CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

1. Chương 5:
CÁC PHƯƠNG PHÁP
KIỂM NGHIỆM VI SINH
THỰC PHẨM

2. Chuẩn bị mẫu
• Thu mẫu ngẫu nhiên, tại nhiều vị trí để có tính
đại diện
• Mẫu chứa trong bình nhựa hay bao nilon
• Bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển
• Bảo quản -200C cho đến khi phân tích hoặc 0-
40C trong vòng 36h
• Giải đông ở 2-50C trong 18h hoặc 450C trong
15 phút
• Đồng nhất mẫu trước khi phân tích

3. • Phương pháp MPN (most probable
number): phương pháp định lượng theo số
lượng VSV có xác xuất cao nhất dựa vào kết
quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp
lại ở một số độ pha loãng khác nhau

4. Các loại môi trường nuôi cấy VSV
• Về bản chất của thành phần môi trường:
- Môi trường tự nhiên
- Môi trường tổng hợp
- Môi trường bán tổng hợp
Mt tổng hợp hoặc bán tổng hợp dưới dạng
đông khô thương phẩm của các hãng MERCK,
OXOID,DIFCO, BBL, HIGH-MEDIA

5. • Về tính chất vật lý:
- Môi trường lỏng
- Môi trường rắn
- Môi trường bán rắn (xốp)
• Về công dụng:
- Môi trường tiền tăng sinh
- Môi trường tăng sinh
- Môi trường chọn lọc
- Môi trường thử nghiệm sinh hóa

6. QUI TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ
TIÊU VI SINH VẬT

7. 1. TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
• Chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh
giá chất lượng của mẫu về VSV, nguy cơ hư
hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm.
• Xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
• Biểu diễn bằng đơn vị CFU/g hay CFU/ml

8. Mẫu
Cấy mẫu bằng pp hộp đổvới 10-15ml
mt Plate Count Agar
Đếm khuẩn lạc
Đồng nhất mẫu
Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân
Dung dịch nước muối pepton
Lắc đều, ít nhất 2 phút
Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml
mẫu vào các đĩa petri vô trùng ( mỗi nồng độ 2 đĩa)
Ủ 300C, 72h
QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

9. Cách tính kết quả
• Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250
• Mật độ VK trong 1g hay 1ml mẫu:
N
n1Vf1 + …+ niVfi
A: số tế bào VK trong 1g hay 1ml mẫu
N: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ I
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng
A =

10. • Mt nước muối pepton (SPW)
- 8,5g NaCl
- 1g pepton
- Nước cất cho đủ 100ml

11. 2. COLIFORMS VÀ E.COLI
• Coliforms là nhóm VK Gram âm, hiếu khí
hoặc kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, lên men
lactose sinh hơi trong 24- 48h ở 350C
• Nhóm Coliforms bao gồm 4 giống là
Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae và Citrobacter

12. • Coliforms chịu nhiệt là những coliforms có khả năng lên
men sinh hơi khi ủ 440C trong mt EC (E.coli medium)
• Coliforms phân là những coliform chịu nhiệt có khả năng
sinh Indol trong mt trypton
• E.coli là coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC
(++--)
• Nhóm Coliform sinh hơi khi nuôi trong mt canh thang
lactose mật bò BGBL (Brilliant Green Bile Broth Lactose)
và LSB ( Lauryl Sulphate Broth)
• Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, MPN (Most
Probable Number)

13. • Thử nghiệm Indol:
- Vi khuẩn được cấy vào trong môi trường canh thang
tryptophan, để ở 35° - 37°C trong 18 – 24h.
- Nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử Kovac vào trong ống nghiệm.
Quan sát kết quả. Phản ứng (+) sẽ xuất hiện vòng màu đỏ
phía trên dung dịch nuôi cấy
• Cơ sở khoa học:
Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy
phân acid amin tryptophan sinh indol, acid pyruvic và
NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm (CHO) của p –
dimetthylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac
hình thành nên phức hợp màu đỏ.

