Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)
CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.
ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
TP. Hồ Chí Minh, 2015
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt
TS. Lương Tấn Trung
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phượng Hằng
MSSV: 1151110009 Lớp: 11DSH01

2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)
CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.
ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
TP. Hồ Chí Minh, 2015
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt
TS. Lương Tấn Trung
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phượng Hằng
MSSV: 1151110009 Lớp: 11DSH01

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên
cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm
Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về
lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày ....... tháng ....... nãm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Phượng Hằng

4. LỜI CÁM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Ðại
học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh
học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến
thức quý báu cho em trong suốt những nãm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,
người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở
Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các
anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn
thành tốt đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên
con những lúc khó khãn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng
như trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày ...... tháng ...... nãm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Phượng Hằng

5. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục...................................................................................................................... i
Danh sách chữ viết tắt............................................................................................. vi
Danh sách các hình................................................................................................. vii
Danh sách các bảng............................................................................................... viii
MỞ ĐẦU...................................................................................................................1
1. Đặc vấn đề.............................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu.............................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................2
4. Phạm vi nghiên cứu...............................................................................................2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về chi Medinilla sp. ............................................................3
1.1.1 .Phân loại, nguồn gốc và phân bố..................................................................3
1.1.1.1. Phân loại khoa học.......................................................................................3
1.1.1.2 Phân bố và sinh thái......................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học....................................................................................3
1.2.3 Một số loài đặc trưng thuộc chi Medinilla sp. ...............................................3
1.2.3.1 Medinilla septentrionalis ..............................................................................3
1.2.3.2 Medinilla assamica .......................................................................................4
1.2.3.3 Medinilla lanceata ........................................................................................4
1.2.3.4 Medinilla nana ..............................................................................................5
1.2.3.5 Medinilla fengi ..............................................................................................6
1.2.3.6 Medinilla formosana .....................................................................................6
1.2. Một số thành phần hóa học trong thực vật....................................................6
1.2.1 Carbohydrate ...................................................................................................6
1.2.1.1. Khái niệm .....................................................................................................6
1.2.1.2 Vai trò ...........................................................................................................6

6. Đồ án tốt nghiệp
ii
1.2.2 Amino acid.................................................................................................... 7
1.2.2.1 Khái niệm ................................................................................................... 7
1.2.2.2 Vai trò......................................................................................................... 7
1.2.3 Alkaloid......................................................................................................... 8
1.2.3.1 Khái niệm .................................................................................................. 8
1.2.3.2 Vai trò......................................................................................................... 8
1.2.4 Glycoside....................................................................................................... 9
1.2.4.2 Saponin....................................................................................................... 9
1.2.4.3Glycoside tim............................................................................................... 9
1.2.4.4Anthraquinone glycoside........................................................................... 10
1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid ................................................................... 10
1.2.4.6 Tannin ...................................................................................................... 10
1.2.4 Steroid......................................................................................................... 11
1.2.4.1 Khái niệm ................................................................................................ 11
1.2.4.2 Vai trò....................................................................................................... 11
1.2.5 Các hợp chất phenolic................................................................................ 11
1.2.5.1 Khái niệm ................................................................................................. 11
1.2.5.2 Vai trò....................................................................................................... 12
1.3. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ............................. 12
1.3.1. Khái niệm .................................................................................................. 12
1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung...................................................................... 12
1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất
kháng khuẩn trong thực vật ............................................................................... 13
1.3.3.1 Alkaloid ................................................................................................... 13
1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic.................................................................... 14
1.3.3.3 Flavonoid ................................................................................................. 15
1.3.3.4 Tannin ...................................................................................................... 16
1.3.3.5 Các hợp chất quinone .............................................................................. 16
1.3.3.6 Terpenoid và tinh dầu .............................................................................. 17

7. Đồ án tốt nghiệp
iii
1.3.3.7 Saponin..................................................................................................... 18
1.2.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt
Nam...................................................................................................................... 19
1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thê giới ................ 19
1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam .................... 20
1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC) và
nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum bactericidal concentration_MBC)21
1.4.4. Khái niệm, ý nghĩa MIC và MBC............................................................. 21
1.4.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 21
1.4.1.2. Ý nghĩa .................................................................................................... 21
1.4.3. Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
.............................................................................................................................. 22
1.4.3.1Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods) ................ 22
1.4.3.2.Phương pháp pha loãng (Dilution methods) ........................................... 22
1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật .. 23
1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới .................................................. 23
CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ 25
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 25
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................. 25
2.1.2 Địa điểm thu mẫu....................................................................................... 25
2.1.3 Thời gian nghiên cứu................................................................................. 25
2.2.Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 25
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 25
2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị.......................................................................................... 25
2.2.3 Môi trường ................................................................................................. 25
2.2.3.1 Môi trýờng nuôi cấy và phân lập ............................................................ 25
2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................. 26
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 26
2.3.1. Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật........................ 26

8. Đồ án tốt nghiệp
iv
2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị ............................................... 27
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật..................................... 27
2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật ........................................................ 27
2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu ............................................................ 27
2.3.4. Phương pháp pha loãng vi sinh vật.......................................................... 28
2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào ....................................................... 28
2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol bằng phương pháp
khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) ............................................ 29
2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường
lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (broth dilution resazurin method)............ 30
2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp đĩa giấy
khuếch tán (disc diffusion method) ................................................................... 31
2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu......................................................................... 32
2.4 Bố trí thí nghiệm........................................................................................... 32
2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ cây Medinilla sp...................... 33
2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết........................................................................................ 33
2.4.1.2 Thuyết minh quy trình .............................................................................. 33
2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ
cây Medinilla sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ................ 34
2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định chỉ số MIC của cao chiết
ethanol 70% từ cây Medinilla sp. ....................................................................... 35
2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ..................... 36
2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung
chất chỉ thị resazurin ........................................................................................... 37
2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán .................................. 38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 40
3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol từ cây Medinilla sp... 40
3.1.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli.................................................. 41
3.1.2 Đối với nhóm Salmonella spp.................................................................... 42

9. Đồ án tốt nghiệp
v
3.1.3 Đối với nhóm Shigella spp......................................................................... 43
3.1.4 Đối với nhóm Vibrio spp. ........................................................................... 44
3.1.5 Đối với nhóm chủng vi sinh vật gây bệnh khác........................................ 45
3.2 Kết quả xác định chỉ số (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây
Medinilla sp. (MEE) ........................................................................................... 46
3.2.1 Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên
giếng thạch (WDA).............................................................................................. 47
3.2.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị
resazurin (MDR).................................................................................................. 48
3.2.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (DDA) ................................................ 50
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………56
4.1 Kết luận………………………………………………………………………56
4.2 Kiến nghị……………………………………………………………………..56

10. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MEE: Medinilla sp. ethanol extract: Cao chiết 70% từ cây Medinilla sp.
MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu
MBC: Minimum Bactericidal Concentration: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
WDA: Agar well diffusion assay: Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
MDR: Broth dilution resazurin menthod: Phương pháp pha loãng trên môi trường
lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin
DDA: Disc diffision assay: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán
TSA: Trypticase Soya Agar
TSB: Trypton Soya Broth

11. Đồ án tốt nghiệp
vii
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.1. Medinilla septentrionalis............................................................................4
Hình 1.2. Medinilla assamica.....................................................................................4
Hình 1.3. Medinilla lanceata......................................................................................5
Hình 1.4. Medinilla nana............................................................................................5
Hình 1.5. Medinilla formosana ..................................................................................6
Hình 1.6. Cấu tạo amino acid .....................................................................................7
Hình 1.7. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên ..............................12
Hình 1.8. Berberine ..................................................................................................14
Hình 1.9. Eugenol.....................................................................................................15
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học saponin .......................................................................18
Hình 2.1. Đường kính vùng ức chế của MEE đối với chủng Escherichia coli
O157:H7....................................................................................................................29
Hình 2.2. Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị resazurin.........................................31
Hình 2.3. Đường kính vùng ức chế của cao chiết Medinilla sp. nồng độ 100
mg/mlđối với chủng Shi. Sonnei ...............................................................................32
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát.............................................................33
Hình 2.5. Quy trình tách chiết cao ethanol 70% ......................................................33
Hình 2.6. Dịch lọc mẫu ethanol 70% .......................................................................34
Hình 2.7. Quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn ...............................................35
Hình 2.8. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch36
Hình 2.9. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên môi trường
lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin............................................................................37
Hình 2.10. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán ..........38
Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của MEE (100mg/ml) và ciprofloxacin (500µg/ml) đối
với nhóm Escherichia coli ........................................................................................40

12. Đồ án tốt nghiệp
viii
Hình 3.2. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhóm
Salmonella spp. .........................................................................................................41
Hình 3.3. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhóm
Shigella spp. ............................................................................................................. 42
Hình 3.4. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (8µg/ml) đối với nhóm
Vibrio spp................................................................................................................. 43

