TANIN VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN - ThS.DS. Huỳnh Anh Duy

1. ThS.DS. Huỳnh Anh Duy
1

2. 2
A. ĐẠI CƢƠNG VỀ TANIN
I. ĐỊNH NGHĨA
II. CẤU TRÚC HOÁ HỌC
III. TÍNH CHẤT
IV. ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƢỢNG
B. CÁC DƢỢC LIỆU CHỨA TANIN
NỘI DUNG

3. ĐỊNH NGHĨA
• Những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị
chát được phát hiện dương tính với thí nghiệm
thuộc da.
• Pseudotanin: acid gallic, các chất catechin, acid
chlorogenic.
• Cơ chế thuộc da: liên kết hydro tanin và protein.
3

4. 4

5. Cơ chế thuộc da
5

6. Đun chảy tanin/kiềm
6

7. PHÂN LOẠI
Tanin
Tanin pyrogallic Thủy phân đƣợc
Tanin
pyrocatechic
Không thủy
phân đƣợc
Tanin hỗn hợp
7

8. 1. Tanin thủy phân đƣợc
Tanin
pyrogallic
Không đƣờngĐƣờng
- Glucose
- Hamamelose: đặc biệt
- Các acid
8
H+ /tanase
Cấu trúc glycosid
LK esther

9. Các acid hay gặp
Liên kết depsid
Acid gallic
Acid m-trigallic
Acid m-digallic
9

10. Acid ellargic
Acid hexahydroxydiphenic
Acid luteolicAcid chebulic
10

11. Ribose Hamamelose
(Hydroxy-methyl-D-ribose)
11

12. Các đặc trưng của tanin pyrogallic
• Pseudoglycosid
• Khi cất khô ở 180 - 200 °C sẽ thu được pyrogallol là chủ
yếu.
• Khi đun nóng với HCl (thủy phân) sẽ cho acid gallic
(gallotanin) hoặc acid ellargic (ellargitanin).
12

13. 13
pyrogallolacid gallic

15. Các phản ứng khác
• Cho tủa bông với chì acetat 10 %.
• Cho tủa màu xanh đen với muối sắt (III).
• Thường dễ tan trong nước.
15

16. Một số ví dụ
• Ngũ bội tử: Quercus spp. và Rhus spp.
Penta-O-galloyl--D-glucose
16
Nhóm galloyl

17. • Là và vỏ cây Hamamelis virginiana L.
17

18. • Ổi: Psidium guajava L.
Casuarinin Casuarictin
18

19. 2. Tanin ngƣng tụ
• Tanin không thủy phân/tanin pyrocatechic/phlobatanin.
• Ngưng tụ flavonoid: flavan-3-ol hoặc flava-3,4-diol.
Tanin
pyrocatechic
Đỏ tanin/phlobaphen
Acid / Enzym
19

21. Đặc điểm tanin pyrocatechic
• Khi cất khô thu được pyrocatechin là chính.
• Cho tủa màu xanh lá đậm với muối sắt (III).
• Cho tủa bông với nước brom.
• Khó tan trong nước hơn tanin pyrogallic.
21
OH
OH
pyrocatechin

22. Tanin pyrogallic vs tanin pyrocatechic

23. 3. Tanin hỗn hợp
• Loại này được tạo thành trong cây do sự kết
hợp giữa 2 loại tanin.
Ví dụ: tanin trong vỏ cây Quercus stenophylla, lá
ổi và lá chè.
• Chứa cả 2 loại tanin: lá Ổi, lá Bàng...
23

24. G-G=2, 2’, 3, 3’, 4, 4’-hexahydroxydiphenoyl
Stenophynin A
24

25. OHO
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
catechin
gallocatechin
O
OH*
*
Catechin = Flavan 3-ol
epicatechin
epigallocatechin
(3)
(3)

26. 26
Epigallocatechin gallate (EGCG)

27. 27
Epigallocatechin gallate (EGCG)