14. • Thử nghiệm MR (Methyl-Red)
- Kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo
ra từ quá trình lên men glucose của vi sinh vật
- Thực hiện: Nuôi VSV trên canh thang (broth)
MR-VP, thêm 5 giọt dung dịch đỏ methyl 0,2%
(chỉ thị pH), phản ứng (+) khi mt có màu đỏ

15. • Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer):
- Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol
(acetoin) trong quá trình lên men glucose của
một số vi sinh vật.
- Thực hiện: nuôi VSV trên MR-VP Broth, nhỏ
6 giọt dung dịch a-napthol 5%, 2 giọt KOH
40%. Phản ứng (+) khi có màu đỏ xuất hiện
sau 15-20 phút

16. • Thử nghiệm citrate:
- Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy
nhất trong quá trình biến dưỡng của vi sinh vật.
- Môi trường (Simmons citrate) có chứa muối ammonium vô
cơ. Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn
Carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium
làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm.
Trong mt có Bromthymol blue – chất chỉ thị pH, chuyển từ
xanh lục sang xanh dương khi mt kiềm.
- Thực hiện: nuôi VSV trên mt Simmons citrate, ủ 24h, phản
ứng (+) khi mt chuyển từ màu xanh lục sang xanh dương.

17. Qui trình định lượng Coliforms, coliforms chịu nhiệt,
coliforms phân và E.coli bằng pp MPN
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu
để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml
canh LSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 48h
Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng
Cấy vào ống canh BGBL
ủ 37 + 10C, 48h
Cấy vào ống canh EC
ủ 44,5 + 0,20C, 24h
Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Coliforms Coliforms chịu nhiệt

18. Cấy lên thạch EMB, ủ 370C, 24h
Chọn khuẩn lạc điển hình
(tròn, dẹt hình đĩa, có ánh kim
tím), cấy vào canh Trypton,
ủ 44,5 + 0,20C, 24h
Chọn khuẩn lạc điển hình (tròn, dẹt
hình đĩa, có ánh kim tím), cấy vào
canh Trypton, MR- VP, SC Citrate ủ
44,5 + 0,20C, 24h
Thử nghiệm Indol Thử nghiệm IMViC
Đếm số ống canh EC(+) và
Indol (+), tra bảng MPN
Đếm số ống canh EC(+) và
IMViC (++--), tra bảng MPN
Coliforms phân E.coli
Eosin Methylene Blue Agar: phân biệt có
lên men lactose hay không? Sinh acid phản
ứng thuốc nhuộm tạo màu ánh kim tím

21. • Mt LSB
- Trypton: 20g
- Lactose: 5g
- KH2PO4: 2,75g
- K2HPO4: 2,75g
- NaCl:5g
- Sodium lauryl sulfate:0,1g
- Nước cất: 1 lít
pH cuối 6,8 + 0,2. Phân phối vào các ống nghiệm
có ống Durham

22. • Mt BGBL
- Peptone: 10g
- Lactose: 10g
- Mật bò: 20g
- Brilliant green: 0,0133g
- Nước cất: 1 lít
Hòa tan từng loại rồi trộn chung.
pH cuối 7,2 + 0,2. Phân phối vào các nghiệm chứa
ống Durham.

23. • Mt EC
- Trypton: 20g
- Muối mật: 1,5g
- Lactose: 5g
- KH2PO4: 1,5g
- K2HPO4:4g
- NaCl: 5g
- Nước cất: 1 lít
pH cuối 6,9 + 0,2. Rót vào các ống nghiệm có chứa
ống Durham.

24. • Mt canh Trypton
- Trypton :10g
- Nước cất: 1 lít
pH 6,9 + 0,2

25. Qui trình định lượng Coliforms, coliforms phân và E.coli
bằng pp đếm khuẩn lạc
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu
để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Rót 10-15ml mt thạch VRB, để đông ủ 370C, 24- 48h
Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa
muối mật, dk > 0,5mm, chọn 5 khuẩn lạc
Cấy vào ống canh BGBL
ủ 370C, 24- 48h
Cấy vào ống canh EC
ủ 440C, 24-48h
Đếm số ống canh (+) (sinh hơi),
tính mật độ Coliforms
Chọn ống canh (+)( sinh hơi)
Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đỉa petri bổ sung
5ml mt TSA, lắc đều, để yên 1-2h
Violet Red Bile
Tryptone casein soy agar

26. Thử nghiệm Indol Thử nghiệm IMViC
Đếm số ống canh EC(+) và
Indol (+)
Đếm số ống canh EC(+) và
IMViC (++--), tra bảng MPN
Coliforms phân E.coli

27. • Mt TSA (Tryptic Soy Agar)
- Trypticase pepton: 15g
- Phytone pepton: 5g
- NaCl:5g
- Agar: 15g
- Nước cất:1 lít
pH 7,3 + 0,2