13. Đồ án tốt nghiệp
ix
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất
lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin............................................................................44
Bảng 3.1. Kết quả đối kháng của MEE với 20 chủng vi sinh vật khảo sát ..............44
Bảng 3.2. Chỉ số MIC của MEE đối với 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương
pháp WDA.................................................................................................................47
Bảng 3.3. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương pháp MDR...
...................................................................................................................................49
Bảng 3.4. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát được thực hiện bằng
phương pháp DDA ....................................................................................................50

14. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh cho con
người được báo cáo từ khắp nơi trên thế giới (Piddock và ctv, 1989). Tình hình
đáng báo động là việc sử dụng kháng sinh bừa bãi ở các nước đang phát triển
(Ahmad và ctv, 2001), mặc dù ngành công nghiệp dược đã sản xuất một số loại
kháng sinh mới trong ba thập kỷ qua, nhưng đề kháng của vi khuẩn đối với các loại
thuốc đã tăng lên, vì vi khuẩn có khả năng di truyền nên có khả năng kháng thuốc
qua các thế hệ (Cohen, 1992).
Thuốc kháng sinh là cơ sở chính để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn.
Từ khi phát hiện ra các loại thuốc kháng sinh và sử dụng chúng như hóa học trị liệu
với hy vọng cho ngành y tế rằng kháng sinh sẽ tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật gây
các bệnh truyền nhiễm. Tuy nhiên, lạm dụng kháng sinh đã trở thành nhân tố chính
cho sự xuất hiện và phát triển nên nhiều chủng kháng thuốc của một số nhóm vi
sinh vật (Harbottle và ctv, 2006).
Do đó, việc quan trọng là phải tìm ra các loại kháng sinh mới. Tuy nhiên theo hồ
sơ trước đây, ngay cả những loại kháng sinh thương mại mới được giới thiệu chỉ có
hiệu quả trong một thời gian ngắn (Coates, 2002). Hơn nữa, sự phát triển kháng
thuốc và sự xuất hiện của các tác dụng phụ không mong muốn của thuốc kháng sinh
thương mại đã dẫn đến việc tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn mới, chủ yếu là các
chất chiết xuất từ thực vật, để tìm ra cấu trúc hóa học mới để khắc phục những
nhược điểm nói trên (Ordóñez và ctv, 2003). Vì lý do này, các nhà nghiên cứu đang
ngày càng chuyển sự chú ý sang các sản phẩm thảo dược, tìm kiếm hy vọng mới
cho sự phát triển loại thuốc tốt hơn so với các chủng vi khuẩn đã kháng (Braga và
ctv, 2005)
Hàng nghìn năm trước, con người đã biết về lợi ích của việc sử dụng thực vật để
làm giảm hoặc chữa bệnh. Các loài thực vật tạo thành một nguồn các hợp chất hóa
học mới quan trọng có tiềm năng sử dụng trong y học và các ứng dụng khác. Chiết
xuất từ thực vật đã được ghi nhận bởi các nền văn minh cổ đại là có ý nghĩa cho

15. Đồ án tốt nghiệp
2
việc điều trị các bệnh khác nhau, và khoảng 30% doanh số dược phẩm bán ra trên
toàn thế giới được dựa trên các sản phẩm tự nhiên (Grabley, 1999)
Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu khoa học đề cập đến hoạt tính kháng khuẩn
củng như quy trình xác định nồng độ kháng khuẩn của chiết xuất từ thực vật được
sử dụng trong y học dân gian. Vì vậy, để làm phong phú cho danh sách các thực vật
có tiềm năng sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, và xây dựng quy trình xác định
nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng đối tượng thực vật _ cây thuốc (có màu) là lý do
chính để đề tài “Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp” được thực hiện
2. Mục đích nghiên cứu
Bước đầu xác định được quy trình phù hợp để khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp.
3. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cho cao chiết ethanol của chi Medinilla sp.
Nghiên cứu một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ đó đưa
ra quy trình chung cho đối tượng cây thuốc
4. Phạm vi nghiên cứu
Sử dụng dung môi ethanol 70% cho quá trình tách chiết cao
Thử nghiệm trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

16. Đồ án tốt nghiệp
3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về chi Medinilla sp.
1.1.1 .Phân loại, nguồn gốc và phân bố
1.1.1.1. Phân loại khoa học
Giới (regnum) : Plantae
Ngành (division) : Magnoliophyta
Lớp (class): Magnoliopsida
Bộ (ordo): Myrtales
Họ (familia): Melastomataceae
Chi (genus): Medinilla
1.1.1.2 Phân bố và sinh thái
Medinilla sp. là một chi có khoảng 193 loài thực vật có hoa thuộc họ
Melastomataceae, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới cổ xưa bắt nguồn từ Châu Phi
(hai loài) về phía đông qua Madagascar (khoảng 70 loài) và miền Nam châu Á đến
phía tây các đảo Thái Bình Dương. Chi này được đặt tên theo J. de Medinilla, thống
đốc của quần đảo Mariana vào năm 1820. (Renner và ctv, 2004)
1.1.2. Đặc điểm thực vật học
Medinilla thuộc loại cây bụi hoặc dây leo. Lá mọc đối diện hay vòng, có
cuống lá hoặc không cuống, phiến lá thường nhẵn, rìa lá có hoặc không có răng cưa.
Lá bắc nhỏ, sớm rụng. Hoa có 4 hay 6 cánh. Có chùy hoa lớn màu trắng hoặc hồng,
có cuống nhỏ và đôi khi có lá bắc con. Đế hoa có hình chén, hình phễu, hình
chuông, hoặc hình ống. Cánh hoa dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuống lá), hình
trứng đôi khi xiên. Nhị hoa = 2 x cánh hoa. Hạt nhiều. Bầu nhụy thấp, hình trứng,
chóp cụt hoặc với màng bao quanh đỉnh, đôi khi có vách ngăn.(Jie và ctv, 2007)
1.2.3 Một số loài đặc trưng thuộc chi Medinilla sp.
1.2.3.1 Medinilla septentrionalis

17. Đồ án tốt nghiệp
4
Là cây bụi, cao khoảng 1 – 7m,
nhiều nhánh, nhánh thẳng đứng đôi khi
xen kẽ. Cành dày, hình trụ, nhẵn với vỏ
mỏng có màu nâu. Cuống lá dày
khoảng 0,4 – 0,9 mm. Phiến lá hình
lưỡi mác, có kích thước 7–8,5 × 2–2,5
cm, mỏng như giấy, rìa lá có răng cưa
nhỏ, thưa thớt. Cụm hoa nách, có kích
thước 3,5-5,5 cm, có 1 – 5 hoa, nhẵn,
cuống hoa 1-2,5 cm, đế hoa có hình chuông 4-4,5 mm
Phân bố: Các rừng rậm, bìa rừng, khu vực râm ẩm ướt; độ cao khoảng 200-
1800 m. Được tìm thấy ở Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam),
Myanmar, Thái Lan, Việt Nam.
1.2.3.2 Medinilla assamica
Là cây bụi, hoặc dây leo, cao 1
– 4m. Cành có 4 góc khi còn nhỏ, khi
trưởng thành cành dày, nhẵn có hình
trụ. Lá có cuống hoặc không cuống.
Phiến lá hình trứng, lanceolateovate
hoặc hình elip có kích thước 10 – 21 ×
3,8 – 11 cm, rìa lá có đường răng cưa
nhỏ, nhọn đỉnh. Đế hoa có hình chuông
(15 – 30 cm). Cuống hoa nhỏ (0.,5 - 2
mm), đế hoa có hình chén (3 - 4 mm). Cánh hoa màu hồng, có 4 cánh hình trứng
- Phân bố: tập trung thưa thớt ở rừng rậm, thung lũng, sườn đồi, nơi ẩm ướt,
độ cao khoảng 200 – 1300m. Được tìm thấy ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Thái Lan,
Myanmar, Việt Nam
1.2.3.3 Medinilla lanceata
Hình 1.1. Medinilla septentrionalis
Hình 1.2. Medinilla assamica

