SlideShare a Scribd company logo

Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra

•
•
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ ngành vi sinh vật học với đề tài: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein, cho các bạn tham khảo

Education
1 of 117
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Út Lợt NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU CALCIUM VÀ PROTEIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Út Lợt NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU CALCIUM VÀ PROTEIN Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2012
LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Chiến Phương, người đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Và thầy cũng là người giúp tôi gắn kết được khoa học với thực tế. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Khoa Sinh học Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi. Tôi xin giử lời cảm ơn đến các anh chị của phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học - Viện sinh học nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa, khoa Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bà Bùi Thị Truyền, giám đốc Công ty trách nhiệm chế biến thủy sản Minh Quý - cụm công nghiệp Tân Mỹ Chánh - TP. Mỹ Tho - tỉnh Tiền Giang đã cung cấp nguyên liệu cho tôi thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và động nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi.
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Các tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác thực. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Út Lợt
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................i LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... ii MỤC LỤC.................................................................................................................... iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH.......................................................................................... vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...........................................................................................x DANH MỤC CÁC BẢNG ...........................................................................................xi MỞ ĐẦU ........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3 1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu.................................................................3 1.1.1 Vi khuẩn Bacillus..........................................................................................3 1.1.2 Vi khuẩn lactic..............................................................................................7 1.2. Giới thiệu về cá tra...........................................................................................17 1.2.1 Vị trí phân loại ............................................................................................17 1.2.2 Đặc điểm chung ..........................................................................................17 1.2.3 Tình hình sử dụng phụ phẩm cá tra ...........................................................18 1.3 Tổng quan về TP giàu calcium và protein ......................................................19 1.3.1 Giới thiệu về calcium..................................................................................19 CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………25 2.1 Nguyên vật liệu ..................................................................................................25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................25 2.1.2 Nguyên liệu.................................................................................................25 2.1.3 Hóa chất ......................................................................................................25 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ .....................................................................................25
2.2 Môi trường nghiên cứu.....................................................................................26 2.3 Nội dung nghiên cứu .........................................................................................27 2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm.........................................................................................27 2.3.2 Bố trí thí nghiệm.........................................................................................29 2.4 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................37 2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38] ...........................................37 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn.........................37 2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33]...........................40 2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32]...........41 2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]42 2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20]....44 2.4.7 Phương pháp định tính acid lactic [16] [21]...............................................45 2.4.8 Phương pháp định lượng acid tổng [2] [21] ..............................................46 2.4.9 Phương pháp xác định độ ẩm [3] [10] ........................................................46 2.4.10 Phương pháp định lượng calcium [3] [10]................................................47 2.4.11 Định lượng đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl) [3] [10] ......................48 2.4.12 Định lượng đạm formol (phương pháp Sorensen) [3] [10] ......................50 2.4.13 Phương pháp xác định đạm ammoniac [3] [10] .......................................51 2.4.14 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................53 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................54 3.1 Khảo sát thành phần hóa học của bột xương cá tra ......................................54 3.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus và VK lactic..................................................54 3.2.1 Bacillus .......................................................................................................55 3.2.2 VK lacic ......................................................................................................56 3.2.3 Kết quả định danh đến loài bằng sinh học phân tử.....................................58 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease và acid của 2 chủng VK nghiên cứu...............................................59 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens..............................................59
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei.................................................................................69 3.4 Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens .........................................79 3.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước...........................................................................80 3.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy.............................................................81 3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ..............................................................................83 3.4.4 Ảnh hưởng của thời gian ............................................................................84 3.5 Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei...................................................................85 3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men..............................................................85 3.5.2 Ảnh hưởng của thời gian trích ly................................................................86 3.6 Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV......................................................................................88 CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................90 4.1 Kết luận..............................................................................................................90 4.2 Kiến nghị............................................................................................................90 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................92 PHỤ LỤC.....................................................................................................................98
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CCa 2+ Hàm lượng calcium HSTNđht Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan HSTP Hiệu suất thủy phân KL Khuẩn lạc MT Môi trường NF Nitrogen formol NNH3 Nitrogen ammoniac NTS Nitrogen tổng số NL Nguyên liệu STP Sau thủy phân TP Thực phẩm t0 opt Nhiệt độ tối thích VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic........................................................................... 8 Hình1.2: Lactobacillus casei ................................................................................................. 10 Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus........................................................................................ 11 Hình 1.4: Lactobacillus brevis............................................................................................... 12 Hình 1.5: Cá tra....................................................................................................................... 7 Hình 1.6: Sữa giàu calcium .................................................................................................. 21 Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium......................................................................... 22 Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium.................................................................... 22 Hình 3.1: Bột xương cá tra................................................................................................... 54 Hình 3.2: Hình thái KL của Bacillus (x4) ........................................................................... 55 Hình 3.3: Hình thái tế bào của Bacillus (x100)................................................................... 55 Hình 3.4: Bào tử của Bacillus (x100)................................................................................... 55 Hình 3.5: Bacillus có catalase dương tính........................................................................... 56 Hình 3.6: Vòng phân giải casein của Bacillus có hoạt tính protease................................ 56 Hình 3.7: Hình thái KL của VK lactic (x4)......................................................................... 57 Hình 3.8: Hình thái tế bào của VK lactic (x100) ................................................................ 57 Hình 3.9: VK lactic có catalase âm tính.............................................................................. 58 Hình 3.10: Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphermen............................................. 58 Hình 3.11: Vòng phân giải casein của Bacillus amyloliquefaciens khi được nuôi........... 60 cấy ở các khoảng thời gian khác nhau ................................................................................ 60 Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của ........................ 60
Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 60 Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của ..................................... 62 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 62 Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của ........................... 63 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 63 Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của .................................. 64 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 64 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của......................................... 66 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 66 Hình 3.17: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens ......................... 67 Hình 3.18: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ................................................................................................................. 70 Hình 3.19: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của............................. 71 Lactobacillus casei ................................................................................................................. 71 Hình 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của ................................. 73 Lactobacillus casei ................................................................................................................. 73 Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ................................................................................................................. 74 Hình 3.22: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ................................................................................................................. 75 Hình 3.24: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei ...................................... 78 Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ............................................ 81
Hình 3.26: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra ..................................................................... 82 Hình 3.27: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ........................................................ 83 Hình 3.28: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ........................................................ 85 Hình 3.29: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra........................................................................................... 86 Hình 3.30: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei........................................................................... 87 Hình 3.31: Dịch xương cá tra............................................................................................... 88
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt)............. 13 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu TP giàu calcium và protein............................................................................................... 28 Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens.................................................. 31 Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ...................................................................................... 33 Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens.................................... 35 Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ..................................................... 36
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được............................... 18 Bảng 1.2: Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra....................................... 19 Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng ..................................... 24 Bảng 3.2: Đặc điểm sinh học của Bacillus.......................................................................... 55 Bảng 3.3: Đặc điểm sinh học của VK lactic ....................................................................... 56 Bảng 3.4: Mật độ tế bào Bacillus amyloliquefaciens trong giống các cấp ...................... 59 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của......................... 60 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 60 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của...................................... 61 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 61 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của ............................ 63 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 63 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của ..................................... 4 Bacillus amyloliquefaciens..................................................................................................... 4 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của.......................................... 65 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 65 Bảng 3.10: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens ....................... 67 Bảng 3.11: Mật độ tế bào Lactobacillus casei trong giống các cấp ................................. 69 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei................................................................................................................ 70 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của............................ 71
Lactobacillus casei................................................................................................................ 71 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của................................ 72 Lactobacillus casei................................................................................................................ 72 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei................................................................................................................ 74 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei................................................................................................................ 75 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid của.................................... 76 Lactobacillus casei................................................................................................................ 76 Bảng 3.18: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei..................................... 78 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens........................................... 80 Bảng 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra ................................................................... 82 Bảng 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 83 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 84 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra.......................................................................................... 86 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ......................................................................... 87 Bảng 3.25: Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV ................................................................................ 88
MỞ ĐẦU  Lí do chọn đề tài Theo nghiên cứu của Viện dinh dưỡng Việt Nam, lượng calcium từ bữa ăn hằng ngày của người Việt Nam trung bình là 700mg. Muốn cung cấp đủ calcium cho cơ thể thì lượng thức ăn phải đảm bảo từ 1.200 - 1.300mg calcium/ngày, thậm chí nhiều hơn trong một số trường hợp cần thiết. Hiện nay, các thực phẩm (TP) giàu calcium chủ yếu nhập từ nước ngoài với giá thành cao. Trong khi đó, các nguồn nguyên liệu TP giàu calcium tại Việt Nam rất nhiều, đặc biệt trong phế phẩm động vật như vỏ ghêu, vỏ sò, xương cá, xương gia súc, xương gia cầm, … đang bị bỏ phí, chưa được tận dụng và gây ô nhiễm môi trường (MT). Trong đó, phụ phẩm cá tra được xem như một nguồn tiềm năng cung cấp nguyên liệu giàu calcium và protein rất cần thiết cho con người. Vì vậy, vấn đề xử lý phụ phẩm cá tra hiệu quả, kinh tế và thân thiện với MT đang ngày càng trở nên cấp thiết. Những năm gần đây, việc tận dụng phụ phẩm cá tra đang được sự quan tâm đầu tư của các doanh nghiệp chế biến thủy sản nhằm chế biến ra những mặt hàng có giá trị gia tăng như: đầu, xương chế biến thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi, da cá xuất khẩu sang châu Âu phục vụ công nghiệp TP, dược phẩm, ... Bên cạnh đó việc xử lý loại phụ phẩm này bằng phương pháp sinh học đang rất được quan tâm, đặc biệt là sử dụng VSV, vì đây là một trong những biện pháp thân thiện với môi trường nhằm tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng và giá trị dinh dưỡng cao. Từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein”.  Mục đích của đề tài Nghiên cứu điều kiện tối ưu để xử lý xương cá tra bằng tác dụng của VSV tạo ra nguyên liệu TP giàu calcium và protein.  Đối tượng nghiên cứu Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp.  Nhiệm vụ của đề tài
- Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra. - Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện MT nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens và khả năng sinh acid của Lactobacillus casei. - Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens. - Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra (sau khi tách protein) bằng dịch lên men Lactobacillus casei. - Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra đã được xử lý bằng VSV.
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu 1.1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1.1 Đặc điểm chung * Vị trí phân loại Bacillus là giống lớn, đa dạng (có khoảng 48 loài). Theo Ferdinand Cohn (1872), Bacillus (VK tạo nội bào tử) có vị trí phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacilliales Họ: Bacilliaceae Giống: Bacillus (trực khuẩn tạo nội bào tử) Một số loài thường gặp như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus mensentericus, ... Loài Bacillus amylolyquefaciens có quan hệ rất gần gũi với loài Bacilus subtilis là hai loài phụ của nó là Bacillus licheniformis và Bacillus pumilus tạo nên nhóm Bacilus subtilis. Vì vậy có khi người ta còn gọi Bacillus amyloliquenfaciens là Bacillus subtilis subsp. amyloliquefaciens. Danh pháp chủng loại quốc tế của Bacillus amyloliquenfaciens là chủng (Strain) ATCC 23350. [40] * Môi trường sống Bacillus có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên như trong rơm cỏ, mùn thực vật, đất, không khí, trên bề mặt các loại hạt và sản phẩm được chế biến từ hạt, ... [45] [65] Bacillus có mức độ thích nghi cao. Phần lớn Bacillus là VK ưa nhiệt với nhiệt độ tối thích (t0 opt) từ 30 - 450 C, một số chịu nhiệt lên tới 650 C hoặc ưa lạnh với từ 50 C - 250 C nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34 – 370 C. Bacillus sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ 2 – 11 [41]. Chúng sinh trưởng tốt ở pH = 7 [33]. Ngoài ra, trong chi này chúng ta có thể gặp một số loài có thể phát triển ở những
MT đặc biệt khắc nghiệt như pH cực trị, nhiệt độ rất cao (một số chủng có thể sống ở MT 1000 C trong 30 phút) [45] [65] hoặc rất thấp, và nồng độ muối rất cao mà ít sinh vật nào có thể chịu được là do chúng có khả năng hình thành nội bào tử (nha bào) tồn tại ở trạng thái “ngủ đông” trong thời gian dài [41] [52], và tái tổ hợp DNA bộ gen với DNA lạ [45] [61]. Dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu trong phòng thí nghiệm, Bacillus có thời gian thế hệ là 25phút. [41] * Về hình thái KL khô, không màu hoặc màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra một lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi, lõm nhiều hay ít bám chặt vào môi trường thạch. [5] [45] [65] Tế bào hình que, kích thước 0.3 - 2.2 x 1.2 - 7µm [41], tế bào thường nối với nhau thành chuỗi có độ dài khác nhau hoặc tạo ra lớp riêng rẽ [45] [65]. Bào tử có dạng hình cầu elip hay hình trụ tròn nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào và túi bào tử phồng hoặc không phồng, bào tử có kích thước 0.6 - 0.9 x 1.0 - 1.5µm. [43] [68] * Về sinh lý, sinh hóa Bacillus là loại trực khuẩn Gram dương, phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi trong chu trình sống của nó, chỉ những tế bào còn non mới chắc chắc là Gram dương. Chúng có sinh bào tử [43], khác với tế bào dinh dưỡng, vách bào tử mỏng, không bắt màu phẩm nhuộm được bao bọc bởi vỏ trong có cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài nên nó bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu, bền với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác. Tế bào khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao. [1] Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện. Là những sinh vật hóa dị dưỡng thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ, chúng có khả năng sử dụng chất hữu cơ do nhiều nguồn cơ chất khác nhau cung cấp như tinh bột, đường, protein đến chất béo, một số VK tự dưỡng không bắt buộc (Bacillus schlegelli). Chúng có khả năng phát triển trong MT chỉ có CO2 và tạo ra ATP thông qua quá trình lên men butandiol cũng như amon hóa nitrate. [36] [46]