28. • Mt VRB (Violet Red Bile Agar)
- Cao nấm men: 3g
- Pepton: 7g
- NaCl: 5g
- Muối mật: 1,5g
- Lactose: 10g
- Neutral red:0,03g
- Crystal violet: 0,002g
- Agar: 15g
- Nước cất: 1 lít
pH 7,4 + 0,2

29. 3. Staphylococcus aureus
• VK hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, hình cầu, Gram
dương, có thử nghiệm coagulase, có khả năng
lên men và sinh acid từ mannitol, sucrose.
• Sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin bền
nhiệt, không bị phân hủy 1000C trong 30 phút.
• Gây triệu chứng nôn mữa, tiêu chảy kéo dài

30. Qui trình định lượng Staphylococcus aureus
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu
để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2,
10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi
nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 48h
Chọn ống (+) (mt chuyển từ đỏ sang
vàng) ở mỗi độ pha loãng
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 370C, 48h
Trải lên đĩa thạch BPA, ủ 370C, 24- 48h,
trải lên đĩa thạch máu, ủ 370C, 24h
Chọn khuẩn lạc đặc trưng (lồi, đen
bóng có vòng sáng rộng bao quanh)
Đếm số khuẩn
lạc đặc trưng
Đếm số khuẩn lạc
không đặc trưng

31. Cấy vào TSA,
ủ 37 + 10C, 24h
Lấy 5 khuẩn lạc đặc
trưng cấy vào TSA,
ủ 37 + 10C, 24h
Thử nghiệm ngưng kết
coagulase
Tỉ lệ khuẩn lạc đặc
trưng, coagulase (+)
Mật độ S.aureus
(MPN/g hoặc MPN/ml)
Mật độ S.aureus (CFU/g hoặc
CFU/ml)
Ghi nhận số coagulase(+) ở
mỗi nồng độ pha loãng
Tra bảng MPN
Lấy 5 khuẩn lạc không
đặc trưng cấy vào TSA,
ủ 37 + 10C, 24h
Thử nghiệm ngưng kết coagulase
Tỉ lệ khuẩn lạc không
đặc trưng, coagulase (+)

32. • Thử nghiệm coagulase: VSV tiết ra enzym
coagulase làm kết tụ các thành phần huyết
tương tạo thành các khối đông làm đông huyết
tương
- Huyết tương người hay dạng đông khô thương
phẩm hoặc tự điều chế bằng cách ly tâm máu
chứa chất chống đông (citrate) để thu huyết
tương
- Cho vào ống nghiệm 0,5ml huyết tương, bổ
sung 0,5ml dịch nuôi cấy chủng thuần. Trộn
đều, ủ 370C. Kết quả (+) khi có xuất hiện khối
kết tụ

33. • Mt MSB (Mannitol Salt Broth)
- Cao thịt: 1g
- Polypeptone:10g
- NaCl:75g
- Mannitol: 10g
- Phenol red: 0,025g
- Nước cất: 1 lít
pH: 7,4 + 0,2

34. • Mt Baird- Parker (BPA), pH:7,0
- Trypton:10g
- Cao thịt: 5g
- Cao nấm men: 1g
- Sodium pyruvate: 10g
- Glycine: 12g
- Lithium chloride.6H2O: 5g
- Agar: 20g
Đem hấp vô trùng. Bảo quản tủ lạnh dùng trong 1
tháng. Trước khi sử dụng, đun nóng chảy, thêm
5ml Bacto EY tellurite enrichment ấm vào 95ml
mt trên. Đổ đĩa, sử dụng.

35. 4. Streptococcus phân
• Liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân, Gram
dương, không di động không sinh bào tử, sống
hiếu khí tùy ý nhưng tốt nhất trong đk kỵ khí.
• Chỉ thị chất lượng vệ sinh thực phẩm