18. Đồ án tốt nghiệp
5
Là cây riêng lẽ hoặc bụi, cao
khoảng 2 – 5 m. Cuống lá dài khoảng
8 - 10 mm, hơi có lông; lá hình lưỡi
mác đến hình ovate - lanceolate, có
kích thước khoảng 15 - 24 × 3-5,5 cm,
mỏng như giấy, 2 bề mặt lá nhẵn, đỉnh
và đuôi lá nhọn, rìa lá có đường răng
cưa nhỏ nông. Cụm hoa chèn vào lá
cành hoặc các đốt của rễ. Hoa mọc
theo cụm, hình chùy (15 – 25 cm), đế
hoa có hình chuông (5 - 6 mm), cánh hoa hình trứng rộng, cùn ở đỉnh và tròn dần về
cuối
Phân bố rải rác ở rừng rậm, nơi ẩm ướt, dưới bóng cây, thung lũng, sườn đồi,
độ cao khoảng 400 - 1000m. Được tìm thấy ở Trung Quốc (Hải Nam, Vân Nam)
1.2.3.4 Medinilla nana
Là cây bụi, cao khoảng 15 -
100cm. Chúng là thực vật biểu sinh,
thân bò. Cuống lá (1 – 4 mm), nhẵn lá
có hình lưỡi trứng đến elip, có kích
thước 2 - 3,5 × 1,1 - 1,5 cm, lá mọng
nước để trữ nước, 2 bề mặt lá nhẵn.
Cum hoa có khoảng 1 - 3 hoa, hoa có
4 cánh, màu hồng, hình trứng
Phân bố: ở các rừng rậm, độ cao khoảng 1100 – 2000 m. Được tìm thấy ở
Trung Quốc (Vân Nam) và Việt Nam
1.2.3.5 Medinilla fengi
Là cây bụi, cao 50 – 120 cm, nhiều nhánh. Cuống lá (5 - 12 mm), phiến lá
hình trứng đến elip, có kích thước 4 – 10 × 2 - 3,5 cm, lá có răng cưa nhỏ thưa thớt
hoặc không có răng cưa, đầu và đuôi lá đều nhọn. Hoa mọc theo chùm, có kích
Hình 1.3. Medinilla lanceata
Hình 1.4. Medinilla nana

19. Đồ án tốt nghiệp
6
thước 2 – 3 × 3 – 5 cm, chùm khoảng 3 - 6 hoặc 16 hoa, cuống hoa (5 - 10 mm), đế
hoa hình phễu (4 – 5 mm), hoa có 4 cánh, màu hồng, hình trứng rộng (6 - 7,5 mm),
đỉnh cắt xén hoặc nhọn
Phân bố: rừng thường xanh cây lá rộng, những nơi ẩm ướt có bóng, vết nứt
của đá, độ cao khoảng 600 - 1800 m. Được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc
(Vân Nam).
1.2.3.6 Medinilla formosana
Là cây bụi, hoặc dây leo. Lá mọc đối
diện hoặc mọc vòng quanh thân, cuống lá (5
– 10 mm), nhẵn; phiến lá hình thuôn - trứng
đến trứng - mũi mác, kích thước 10 - 20 × 7
- 14 cm, mỏng như giấy. Cụm hoa đầu cuối
hoặc gần cuối, hoa mọc theo chùy, cuống
hoa (6 mm), nhẵn. Đế hoa gần hình cầu,
kích thước 3 × 2,5 mm, 4 cạnh, nhẵn. Hoa 4
cánh, hình trứng.
Phân bố: rừng, sườn núi, độ cao dưới 100 - 1000 m. Được tìm thấy ở Đài
Loan
1.2. Một số thành phần hóa học trong thực vật
1.2.1 Carbohydrate
1.2.1.1. Khái niệm
Carbohydrate là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố: C, H, O.
Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhất trong
bốn nhóm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở
thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ
Nguồn gốc các carbohydrate trong tự nhiên: được hình thành từ trong lá cây
của thực vật nhờ quá trình quang hợp của ánh sáng mặt trời và sắc tố xanh
chlorophyll (diệp lục) (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013)
1.2.1.2 Vai trò
Hình 1.5. Medinilla formosana

20. Đồ án tốt nghiệp
7
- Cung cấp năng lượng
- Cấu trúc, tạo hình (cellulose,…)
- Bảo vệ (mucopolysaccharide)
- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể)
- Điểm tựa: bộ khung thực vật
- Dự trữ: tinh bột ở thực vật (hạt, thân, củ) (Nguyễn Huy Công và ctv, 2005)
1.2.2 Amino acid
1.2.2.1. Khái niệm
Amino acid là loại hợp chất hữu cơ tạp chức
mà phân tử chứa đồng thời nhóm amino (-NH2-) và
nhóm cacboxyl (-COOH-)
Công thức cấu tạo: Gồm nguyên tử carbon
trung tâm, nhóm amin (amino), nhóm carboxylate,
mạch nhánh. Có công thức : (H2N)x – R – (COOH)y.
Các acid amin khác nhau là do cấu tạo mạch nhánh
khác nhau
Trong phân tử amino acid, nhóm NH2 và nhóm COOH tương tác với nhau tạo ion
lưỡng cực. Vì vậy amino acid kết tinh tồn tại ở dạng ion lưỡng cực (Hồ Chí Tuấn,
2009)
1.2.2.2 Vai trò
Vai trò và một số amino acid được thể hiện ở bảng 1.1
Hình 1.6. Cấu tạo amino
acid

21. Đồ án tốt nghiệp
8
Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất
Các amino acid Hoạt động sinh hóa
Glycine - Là tiền chất của chlorophyll
Proline và
hydroxyproline
- Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước
- Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action)
- Thiết yếu để tạo phấn hoa
Glutamic và
glutamine
Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và
protein thông qua phản ứng trao đổi
Serine - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng
cho quá trình tổng hợp chlorophyll
Arginine - Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân
chia tế bào
Phenylalanine - Là tiền chất cấu tạo nên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe
hơn
Alanine - Vai trò rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi
chất và kháng virus
Tryptophan - Tiền tố của indole-acetic acid, các chất kích thích sinh
trưởng tự nhiên
1.2.3 Alkaloid
1.2.3.1 Khái niệm
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường
gặp trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật. Chúng
có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần
kinh. Alkaloid là chất độc gây chết người nhưng rất quan trong trong lĩnh vực y học

22. Đồ án tốt nghiệp
9
và cung cấp những loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao (Nguyễn Huy Công và ctv,
2005)
1.2.3.2 Vai trò
- Diệt khuẩn
- Tác động lên hệ thần kinh
- Hạ huyết áp
- Chống ung thư
- Là những chất chuyển hóa thứ cấp, đóng vai trò trong quá trình sinh sản và
giúp bảo vệ thực vật chống lại các sinh vật ăn thực vật. (Nguyễn Huy Công và ctv,
2005)
1.2.4 Glycoside
Là những hợp chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp. Glycoside thường được hòa
tan trong dịch tế bào của cây, khi gặp điều kiện thuận lợi thì nó có thể bị các
enzyme phân hủy.
Khi thủy phân glycoside sẽ cho hai phần: một phần không đường và một
phần gồm một hay nhiều đường, phần đường có thể là đường đơn hay đường đa, có
tác dụng làm tăng sự hòa tan glycoside trong nước, còn phần không đường (gọi là
aglycon hay genin) có cấu trúc hóa học rất khác nhau. Tùy theo phần không đường
này và tác dụng của các cây thuốc, glycoside lại chia làm nhiều chất khác nhau. Có
thể kể đến một số glycoside chính sau đây: (Đỗ Tất Lợi, 2004)
1.2.4.2 Saponin
a. Khái niệm: Là những glycoside có tính chất gây bọt, phá huyết. Những vị thuốc
có chất saponin khi tán nhỏ, lắc với một ít nước thì sẽ gây rất nhiều bọt như bọt xà
phòng trong ống thí nghiệm. Bọt này rất lâu mới tan
b. Vai trò
- Tác dụng bổ, tăng cường sinh lực (saponin có trong họ nhân sâm)
- Tác dụng long đờm, dịu ho (có trong cam thảo, viễn chí)
- Giảm đau nhức khớp xương (có trong ngưu tất, cỏ xước)
- Hạ cholesterol trong máu (Đỗ Tất Lợi, 2004)

23. Đồ án tốt nghiệp
10
1.2.4.3 Glycoside tim
a. Khái niệm: Là các glycoside thực vật, có ảnh hưởng kích thích tim và thường có
độc tính cao. Có đặc điểm là những kết tinh, không màu, có vị đắng. Tan trong các
dung môi phân cực. Dễ bị thủy phân trong môi trường acid
1.2.4.4Anthraquinone glycoside
a. Khái niệm: thường có màu từ vàng, cam tới đỏ. Gắn vào nhân thường có các
nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH...Tuỳ theo vị trí các nhóm chức gắn vào
nhân mà có các dẫn xuất khác nhau
b. Vai trò: một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinone có tác dụng kích
thích miễn dịch chống ung thư
1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid
a. Khái niệm: là những chất glycoside có màu sắc. Flavonoid là những sắc tố màu
vàng có trong thực vật, còn anthoxyanosid là những sắc tố cùng loại, có thể là màu
xanh, tím, đỏ hoặc không màu củng được xếp vào nhóm flavonoid. Có đặc điểm là
trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng
liên kết với glucide (glycoside). Trong đó, dạng aglycol thưòng tan trong các dung
môi hữu cơ như este, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng
glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực
như aceton, benzen, chloroform. Những chất này có liên quan chặt chẽ với chất
tannin (Nguyễn Huy Công và ctv, 2005)
b. Vai trò: một chất flavon rất quý là rutin hay rutoside có trong hoa hòe có tác
dụng giảm huyết áp, giúp cho cơ thể chống lại những trường hợp đứt mạch máu nhỏ
khi huyết áp tăng cao. Vai trò của anthoxyanosid hiện nay chưa được xác định rõ rệt
về mặt điều trị. (Đỗ Tất Lợi, 2004)
1.2.4.6 Tannin
a. Khái niệm: tanin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật
có vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng
dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn. Tannin có đặc điểm:

24. Đồ án tốt nghiệp
11
- Tannin thường là bột vô định hình từ màu ngả vàng cho đến màu nâu sáng, không
mùi hoặc mùi rất nhẹ, vị rất chát, gây săn se niêm mạc.
- Khối lượng phân tử từ 500 – 20000, điểm chảy không cố định mà thay đổi tùy
cách chiết xuất, phân lập
- Tannin thường là những chất rất phân cực, dễ tan trong các dung môi phân cực
như cồn, glycerin, aceton…
- Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ
- Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)
- Tạo phức tủa bền với các dun dịch của protein (albumin, gelatin…) nên có tính
thuộc da, làm cho da bền, ít thấm nước, không bị trương phồng hay thối rửa
b. Vai trò
Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu. Tác
dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng. Công dụng chữa viêm ruột,
tiêu chảy. Chữa ngộ độc kim loại nặng và các alkaloid vì làm kết tủa các chất đó
(Đỗ Tất Lợi, 2004)
1.2.4 Steroid
1.2.4.1 Khái niệm
Là những hợp chất thiên nhiên có bộ khung cacbon stenan gồm bốn vòng
ngưng tụ với nhau, chứa các mạch bên và các nhóm chức khác nhau như: CO, -
CHO, -COOH, -OH. Steroid tồn tại trong động, thực vật dưới dạng glycosid hoặc
liên kết với các cacbon acid amin. Steroids có đặc điểm là hợp chất chất béo hữu cơ
hòa tan. Có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Khi đun nóng với Se ở 36000
C sẽ
tạo hợp chất Hidrocacbon Diel
1.2.4.2 Vai trò
Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Thường dùng làm các
thuốc kích thích
1.2.5 Các hợp chất phenolic
1.2.5.1 Khái niệm

25. Đồ án tốt nghiệp
12
Là những hợp chất hóa học được tìm thấy ở khắp các chất màu của hoa quả
được cấu tạo từ các tiểu đơn phân phenol. Có đặc điểm là đa số được tổng hợp từ
phenylalanine. Ở thực vật nhóm phenolics chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid
1.2.5.3 Vai trò
- Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh và các động vật ăn cỏ
- Chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh
- Chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm
- Một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid được biết như là chất gây ra viêm
da dị ứng ở người
1.3. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật
1.3.1. Khái niệm
- Là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế
sự phát triển của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân
tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết cho sự phát
triển của vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng. Thường có tác
dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ .
- Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid,
flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu…
1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung

26. Đồ án tốt nghiệp
13
Hình 1.7. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên
Cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn từ thiên nhiên là phá hủy màng
tế bào chất, làm mất ổn định của proton động lực (PMF), dòng điện tử, hoạt động
vận chuyển và đông tụ của các tế bào
Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất chủ yếu thông qua : phá vách tế bào, làm
rối loạn màng sinh chất và bất hoạt enzyme, protein … của tế bào vi khuẩn .
Có nhiều hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật tiêu diệt vi sinh vật
thông qua phá vỡ vách tế bào
Có rất nhiều hợp chất tấn công vào màng trao đổi chất tiêu diệt vi khuẩn .
+ Thành phần kỵ nước trong tinh dầu hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn làm
ảnh hưởng đến cấu trúc và thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn (Sikkema J
và ctv, 1994)
+ Một số loại tinh dầu có khả năng kích thích sự tăng trưởng của sợi nấm giả, điều
đó chứng minh rằng nó có thể hoạt động trên các enzyme tham gia vào quá trình
tổng hợp thành phần cấu trúc vi khuẩn (Lambert và ctv, 2001)
+ Thymol có khả năng phân hủy màng tế bào của vi khuẩn Gram (-)
Proton động lực
Đông tụ
Vách tế bào
Tế bào chất
Màng protein
Màng tế bào
chất

27. Đồ án tốt nghiệp
14
Tiêu diệt vi khuẩn thông qua ngăn chặn sự bám dính của vi khuẩn và virus
như: mannose specificaglutinin, chrysin…
1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất
kháng khuẩn trong thực vật
1.3.3.1 Alkaloid
a. Cơ chế kháng khuẩn chung của alkaloid
Cơ chế kháng khuẩn alkaloid: là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn..
Berberine có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế được Shigella, S.aureus, Vibrio
choleare,..
Có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram (-) , gram (+ ) và các vi khuẩn
acid
b. Một số alkaloid có tính kháng khuẩn điển hình
Morphine là một alkaloid được sử dụng trong y tế trong những năm đầu của thế
kỷ XIX. Morphine được lấy từ cây thuốc phiện Papaver somniferum. Codein và
heroin là hai dẫn xuất của morphine. Diterpenoid alkaloids là một loại alkaloid
thường được lấy từ các họ cây mao lương (Ranunculaceae), chúng có đặc tính
kháng kháng khuẩn.
- Solamargine
Solamargine, một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum
khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dung chống lại sự lây
nhiễm khi đã mắc phải HIV.
Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan
trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy.
- Berberine
Một đại diện quan trọng của alkaloid có trong
các cây: hoàng đằng, hoàng bá, hoàng liên…
Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối
với shigella, tụ cầu khuẩn. Những năm gần đây,
một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine Hình 1.8. Berberine

28. Đồ án tốt nghiệp
15
có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn axit.
Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên
sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét.
Cơ chế kháng khuẩn berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn
gây bệnh sốt rét, chính vì điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá
mạnh đối với loại trùng gây bệnh này.
Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh
hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu
gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với
berberine sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ
vi sinh vật đường ruột.
1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic
a. Một số hợp chất phenolic có khả năng kháng khuẩn
Catechol và pyrogallol là hai hợp chất hydroxyl hóa của phenol cho thấy là có
độc tính đối với vi sinh vật. Cơ chế được cho là nguyên nhân dẫn đến độc tính của
các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật bao gồm sự ức chế enzyme bởi các
hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua
sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein
Hợp chất phenolic có chứa một nhánh thế mà
có carbon ở trạng thái oxy hóa thấp không chứa
oxy được xếp vào nhóm tinh dầu và thường được
xem như là chất kháng khuẩn. Eugenol là đại diện
đặc trưng được tìm thấy trong dầu đinh hương.
Eugenol được xem là chất kìm hãm đồng thời
chống lại cả nấm sợi và vi khuẩn.
1.3.3.3 Flavonoid
a. Cơ chế kháng khuẩn
Hình 1.9. Eugenol

29. Đồ án tốt nghiệp
16
Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với
các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo càng có khả
năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật
Flavonoid có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có
mặt glucose.
Flavonoid ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho
thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được
Flavonoid gắn lên màng sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu
chọn lọc của màng nguyên sinh chất
Ức chế tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn
Có tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn
b. Một số hợp chất flavonoid kháng khuẩn điển hình
Trong trà xanh có catechine, catechine vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio
cholerae, ức chế enzyme glucosyltransferase của Streptococcus mutans, ức chế hoạt
động của Shigella và một số vi khuẩn, vi nấm khác
Một số flavonoid như quercetin, hesperetin và catechine có thể chống lại
virus type 1 (HSV – 1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh
khó thở ở trẻ
Galangin (3,5,7 – trihydroxylflavone) được chiết xuất từ cây thảo mộc sống
lâu năm Helichrysum aureonitens có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (+) củng
như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV – 1 và coxsackie B type - 1
1.3.3.4 Tannin
a. Cơ chế kháng khuẩn
Là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát được phát hiện
dương tính với “thí nghiệm thuộc da” và được định lượng dựa trên mức độ hấp phụ
của bột da sống chuẩn.
Nhiều hoạt động sinh lý của con người, chẳng hạn như sự kích thích của thực
bào các tế bào và chống nhiễm khuẩn tại nhiều cơ quan trong cơ thể được thực hiện
bởi các hợp chất của tannin.