28. 28

29. CHIẾT XUẤT
• Tanin: không tan / DM kém phân cực.
• Tan / DM phân cực: aceton, cồn, cồn loãng
và nước.
• Tan tốt nhất là nước nóng.
• Sóng siêu âm: hỗ trợ tăng hiệu suất chiết
29

30. TÍNH CHẤT VÀ ĐỊNH TÍNH
• Tính chất:
 Vị chát, làm săn da.
 Tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin
và aceton.
 Hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ.
30

31. Định tính
2.1. Định tính hóa học
Thí nghiệm thuộc da:
- “Da sống” ngâm vào HCl 2%, rửa nước.
- Ngâm vào dung dịch thử 5’ phút.
- Rửa sạch bằng nước, nhúng Fe (III) sulfat 1%
- Da màu nâu => tanin (+)
31

32. Phản ứng kết tủa
• Gelatin muối 1%
• Phenazon
• Alkaloid
• Muối kim loại nặng
• K2Cr2O7 đậm đặc
32

33. - Tủa với gelatin muối
Dịch chiết Tủa bông
+ Gelatin 1% có NaCl 10%
Tanin (+)
Pseudotanin không cho tủa với dung dịch gelatin loãng
33
***Pseudotanin: acid gallic, catechin, acid clorogenic.

34. - Tủa với phenazon
Dịch chiết
+ phosphat acid natri
, để nguội, lọc
+ phenazon 2%
Tủa (màu)
34

35. - Tủa với alkaloid
- Tạo tủa với alkaloid, một số dẫn chất nitơ...
- Tủa với muối kim loại nặng
- Tạo tủa với muối của Pb, Hg, Zn, Fe, Cu.
- Tủa với K2Cr2O7 đậm đặc
35

36. 36
Phản ứng tạo màu
- Phản ứng với TT Folin hoặc Folin - Ciocaulteau:
Cho màu xanh => định tính & định lƣợng
Cơ chế tanin với TT Folin - Ciocaulteau

37. - Phản ứng với kali fericyanid
Dịch chiết Đỏ đậm
Amoniac
Kali fericyanid
+
37
Phản ứng tạo màu

38. Phản ứng Stiasny
• Dùng để phân biệt 2 loại tanin
Dịch tanin
Tủa vón,
đỏ gạch
Tanin
pyrocatechic
Không tủa
Tanin
pyrogallic
TT Stiasny: Formol + HCl, 
+
38

39. Phát hiện catechin tự do
HCl đậm đặc, 
- Nhuộm lignin
- HCl đậm đặc
Hồng, đỏ
Phloroglucinol
Catechin
39

40. Phát hiện catechin tự do
TT Stiasny, 
Tủa đỏ gạch
Catechin
40

41. Phát hiện acid chlorogenic
(Acid 3-trans-Caffeoylquinic)
Dịch chiết
(có acid chlorogenic)
NH4OH
Không khí
Xanh lục
41

42. 2.2. Định tính bằng sắc ký
* Sắc ký lớp mỏng
Silica gel G
Toluen - CHCl3 - aceton (40:25:35)
Cellulose
CHCl3 - acid acetic - nước (50:45:5)
Thuốc thử:
- Dung dịch FeCl3*.
- Các catechin: màu hồng với TT Vanilin - HCl.
* HPLC
* 0,5 ml dung dịch FeCl3 trộn với 20 ml ethanol 42

43. Định tính tannin bằng sắc ký lớp mỏng
43

44. Định tính tannin bằng HPLC

45. ĐỊNH LƢỢNG
• Phương pháp bột da*
• Phương pháp tạo tủa với đồng acetat.
• Phương pháp oxy hóa (PP Lowenthal)*
• Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin*
• Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteau*
• Phương pháp HPLC*
45

46. Phƣơng pháp bột da
• Cách tiến hành:
- Chiết kiệt tanin: TT Fe (III).
- Chính xác dịch chiết, bốc hơi, sấy 105 oC, cân => T1.
- Chính xác dịch chiết, thêm bột da, khuấy đều, để yên 15’.
- Lọc. Lấy chính xác dịch lọc, bốc hơi, sấy 105 oC, cân => T2.
46
Lƣợng tanin = (T1 - T2)