36. Qui trình định lượng Streptococcus phân
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha
loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3
vào ống 5ml canh Azide Glucose, mỗi
nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 48h
Trải lên mt Enterococcus Agar, ủ
440C, 48h
Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào
TSA, ủ 370C, 24h
Mật độ Streptococcus phân
(CFU/g hay CFU/ml)
Khẳng định (+):
BHI chịu muối 6,5% (+), chịu pH 9,6
(+), catalase (-), oxidase (-)
Ria các ống (+) lên thạch Bile Esculin,
ủ 44 + 0,50C trong 48h
Khuẩn lạc đặc trưng ( nâu đen)
Đếm khuẩn lạc đặc trưng (màu hồng
đến đỏ đậm, có thể có vòng trong suốt
bao quanh khuẩn lạc)
Thử nghiệm catalase (-)
Số ống nghiệm (+) cho mỗi độ pha
loãng: AG (+), BE (+), Catalase (-)
Mật độ Streptococcus phân
(MNP/g hay MNP/ml)

37. • Thử nghiệm catalase:
Trên phiến kính hoặc nhỏ trực tiếp H2O2 30% trực
tiếp lên sinh khối VSV. Ghi nhận (+) nếu có bọt
khí sủi quanh sinh khối
• Thử nghiệm oxidase
Giấy lọc nhúng dung dịch 1% tetramethyl –p-
phenylenediamin dihydrochloride hoặc oxalate.
Dùng que cấy lấy sinh khối dàn đều lên miếng giấy
lọc tại vị trí có thuốc thử, ghi nhận sự xuất hiện
màu xanh dương

38. • Mt BHI (Brain Heart Infusion)
- Dịch não dê: 200g
- Dịch tim bò: 250g
- Polypepton: 10g
- NaCl: 5g
- Na2HPO4:2,5g
- Dextrose: 2g
- Nước cất:1 lít

39. • Mt Bile Esculin agar
- Cao thịt:3g
- Pepton: 5g
- Esculine:1g
- Oxgall:40g
- Fe citrate:0,5g
- Agar:15g
- Nước cất: 1 lít
pH: 6,6 + 0,2

40. • Mt Azide Glucose
- Trypton : 20g
- Dextrose: 5g
- K2HPO4: 4g
- KH2PO4: 1,5g
- NaCl: 5g
- Sodium azide: 0,5g
- Bromocresol purple:0,032g
- Nước cất: 1 lít
pH: 6,9 + 0,2

41. 4. Salmonella
• Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý,
có khả năng di động, không tạo bào tử, lên
men glucose và mannitol sinh acid nhưng
không lên men saccharose và lactose, không
sinh Indol, không phân giải ure, hầu hết đều
sinh H2S.
• Gây ngộ độc thực phẩm với các triệu chứng
tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn

42. Qui trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mt tăng
sinh (BPW), ủ 370C, 18-24h
Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang mt tăng
sinh chọn lọc (RV), ủ 420C, 18-24h
Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang BHI
hay TSA, ủ qua đêm
Kết luận Salmonella (+) hay (-)
trong 25 g mẫu
Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không.
Urease (-), Indol (-), VP(-), Manitol (+), Sorbitol (+)
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mt chọn
lọc phân biệt (XLD,BS), ủ 370C, 24h
Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh: Poly: O, Poly: H

43. • Trên mt XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong
suốt, có hay không có tâm đen
• Trên mt BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu
đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi
trường chung quanh khuẩn lạc chuyển thành
màu nâu và sau đó thành đen nếu kéo dài thời
gian ủ

44. • Thử nghiệm KIA/TSI
- KIA chứa 2 loại đường glucose và lactose
- TSI chứa 2 loại đường trên cùng với sucrose
+ chỉ sử dụng glucose: mt đỏ bề mặt, vàng phần sâu
+ dùng hết các đường: mt vàng toàn bộ
+ không sử dụng: đỏ trên bề mặt, phần sâu không đổi màu
• Thử nghiệm H2S
- Sử dụng chính loại mt trên do trong thành phần có sodium
thiosulphate
- VSV khử sulphate sinh H2S kết hợp ion Fe2+ của chỉ thị ferric
ammonium citrate tạo kết tủa đen FeS

45. • Thử nghiệm urease:
Mt urea lỏng chứa chỉ thị đỏ phenol. Dùng que
cấy lấy khuẩn lạc chủng thuần cho vào ống
nghiệm chứa 3ml mt. Ủ 370C, 48h. Thử
nghiệm (+) khi mt trở thành màu đỏ tím và (-)
khi mt giữa màu vàng cam
• Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh
(thực hiện song song chứng âm để loại ngưng
kết giả). Phản ứng (+) khi tạo ngưng kết với
kháng huyết thanh Poly O và Poly H

46. 4. Shigella
• Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy
ý,cho thử nghiệm catalase (+), oxidase (-), lên
men glucose không sinh hơi, không lên men và
sinh acid từ lactose, không sinh H2S.
• Tác nhân gây bệnh lỵ. Biểu hiện bệnh lý từ
nhẹ tiêu chảy đến mức nặng đi tiêu ra máu,
mất nước, sốt cao, bị co rút thành bụng.