30. Đồ án tốt nghiệp
17
Một trong những tính chất rất đặc trưng của tannin là tạo phức với các
protein thông qua các liên kết không đặc hiệu như liên kết hydro và các liên kết
cộng hóa trị.. Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các
protein chức năng. Các protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay
thành tế bào polypeptide…
Tannin có thể gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn
1.3.3.5 Các hợp chất quinone
a. Cơ chế kháng khuẩn
Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone
Chúng tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trưng cao. Những
hợp chất này là những hợp chất màu, là nguyên nhân của những phản ứng hóa nâu ở
bề mặt cắt hoặc vết thương của rau trái và là hợp chất trung gian trong con đường
tổng hợp melanine ở da người.
Quinone gây sự bất hoạt và làm mất chức năng của protein do hình thành
phức không phục hồi với các acid amin của vi khuẩn
Hoạt tính chống chảy máu của chúng là do sự dễ dàng bị oxy hóa của chúng
ở các mô trong cơ thể. Các amino acid cũng có thể tạo thành quione khi có enzyme
xúc tác, chẳng hạn như polyphenoloxydase.
Ngoài ra nó còn là nguồn cung cấp các gốc tự do ổn định, quinones được biết
là có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein,
thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó khả năng
kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt
tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra
chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật
b. Một số hợp chất quinone kháng khuẩn điển hình
Cây óc chó có tác dụng kháng khuẩn: Candida mycoderma, B. Subtills,
Hansenula anomala, Botrys cinerea… và nhiều loài nấm mốc, chữa herpes sinh
dục, trị ho, viêm phế quản.

31. Đồ án tốt nghiệp
18
Cây bạch hoa xà: S.aureus, Streptococus pyogenes, Pneumococus, E. coli…
Có tác dụng chữa các bệnh ngoài da, những vết loét, vết thương.
Một số loài thuộc họ Gọng vó có thể kháng Mycobacterium tuberculosis. Tác
dụng chữa ho, chống co thắt.
Cây lá móng kháng nhóm vi khuẩn: Staphylococus, Streptococus, Brucella
và Salmonella…có tác dụng chữa lở loét, hắc lào, ho, viêm khí quản.
1.3.3.6 Terpenoid và tinh dầu
a. Cơ chế kháng khuẩn
Terpen: chất chuyển hóa thứ cấp dựa trên đơn vị isopren
Khi các hợp chất có chứa các thành phần bố sung, thường oxi, nó được gọi là
terpenoid
Tinh dầu thuộc nhóm chất izoprenoid, là sản phẩm trao đổi chất bậc hai
Về bản chất hóa học tinh dầu thường là hỗn hợp các chức khác nhau:
hydrocarbon, rượu, phenol, aldehyde, acid, este,... Tuy nhiên quan trọng và thường
gặp hơn cả trong hợp phần của tinh dầu là terpen và các dẫn xuất chứa oxy của
terpen.
Cơ chế tác động của terpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được suy
đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic.
b. Một số terpenoid và tinh dầu có tính kháng khuẩn điển hình
Cây thanh hao hoa vàng: Artemisin là một secquiterpen chiết xuất từ cây
thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) có hoạt tính kháng sốt rét mạnh, hoạt chất
này đã được nghiên cứu và phân lập từ những năm 70.
Tinh dầu từ các loài sả - Andropogon spp. có tác dụng kháng khuẩn chủ yếu
lên vi khuẩn Gram âm. Tác dụng của tinh dầu sả tỉ lệ với hàm lượng citral
Tinh dầu từ cây bạch đàn – Eucalyptus globulus có tác dụng lên Bacillus
subtilis và Staphylococcus aureus nhưng kém tác dụng với E.coli. Cineol trong tinh
dầu là thành phần có tác dụng
Menthol có trong tinh dầu bạc hà có tác dụng chọn lọc trên một số chủng
Brucella

32. Đồ án tốt nghiệp
19
1.3.3.7 Saponin
Là nguyên liệu đầu tổng hợp các hormone steroid. Chủ yếu là kháng dầu và
kháng nấm.
a. Cơ chế kháng khuẩn của saponin:
Saponin, chủ yếu là asiaticoside có tác dụng lên Mycobacterium leprae, do
asiaticoside làm tan màng sáp của vi khuẩn.
Nhiều saponin thuộc nhóm spirostan, nhóm spirosolan, solanidan và olean đã
được nghiên cứu, có tác dụng chủ yếu là kháng nấm.
b. Một số saponin có khả năng kháng khuẩn điển hình
Tomatin có trong cây cà chua nhiều nhất ở lá: hạt không có. Tomatin ức chế
nhiều loại nấm gây bệnh ở người. Tomatin còn ức chế nấm gây bệnh cà chua –
Fusarium oxysporum f. lycopersici, một số nấm mốc khác như Aspergillus niger,
Penicillium notatum và một số vi khuẩn: Staph. aureus, Bacillus cerus, B.
mycoides, B. subtilis, E. coli.
Parillin có tác dụng kháng Candida albicans, Trichoderma mentagrophytes,
Aspergillus niger
Cyclamin, Primulasaponin (nhóm olean) ngoài tác dụng kháng nấm còn có
tác dụng lên vi khuẩn Staph. aureus, E. coli.
Một số saponin còn có tác dụng ức chế virus cúm type A trên thực nghiệm.
Saponin của cam thảo có tác dụng mạnh nhất
1.2.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt
Nam
1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới
- Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt
khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp
chất Alicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Một nghiên cứu khác tại
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học saponin

33. Đồ án tốt nghiệp
20
Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất từ tỏi có thể chữa được nhiều bệnh
nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella (Nguyễn Thị
Vân Thái, 2003)
- Vào năm 1967, Binz đã chứng minh được quinin rất độc với Paramecium. Quinin
ở nồng độ 1/20000 làm suy yếu hoạt lực của Paramecium để điều trị các bệnh do
Paramecium gây ra (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)
- Năm 1928, B. P. Tokin đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng
đối với vi khuẩn được gọi là Phytocid. Gries (1943), Largralge (1956) chiết xuất từ
cây Hồ Đào (Juglals ligra – Juglandaceae) được chất Juglon, đây là một dẫn xuất
Natoquinon, chất này có tác dụng với nhiều loại nấm và vi khuẩn nha bào. Năm
1959 Horak, Santavi chiết xuất từ cây Cannabit sativa thuộc họ Cannabinnaceae
được chất Cannabiriolic có tác dụng với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn
Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại Penicilin (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)
- Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và cộng sự đã thử nghiệm thành
công khả năng kháng khuẩn của các loài cây thảo dược như: O.sanctum, C.alata,
Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava,
Clinacanhus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus
reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, và P.urinaria đối với Vibrio
spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây Momordica charatina và Psidium guajava có hiệu
quả ức chế đối với Vibrio spp. (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)
- Năm 2007, J.R. Soberón và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn của
chiết xuất từ 12 cây vùng Argentina và chiết xuất Tripodanthus acutifolius có khả
năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn. (Soberón J.R. và ctv, 2007)
- Năm 2011, Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của
chiết xuất từ lá của cây Syzygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis (Mehndi),
Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) and Ficus religiosa (Peepal)
chống lại chủng Staphylococcus aureus (Firdaus Jahan và ctv, 2011)

34. Đồ án tốt nghiệp
21
- Năm 2011, Naveed Ahmad và cộng sự đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và
kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại
dung môi khác nhau (Võ Văn Chi, 2000)
1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam
- Năm 1959, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc có tác
dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hưởng cùng cộng sự đưa ra chế
phẩm Tô Mộc trị tiêu chảy sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc về tính kháng
khuẩn (Võ Văn Chi, 1997, 2000)
- Năm 2012, Trần Ngọc Hùng và Trương Thị Thành Vinh đã nghiên cứu bước đầu
trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy dịch ép nguyên chất từ cây cỏ mực
(Eclipta prostrata L) có tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococus spp (Đỗ
Tấn Lợi, 1968)
- Qua 20 năm nghiên cứu theo dõi trên động vật và người (1987 - 2007) tập thể của
các cán bộ khoa học của Học Viện Quân Y, Viện Lão Khoa, Viện Quân Y 103,
Bệnh Viện Lao Và Bệnh Phổi TW, Bệnh Viện Xanh Pôn, Bệnh Viện U Bướu Hà
Nội,.. đã chiết xuất thành công Cao toàn phần của loài Azolla microphylla có tên là
Phylamin được thương mại hóa dưới tên “Mediphylamin”
- Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hương đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của
cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người (Nguyễn
Thị Thu Hương, 2011)
1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC)
1.4.1 Khái niệm, ý nghĩa MIC
1.4.1.1 Khái niệm
Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) là nồng độ
thấp nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật
sau khoảng 24 giờ nuôi cấy. (Andrews, 2011)
1.4.1.2 Ý nghĩa
Nồng độ ức chế tối thiểu rất quan trọng trong việc xác nhận sự đề kháng của vi
khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn và cũng để theo dõi hoạt động của các tác