47. - Chính xác nước cất, thêm bột da, khuấy đều, để yên 15’.
- Lọc, lấy chính xác dịch lọc, bốc hơi, sấy 105 oC, cân =>
To
Lƣợng tanin = (T1 + To) - T2
- WHO, Quality control methods for medicinal plant materials, Geneva,
1998.
- Dược điển VN IV (phương pháp 1)
47

48. Phƣơng pháp oxy hóa (Lowenthal)
• Tanin bị KMnO4 oxy hóa/môi trường acid.
• Từ lượng KMnO4  lượng chất oxy hóa quy theo một
tanin chuẩn.
• Chỉ thị: Sulfo indigo (Xanh dương - Vàng)
48
KMnO4
Tanin + Chất chỉ thị

49. Phương pháp oxy hóa (Lowenthal)
• Cách tiến hành
- Chiết kiệt tanin
- Chuẩn độ với KMnO4, chỉ thị màu là sulfo indigo.
- Định lượng dung dịch chuyển sang vàng.
1 ml KMnO4 tương ứng với 4,157 mg tanin.
49

50. Phương pháp tạo tủa với Cu acetat
• Cách tiến hành
- Chiết tanin bằng cồn 60%.
- Thêm Cu acetat 15%, được  Cu tannat.
- Lọc tủa, sấy, cân.
- Nung tủa được Cu oxyd
- Lấy hiệu số giữa đồng tanat và đồng oxyd rồi qui về
phần trăm.
50

51. Phương pháp tạo tủa với Cu acetat
• Kết hợp
- Chiết tanin trong dược liệu bằng nước, nếu có pectin thì tủa
bằng cồn,
- Thêm một lượng chính xác dung dịch Cu acetat. Lọc tủa đồng
tanat.
- Dịch lọc được thêm H2SO4 10% và KI. Acetat đồng thừa sẽ
tác dụng lên KI trong môi trường acid để giải phóng Iod.
2Cu(CH3COO)2 + 4 KI  4KCH3COO + Cu2I2 + I2
51

52. Phương pháp tạo tủa với Cu acetat
o Chuẩn độ iod bằng Natri thiosulfat, công thức sau:
E = D - C trong đó C = (A–B) x 1,2517
o E là lượng tanin trong dung dịch đem định lượng.
o D là lượng đồng tanat xác định bằng phương pháp cân.
o C là lượng đồng oxyd kết hợp với tanin.
o A là lượng đồng cho vào dung dịch lúc ban đầu.
o B là lượng đồng thừa trong dung dịch sau khi lọc loại đồng tanat
xác định bằng phương pháp đo Iod.
o (1ml natrithiosulfat 0,1N ứng với 0,00635g đồng)
o 1,2517 là hệ số CuO/Cu
52

53. Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteu
• TT Phosphomolybdostungtic / TT Folin - Denis
• Cách tiến hành
- Dịch chiết nước + TT Phosphomolybdostungtic/kiềm  Màu xanh.
- Đo A ở 755 - 760 nm.
- Tiến hành 2 mẫu:
+ Mẫu 1: dịch chiết đã loại tanin  Polyphenol không phải tanin
+ Mẫu 2: Không loại tanin  Polyphenol toàn phần.
- Sự chênh lệch hai độ hấp thu là lượng tanin trong mẫu.
53

54. Phương pháp đo màu với TT Folin - Ciocalteu
• TT dùng để loại tanin: bột da, casein, polyvinyl
polypyrrolidon (PVPP).
• Tanin chuẩn: acid tannic. Xây dựng đường chuẩn
• Tính toán kết quả: %tanin/dược liệu
54

