác
định bằng cách sử dụng kit D-monogalacturonic. Nồng độ muối trước và sau màng
được xác định. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.

43
Bảng 3.1. Xác định hiệu suất thu hồi của bước cô đặc bằng lọc nano
Mẫu Thể tích
(lít)
Hàm lượng
POS
(mg/ml)
Lượng
POS tổng
(g)
Hiệu suất
thu hồi
(%) - H1
Tổng
lượng muối
(g)
Dịch thủy phân 100 8.47 847 100 859
Dịch cô đặc 20 37.35 747.05 88.2 776
Kết quả phân tích trong bảng 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi POS ở bước này (H1)
là 88.2%. Kết quả phân tích thành phần POS bằng TLC trong hình 3.1 cho thấy dịch cô
đặc vẫn còn chứa monogalacturonic (giếng 1) trong khi dịch lọc sau màng không chứa
monosacharide (giếng 2). Kết quả này cho thấy màng nano sử dụng trong thí nghiệm
này chỉ có tác dụng cô đặc (5 lần) mà không có tác dụng loại monogalacturonic.
Hình 3.1. Sắc ký của các dung dịch thử nghiệm với màng 0.3kDa
M. oligosaccharide chuẩn; G1: monogalacturonic; G2: digalacturonic;
G3: trigalacturonic
1. dung dịch cô đặc (dịch trên màng); 2. Dịch qua màng

44
Kết quả xác định hàm lượng muối tổng cho thấy lượng muối đệm trong dịch
không thay đổi nhiều sau quá trình lọc. Nguyên nhân có thể do bản chất của màng nano
chỉ loại được các ion hoá trị 1, mà muối đệm trong dịch thủy phân là muối trisodium
citrate, nên màng không cho muối đi qua. Như vậy, với màng lọc nano này chỉ có tác
dụng cô đặc sản phẩm, không có khả năng tách muối hay mono monogalacturonic.
3.1.2. Loại muối đệm khỏi sản phẩm POS
Dịch thủy phân sau khi cô đặc thu được ở trên vẫn còn chứa một lượng lớn
muối đệm (trisodium citrate), nếu không được loại ra sẽ tạo ra vị chua cho sản phẩm
cuối cùng. Có nhiều giải pháp để loại bỏ muối khỏi dung dịch, chẳng hạn như sử dụng
màng có kích thước lỗ phù hợp, thẩm tách hoặc kết tủa... Trong trường hợp này ethanol
đã được lựa chọn để kết tủa sản phẩm POS tách khỏi muối trong dung dịch.
Thí nghiệm được thực hiện với 100 ml dịch thủy phân sau cô đặc (37.35 mg
POS/ml) ở các tỷ lệ ethanol: dịch thủy phân là 1:1; 2:1; 3:1; 4:1, khảo sát ở các mức
nhiệt độ -20, 4, 20oC, trong các khoảng thời gian 0.5; 2; 4; 6 giờ. Kết tủa POS được thu
hồi bằng ly tâm 10 000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó được rửa với ethanol 96˚. Sấy
khô tủa đến khối lượng không đổi ở 50˚ và cân xác định khối lượng POS thu được để
xác định hiệu suất thu hồi POS ở công đoạn này (H2). Phần dịch nổi được lấy đi xác
định hàm lượng muối để đánh giá khả năng loại muối khỏi sản phẩm POS.

45
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol : dịch đến hiệu quả kết tủa và khả
năng loại muối (kết tủa ở 4˚C trong 4 giờ).
Tỷ lệ ethanol :
dịch (v/v)
(nhiệt độ 4oC,
thời gian 4 giờ)
Lượng POS
tổng
(g)
Hiệu suất
thu hồi POS
- H2 (%)
Tổng lượng
muối trong pha
lỏng
(g)
Khả năng
loại muối
(%)
0:1 3.70 - 0.766 -
1:1 1.8 48.60 0.754 98.43
2:1 2.65 71.64 0.750 97.91
3:1 3.05 82.56 0.740 96.61
4:1 3.09 83. 60 0.740 96.61
5:1 3.15 85.20 0.740 96.61
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol : dịch cho thấy khi tỷ lệ này tăng
lên, hiệu suất thu hồi cũng tăng và đạt giá trị cao nhất là 85.2% đối với tỷ lệ 5:1. Tuy
nhiên ở tỷ lệ 3:1, hiệu suất thu hồi cũng đã đạt mức 82.56%. A. Ma - Munoz và cộng
sự (2012) cũng thu được POS có kích thước 0,3-1 kDa tại phân đoạn ethanol 80%.
Kết quả phân tích lượng muối nằm lại trong dịch nổi khi kết tủa POS ở các nồng
độ cồn khác nhau cũng cho thấy chúng chiếm một tỉ lệ khá cao từ khoảng 97 đến 98%
so với tổng lượng muối ban đầu có trong dịch cô đặc. Điều này cho thấy hiệu quả loại
muối của việc kết tủa bằng ethanol.
Cân nhắc giữa hiệu suất thu hồi POS và khả năng loại muối khỏi sản phẩm, tỉ lệ
ethanol : dịch là 3:1 được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

46
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới hiệu suất thu hồi POS được tiến
hành ở 3 mốc nhiệt -20oC , 4oC và 20oC với tỷ lệ ethanol : dịch thuỷ phân là 3:1, trong
các khoảng thời gian 0.5; 2; 4; 6 giờ.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện kết tủa đến hiệu suất thu hồi POS
Yếu tố khảo sát Lượng POS tổng (g)
Hiệu suất thu hồi - H2
(%)
Nhiệt độ (oC)
(tỉ lệ ethanol:dịch
thuỷ phân = 3:1;
4 giờ)
-20 3.11 ± 0.48 84.08 ± 1.92
4 3.05 ± 0.50 82.56 ± 2.00
20 2.78 ± 0.43 75.36 ± 1.72
Thời gian (giờ)
(tỷ lệ ethanol : dịch
thuỷ phân = 3:1;
4oC)
0.5 2.29 ± 0.42 61.92 ± 1.68
2 2.68 ± 0.48 72.44 ± 1.92
4 3.05 ± 0.50 82.56 ± 2.00
6 3.11 ± 0.35 84.28 ± 1.40
Kết quả phân tích bảng 3.3 cho thấy hiệu suất thu hồi POS đạt cao nhất khi tiến
hành kết tủa ở -20oC đạt 84,08%. Tuy nhiên để tiết kiệm năng lượng làm lạnh ethanol
và dịch thuỷ phân, lựa chọn kết tủa ở 4oC trong 4 giờ, hiệu suất thu hồi cũng đạt tới
82.56% thấp hơn không nhiều so với phương án kết tủa ở -20oC. Tương tự như vậy,
hiệu suất kết tủa sau 6 giờ cao hơn không đáng kể so với 4 giờ khi thực hiện kết tủa ở tỉ
lệ ethanol : dịch thuỷ phân là 3:1 và nhiệt độ 4oC. Nên có thể chọn thời gian kết tủa thu
hồi POS ở 4 giờ.

Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin

Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin

Similar to Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Đề tài: Thu nhận Pectic Oligosaccharide từ dịch thủy phân pectin