35. Đồ án tốt nghiệp
22
nhân kháng khuẩn mới. MIC thường được coi là các đo lường trong phòng thí
nghiệm cơ bản nhất của các hoạt động của một tác nhân kháng khuẩn chống lại một
chủng vi sinh vật
Nồng độ ức chế tối thiểu về mặt lâm sàng được sử dụng không chỉ để xác định
lượng thuốc mà bệnh nhân sẽ nhận được, do đó hạn chế khả năng kháng thuốc của
vi khuẩn
Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất diệt khuẩn phù
hợp với từng loại vi sinh vật...Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ
liệu MIC. Chọn được nồng độ tối ưu để làm chậm sự phát triển của vi khuẩn kháng
thuốc.
Ngoài ra còn có ý nghĩa về:
+ Dược động học (pharmacokinetics = PK): là sự thay đổi nồng độ của chất diệt
khuẩn thay đổi theo thời gian.
+ Dược lực học (pharmacodynamics = PD) : là mối quan hệ giữa nồng độ với
hiệu quả của một chất diệt khuẩn trên vi sinh vật gây bệnh
1.4.3 Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Các phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu được phân loại thành 3 nhóm
chính: khuếch tán, pha loãng và phương pháp bioautographic.
1.4.3.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods)
Trong kỹ thuật khuếch tán, một giếng chứa các hợp chất thử nghiệm ở một
nồng độ nhất định được đưa vào tiếp xúc với một môi trường đã cấy vi sinh vật và
đường kính ức chế xuất hiện xung quanh các giếng chứa được đo tại đầu và cuối
trong thời gian ủ vi sinh vật. Ở phương pháp này, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
được định nghĩa là nồng độ thấp nhất có thể ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật
có thể nhìn thấy. Các phương pháp được sử dụng phổ biến như phương pháp đĩa
giấy khuếch tán hoặc khuếch tán qua giếng thạch.
Phương pháp khuếch tán không thích hợp để thực hiện trên mẫu không phân
cực hoặc các mẫu không thể khuếch tán vào môi trường thạch (Paul Cos và ctv,
2006)

36. Đồ án tốt nghiệp
23
1.4.3.2 Phương pháp pha loãng (dilution methods)
Trong phương pháp pha loãng, các hợp chất thử nghiệm được thêm vào môi
trường thích hợp đã được bổ sung vi sinh vật. Phương pháp thường được sử dụng
phổ biến là pha loãng trong môi trường lỏng, so độ đục và dựa vào chất oxi hóa
khử. Độ đục có thể được ước tính một cách trực quan hoặc xác định chính xác hơn
bằng cách đo mật độ quang ở 405 nm. Tuy nhiên, không phải mẫu thử nghiệm nào
củng hòa tan hoàn toàn vào môi trường, nên sẽ gây ảnh hưởng đến độ đục, vì vậy
cần phải thực hiện đối chứng âm và dương để so sánh với kết quả thí nghiệm.
Hiện nay các chất oxi hóa khử MTT và resazurin thường được sử dụng để
xác định số lượng vi khuẩn (Eloff, 1998; Gabrielson và ctv, 2002) và phát triển của
nấm (Jahn và ctv, 1995; Pelloux-Prayeret và ctv, 1998). Resazurin có lợi thế không
kết tủa khi cho vào môi trường, cho phép đọc trực tiếp, dễ thực hiện.
Phương pháp pha loãng phương pháp pha loãng thích hợp cho khảo nghiệm
chiết xuất hoặc hợp chất phân cực và không phân cực để xác định giá trị MIC và
MBC/MFC. (Paul Cos và ctv, 2006)
1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật
1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới
Năm 2005, Mullika đã tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối
thiểu của 19 loại thảo dược lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và
Staphylococcus epidermidis bằng phương pháp thạch. Kết quả cho thấy 13 loại
thuốc thảo dược có ảnh hưởng đến sự phát triển của hai loài vi khuẩn trên môi
trường thạch. Trong đó, Garcinia mangostana là thuốc có tác dụng mạnh nhất, với
giá trị MIC nhỏ nhất (39 ppm). Điều đặc biệt là giá trị MIC của thảo dược này trên
cả hai loài vi khuẩn thì bằng nhau. (Mullika và ctv, 2005).
Năm 2007, Kumar cũng tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối
thiểu của thảo dược lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và
Staphylococcus epidermidis, với 12 loại thuốc thảo dược hemidesmus indicus,
eclipta alba, coscinium fenestratum, curcubito pepo, tephrosia purpurea, mentha
piperita, pongamia pinnata, symplocos racemosa, euphorbia hirta, tinospora

37. Đồ án tốt nghiệp
24
cordyfolia, thespesia populnea, jasminum officinale. Qua phương pháp thạch có 7
loại thuốc cho kết quả ức chế sự phát triển của hai loài vi khuẩn này trên môi trường
thạch. Và qua phương pháp pha loãng xác định được nồng độ ức chế của Coscinium
fenestratum trên hai loài vi khuẩn này bằng nhau và nhỏ nhất. Giá trị MIC trên hai
loài vi khuẩn là 49ppm. (Kumar và ctv, 2007)
Chiết suất methanol và acetone từ nhiều cây nấm có tác dụng trên vi khuẩn
baccilus cereus, Staphylococcus aureus, listeria monocitogenes, Escherichia coli,
salmonella infantis. Qua phương pháp pha loãng xác định được khoảng giá trị MIC
của các chiết suất này từ165 – 2640 mg/ml. B.cereus nhạy với hầu hết các chiết suất
từ cinnamomumcassia, azadirachta indica, ruta graveolén, rumex nervosus với
khoảng MIC từ 165 – 660 mg/ml. Chiết suất từ Cinnamomum cassia chỉ có hiệu
quả trên vi khuẩn E.coli, S. infantis ở giá trị MIC cao nhất (2640 mg/ml) (Mohan
& ctv, 2004)
Năm 2005, thí nghiệm kiểm tra tác dụng của ethyl acetate và n-butanol chiết
suất từ vỏ quả Punica granatum lên E. coli O157:H7, E. coli O26:H11, E. coli
O111:NM và E.coli O22 bằng phương pháp thạch. Xác định được giá trị MIC của
cả hai chiết suất này lên E. coli O157:H7 là nhỏ nhất (50 ppm). Giá trị MIC của
ethyl acetate chiết suất từ Centaurealên vi khuẩn Staphylococcus aureus là 62,5
ppm, thấp hơn so với giá trị MIC của chloramphenicol (125 ppm), nghĩa là ethyl
acetate có tác dụng mạnh hơn chloramphenicol lên vi khuẩn Staphylococcus aureus
(Kiymet & ctv, 2005)

38. Đồ án tốt nghiệp
25
CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học –
Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM.
2.1.2 Địa điểm thu mẫu
Nguồn mẫu được thu tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng
2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015
2.2.Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Toàn bộ mẫu cây Medinilla sp. gồm lá, thân, cành
2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị
Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 16 chủng vi khuẩn được
cung cấp bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh – Khoa sinh học
bao gồm:
- Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium,
S. dublin.
- Nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli
O157:H7
- Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm Shi. sonnei, Shi. boydii, Shi. flexneri.
- Các vi khuẩn gây bệnh khác: L. monocytogenes, L. innocua, Enterococcus
feacalis, Staphylococcus aureus.
Và nhóm vi khuẩn Vibiro: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. Harveyi.
V. cholerae được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II
2.2.3 Môi trường
2.2.3.1 Hóa chất
Resazurin
NaCl

39. Đồ án tốt nghiệp
26
Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Ðộ).
Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Ðộ).
DMSO – Dimethyl Sulfoxide
Glycerol.
2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị
a. Dụng cụ
Ống nghiệm
Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml
Ống đong 100 ml
Pipet 1ml, 10 ml
Ống ly tâm ependoff 2 ml
Bình môi trường 250 ml, 500
ml, 1000 ml
Dây cấy ria, que cấy trang
Đèn cồn
Đĩa petri
Dụng cụ đục lỗ
Thước đo
Bông thấm và bông không thấm
nước
Ðũa thuỷ tinh
Các loại đầu típ
Micropipette 100 µl, 1000 µl
Các loại dụng cụ khác như: bao chịu
nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp,
muỗng, dao, thun,...
b. Thiết bị
Autoclave (Huxky Ðài Loan)
Tủ ấm 300
C, 370
C (Memmert Đức)
Máy ly tâm (Tuttligen Đức)
Máy đo pH (Hach – Đức)
Máy đo UV – VIS (Hach)
Cân phân tích (Orbital Đức)
Bếp từ (Billy – Anh)
Máy nước cất (Branstead USA)
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật
Mục đích: Tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật
nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau.
Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng môi để tách chiết các hợp chất có trong
cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học nhờ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi
mẫu cây thuốc.

40. Đồ án tốt nghiệp
27
Phương pháp: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để lại bỏ bụi bẩn rồi đem đi
phơi khô rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm với dung môi
trong 24 giờ để trích ly hợp chất, sau đó lọc lấy dịch lọc. Bã đem ngâm lại với dung
môi, lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch lọc trong. Dịch lọc sẽ được loại bỏ dung
môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô quay chân không ở nhiệt độ nhỏ hơn
500
C hoặc cô cách thủy ở nhiệt độ 700
C. Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở
nhiệt độ -40
C (Atta và Mouneir, 2004)
2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị
Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường
vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu
sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh
dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh
dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh
vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi
chất giữa vi sinh vật và môi trường.
Phương pháp: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi
khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh
bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó
tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi
khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).
2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật
2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật
Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật
được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh
vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50
C) để bảo quản.
Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật
luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh

41. Đồ án tốt nghiệp
28
vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa
là 3 tháng cấy chuyển một lần.
Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy
chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo
quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40
C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu
Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng,
có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ
trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là
việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước
trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn
chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol.
Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích
hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và
thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ
giống ở nhiệt độ lạnh -150
C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).
2.3.4. Phương pháp pha loãng vi sinh vật
Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có
vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở
các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân
tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử
dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh
vật trong mẫu.
Phương pháp: Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào
ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là
10-1
. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1
hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml
dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục tiến hành như vậy cho
đến khi được nồng độ cần thiết.