55. Acid tannic

56. • Bột dược liệu (0.75 g) được chiết xuất với nước nóng ở 70 °C
trong 15 phút.
• Để nguội và lọc, dịch chiết được cho vào bình định mức 100
mL, bổ sung đến vạch bằng methanol 30%.
• Dung dịch 1: Trộn 2 mL dịch chiết trên với 8 mL nước cất và
10 mL đệm natri acetat (pH = 5).
• Dung dịch 2: thu được bằng cách lắc 10 mL dung dịch 1 với
50 mg casein trong 1 giờ, lọc.
56

57. • Mẫu 1: Cho 1 mL dung dịch 1, thêm 0,5 mL thuốc thử Folin-
Ciocalteu, thêm tiếp Na2CO3 33% vừa đủ 10 mL.
• Mẫu 2: Cho 1 mL dung dịch 2, thêm 0,5 mL thuốc thử Folin-
Ciocalteu, thêm tiếp Na2CO3 33% vừa đủ 10 mL.
• Mẫu trắng: nước cất.
• Độ hấp thu được đo ở 720 nm.
57

58. • Độ hấp thu A1 từ mẫu 1.
• Độ hấp thu A2 từ mẫu 2.
• Độ hấp thu A được đo 3 lần, lấy kết quả trung bình.
• Độ chênh lệch độ hấp thu:
A = (A1 - A2) tương ứng với hàm lượng tannin trong mẫu.
• Chất chuẩn: acid tannic (khoảng nồng độ 10–60 μg/mL).
58

59. Phương trình hồi quy:
y = 19,346x + 0,0185
Trong đó:
- x: nồng độ (C)
- y: Độ hấp thu (A)
Lấy A thế vào phƣơng trình hồi quy:
=> C của mẫu thử quy về acid tannic

60. Phƣơng pháp đo màu với TT Folin
• TT acid phospho wolframic
• Cách tiến hành
- Dịch chiết nước + TT Folin/Na bicarbonat  Màu xanh.
- Đo A, 715 nm, 2 phút.
- Tiến hành 2 mẫu:
+ Mẫu 1: dịch chiết đã loại tanin bằng bột da + TT Folin
+ Mẫu 2: Không loại tanin
- Lấy hiệu mật độ quang của 2 mẫu trên.
- Tiến hành song song mẫu chuẩn là pyrogallol.
60

61. Chuẩn bị dịch chiết:
• Lấy 0,75 g dược liệu (m), thêm 150 mL nước cất.
• Đun nóng trong 15 phút. Để nguội, lọc. Cho dịch lọc vào
bình định mức 250 mL, bổ sung nước tới vạch.
• Lọc tiếp, loại bỏ 50 mL dịch lọc đầu tiên.
• 200 mL còn lại được sử dụng cho thử nghiệm (G).
61

62. Mẫu trắng: nước cất.
Mẫu chuẩn: pyrogallol.
Mẫu 1: Polyphenol toàn phần
• Lấy 5 mL dịch lọc (G) trên, bổ sung nước vừa đủ thành 25 mL.
• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TT
Folin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%.
• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm
• Được giá trị A1.
62

63. Mẫu 2:
• Lấy 20 mL dịch lọc (G) thêm 0.2 g bột da. Lắc kỹ 60 phút, lọc.
• Lấy 5 mL dịch lọc bổ sung vừa đủ thành 25 mL bằng nước cất.
• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TT
Folin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%.
• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm
• Được giá trị A2.
63

64. Tính toán:
• 50 mg pyrogallol pha trong nước cất thành 100 mL dung dịch.
• Tiếp tục, lấy 5 mL pha thành 25 mL bằng nước cất.
• Lấy 5 mL vừa pha, thêm 2 mL acid phosphowolframic (TT
Folin), bổ sung vừa đủ 50 mL bằng dung dịch Na2CO3 15%.
• Sau 3 phút, đo độ hấp thu A ở 715 nm, được A3.
• Hàm lượng tannin được tính theo công thức:
64
m: khối lƣợng dƣợc liệu
.mA
)A13,12.(A
%tannin
3
21 