Chu trình sống của Bacillus được chia ra làm 3 giai đoạn: tăng trưởng sinh dưỡng, hình thành bào tử và nảy mầm. Tăng trưởng tế bào sinh dưỡng xảy ra khi các chất dinh dưỡng dồi dào và tăng trưởng theo hàm số mũ. Khi chất dinh dưỡng cạn kiệt chúng bắt đầu hình thành bào tử. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo một bào tử, bào tử này có khả năng chịu nhiệt, chịu tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm. Vì vậy, Bacillus có thể chịu được nhiều sinh cảnh khắc nghiệt như cát sa mạc, suối nước nóng, môi trường đất ở Bắc Cực và có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm [43]. Tuy nhiên sự phát triển bào tử không phải là sự phát triển tùy chọn của tế bào sinh dưỡng mà nó cũng có thể theo những trình tự thay đổi khác nhau, việc biểu hiện các gen là cần thiết để đáp ứng lại các điều kiện bất lợi của MT hoặc tìm kiếm các chất dinh dưỡng khác và tăng cường khả năng cạnh tranh chống lại các loài khác [39]. Việc hình thành bào tử là một quá trình phức tạp tiêu tốn nhiều năng lượng, tế bào cần giảm nhu cầu sử dụng chất dinh dưỡng để đảm bảo đủ chất dinh dưỡng cho quá trình hình thành bào tử (Gonzalez – Pastor et al, 2003). Trong điều kiện đó, chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme như amylase, chitinase, hemicellulase, glucanase, lipase, protease, ... [43] [37] và các chất chuyển hóa sơ cấp như chất kháng sinh, inosinic acid, guanilic acid, nucleotide acid, các hợp chất thứ cấp, ... [1] 1.1.1.2 Một số ứng dụng và tác hại của Bacillus * Ứng dụng của Bacillus Bacillus được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: - Trong công nghiệp: + Bacillus có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp như được ứng dụng nhiều trong α - amylase, protease, phytase, ... có vai trò trong công nghệ thực phẩm như amylase dùng để đường hoá tinh bột hay hệ enzyme của Bacillus subtilis được ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa và sản xuất enzyme công nghiệp. Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp lysine khá cao (15 - 20%) từ tinh bột nên được ứng
dụng để sản xuất lysine, lên men đậu nành [38]. Bacillus amyloliquefaciens được thế giới sử dụng để sản xuất α – amylase và protease ở quy mô công nghiệp. + Ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da. Việc xử lý da bằng cách sử dụng enzyme là tốt nhất vì nó mang lại nhiều lợi thế: dễ kiểm soát, nhanh chóng và giảm được chất thải. Xử lý bằng enzyme sẽ tiêu hủy các sắc tố không mong muốn, từ đó có được da sạch [42]. George và cộng sự (1995) sử dụng protease kiềm của B. amyloliquefaciens cho việc làm rụng lông và da. - Trong nông nghiệp: Do Bacillus có khả năng tạo bào tử, sinh các loài enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus pyogenes, E. coli, Salmonella, Vibrio sp, ... nên được sử dụng làm probiotic. [25] [35] Ví dụ như Bacillus subtilis bổ sung trong thức ăn chăn nuôi nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng, giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi [38]. Yerra Koteswara Rao và cộng sự (2006) đã nghiên cứu và chứng minh được chủng Bacillus amyloliquefaciens B128 là một tác nhân kiểm soát sinh học đối với Botrylis elliptica (mầm bệnh màu xám mốc trên hoa huệ). - Bảo vệ môi trường: Một số loài thuộc chi này có khả năng sinh protease và cellulase với hoạt tính khá cao như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacien, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, ... người ta sử dụng chúng làm phân bón hữu cơ để thủy phân protein thực vật và động vật có trong rác hữu cơ hoặc sử dụng để xử lý rác thải [38][23]. Ngoài ra, chúng còn là một trong những thành phần của sản phẩm dùng để xử lý môi trường nuôi tôm và thức ăn bổ sung cho tôm. Thành phần của các sản phẩm này là các VSV (Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Lactic bacteria, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodosporidium toruloides) mà trong đó mỗi loại giữ một chức năng riêng và tổng của các sản phẩm là hệ VSV có ích, giúp cho con tôm phát triển khoẻ mạnh, chống lại được một số bệnh và điều kiện khắc nghiệt [50]. - Trong y dược: Bacillus được ứng dụng tạo ra nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu như: Bacillus subtilis được đóng thành từng ống 10ml hoặc gói dạng bột gọi là
subtilin (Humfeld and Feustel, 1943) để điều trị bệnh tiêu chảy cho người do Coliforms gây ra, bệnh đường ruột do lị trực trùng hoặc dùng để đắp vết thương ngoài da [38]. Từ Bacillus subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh như Subtilin (Humfeld and Feustel, 1943), Eulycin (Johnson and Durdon, 1946), Bacillomin (Shtikell and Poplavskii, 1955) * Tác hại của Bacillus - Đa số các loài thuộc chi Bacillus là vô hại, một số có hại là do chúng có khả năng tạo bào tử. Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là: + Bacillus subtilis có thể sống sót trong độ nóng rất cao đó là tác nhân chính làm bánh mì bị hư, gây hỏng một số thực phẩm đồ hộp làm thực phẩm đồ hộp có mùi thối chua rất khó chịu, là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa bánh ngọt, chocolate, kẹo có nhân được bảo quản khi khí hậu nóng, gây bệnh “chảy nhớt khoai tây” và “chảy nhớt bánh mì” được Laurent phát hiện đầu tiên 1885. [52] + Bacillus coagulans có thể phát triển ở mức pH = 4.2 và gây ra vị chua nặng ở thức ăn đóng hộp và các thức ăn có tính acid mà bình thường khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất. - Ngoài ra bào tử của loài Bacillus cereus phân bố khắp nơi trong đất, không khí, ... thường phát triển trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm. [26] 1.1.2 Vi khuẩn lactic 1.1.2.1 Đặc điểm chung * Vị trí phân loại Theo khóa phân loại của Bergey (1957), VK lactic thuộc: [44] Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus, Pediococcus Họ: Enterococcaceae
Giống: Enterococcus Họ: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Ho: Streptococcaceae Giống: Streptococcus, Lactococcus Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic [47] * Môi trường sống Trong tự nhiên, VK lactic thường gặp trong đất, nước, không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật (rau, quả, ...) và các sản phẩm lên men (sữa chua, nem chua, dưa muối chua, ...). Chúng tồn tại trong đường ruột (có nhiều VK lactic thuộc Enterococcus và Lactobacillus, trong đó VK Lactobacillus chiếm số lượng nhiều nhất) và miệng của cơ thể người và động vật [20]. VK lactic không thể phát triển được trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose, NH4 + . Đa số chúng cần hàng loạt vitamin và các acid amin. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của VK lactic ưa ấm là 25 - 350 C, ưa nhiệt 40 - 450 C và ưa lạnh là thấp hơn 50 C. Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800 C thì hầu hết chúng bị chết sau 10 - 30phút. * Đặc điểm hình thái
KL tròn, nhỏ, màu trắng sữa, nhẵn bóng, lồi trên bề mặt thạch, có mép đều hoặc rìa xung quanh bám vào môi trường thạch [17]. Tế bào có dạng hình que (trực khuẩn) kích thước 1 - 8µm, xếp thành cặp hay chuỗi với chiều dài khác nhau; hoặc hình cầu (cầu khuẩn) kích thước 0.5 - 1.5 µm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. [20] * Đặc điểm sinh lý, sinh hóa VK lactic là VK Gram dương (tế bào còn non cho kết quả Gram dương, và trở thành Gram âm khi về già, không sinh bào tử (tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ VK lactic có khả năng tạo bào tử) và hầu hết không có khả năng di động. VK lactic không hô hấp do không có cytochrom và catalase âm tính. Là VK có khả năng sống được trong MT có oxy và không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2, H2O và tạo ra 36 hoặc 38 ATP; trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP, do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng sinh. Trong điều kiện hiếu khí sinh khối của VK phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí. LAB có khả năng tổng hợp peroxydase rất mạnh, chúng phân giải H2O2 để tạo H2O và O2 để phát triển. 1.1.2.2 Phân loại Việc phân loại VK lactic khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm hoặc phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. VK lactic trao đổi chất chủ yếu bằng quá trình lên men. VK lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, disaccharid, protein tan, pepton, ... Phần lớn chúng không lên men tinh bột và các polisaccharid khác. Khi nghiên cứu về khả năng lên men lactic từ nguyên liệu chứa đường, người ta thấy có hai nhóm VK
lactic chuyển hóa đường hoàn toàn khác nhau: VK lactic đồng hình và VK lactic dị hình [20]. * VK lactic đồng hình - Lactobacillus casei [6] [20] [67] + Là những trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn. Chúng có thể tạo thành chuỗi, không chuyển động, Gram dương. + Yếm khí tuỳ tiện; lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8% - 1% axit lactic; và không tạo catalase. Hình1.2: Lactobacillus casei + Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Chúng thuỷ phân casein và gelatin rất yếu. + Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 10o C, t0 opt từ 28 - 320 C.
- Lactobacillus bulgaricus [6] [20] [51] + Là trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, Gram dương, không có khả năng di chuyển. + Nhiệt độ phát triển tối ưu t0 opt từ 45 - 620 C. + Chúng có khả năng lên men glucose, lactose tạo độ axit cao (3,7% axit lactic). Không lên men được xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin. Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus + Chúng không có khả năng tạo nitrite và nitrat. - Streptococcus cremoris [19] [20] [70] + KL tròn, có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng mịn và tạo chất nhày, bề mặt KL lồi và thường nhỏ hơn 1mm. Tế bào cò dạng hình tròn hoặc hình trứng (oval) đường kính 0.5 - 1µm thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc tạo thành chuỗi dài. Cầu khuẩn Gram dương, không nha bào, không di động, và thường không tạo sắc tố. + Thường phát triển t0 opt từ 250 C - 300 C. + Lên men glucose, galactose. Khi lên men sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic, … (Gunsalus and Niven, 1942) * VK lactic dị hình - Lactobacillus pasteurianus [20] + Là trực khuẩn Gram dương có kích thước 0.5 - 1.0µm x 7.0 - 35µm. Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng rẽ, không di động. + Nhiệt độ thích hợp là 290 C - 330 C. + pH thích hợp 8.0.
+ Có khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, rafinose, trehalose, mannitol, dextrin. Trong quá trình lên men tạo một loạt sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic. - Lactobacilus brevis [20] [54] + Là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0.7 - 1.0µm x 2.0 - 4.0µm, chúng liên kết với nhau thành chuỗi, không di động. + Chúng có nhiều trong sữa, kefia, dưa chua. Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat calcium như nguồn cung cấp cacbon. Hình 1.4: Lactobacillus brevis + Chúng có khả năng lên men các loại đường như arabinose, xylose, glucose, fructose, galactose, maltose. + Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300 C. - Streptococcus cumoris [20] + Là cầu khuẩn Gram dương, trong tự nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài. + Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 300 C. + Chúng không phát triển được ở nồng độ NaCl 4%. + Khi lên men đường tạo acid acetic, diacetyl, CO2. + Chúng có khả năng tạo các chất kháng khuẩn. 1.1.2.3 Quá trình lên men lactic [6] [20] [30] Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường tạo acid lactic dưới tác dụng của VK lactic. Do các VK lactic khác nhau tham gia có cơ chế khác nhau và sản phẩm chính phụ khác nhau nên lên men lactic được chia thành hai loại: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.
Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt) [51] (1) lactate dehydrogenase; (2) alcohol dehydrogenase * Lên men lactic đồng hình Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic, chiếm 90 - 98% tổng sản phẩm lên men. Ngoài ra còn một lượng nhỏ acid bay hơi, rượu ethanol và các sản phẩm khác. Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình: C6H12O6 → 2CH3-CHOH-COOH Các VK lên men lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường Embden - Mayerhof, nhưng chúng không có đủ enzyme carboxylase nên acid pyruvic không Glucose ATP ADP ATP ADP Acetaldehyde Glucose - 6 - P Fructose - 6 - P Fructose - 1,6 - bis P 6 - Phosphogluconate Xylulose - 5 - P NAD- NADH ATP ADP NADH NAD+ CO2 Glyceraldehyde - 3 - P Dihydroxyacetone - P Glyceraldehyde - 3 - P Acetyl - P 2 Pyruvate 2 Lactate 2NADH 2NAD+ Pyruvate Lactate 2NADH 2NAD+ Ethanol NADH NAD+ NADH NAD+ 2NAD+ 2NADH 4ADP 4ATP 2H2O NAD+ NADH 2ADP 2ATP H2O (1) (1) (2)