42. Đồ án tốt nghiệp
29
Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha
loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1
. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml
dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch
pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2
. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu
lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013).
2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào
Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland):
Mật độ = OD600 x 1,02 x 109
(cfu/ml)
2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol bằng phương pháp
khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) (Sen và Batra, 2012)
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng trực tiếp của chất
kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị trên môi trường nuôi cấy. Chất kháng khuẩn có
khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nếu
chất kháng khuẩn kháng được vi khuẩn chỉ thị thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn
xung quanh giếng thạch.
Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh và pha loãng để đạt nồng độ 106
cfu/ml. Sau đó cấy trang vi khuẩn trên môi trường TSA. Dùng ống thép không gỉ
(đường kính 6 mm) tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ cao đã pha loãng với nồng độ cần
khảo sát vào các giếng trên đĩa. Sau đó đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24
giờ cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, tiến hành đo đường kính vòng kháng
khuẩn quanh miệng giếng trên đĩa -> Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch cao
đối với các vi khuẩn chỉ thị.

43. Đồ án tốt nghiệp
30
Hình 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) đối với chủng Escherichia
coli O157 :H7
2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường lỏng
bổ sung chất chỉ thị resazurin (broth dilution resazurin method) (Banfi và ctv,
2003)
Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi màu của resazurin theo thời gian phụ thuộc
vào sự hoạt động của vi sinh vật, điều đó có nghĩa là phản ứng với resazurin cho ta
biết mức độ hoạt động của vi sinh vật hơn là số lượng của chúng.
Phương pháp: Chuẩn bị dung dịch resazurin bằng cách hòa tan một viên
resazurin vào 50 ml nước cất vô trùng.
Chuẩn bị ống nghiệm vô trùng. Thêm cao pha loãng với nồng độ khảo sát và
vi khuẩn đã được tăng sinh và pha loãng (106
cfu/ml) vào ống nghiệm đã được bổ
sung môi trường TSB. Sau đó đem các ống nghiệm ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24 giờ
cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, thêm vào các ống nghiệm chất chỉ thị
resazurin. Sự thay đổi màu sắc được đánh giá trực quan, bất kỳ thay đổi màu sắc từ
tím sang màu hồng hoặc mất màu được ghi nhận là dương tính với sự hoạt động của
vi sinh vật trong ống nghiệm. Nồng độ thấp nhất mà tại đó sự thay đổi màu xảy ra
được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

44. Đồ án tốt nghiệp
31
Hình 2.2. Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị resazurin
2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp đĩa giấy
khuếch tán (disc diffusion method) (Ahmad, 2011)
Nguyên tắc: Đĩa giấy sẽ hấp thu nước từ môi trường thạch, dịch cao hòa tan
và bắt đầu khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ
nhạy cảm của vi khuẩn với dịch cao được biểu hiện bằng đường kính các vùng ức
chế xung quanh khoanh giấy.
Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh và pha loãng để đạt nồng độ 106
cfu/ml. Sau đó cấy trang vi khuẩn trên môi trường TSA. Đặt các khoanh giấy (d =
6mm) lên mặt thạch, sau đó nhỏ dịch cao đã pha loãng với nồng độ (100mg/ml;
50mg/ml; 25mg/ml; 12,5mg/ml) vào các đĩa. Sau đó đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ
370
C trong 24 giờ cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, tiến hành đo đường
kính vùng ức chế -> Nồng độ thấp nhất xuất hiện vùng ức chế được xác định là giá
trị MIC (Anja Klancnik, 2010)

45. Đồ án tốt nghiệp
32
Hình 2.3. Đường kính vùng ức chế của cao chiết Medinilla sp. đối với chủng Shi.
sonnei
2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm
Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. So sánh thống
kê bằng phương pháp One way – ANOVA ở mức tin cậy 95%
2.4 Bố trí thí nghiệm
Tiến trình thí nghiệm tổng quát được trình bày ở hình 2.4
100mg/ml 50mg/ml

46. Đồ án tốt nghiệp
33
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ cây Medinilla sp.
2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết
Hình 2.5. Quy trình tách chiết cao ethanol 70%
Xử lý mẫu
Cao thuốc
Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Xác định giá trị MIC của cao ethanol trên
các chủng vi sinh vật
Phương pháp pha loãng
trên môi trường lỏng bổ
sung resazurin (broth
dilution resazurin method)
[3.2]
Phương pháp khuếch
tán trên giếng thạch
(agar well diffusion
assay )
[3.1]
Phương pháp đĩa
giấy khuếch tán
(disc diffusion assay)
Mẫu cây Medinilla sp.
Phơi khô, xay nhuyễn
Ngâm ethanol 70%
Lọc tinh
Tỷ lệ 1:20 (w/v)
Cô cách thủy 70
o
C
Cao Medinilla sp.
Bã
Mẫu cây Medinilla sp.

47. Đồ án tốt nghiệp
34
2.4.1.2 Thuyết minh quy trình
Mẫu cây Medinilla sp. tươi được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn và đem đi phơi
khô. Cây khi đã khô được đem xay thành dạng bột. Sau đó tiến hành cân 5g bột cây
và ngâm trong 100ml ethanol 70% theo tỷ lệ 1 : 20 (w/v) ở nhiệt độ phòng trong 24
giờ. Sau 24 giờ, tiến hành lọc tinh thu lấy dịch lọc. Bã được ngâm tiếp với dung môi
từ 3-5 lần cho đến khi màu sắc dịch lọc không thay đổi.
Tất cả các dịch lọc thu được qua các lần ngâm được hòa trộn và đem đi cô
cách thủy ở 700
C cho đến khi đuổi hết dung môi, ta thu được cao chiết ethanol 70%.
Cao chiết được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40
C để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp
theo.
Hình 2.6. Dịch lọc mẫu ethanol 70%
2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ cây
Medinilla sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion
assay)

48. Đồ án tốt nghiệp
35
Hình 2.7. Quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn
Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB
(hoặc TSB + 1.5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150
vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sóng
600nm đê xác định mật độ. Sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ 106
CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt đĩa môi trường thạch
TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch
sau đó được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6mm.
Cao chiết Medinilla sp. được pha trong DMSO 1% ở nồng độ 100 mg/ml. Hút
100μl dịch cao chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được đục lỗ
trước đó. Đem ủ ở 370
C trong vòng 24 giờ. Đối chứng âm sử dụng DMSO 1%, đối
chứng dương sử dụng Ciprofoxacin ở nồng độ 500 µg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại
3 lần.
Quan sát: Sau 24 giờ, nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh, chứng tỏ
cao ethanol 70% có kháng chủng vi khuẩn đó. Từ kết quả kháng khuẩn đó, sử dụng
cao ethanol 70% tiếp tục làm thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định chỉ sô MIC của cao chiết
ethanol 70% từ cây Medinilla sp.
Vi sinh vật chỉ thị
Tăng sinh
Đo OD600nm
Pha loãng để đạt nồng
độ 10
6
cfu/ml
Đục lỗ thạch (d=6mm)
Nhỏ 100 μl cao pha loãng
vào các giếng
Ủ 370
C trong 24 giờ
Đổ đĩa
Môi trường TSA Cao ethanol
70%
Dịch cao nồng
độ 100mg/ml
DMSO 1%
Hút 100 µl cấy trang

49. Đồ án tốt nghiệp
36
Kết thúc thí nghiệm 2, xác định được cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn với
chủng nào và cao chiết này được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng
đối kháng. Tiến trình khảo sát chỉ số MIC được trình bày ở hình 2.8, hình 2.9 và
hình 2.10
2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
Hình 2.8. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB
(hoặc TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150
vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sóng
600nm đê xác định mật độ. Sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ 106
CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt đĩa môi trường thạch
TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch
sau đó được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6mm.
Vi sinh vật chỉ thị
Tăng sinh
Đo OD600nm
Pha loãng để đạt nồng
độ 10
6
cfu/ml
Đục lỗ thạch (d=6mm)
Nhỏ 100μl cao pha
loãng vào các giếng
Ủ 37
0
C trong 24 giờ
Đọc kết quả
Đổ đĩa
Môi trường TSA Cao ethanol 70%
Pha loãng bằng
DMSO 1% thành
dãy nhiều nồng độ
theo cấp số 2
100 µl
Cấy trang