65. Phương pháp HPLC
• Pha tĩnh: RP-18, đôi khi rây phân tử (Sephadex).
• Pha động: Hỗn hợp nước, MeOH, ACN.
• Chất điều chỉnh pH: acid phosphoric, NH4H2PO4, acid
trifluoroacetic (TFA).
• Detector: UV.
• Riêng lẻ hay đồng thời.
65

66. 66
- Cột sắc ký: RP-18 (SunFire,Waters, USA) (150 mm x 4,6mm, 5 m)
- Đầu dò: PAD
- Hệ dung môi: acetonitril - TFA 0,05% trong nước (pH 2.25).
- Kiểu rửa giải: gradient
- Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút,
- Thể tích tiêm mẫu: 20 L.
- Nhiệt độ cột: 25 oC.
- Bước sóng: 272 nm

69. A – acid tannic
B – procyanidin B2
C – acid gallic

70. TÁC DỤNG - CÔNG DỤNG
• Đối với thực vật:
- Chất bảo vệ: khỏi nấm mốc, côn trùng...
- Tham gia trao đổi chất, oxy hóa khử.
70

71. Đối với con người
• Thuốc săn da.
• Kháng khuẩn
• Viêm ruột, tiêu chảy.
• Chữa ngộ độc (kim loại nặng và alkaloid)
• Tác dụng đông máu
71

72. • Các ellagitanin có tính kháng ung thư: gemin A,
agrimoniin, rugosin D kháng Sarcoma 180 / chuột.
• Chống oxy hóa
• Trong công nghiệp: thuộc da.
72

73. DƢỢC LIỆU CHỨA TANIN
• Ngũ bội tử
• Ổi
• Măng cụt
• Lá Bàng
• Chiêu liêu, Chè, Sim...
73

74. Ngũ bội tử
• Tổ đã phơi hay sấy khô của ấu trùng sâu Ngũ bội tử
(Melaphis chinensis (Bell.) Baker = Schlechtendalia
chinensis Bell.) ký sinh trên cây Muối/cây Diêm phu
mộc (Rhus chinensis Muell.), họ Đào lộn hột
(Anacardiaceae)
• Tên khoa học: Galla sinensis
74

75. • Thành phần hóa học
- TP chính: tanin pyrogallic.
- Còn có acid gallic, acid ellargic.
- Tanin là pentagalloyl--D-glucose
75

76. 76

77. • Tác dụng, công dụng
- Kháng HIV
- Ức chế peroxid hóa / chuột.
- Viêm ruột, nhiễm trùng da...
77

78. Ổi
• Tên khoa học: Psidium guajava L., Myrtaceae.
78

79. 79

80. • Thành phần hóa học:
- 10% tanin: Búp và lá
- Cả 3 loại tanin:
 Thủy phân được.
 Không thủy phân.
 Hỗn hợp.
80

81. • Thủy phân được: gallotanin, ellargitanin
gallotanin
81

82. • Không thủy phân: procyanidin-B1, prodelphinidin-B1
procyanidin-B1 prodelphinidin-B1
82

83. • Tanin hỗn hợp: acutissimin A, B; guajavin A & B.
acutissimin A Acutissimin B
83

84. - Catechin, gallocatechin, leucocyanidin.
- Flavonoid: quercetin, avicularin, guajaverin...
84

85. gallocatechin
leucocyanidin
quercetin avicularin
guajaverin
85

86. Công dụng
• Kháng khuẩn mạnh.
• Kháng các dòng tế bào ung thư.
• Chữa lỵ, tiêu chảy.
86

87. Măng cụt
• Tên khoa học: Garcinia mangostana L., Clusiaceae
87

88. • Thành phần hóa học
- Vỏ chứa tanin 8%: Procyanidin A-2, B-2.
- Xanthon: dẫn chất isoprenyl hóa, vd: -mangostin.
88

89. Procyanidin A-2 Procyanidin B-2
89

90. Công dụng
• Kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm.
• Chữa lỵ, tiêu chảy.
90

91. Terminalia nigrovenulosa Kiene Terminalia catappa L.
Rhodomyrtus tomentosa Wight. Camellia sinensis (L.) Kuntze 91

92. 92