bị phân giải tiếp tục mà chỉ nhận hydro để tạo thành acid lactic, một phần nhỏ acid lactic bị decarboxyl để tạo một lượng nhỏ sản phẩm phụ nói trên. Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghệ thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Các chủng VK tham gia trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống: Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricum, Lactobacillus plantarum, …) và Streptococcus (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, …). * Lên men lactic dị hình Quá trình lên men tạo sản phẩm đa dạng, ngoài acid lactic còn hang loạt các sản phẩm khác với tỉ lệ khá cao như: acid lactic 40%, acid sucxinic và ethanol 20%, acid acetic 10% , các chất khí (CO2, H2) 20%, … Phương trình tổng quát lên men dị hình: C6H1206 → CH3-CHOH-COOH + COOH-(CH)2-COOH + CH3COOH + C2H2OH + CO2 + H2 … Quá trình lên men dị hình là sự lên men khá phức tạp, những VK lên men kiểu này có men decarboxylase để phân huỷ acid pyruvic ra CO2 và CH3CHO. Tuy nhiên enzyme này không phân giải hết được acid pyruvic, nên một phần acid này được chuyển thành acid lactic và acid sucxinic. Trong hệ VK lactic dị hình, thiếu các enzyme chủ yếu của con đường Embden - Mayerhof, đó là adolase và triosephosphate isomerase nên glucose sẽ chuyển hóa theo chu trình pentosephosphate qua hàng loạt sản phẩm trung gian để tạo xilulose 5-phosphate, sau đó bị phân ly thành aldehyde và acetyl phosphate. Từ aldehyde, phosphoglycerinic chuyển tiếp tạo thành acid succinic và acid lactic, còn acetyl phosphate tiếp tục chuyển hóa theo hai hướng để tạo ethanol và acid acetic. Quá trình lên men dị hình tạo nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém. Tuy nhiên quá trình này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến một số loại thực phẩm. VK lactic dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn.
Các chủng VK chủ yếu lên men lactic dị hình: Bacterium aeogenes, Bacterium pentoacetium, Lactobacillus brevis, ... 1.1.2.4 Một số ứng dụng và tác hại của VK lactic VK lactic là nhóm VK có rất nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia vào tất cả hoạt động sống của con người nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: * Công nghệ thực phẩm - Bacteriocin: Việc lên men thực phẩm bằng cách sử dụng VK lactic là phương pháp bảo quản truyền thống dựa vào sự đối kháng các loại VSV khác nhau. Một trong những đặc điểm quan trọng của VK lactic là khả năng tạo các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn gọi là bacteriocin (Klaenhammer, 1987) [49]. Một vài loại bacteriocin từ VK lactic như Nisin (Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454), Pediocin A (Pediococcus pentosaceus FBB61 và L - 7230), Pediocin AcH (Pediococcus acidilactici H), Leucocin (Leuconostoc gennlidum), ... Các bacteriocin có khả năng kìm hãm sự phát triển của các VK gây bệnh hay gây hư hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp, Enterococcus spp [48]. - Probiotics: là những VSV sống mà khi đưa vào cơ thể người hay động vật nó có những tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ và làm tăng khả năng hoạt động hệ VSV của vật chủ (Hevenaar và Huis in’t Veld, 1992). Một số VK lactic được sử dụng như probiotics là: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, ....(Conway, 1996). - Trong quá trình lên men, VK lactic có khả năng tạo ra acid lactic và acid acetic cùng với một số loại acid hữu cơ khác. Chính vì thế chúng được ứng dụng để sản xuất dưa chua, sản xuất tương, sản xuất đậu phụ, sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa, .... * Trong y dược - VK lactic được dùng trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất sản phẩm mang tên là Biolactyl chuyên trị tiêu chảy bằng VK lactic [20]. Có nhiều
nghiên cứu để chữa bệnh tiêu chảy, kết quả cho thấy chủng Streptococcus boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng Lactobacillus acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006). Tính hiệu quả của phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng VSV được sử dụng và liều lượng, có thể giảm đến 50% mức độ của bệnh. Các loại thực phẩm bổ sung VK lactic được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp, giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em và tiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002). - Mặc dù vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên VK lactic được cho là có một số hiệu ứng có lợi cho chức năng miễn dịch. VK lactic có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh bằng sự ức chế cạnh tranh báo hiệu cho tế bào chủ làm giảm đáp ứng viêm; tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và Martha, 2003); tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA - kháng thể chính trong cơ thể; hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ lympho - T (Reid et al., 2003), Ouwehand et al., 2002); kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (O'Toole và Cooney, 2008). - VK lactic ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặp khi dùng kháng sinh. Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" trong khi VK lactic lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản ứng với lây nhiễm mới. * Một số ứng dụng khác - VK lactic được ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid lactic. Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo và các loại muối lactate (các loại lactat kim loại được sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal và của hãng mỹ phẩm Punac có tác dụng chống lại các VSV có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da) [20]. - Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi [6].
Ngoài mặt có lợi ra, trong một số ngành công nghiệp quá trình lên men lactic lại rất có hại. Nếu bị nhiễm khuẩn lactic thì quá trình sản xuất rượu vang, rượu, nước giải khát, đồ hợp, sản xuất đường, mật tinh bột bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Do đó, phải dùng nhiều phương pháp khác nhau để chống sự hư hỏng này [18]. 1.2. Giới thiệu về cá tra 1.2.1 Vị trí phân loại Phân loại khoa học [58] Giới: Animalia Ngành: Chordata Phân ngành: Vertebrata Lớp: Actinopterygii Phân lớp: Neopterygii Liên bộ: Ostariophysi Bộ: Siluriformes Hình 1.5: Cá tra Họ: Pangasiidae 1.2.2 Đặc điểm chung Cá tra là một loài cá có giá trị kinh tế quan trọng và nuôi rộng rãi ở các tỉnh ĐBSCL, phân bố trong tự nhiên ở vùng hạ lưu sông Mêkong. Cá tra là cá da trơn, thân dài, dẹp ngang, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to. Vây lưng cao, có một gai cứng có răng cưa. Vây ngực có ngạnh, bụng có 8 tia phân nhánh, trong khi các loài khác có 6 tia (Phạm Văn Khánh, 1996). Mẫu thu được lớn nhất trong tự nhiên dài 90cm, nặng 17kg. [34] [65]
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được Tổng năng lượng cung cấp (Calori) Chất đạm (g) Tổng lượng chất béo (g) Chất béo chưa bão hòa (có DHA, EPA) (g) Cholesterol (%) Natri (mg) 124.52 23.42 3.42 1.78 0.025 70.6 Trong thành phần dinh dưỡng của cá tra có chứa các axit béo chưa bão hoà. Các chất này rất hữu ích trong việc bảo vệ màng tế bào và giúp làm giảm Cholesterol trong máu, từ đó sẽ làm giảm các bệnh tim mạch. Bên cạnh đó, trong cá tra còn có DHA (acid docohexanoic) và EPA (acid écosapentaenoic) hay còn gọi là Omega - 3 có thể giúp làm giảm hàm lượng triglyceride cao trong máu, một yếu tố gây nên bệnh tim. Theo Hiệp hội Tim Hoa Kỳ, chất béo Omega - 3 giúp bảo vệ cơ thể chống lại chứng rối loạn nhịp tim, từ đó giảm nguy cơ đột tử. Ngoài ra, chất béo Omega - 3 còn giúp ngăn ngừa quá trình xơ cứng động mạch (là nguyên nhân dẫn đến chứng xơ vữa động mạch), làm giảm nguy cơ bị lão hóa não, tăng cường hoạt động của trí nhớ, ... [64] 1.2.3 Tình hình sử dụng phụ phẩm cá tra Trong quy trình sản xuất cá tra philê đông lạnh xuất khẩu, người ta chỉ lấy phần nạc của cá, các bộ phận còn lại như da cá, mỡ cá, xương cá, nội tạng, … chiếm trên dưới 70% khối lượng nguyên liệu, được bán với giá rất rẻ. [60] Trong khi đó, theo kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Lan Chi và cộng sự (2009) các phần của phụ phẩm cá tra có hàm lượng protein cao (đầu tới 42,68%), xương sống, đuôi, vây lại có hàm lượng tro và calcium khá cao.
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra (% tính trên vật chất khô) [4] Chỉ tiêu (%) Đầu Xương sống Đuôi Vây Protein 42,68 37,91 30,36 37,23 Lipid 28,79 37,91 45,10 41,57 Tro 23,13 20,11 15,24 18,47 Ẩm 62,77 59,72 47,89 57,61 Carbohydrate 5,40 4,57 9,31 2,74 Calcium 3,98 4,49 2,76 3,70 Phosphor 3,87 3,80 2,99 3,05 Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng ta thấy được phụ phẩm cá tra là nguồn nguyên liệu có tiềm năng lớn cho việc chế biến những sản phẩm có giá trị gia tăng hiện nay. Từ phụ phẩm cá tra khi sản xuất phile có thể tận dụng và chế biến thành nhiều sản phẩm giá trị như: [4] - Bột cá làm nguyên liệu cho thức ăn chăn nuôi. - Mỡ cá chế biến thành dầu cá bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Ngoài ra còn được dùng để sản xuất biodiesel, một nguyên liệu thân thiện với môi trường. - Chất khoáng (calcium, phosphor) từ xương bổ sung vào thực phẩm cho động vật nuôi. - Gelatin, collagen từ da cá được sử dụng trong ngày dược phẩm và mỹ phẩm. - Thu nhận enzyme từ nội tạng cá (Kim và Mendis (2006), Shahidi (2007), Nguyễn Thị Yến (2006)). 1.3 Tổng quan về TP giàu calcium và protein 1.3.1 Giới thiệu về calcium * Vai trò của calcium [53] Calcium là một khoáng chất có nhiều nhất, chiếm khoảng 1.5 - 2% thể trọng. Trong cơ thể con người 99% calcium tồn tại trong xương, răng, móng, 1% tồn tại
trong máu, trong tổ chức tế bào và dịch ngoài tế bào nhưng có nhiều nhiệm vụ rất quan trọng. Vai trò chính yếu của calcium là phối hợp với sinh tố D để cấu tạo bộ xương và hàm răng vững chắc. Bên cạnh đó calcium cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống các enzyme, sự co cơ, phóng thích chất dẫn truyền thần kinh, duy trì nhịp tim bình thường, quá trình đông máu, … đều chịu ảnh hưởng của calcium. Nhu cầu calcium khác nhau theo từng lứa tuổi. Theo tổ chức y tế thế giới WHO, nhu cầu calcium tối thiểu của cơ thể con người: - Trẻ sơ sinh: 300 - 400mg/ngày. - Nhi đồng: 600 - 800 mg/ngày. - Thanh thiếu niên: 1000 mg/ngày. - Người lớn 24 - 50 tuổi: 800mg/ngày. Người cao tuổi, phụ nữ có thai: 1200 mg - 1500 mg/ngày. Theo Walloc (1991), nếu ăn uống thiếu calcium con người có thể bị mắc 147 bệnh. Vì thế, calcium là khoáng chất cần thiết cho sự sống. * Khả năng đồng hóa của calcium [12][57] Calcium là nguyên tố khó đồng hóa bởi cơ thể. Độ đồng hóa của nó phụ thuộc vào mối tương quan giữa những hợp phần khác của thức ăn như chất béo, chất xơ, magiesium, phospho. Vitamin D là chất điều hòa đồng hóa calcium. Chất béo: điều kiện thuận lợi để hấp thụ calcium tốt khi tỉ lệ calcium ứng với 1g chất béo có trong thức ăn là 0.04 - 0.08g. Thừa hay thiếu chất béo đều không tốt,thiếu chất béo thì sẽ chuyển toàn bộ calcium thành muối calcium của chất béo, thừa chất béo thì không đủ acid mật (inozitphosphoric, oxalic) để chuyển hóa muối calcium của acid béo thành phức hòa tan mà cơ thể có thể hấp thụ được. Do đó, phần lớn sẽ thải ra ngoài cùng với phân. Chất xơ: Việc hấp thu calcium có thể thay đổi tùy thuộc vào bản chất, nguồn gốc của chất xơ. Nhiều loại chất xơ từ các loại rau xanh, đậu quả, quả có màu vàng, chuối, ... không ảnh hưởng tới việc hấp thu calcium. Song ngược lại, chất xơ trong
vỏ lúa mạch, vỏ ngũ cốc lại làm giảm hấp thu của calcium. Chất xơ khi kết hợp các thành phần khác của thức ăn như phytat và oxalat cũng sẽ làm giảm sự hấp thu calcium thức ăn. Magnesium: thừa magnesium trong khẩu phần ăn cũng ảnh hưởng xấu đến sự hấp thụ calcium. Để hòa tan muối calcium cũng như muối magnesium đòi hỏi phải kết hợp chúng với acid muối mật, do đó muối magnesium càng nhiều thì acid mật còn lại để kết hợp với muối calcium càng ít, vì thế sẽ làm giảm quá trình hấp thụ calcium của cơ thể. * Nguồn cung cấp calcium Theo các nhà nghiên cứu thì nguồn thức ăn có calcium tốt nhất là sữa và các chế phẩm từ sữa. Sữa không chỉ chứa nhiều calcium mà cơ thể còn dễ hấp thu. Bên cạnh đó, rau xanh và các loại đậu, đặc biệt là đậu tương, vừng, hạt dưa, rong biển, tôm, cua, sò huyết là những thực phẩm chứa nhiều calcium. [61] Trong bột xương và vỏ trứng lượng calcium chiếm đến 20% và khả năng hấp thụ lên tới 70%, chính vì vậy đây cũng là thực phẩm tốt dành cho những người thiếu calcium. Hình 1.6: Sữa giàu calcium [56] [69] Người ta còn có thể bổ sung calcium cần thiết cho cơ thể dưới dạng viên thuốc, dịch hoặc sử dụng thực phẩm có bổ sung calcium. Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng calcium thông qua thực phẩm có lợi hơn là thông qua uống viên calcium, vì hấp thụ tốt hơn và tránh hiện tượng lắng đọng tạo sỏi thận [53].
Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium [54] [62] [66] Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium [71] 1.3.2 Giới thiệu về protein Protein (Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptid (gọi là chuỗi polypeptid). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. * Vai trò dinh dưỡng: protein là hợp phần chủ yếu, quyết định toàn bộ các đặc trưng của khẩu phần thức ăn. [59] [63] - Cung cấp các nguyên liệu cho sự tạo máu, bạch huyết, hormone, enzyme, kháng thể, … Cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt vitamin và chất khoáng. - Là nguồn năng lượng cho cơ thể: đáp ứng 10 - 15% năng lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4Kcal. Về nhiệm vụ cung cấp năng
lượng có thể thay thế protein bằng các chất dinh dưỡng khác nhưng về mặt tạo hình không có chất dinh dưỡng nào có thể thay thế. - Protein chiếm 19% trọng lượng cơ thể. + Protein là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống, chúng giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển, duy trì sự sống và phục hồi của tế bào và các mô. + Khi thiếu protein trong chế độ ăn hằng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu cho sức khỏe như suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn (đối với trẻ em), giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đỡ của cơ thể đối với một số bệnh. + Thiếu protein sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh. + Thiếu protein cũng sẽ làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái của xương (lượng calcium giảm, lượng magnesium tăng cao). Do vậy mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong thức ăn cho mọi lứa tuổi. * Cơ sở của quá trình thủy phân protein [31] Sự thủy phân protein cũng như mọi phản ứng hóa học khác đều là sự trao đổi điện tử giữa các nguyên tử nhất định của các phân tử phản ứng. Việc thủy phân các phân tử dẫn đến làm đứt liên kết peptit nối nguyên tử carbon của một gốc acid amin này với nguyên tử nitơ của gốc kia và các nhóm amin được giải phóng theo phương trình: H+ C R H H2N C O N H C H R C O N C R H COOH OH- C H H H2N C N CH COOH R O H + C H H2N H COOH * Nguồn protein trong TP [15] Hàm lượng protein trong các thức ăn không giống nhau. - TP có nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều về số lượng, cân đối về thành phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu.
- TP có nguồn gốc thực vật (đậu nành, các loại đậu khác, …) là nguồn protein quan trọng. Hàm lượng acid amin thiết yếu cao trong đậu nành còn các loại đậu khác thì hàm lượng acid amin thiết yếu không cao, sự cân đối về thành phần các acid amin thiết yếu thấp hơn protein có nguồn gốc động vật. Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng Tên thực phẩm Lượng protein (g/100g) Tên thực phẩm Lượng protein (g/100g) Đậu nành 34 Tôm đồng 18.4 Đậu phộng 27.5 Trứng vịt 15 Đậu xanh 23.4 Ngô mảnh 8.5 Đậu đen 24.2 Gạo tẻ 7.6 Mè 20.1 Bột mì 11 Thịt trâu, bò 21 Bánh mì 7.9 Thịt gà 21.4 Khoai tây 2 Cá chép 16 Khoai sọ 1.8 Cá lóc 18.2 Khoai lang 0.8
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. - Bacillus amyloliquefaciens - Lactobacillus casei 2.1.2 Nguyên liệu Phụ phẩm cá tra: Công ty trách nhiệm chế biến thủy sản Minh Qúy - cụm công nghiệp Tân Mỹ Chánh - TP. Mỹ Tho - tỉnh Tiền Giang. Dịch tương đậu nành: cơ sở sản xuất đậu phụ Bách hóa tổng hợp - quận Thủ Đức - TP. Hồ Chí Minh. Cà chua, bắp mỹ, giá, đậu nành, nước mắm 350 N, agar, sucrose mua tại chợ An Đông (34 - 36 An Dương Vương phường 9 - Quận 5 - TP. Hồ Chí Minh) 2.1.3 Hóa chất D - glucose, peptone, cao nấm men, cao thịt, casein, peptone, CH3COONa, K2HPO4, MnSO4.4H2O, Amonium citrate, Tween 80, NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaCl, FeSO4.7H2O, H2O2, HCl đặc, NaOH, acid trichloracetic, Na2HPO4, FeCl3, Trilon B (EDTA), H2SO4 đặc, CuSO4, K2SO4, KCN, tyrosin, phenol, murexid, crystal violet, lugol, fuschin, xanh metylen, folin, phenolphthalein, metyl đỏ. 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh cung cấp gồm: 2.1.4.1 Thiết bị
Tủ sấy (Memmert - Đức), cân phân tích điện tử (Scientech - Đức), nồi hấp vô trùng (Huxley - Đài Loan), tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ ấm (Binder - Đức), tủ lạnh (National - Nhật Bản), máy đo pH (Hana - Trung Quốc), máy lắc (Gerhardt - Đức), máy li tâm (Hettich - Đức), bể lắc nhiệt (Grant - Anh), kính hiển vi (Olympus - Nhật), máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus - Nhật), máy khuấy từ, máy chưng cất đạm (Gerhardt, Đức), máy phá mẫu (Gerhardt, Đức), máy trung hòa khí (Gerhardt, Đức), máy đo quang phổ UV (Amersham Biosciences, Thụy Điển), máy lắc ống nghiệm, nồi nấu môi trường, bếp điện. 2.1.4.2 Dụng cụ Bình tam giác (50ml, 100ml, 250ml), ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tinh (100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), ống đong (10ml, 100ml, 500ml), ống ly tâm, bình định mức (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), bình hút ẩm, đèn cồn, diêm quẹt, que gạt, que cấy (que cấy vòng, que cấy nhọn), khoan nút chai, pipetman (0,1ml, 1ml, 5ml, 10ml), thước đo, giấy lọc, khăn lọc, bông mỡ, bông thấm nước, lame, lamel, ... 2.2 Môi trường nghiên cứu MT1 (MT giữ giống Bacillus amyloliquefaciens: MT cá peptone): nước mắm 350 N 30ml, peptone 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [7] MT2 (MT giữ giống Lactobacillus casei: MT MRS (de Man, Rogosa and Sharp)): D - glucose 20g, peptone 10g, cao nấm men 5g, cao thịt 10g, CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g, Tween 80 1ml, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [22] MT3 (MT nhân giống Bacillus amyloliquefaciens và Lactobacillus casei, khảo sát hoạt tính và hoạt độ protease: MT sữa đậu nành): sữa đậu nành 1000ml (đậu nành 100g ngâm trương nước từ 4 - 6 giờ → xay nhuyễn → lọc → bổ sung nước cất đến 1000ml), sucrose 20g. MT4 (MT định tính khả năng sinh protease): pepton 5g, cao nấm men 2.5g, casein 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [27]
MT5 (MT cà chua: MT khảo sát khả năng sinh acid): Nước ép cà chua 400ml, D - glucose 10g, cao nấm men 10g, dung dịch muối A 5ml (K2HPO4 2,5g, KH2PO4 2,5g, nước cất 250ml), dung dịch muối B 5ml (MgSO4.7H2O 10g, NaCl 5g, FeSO4.7H2O 5g, MnSO4.4H2O 5g, nước cất 250ml), agar 20g, nước cất bổ sung đến: 1000ml. [7] MT6 (MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, nước chiết bắp bổ sung 1000ml. [20] MT7 (MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, nước chiết giá đậu bổ sung đủ 1000ml. [13] MT8 (MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, dịch tương đậu nành bổ sung đủ 1000ml. [12] 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu TP giàu calcium và protein Dịch nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens Thủy phân Phụ phẩm cá tra Bột xương cá tra Phân tích sinh hóa Nguyên liệu TP giàu Calcium và protein Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei Dịch lên men Lactobacillus casei Xương đã tách protein Ngâm trích ly calcium Xác định các điều kiện thích hợp Dd protein Phân tích sinh hóa
2.3.2 Bố trí thí nghiệm 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra Tiến hành xác định các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng Ca2+ , Nitrogen tổng số (NTS), protein tổng, Nitrogen formol (NF), Nitrogen ammoniac (NNH3). 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens  Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1 - Chuẩn bị các bình tam giác (50ml) chứa 5ml MT3 đã vô trùng. - Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2 - Chuẩn bị bình tam giác (250ml) chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ.  Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens * Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Cấy 1% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy: 24giờ, 48giờ, 72giờ thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn thời gian thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các tỷ lệ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nồng độ sucrose
Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các nồng độ sucrose: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn nồng độ sucrose thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định pH ban đầu của MT thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các nhiệt độ: 300 C, 350 C, 400 C, 450 C. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Động thái học của quá trình lên men Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các các điều kiện đã chọn. Cứ 6giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hoạt độ protease.
Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei  Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1 - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT3 đã vô trùng. - Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang ống nghiệm MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430 C trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2 - Chuẩn bị bình tam giác chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430 C trong 24giờ. Bacillus amyloliquefaciens Tỷ lệ giống/MT 1% 2% 3% 4% 5% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ pH ban đầu 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 300 C 350 C 400 C 450 C Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5% Hoạt độ protease Chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp
 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei * Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT2 dịch thể. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 24giờ, 48giờ, 72giờ, 96giờ, 120giờ thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn thời gian thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của MT nuôi cấy Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT (gồm các loại MT khác nhau: MT5, MT6, MT7, MT8). Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn MT thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Cấy vào bình tam giác chứa 50ml MT với các tỷ lệ giống: 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo. * Ảnh hưởng của nồng độ surose Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn với các nồng độ surose: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn nồng độ surose thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo. * Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định pH MT ban đầu thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50 ml MT với các điều kiện đã chọn, nuôi ở các nhiệt độ: 200 C, 250 C, 300 C, 350 C, 400 C, 450 C. Sau thời gian thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định nhiệt độ thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Động thái học của quá trình lên men Nuôi VK với các điều kiện thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trên. Cứ 12giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hàm lượng acid. Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei Chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp Hàm lượng acid Lactobacillus casei Tỷ lệ giống/MT 1% 3% 5% 7% 10% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ pH ban đầu 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 200 C 250 C 300 C 350 C 400 C 450 C Môi trường MT5 MT6 MT7 MT8 Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5%