47. Qui trình phát hiện Shigella trong thực phẩm
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml mt tăng
sinh (TSB), pH 7,2, ủ 370C, 16-20h
Cấy 0,1ml dịch tăng sinh sang 10ml mt
tăng sinh chọn lọc (GN), ủ 370C, 16-20h
Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang BHI
hay TSA, ủ qua đêm 370C
Kết luận Shigella (+) hay (-)
trong 25 g mẫu
Thử nghiệm sinh hóa: Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (-), sinh hơi(-)
Không di động trong thạch mềm, Oxydase (-)
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mt
chọn lọc phân biệt (HE,DC), ủ 370, 24h
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định

48. • Trên mt thạch HE: khuẩn lạc Shigella có màu xanh
nhạt, trong suốt
• Trên mt thạch DC: khuẩn lạc Shigella có màu đỏ nhạt
• Thử nghiệm sinh hóa khẳng định
- Urease (-)
- MR (+)
- VP (-)
- Thử nghiệm kháng huyết thanh dương tính : A,B,C,D

49. 4. Vibrio
• Phẩy khuẩn, Gram âm, di động, sống kỵ khí
tùy ý, catalase và oxidase (+), lên men glucose
nhưng không sinh hơi, không sinh H2S,
• Tác nhân gây bệnh tả do tạo độc tố tả là
chlorae-toxin, có độ tính mạnh, chỉ cần 5µg có
thể gây tiêu chảy ở người trưởng thành.
• Triệu chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng,
viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy.

50. Qui trình phát hiện và định danh Vibrio trong thực phẩm
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml APW hoặc Colistine
Ủ canh khuẩn ở 370C
Chọn khuẩn lạc đặc trưng (V.parahaemolyticus :xanh; V.cholerae:
vàng), ria trên TSA chứa 1% NaCl hay BHI , ủ qua đêm 370C
Kết luận: V.parahaemolyticus hay V.cholerae
Thử nghiệm sơ bộ: Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (-), sinh hơi(-), di
động trong thạch mềm, Oxydase (+), Gram (-)
Ủ 370, 24h
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định
Phân lập trên TCBS
Sau 16-24h
Phân lập trên TCBS
Sau 6-8h

51. • Mt TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Salt- Sucrose)
- Cao nấm men: 5g
- Sucrose: 20g
- Sodium thiosulfate.75H2O:10g
- Sodium citrate.72H2O:10g
- Sodium cholate:3g
- Oxgall: 5g
- NaCl:10g
- Ferric citrate:1g
- Bromothymol blue: 0,04g
- Thymol blue: 0,04g
- Agar: 15g
- Nước cất: 1 lít
Để vừa sôi nhấc ra, không hấp khử trùng

52. Qui trình định lượng Clostridium
Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy thập phân, xử lý mẫu
800C, 15-20 phút
Cấy 1ml vào ống nghiệm vô trùng. Đổ
10-15ml ISA 450C, lắc đều
Cấy 1ml vào đĩa petri, đổ 10-15ml mt
ISA, 450C, lắc đều
Ủ trong bình kín, ủ 370C, 24-48h
Tính kết quả
Đếm tất cả khuẩn lạc có màu đen,
đường kính > 0,5mm
Đổ lớp ISA thứ 2 cao 1-2cm sau khi
phần dưới đông đặc
Đổ lớp ISA thứ 2 khi lớp thứ 1 đã
đông đặc
Ủ 370C, 24-48h
Đếm tất cả khuẩn lạc màu đen xuất hiện
trong ống
Tính kết quả

53. Qui trình định tính nấm mốc
Đống nhất mẫu trong SDB thành độ pha
loãng 10-1, ủ 300C, 1-7 ngày
Cấy canh trường có nấm mốc mọc lên đĩa
SDA, MEA hay PDA, ủ 300C trong 7 ngày
Kết luận có hay không có nấm mốc