50. Đồ án tốt nghiệp
37
Cao Medinilla sp. được pha loãng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều
nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm
thức lặp lại 3 lần
Quan sát: Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo vòng kháng. MIC được xác định là
nồng độ thấp nhất của dịch cao ethanol có sự xuất hiện vùng ức chế xung quang
miệng giếng.
2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất
chỉ thị resazurin
Hình 2.9. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên môi trường
lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin
Cao Medinilla sp. được pha loãng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều
nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm
thức lặp lại 3 lần
Ống nghiệm vô
trùng
Môi trường TSB
Ủ 370
C trong 24
giờ
Thêm resazurin
(tỷ lệ 1:10 (v/v))
Quan sát sự thay
đổi màu sắc
Cao ethanol 70%
Pha loãng bằng
DMSO 1% thành
dãy nhiều nồng
độ theo cấp số 2
Xác định MIC
Tỷ lệ 1:3 (v/v)
VSV chỉ thị
Tăng sinh
Pha loãng để đạt nồng độ
10
6
cfu/ml
Đo OD600nm

51. Đồ án tốt nghiệp
38
Vi sinh vật
Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB (hoặc
TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150 vòng/phút ở
nhiệt độ phòng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sóng 600nm đê
xác định mật độ. Sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ 106
CFU/ml.
Từ dịch tăng sinh, hút 1ml vi khuẩn vào ống nước muối sinh lý 9 ml, khi đó ta sẽ
được nồng độ pha loãng là 10-1
.Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1
hút tiếp một thể tích vi
khuẩn được tính theo công thức Mc Farland vào các ống nghiệm (chứa 3ml môi
trường TSB và 1ml dịch cao chiết ở các nồng độ). Ủ tất cả các ống nghiệm trong tủ
ấm 370
C trong 24 giờ. Đối chứng âm sử dụng ống nghiệm chứa 3ml môi trường
TSB bổ sung dịch vi khuẩn. Đối chứng dương sử dụng ống nghiệm chứa 3ml môi
trường TSB bổ sung dịch cao chiết ở các nồng độ. Sau 24 giờ, bổ sung chất chỉ thị
resazurin theo tỷ lệ 1:10 (v/v)
Quan sát: Sự thay đổi màu sắc trong ống nghiệm so với đối chứng âm. Nồng độ
thấp nhất mà tại đó sự thay đổi màu sắc từ tím sang màu hồng hoặc mất màu xảy ra
được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (Banfi và ctv, 2003)
2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán
Hình 2.10. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán
Đĩa giấy lọc (d=6mm)
Hấp tiệt trùng
Cao ethanol 70% pha
loãng bằng DMSO 1%
thành dãy nhiều nồng
độ theo cấp số 2
Môi trường TSA
Đổ đĩa
Đặt đĩa giấy
Nhỏ 10µl lên các đĩa
giấy
Ủ 370
C trong 24 giờ
Đọc kết quả
Tăng sinh
Đo OD600nm
Pha loãng để đạt
nồng độ 106
cfu/ml
Cấy trang 100µl

52. Đồ án tốt nghiệp
39
Cao Medinilla sp. được pha loãng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều
nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm
thức lặp lại 3 lần
Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB
(hoặc TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150
vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sóng
600nm đê xác định mật độ. Sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ 106
cfu/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt đĩa môi trường thạch TSA,
tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn.
Đặt đĩa giấy đã hấp tiệt trùng (d = 6mm) lên mặt thạch. Sau đó nhỏ 10 µl dịch
cao chiết theo nồng độ lên đĩa giấy. Ủ ở 370
C trong 24 giờ
Quan sát: Sau 24h, tiến hành đo đường kính vùng ức chế -> Nồng độ thấp nhất
xuất hiện vùng ức chế được xác định là giá trị MIC.

53. Đồ án tốt nghiệp
40
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol từ cây Medinilla sp.
Cao ethanol từ cây Medinilla sp. được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng
phương pháp khuếch tán qua giếng thạch với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị với nồng
độ 100 mg/ml
3.1.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli
Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của cao ethanol 70% (MEE) ở nồng độ
100 mg/ml (MEE) và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhóm vi khuẩn E. coli được
trình bày ở Hình 3.1
*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của MEE (100mg/ml) và ciprofloxacin (500µg/ml) đối
với nhóm Escherichia coli
Dựa vào hình 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng MEE ở nồng độ 100 mg/ml có
hoạt tính đối kháng với tất cả các chủng E. coli khảo sát với đường kính vùng ức
chế chế từ 12,5 mm đến 15 mm. Điều này chứng tỏ rằng, nhóm Escherchia coli
khảo sát nhạy cảm đối với MEE. Trong đó, MEE có khả năng ức chế mạnh đối với
chủng ETEC (đường kính vòng ức chế là 14,7 mm). So với kết quả kháng khuẩn
của ciprofloxacin (500 µg/ml) thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE cũng khá tương
đồng. Đối với chủng E. coli O157 :H7, E. coli, hoạt tính kháng khuẩn của MEE
a a
a
b
a
b
a
a
Đường
kính
vòng
ức
chế(mm)

54. Đồ án tốt nghiệp
41
tương đồng với ciprofloxacin (500 µg/ml) và không có sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê (P > 0,05). Đối với chủng E. coli 0208, hoạt tính kháng khuẩn của MEE
cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) khi so với ciprofloxacin (500 µg/ml).
Nhưng đối với chủng ETEC, hoạt tính kháng của MEE lại thấp hơn một cách ý
nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500 µg/ml).
3.1.2 Đối với nhóm Salmonella
Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml)
đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. được trình bày ở Hình 3.2
*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Hình 3.2. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhóm
Salmonella spp.
Dựa vào hình 3.2, chúng tôi nhận thấy rằng đối với nhóm Salmonella spp.
MEE thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 4/4 chủng khảo sát và vòng ức chế có
đường kính từ 13 mm đến 14 mm. Điều này chứng tỏ MEE có khả năng ức chế
tương đối mạnh đối với nhóm Salmonella spp.; Khi so sánh với khả năng ức chế các
chủng Salmonella spp. với ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính kháng
khuẩn của MEE có sự khác biệt về mặt thống kê. Đối với chủng S. enteritidis, hoạt
tính kháng khuẩn của MEE tương đương với ciprofloxacin (500 µg/ml) và không có
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Tuy nhiên, đối với chủng S. dublin, S.
typhi và S. typhimurium, hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa

55. Đồ án tốt nghiệp
42
thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500 µg/ml). Điều này chứng tỏ, MEE thể
hiện đặc tính kháng khuẩn mạnh và có hoạt tính tốt hơn kháng sinh đối với nhóm
Salmonella spp. ở một nồng độ khảo sát nhất định
3.1.3 Đối với nhóm Shigella spp.
Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml)
trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. được trình bày ở hình 3.3
*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Hình 3.3. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhóm
Shigella spp.
Dựa vào hình 3.3, chúng tôi nhận thấy MEE có khả năng đối kháng với tất cả
3 chủng trong nhóm Shigella spp. và đường kính vòng ức chế từ 13,7 mm đến 14,7
mm. khi so sánh với khả năng ức chế các chủng Shigella spp. với ciprofloxacin ở
nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE có sự khác biệt về mặt
thống kê. Đối với chủng Shi. flexneri và Shi. boydii, hoạt tính kháng khuẩn của
MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500
µg/ml). Một điểm đặc biệt khi tiến hành khảo sát khả năng hoạt tính kháng khuẩn
của MEE ở nồng độ 100 mg/ml và ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml đối với
Shi.boydii là chủng này có khả năng kháng lại kháng sinh nhưng lại nhạy cảm với

56. Đồ án tốt nghiệp
43
MEE. Điều đó chứng tỏ MEE là loại cao chiết có hoạt tính sinh học rất tốt và có
tiềm năng trong việc ứng dụng để xử lý các nhóm vi khuẩn kháng kháng sinh.
3.1.4 Đối với nhóm Vibrio spp.
Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (8 µg/ml)
trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. được trình bày ở hình 3.4
*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Hình 3.4. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (8 µg/ml) đối với nhóm
Vibrio spp.
Dựa vào hình 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng MEE ở nồng độ 100mg/ml có
hoạt tính đối kháng với tất cả các chủng Vibrio spp. khảo sát với đường kính vùng
ức chế từ 12,2 mm đến 14 mm. Khi so với khả năng ức chế các chủng Vibrio spp.
của ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE có sự
khác biệt về mặt thống kê. Đối với chủng V. cholerae, hoạt tính kháng khuẩn của
MEE tương đồng với ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và không có sự khác biệt
có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Trên chủng V. parahaemolyticus, hoạt tính kháng
khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin
(500 µg/ml) nhưng đối với chủng V. alginolyticus và V. harveryi thì ngược lại, hoạt
tính kháng của MEE lại thấp hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) khi so với
ciprofloxacin ở nồng độ 500µg/ml.