2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens Với điều kiện tối ưu để thu dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens cho hoạt độ protease cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens. * Tỷ lệ nước Bổ sung 3% dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens và các tỷ lệ nước khảo sát như sau: 0%, 10%, 30%, 50%, 70%, 100% vào xương cá tra, tiến hành thủy phân trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ nước tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Tỷ lệ dịch nuôi cấy Với tỷ lệ nước tối ưu đã xác định, xương cá tra được thủy phân với tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens khác nhau: 1%, 3%, 5%, 7%, 10% trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch nuôi cấy tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Nhiệt độ thủy phân Với tỷ lệ nước và dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đã xác định, tiến hành thủy phân xương cá tra trong 24giờ ở các nhiệt độ: 400 C, 450 C, 500 C, 550 C. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra nhiệt độ tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Thời gian thủy phân Với các điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens từ 4 - 40giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để
tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens Thủy phân bằng dịch lên men Bacillus amyloliquefaciens Bột xương cá tra Tỷ lệ dịch lên men/cơ chất 1% 3% 5% 7% 10% Tỷ lệ nước/cơ chất 0% 10% 30% 50% … Nhiệt độ 300 C 350 C 400 C 450 C 500 C 550 C Thời gian 0 giờ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ … Đo các chỉ số đạm Hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan Chọn điều kiện thủy phân thích hợp
2.3.2.5 Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei Với điều kiện tối ưu để thu dịch lên men Lactobacillus casei cho hàm lượng acid cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra đã tách protein bằng dịch lên men Lactobacillus casei. Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ … Xương cá tra đã tách protein Ngâm trích ly calcium bằng dịch lên men Lactobacillus casei Tỷ lệ dịch nuôi cấy/cơ chất 1:1 1.5:1 2:1 2.5:1 3:1 Xác định hàm lượng calcium Chọn điều kiện trích ly thích hợp
* Tỷ lệ dịch lên men Xương cá tra đã tách protein được ngâm bằng dịch lên men Lactobacillus casei với các tỷ lệ 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3 trong 72giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thu mẫu để xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch lên men tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Thời gian trích ly Với tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đã xác định, tiến hành khảo sát thời gian ngâm trích ly calcium từ xương cá tra từ 0 - 120giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2.6 Thí nghiệm 6: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV Tiến hành xác định các chỉ tiêu về hàm lượng Ca2+ , NTS, protein tổng, NF, NNH3 của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV. 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38]  Nguyên tắc Trong điều kiện lạnh sẽ làm giảm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV. Đồng thời ngăn cản sự sinh trưởng của chúng để đảm bảo không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống.  Cách tiến hành Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa MT giữ giống đã vô trùng. Dùng que cấy vòng vô trùng, cấy zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 - 48giờ cho tạo sinh khối, sau đó bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40 C. Giống được cấy truyền hàng tháng. 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 2.4.2.1 Phương pháp quan sát KL [23]
Quan sát và miêu tả KL của VK về: - Khả năng phát triển của KL. - Màu sắc KL - Đặc điểm hình thái, kích thước và tính chất bề mặt KL. 2.4.2.2 Phương pháp nhuộm Gram [20] [32]  Nguyên tắc Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà vi khuẩn được chia làm 2 nhóm: - Nhóm vi khuẩn Gram dương (G+): vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn etylic. - Nhóm vi khuẩn Gram âm (G-): không giữ nguyên màu của thuốc nhuộm khi xử lý bằng cồn etylic và bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung.  Cách tiến hành * Làm tiêu bản - Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. - Dung bút bông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lam để đánh dấu vết khuẩn phía trên lam. - Nhỏ dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn. - Dung que cấy khử trùng để nguội đặt nhẹ KL (VK nuôi cấy từ 24 - 48giờ trong ống thạch nghiêng), đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam. - Dàn mỏng thành vết bôi, cố định vết bôi bằng cách để khô trong không khí hoặc hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn. * Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi. - Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để từ 1-2 phút, rửa bằng nước cất. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa bằng nước cất.
- Tẩy màu bằng cồn 960 từ 15-20 giây. Rửa bằng nước cất. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Fuschin trong 1 phút, rửa bằng nước cất. - Làm khô tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu. 2.4.2.3 Phương pháp nhuộm bào tử [20] [32]  Nguyên tắc Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ.  Cách tiến hành * Làm tiêu bản: tương tự mục 2.4.2.2 nhưng VK được nuôi cấy khoảng 2 tuần trên MT thạch nghiêng. * Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhỏ xanh Metylen thấm ướt hết giấy lọc, hơ nóng phía dưới và giữ trong 1 phút, rửa kỹ bằng nước cất đến khi hết màu. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ đỏ trung tính 0.5% trong 1 phút, rửa bằng nước cất. - Làm khô tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu. 2.4.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh catalase [28]  Nguyên tắc Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Catalase thủy phân H2O2 (hydrogen perioxide) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2 sẽ xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí.  Cách tiến hành
Nhỏ trực tiếp 1 giọt dd H2O2 3% lên trên KL, hoặc chuyển một lượng VSV lên lam rồi thử bằng dd H2O2 3%. Ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí nếu có.  Đọc kết quả Thử nghiệm là dương tính: khi có hiện tượng sủi bọt khí xảy ra do O2 được tạo thành. Thử nghiệm là âm tính: khi không có hiện tượng sủi bọt xảy ra. 2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33]  Nguyên tắc Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của VK. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh xác định VK.  Cách tiến hành * Bước 1 - Lấy một ít KL được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch huyền phù. - Tiến hành tách chiết ADN bằng cách: đun sôi 5phút, để nguội 5phút, ly tâm 5phút, sau đó lấy dịch nổi. * Bước 2 - Cho dịch nổi thu được, primer, Taq, dNTP, Mg2+ vào PCR mix để khuếch đại gen 16s rARN. - Phản ứng PCR gồm 3 bước: + Biến tính: Trong một dd đầy đủ thành phần cho sự sao chép, ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94 - 950 C trong vòng 30giây - 1phút. + Lai: Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700 C và kéo dài 30giây - 1phút.
+ Tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên đến 720 C để ADN polimerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự ADN thường kéo dài từ 30giây đến vài phút. * Bước 3: Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose để xác định sản phẩm PCR. * Bước 4: Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEX II của Qiagen. * Bước 5: Giải trình tự đoạn rARN 16s, nhằm xác định trình tự acis nucleic. Có 2 phương pháp xác định: - Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử ADN, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide. - Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ ADN polimerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các dideoxynucleotide thông thường. Kết quả cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn ADN có kích thước chênh nhau 1 nucleoide. Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn ADN sẽ được phân tích trên điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ điện di. * Bước 6: Xuất kết quả trình tự để phân tích. Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH xác định tên VK cần định danh. 2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32]  Nguyên tắc Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù VSV lên MT thạch trong đĩa Petri. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các KL có thể quan sát được bằng mắt thường. Đếm số KL mọc trên môi trường (trên cơ sở xem mỗi KL hình thành từ một TB). Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã lấy và hệ số pha loãng ta có thể suy ra số khuẩn lạc trong 1ml mẫu khảo sát ban đầu.  Cách tiến hành Chuẩn bị đĩa Petri có chứa MT1.
Pha loãng mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý với các độ pha loãng khác nhau: 10-1 , 10-2 , 10-3 , … lắc đều mẫu và dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù cho lên bề mặt thạch trong đĩa Petri. Dùng que gạt vô trùng dàn đều dịch huyền phù trên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô. Lật úp đĩa thạch vừa cấy và đặt vào tủ ấm. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 48 - 72 giờ. Với mỗi độ pha loãng tiến hành gieo cấy 3 đĩa Petri, sử dụng 1 pipet vô trùng và 1 que gạt cho mỗi độ pha loãng. Thực hiện cho 3 dung dịch mẫu với các độ pha loãng liên tiếp nhau.  Tính kết quả Đếm tổng số các KL trên các đĩa Petri. Chọn tất cả các đĩa Petri có từ 25 đến 250 KL. KL đếm trên các đĩa Petri có độ pha loãng khác nhau cần phải tuân theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số KL đếm được trên đĩa Petri phải càng ít. Nếu không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm. Mật độ tế bào được tính theo công thức: Trong đó: M: mật độ tế bào ở các độ pha loãng khác nhau. A: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa. D: Độ pha loãng. V : Thể tích dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa. 2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]  Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzyme của VK phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn của MT trong suốt thể hiện hoạt tính của enzyme. A * D M (CFU/ml) = V
 Cách tiến hành Thu dịch nuôi cấy - Chuẩn bị 50ml MT3 nuôi VK trong bình tam giác 250ml, đem hấp khử trùng 1210 C trong 30 phút. - Dùng pipetman lấy một thể tích giống cấp 2 sao cho mật độ tế bào 106 - 107 /ml nuôi cấy vào bình tam giác chứa MT3. - Đặc bình tam giác lên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Ly tâm dịch nuôi cấy 15phút, tốc độ 5000vòng/phút. Loại bỏ sinh khối thu được dịch enzyme thô. Chuẩn bị các đĩa Petri có MT4. Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 9mm) khoan các lỗ thạch trên MT4 tương ứng trong các đĩa. Dùng pipetman vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào các lỗ khoan. Giữ các đĩa petri trong tủ lạnh 40 C trong 2 - 4giờ, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24giờ. Nhỏ dung dịch HgCl2 10% lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải.  Kiểm tra kết quả VK sinh ra protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do HgCl2 phản ứng với protein tạo kết tủa.  Đánh giá khả năng tạo enzyme Đặt sấp đĩa petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính lỗ khoan (d). Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng nấm sợi. Quy ước: - (D - d) ≥ 25mm: enzyme có hoạt tính rất mạnh - (D - d) ≥ 20mm: enzyme có hoạt tính mạnh - (D - d) ≥ 10-19,5mm: enzyme có hoạt tính trung bình - (D - d) ≤ 10mm: enzyme có hoạt tính yếu
2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20]  Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt độ phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enyme.  Cách tiến hành * Dựng đường chuẩn tyrosine Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dd tyrosin chuẩn 1mM/l (ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dd HCl 0.2N (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Dd NaOH 0.5N (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 Lắc và để yên trong 10 phút, đem đo mật độ quang ở bước sống 660nm Ống 1 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng tyrosin (µmol) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODKC) * Định lượng protease trong mẫu Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Ống thí nghiệm Ống kiểm chứng Dd casein 1% (ml) 5 5 Dd TCA 10% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 300 C trong 30 phút TCA 5% (ml) 5 0 Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra
Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra

Recommended

Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...
Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...
Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cáPhân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cáTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tímNghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tímljmonking
 
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...
Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...
Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaQuy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Recommended

Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...
Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...
Nghiên cứu sản xuất vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus tăng cường ph...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cáPhân lập bacillus subtilis từ ruột cá
Phân lập bacillus subtilis từ ruột cáTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tímNghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tím
Nghiên cứu thành phần hóa học cây chanh leo tímljmonking
 
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho c...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...
Sử dụng vi khuẩn lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thốn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...
Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...
Nghiên cứu quy trình chế biến bánh mì bổ sung bột khoai lang tím quy mô phòng...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...
Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaQuy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưa
Quy trình trồng nấm bào ngư xám trên bã cà phê phối trộn với mạt cưaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Hóa Sinh thực phẩm đại cương
Hóa Sinh thực phẩm đại cươngHóa Sinh thực phẩm đại cương
Hóa Sinh thực phẩm đại cươngFood chemistry-09.1800.1595
 
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vat
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vatChuong 1 sinh ly te bao thuc vat
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vatdoivaban93
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứaNghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Quocphong Nguyen
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namNghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus
Luận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng BacillusLuận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus
Luận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng BacillusDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Bai giang cong nghe enzyme
Bai giang cong nghe enzymeBai giang cong nghe enzyme
Bai giang cong nghe enzymeRuby Tran
 
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-tr
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-trDoko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-tr
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-trKhánh Goby
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Đánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩmĐánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩmFood chemistry-09.1800.1595
 
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phi
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phiNghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phi
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phihttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúc
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúcKỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúc
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúcHạnh Hiền
 
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...https://www.facebook.com/garmentspace
 

More Related Content

What's hot

Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vat
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vatChuong 1 sinh ly te bao thuc vat
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vatdoivaban93
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứaNghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứaTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Quocphong Nguyen
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namNghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namhttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Bai giang cong nghe enzyme
Bai giang cong nghe enzymeBai giang cong nghe enzyme
Bai giang cong nghe enzymeRuby Tran
 
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-tr
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-trDoko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-tr
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-trKhánh Goby
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phi
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phiNghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phi
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phihttps://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúc
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúcKỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúc
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúcHạnh Hiền
 

What's hot (20)

Hóa Sinh thực phẩm đại cương
Hóa Sinh thực phẩm đại cươngHóa Sinh thực phẩm đại cương
Hóa Sinh thực phẩm đại cương
 
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...
Nghiên cứu trồng nấm bào ngư xám trên cơ chất mạt cưa cao su có bổ sung phân ...
 
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...
Sử dụng vi khuẩn Rhodobacteria để xử lí chất hữu cơ trong nước - Gửi miễn phí...
 
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...
Đề tài: Xây dựng kế hoạch phòng vệ thực phẩm cho nhà máy sản xuất bột mì Bình...
 
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vat
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vatChuong 1 sinh ly te bao thuc vat
Chuong 1 sinh ly te bao thuc vat
 
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứaNghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất rượu vang từ quả dứa
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
 
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt namNghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
Nghiên cứu quy trình sản xuất kim chi thập cẩm việt nam
 
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (mic) cho cao chiết et...
 
Luận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus
Luận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng BacillusLuận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus
Luận văn: Tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus
 
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối v...
 
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
Sử dụng vi khuẩn bacillus subtilis và lactobacillus thủy phân thức ăn thừa tạ...
 
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưuNghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
Nghiên cứu sản xuất thanh long sấy bằng phương pháp sấy đối lưu
 
Bai giang cong nghe enzyme
Bai giang cong nghe enzymeBai giang cong nghe enzyme
Bai giang cong nghe enzyme
 
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-tr
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-trDoko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-tr
Doko.vn 1833940-enzyme-protease-va-ung-dung-tr
 
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (basella alba...
 
Đánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩmĐánh giá chất lương thực phẩm
Đánh giá chất lương thực phẩm
 
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phi
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phiNghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phi
Nghiên cứu quy trình chế biến sản phẩm chả cá rô phi
 
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính ...
 
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúc
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúcKỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúc
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro và thực hành trên cây hoa cúc
 

Similar to Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra

Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệm
Nghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệmNghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệm
Nghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệmTÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...
Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...
Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.ssuser499fca
 
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...luanvantrust
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...luanvantrust
 
Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...
Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...
Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Similar to Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra (20)

Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
 
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
Nghiên cứu ứng dụng màng chitosan nano bạc - tinh dầu nghệ trong bảo quản nhằ...
 
Luận án: Sử dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất lúa an toàn
Luận án: Sử dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất lúa an toànLuận án: Sử dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất lúa an toàn
Luận án: Sử dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất lúa an toàn
 
Luận văn: Giải pháp phát triển sản xuất nông nghiệp hàng hoá, HAY
Luận văn: Giải pháp phát triển sản xuất nông nghiệp hàng hoá, HAYLuận văn: Giải pháp phát triển sản xuất nông nghiệp hàng hoá, HAY
Luận văn: Giải pháp phát triển sản xuất nông nghiệp hàng hoá, HAY
 
Luan van thac si kinh te (25)
Luan van thac si kinh te (25)Luan van thac si kinh te (25)
Luan van thac si kinh te (25)
 
Luận văn: Điều kiện an toàn thực phẩm của bếp ăn tập thể; kiến thức, thực hàn...
Luận văn: Điều kiện an toàn thực phẩm của bếp ăn tập thể; kiến thức, thực hàn...Luận văn: Điều kiện an toàn thực phẩm của bếp ăn tập thể; kiến thức, thực hàn...
Luận văn: Điều kiện an toàn thực phẩm của bếp ăn tập thể; kiến thức, thực hàn...
 
Nghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệm
Nghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệmNghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệm
Nghiên cứu chế biến bia nồng độ cồn thấp trong phòng thí nghiệm
 
Luận án: Hiệu quả kinh tế chăn nuôi gà ở tỉnh Thừa Thiên Huế
Luận án: Hiệu quả kinh tế chăn nuôi gà ở tỉnh Thừa Thiên HuếLuận án: Hiệu quả kinh tế chăn nuôi gà ở tỉnh Thừa Thiên Huế
Luận án: Hiệu quả kinh tế chăn nuôi gà ở tỉnh Thừa Thiên Huế
 
Luận văn: Đánh giá hiện trạng và nghiên cứu sử dụng bèo tây xử lý nước thải c...
Luận văn: Đánh giá hiện trạng và nghiên cứu sử dụng bèo tây xử lý nước thải c...Luận văn: Đánh giá hiện trạng và nghiên cứu sử dụng bèo tây xử lý nước thải c...
Luận văn: Đánh giá hiện trạng và nghiên cứu sử dụng bèo tây xử lý nước thải c...
 
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...
 
Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...
Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...
Khảo sát vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn tập thể của nhà máy kẽm điện ph...
 
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ công nghệ thực phẩm.
 
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
 
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
Nghiên cứu trồng sắn thu lá và sử dụng bột lá sắn trong chăn nuôi gà thịt và ...
 
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
Khảo sát thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm tại bếp ăn công nghiệp của công...
 
Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...
Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...
Nghiên cứu, so sánh khả năng xử lý rác thải nhà bếp thành phân hữu cơ của giu...
 