54. • Mt SDB (Sabouraud’s Dexrotrose Broth)
- Polypepton: 10g
- Dextrose: 40g
- Nước cất: 1 lít
• Mt PDA (Potato Dextrose Agar)
- Khoai tây: 200g
- Dextrose: 20g
- Agar: 15-20g
- Nước cất: 1 lít
• Mt MEA (Malt Extract Agar)
- Cao malt: 30g
- Agar: 15-20g
- Nước cất: 1 lít

55. Qui trình định lượng tống số nấm men nấm mốc
Đồng nhất và pha loãng mẫu thành các
độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Đếm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc,
tính mật độ (CFU/g)
Định danh
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc
DG18, ủ ngửa đĩa ở 250C, 5-7 ngày
Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ 300C,
7 ngày

56. • Mt DG 18 (Dichloran 18% glycerol)
- Glucose: 10g
- Pepton: 5g
- KH2PO4: 1g
- MgSO4: 0,5g
- Dichloran (0,2% trong etanol): 1ml
- Glycerol: 220 ml
- Agar: 15g
- Choramphenicol: 0,1g
- Nước cất: 1 lít

57. Các phương pháp hiện đại
• Phương pháp phát quang ATP
• Phương pháp ELISA
• Phương pháp lai phân tử
• Phương pháp PCR

58. Phương pháp phát quang sinh học ATP
trong giám sát vệ sinh
• ATP là dấu hiệu nhận biết sự tồn tại của vật
chất sống
• Có thể phát hiện nhanh ATP bởi lượng ánh
sáng phát ra khi ATP kết hợp với enzym
luciferase
E + LH2 + ATP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + PPi
(E: Luciferase, LH2:luciferin)

59. • Oxyluciferin phát ra ánh sáng vàng xanh và
được ghi nhận trị số ánh sáng phát ra bằng một
máy đo ánh sáng
• ATP của eukaryote được tách chiết bởi các
chất tẩy không ion như Triton X-100. ATP này
được tách ra trước và bị thủy phân bởi ATPase
được bổ sung vào. Sau đó mới trích ly ATP từ
VSV bằng trichloacetic acid 5%.

60. Quệt trên bề mặt
kiểm tra
Thực hiện phản
ứng
Đọc kết quả trên
máy đo sáng
Qui trình phát hiện VSV bề mặt bằng
dụng cụ Clean-Track

61. Phương pháp ELISA
(Enzyme- Linked ImunoSorbent Assay)
• Phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp
giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng
thể đặc hiệu.
• Tín hiệu của phản ứng miễn dịch được nhận
biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của
kháng nguyên- kháng thể hoặc bằng cách sử
dụng các kháng thể đã đánh dấu bằng chất
nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ
hay enzym)

62. Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzym
(ELISA) sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài
các đĩa giếng. Khi có kháng nguyên mục tiêu trong
mẫu, nó sẽ gắn kết với kháng thể đã có trong giếng.
Sau đó phức hợp này được phát hiện bằng cách sử
dụng kháng thể thứ cấp có gắn enzym horseradish
peroxidase hay alkaline phosphatase. Khi bổ sung cơ
chất đặc hiệu của enzym vào giếng, enzym xúc tác
phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có
màu hay phát sáng. Từ đó định lượng kháng nguyên

64. Phương pháp lai phân tử
• Dựa trên phản ứng bắt cặp giữa một mẫu dò
(oligonucleotit) với DNA/RNA mục tiêu trong
mẫu. Mẫu dò luôn được đánh dấu bằng chất
phát huỳnh quang để có thể được nhận biết khi
có phản ứng bắt cặp xảy ra.

65. • Trình tự:
- Phá vỡ tế bào thu nhận DNA hoặc RNA
- Mẫu dò có gắn đuôi oligodeoxyadenylic nucleotide
(dA) và mẫu dò phát hiện chứa fluorescein
isothiocyanate (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử được
đặt vào phản ứng.
- Que thử được bao bọc với polydeoxythymidine
(dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò
- Que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát
hiện được đánh dấu bằng enzym
- Sau khi rửa loại phần enzym thừa, que thử được đặt
vào ống đo chứa cơ chất tạo màu
- Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước
sóng 450nm

66. Phương pháp PCR
• Khuyếch đại 1 trình tự DNA nhờ mồi
chuyên biệt và nhận biết sản phẩm
khuyếch đại bằng điện di sau khi nhuộm
với ethidium bromide