Bón phân khoáng theo chẩn đoán dinh dưỡng lá cây cao su, HAY
Bón phân khoáng theo chẩn đoán dinh dưỡng lá cây cao su, HAYBón phân khoáng theo chẩn đoán dinh dưỡng lá cây cao su, HAY
Bón phân khoáng theo chẩn đoán dinh dưỡng lá cây cao su, HAY
 
Luận án: Hiệu quả kinh tế và những rủi ro trong sản xuất hồ tiêu
Luận án: Hiệu quả kinh tế và những rủi ro trong sản xuất hồ tiêuLuận án: Hiệu quả kinh tế và những rủi ro trong sản xuất hồ tiêu
Luận án: Hiệu quả kinh tế và những rủi ro trong sản xuất hồ tiêu
 
Luận văn: Phân tích hàm lượng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm, HAY
Luận văn: Phân tích hàm lượng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm, HAYLuận văn: Phân tích hàm lượng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm, HAY
Luận văn: Phân tích hàm lượng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm, HAY
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏiDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏiDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc
200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc
200 de tai khoa luạn tot nghiep nganh tam ly hoc
 
Danh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểmDanh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành khách sạn,10 điểm
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngân hàng, hay nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ngữ văn, hay nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểmDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ ô tô, 10 điểm
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản lý giáo dục mầm non, mới nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhấtDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhất
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ quản trị rủi ro, hay nhất
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏiDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tài chính ngân hàng, từ sinh viên giỏi
 
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểmDanh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểm
Danh sách 200 đề tài luận văn thạc sĩ tiêm chủng mở rộng, 10 điểm
 
danh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhua
danh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhuadanh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhua
danh sach 200 de tai luan van thac si ve rac nhua
 
Kinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay Nhất
Kinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay NhấtKinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay Nhất
Kinh Nghiệm Chọn 200 Đề Tài Tiểu Luận Chuyên Viên Chính Trị Hay Nhất
 
Kho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểm
Kho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểmKho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểm
Kho 200 Đề Tài Bài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Kế Toán, 9 điểm
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại họcKho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Ngành Thủy Sản, từ các trường đại học
 
Kho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tử
Kho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tửKho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tử
Kho 200 đề tài luận văn ngành thương mại điện tử
 
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểmKho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành điện tử viễn thông, 9 điểm
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu HọcKho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Giáo Dục Tiểu Học
 
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhất
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhấtKho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhất
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành luật, hay nhất
 
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểmKho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểm
Kho 200 đề tài luận văn tốt nghiệp ngành quản trị văn phòng, 9 điểm
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin HọcKho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin Học
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Sư Phạm Tin Học
 
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập Khẩu
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập KhẩuKho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập Khẩu
Kho 200 Đề Tài Luận Văn Tốt Nghiệp Ngành Xuất Nhập Khẩu
 

Recently uploaded

Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfhoangtuansinh1
 
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líKiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líDr K-OGN
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxChàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxendkay31
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...hoangtuansinh1
 
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNguyễn Đăng Quang
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...Nguyen Thanh Tu Collection
 
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...Nguyen Thanh Tu Collection
 
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhvanhathvc
 
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoabài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa2353020138
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...ThunTrn734461
 
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxTrích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxnhungdt08102004
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdfSơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdftohoanggiabao81
 

Recently uploaded (19)

Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
 
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líKiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
 
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
 
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxChàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
 
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
 
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
 
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
 
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
 
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoabài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
 
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxTrích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
 
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdfSơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
 

Luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Út Lợt NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU CALCIUM VÀ PROTEIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012
  • 2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Út Lợt NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU CALCIUM VÀ PROTEIN Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2012
  • 3. LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Chiến Phương, người đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Và thầy cũng là người giúp tôi gắn kết được khoa học với thực tế. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Khoa Sinh học Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi. Tôi xin giử lời cảm ơn đến các anh chị của phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học - Viện sinh học nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa, khoa Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bà Bùi Thị Truyền, giám đốc Công ty trách nhiệm chế biến thủy sản Minh Quý - cụm công nghiệp Tân Mỹ Chánh - TP. Mỹ Tho - tỉnh Tiền Giang đã cung cấp nguyên liệu cho tôi thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và động nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi.
  • 4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Các tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác thực. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Út Lợt
  • 5. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................i LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... ii MỤC LỤC.................................................................................................................... iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH.......................................................................................... vii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...........................................................................................x DANH MỤC CÁC BẢNG ...........................................................................................xi MỞ ĐẦU ........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3 1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu.................................................................3 1.1.1 Vi khuẩn Bacillus..........................................................................................3 1.1.2 Vi khuẩn lactic..............................................................................................7 1.2. Giới thiệu về cá tra...........................................................................................17 1.2.1 Vị trí phân loại ............................................................................................17 1.2.2 Đặc điểm chung ..........................................................................................17 1.2.3 Tình hình sử dụng phụ phẩm cá tra ...........................................................18 1.3 Tổng quan về TP giàu calcium và protein ......................................................19 1.3.1 Giới thiệu về calcium..................................................................................19 CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………25 2.1 Nguyên vật liệu ..................................................................................................25 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................25 2.1.2 Nguyên liệu.................................................................................................25 2.1.3 Hóa chất ......................................................................................................25 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ .....................................................................................25
  • 6. 2.2 Môi trường nghiên cứu.....................................................................................26 2.3 Nội dung nghiên cứu .........................................................................................27 2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm.........................................................................................27 2.3.2 Bố trí thí nghiệm.........................................................................................29 2.4 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................37 2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38] ...........................................37 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn.........................37 2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33]...........................40 2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32]...........41 2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]42 2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20]....44 2.4.7 Phương pháp định tính acid lactic [16] [21]...............................................45 2.4.8 Phương pháp định lượng acid tổng [2] [21] ..............................................46 2.4.9 Phương pháp xác định độ ẩm [3] [10] ........................................................46 2.4.10 Phương pháp định lượng calcium [3] [10]................................................47 2.4.11 Định lượng đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl) [3] [10] ......................48 2.4.12 Định lượng đạm formol (phương pháp Sorensen) [3] [10] ......................50 2.4.13 Phương pháp xác định đạm ammoniac [3] [10] .......................................51 2.4.14 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................53 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..............................................................54 3.1 Khảo sát thành phần hóa học của bột xương cá tra ......................................54 3.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus và VK lactic..................................................54 3.2.1 Bacillus .......................................................................................................55 3.2.2 VK lacic ......................................................................................................56 3.2.3 Kết quả định danh đến loài bằng sinh học phân tử.....................................58 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease và acid của 2 chủng VK nghiên cứu...............................................59 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens..............................................59
  • 7. 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei.................................................................................69 3.4 Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens .........................................79 3.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước...........................................................................80 3.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy.............................................................81 3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ..............................................................................83 3.4.4 Ảnh hưởng của thời gian ............................................................................84 3.5 Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei...................................................................85 3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men..............................................................85 3.5.2 Ảnh hưởng của thời gian trích ly................................................................86 3.6 Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV......................................................................................88 CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................90 4.1 Kết luận..............................................................................................................90 4.2 Kiến nghị............................................................................................................90 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................92 PHỤ LỤC.....................................................................................................................98
  • 8. DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CCa 2+ Hàm lượng calcium HSTNđht Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan HSTP Hiệu suất thủy phân KL Khuẩn lạc MT Môi trường NF Nitrogen formol NNH3 Nitrogen ammoniac NTS Nitrogen tổng số NL Nguyên liệu STP Sau thủy phân TP Thực phẩm t0 opt Nhiệt độ tối thích VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật
  • 9. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic........................................................................... 8 Hình1.2: Lactobacillus casei ................................................................................................. 10 Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus........................................................................................ 11 Hình 1.4: Lactobacillus brevis............................................................................................... 12 Hình 1.5: Cá tra....................................................................................................................... 7 Hình 1.6: Sữa giàu calcium .................................................................................................. 21 Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium......................................................................... 22 Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium.................................................................... 22 Hình 3.1: Bột xương cá tra................................................................................................... 54 Hình 3.2: Hình thái KL của Bacillus (x4) ........................................................................... 55 Hình 3.3: Hình thái tế bào của Bacillus (x100)................................................................... 55 Hình 3.4: Bào tử của Bacillus (x100)................................................................................... 55 Hình 3.5: Bacillus có catalase dương tính........................................................................... 56 Hình 3.6: Vòng phân giải casein của Bacillus có hoạt tính protease................................ 56 Hình 3.7: Hình thái KL của VK lactic (x4)......................................................................... 57 Hình 3.8: Hình thái tế bào của VK lactic (x100) ................................................................ 57 Hình 3.9: VK lactic có catalase âm tính.............................................................................. 58 Hình 3.10: Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphermen............................................. 58 Hình 3.11: Vòng phân giải casein của Bacillus amyloliquefaciens khi được nuôi........... 60 cấy ở các khoảng thời gian khác nhau ................................................................................ 60 Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của ........................ 60
  • 10. Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 60 Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của ..................................... 62 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 62 Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của ........................... 63 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 63 Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của .................................. 64 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 64 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của......................................... 66 Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 66 Hình 3.17: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens ......................... 67 Hình 3.18: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ................................................................................................................. 70 Hình 3.19: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của............................. 71 Lactobacillus casei ................................................................................................................. 71 Hình 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của ................................. 73 Lactobacillus casei ................................................................................................................. 73 Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ................................................................................................................. 74 Hình 3.22: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ................................................................................................................. 75 Hình 3.24: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei ...................................... 78 Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ............................................ 81
  • 11. Hình 3.26: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra ..................................................................... 82 Hình 3.27: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ........................................................ 83 Hình 3.28: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ........................................................ 85 Hình 3.29: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra........................................................................................... 86 Hình 3.30: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei........................................................................... 87 Hình 3.31: Dịch xương cá tra............................................................................................... 88
  • 12. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt)............. 13 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu TP giàu calcium và protein............................................................................................... 28 Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens.................................................. 31 Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei ...................................................................................... 33 Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens.................................... 35 Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ..................................................... 36
  • 13. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được............................... 18 Bảng 1.2: Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra....................................... 19 Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng ..................................... 24 Bảng 3.2: Đặc điểm sinh học của Bacillus.......................................................................... 55 Bảng 3.3: Đặc điểm sinh học của VK lactic ....................................................................... 56 Bảng 3.4: Mật độ tế bào Bacillus amyloliquefaciens trong giống các cấp ...................... 59 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của......................... 60 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 60 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của...................................... 61 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 61 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của ............................ 63 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 63 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của ..................................... 4 Bacillus amyloliquefaciens..................................................................................................... 4 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của.......................................... 65 Bacillus amyloliquefaciens................................................................................................... 65 Bảng 3.10: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens ....................... 67 Bảng 3.11: Mật độ tế bào Lactobacillus casei trong giống các cấp ................................. 69 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei................................................................................................................ 70 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của............................ 71
  • 14. Lactobacillus casei................................................................................................................ 71 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của................................ 72 Lactobacillus casei................................................................................................................ 72 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei................................................................................................................ 74 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei................................................................................................................ 75 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid của.................................... 76 Lactobacillus casei................................................................................................................ 76 Bảng 3.18: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei..................................... 78 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens........................................... 80 Bảng 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra ................................................................... 82 Bảng 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 83 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 84 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra.......................................................................................... 86 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ......................................................................... 87 Bảng 3.25: Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV ................................................................................ 88
  • 15. MỞ ĐẦU  Lí do chọn đề tài Theo nghiên cứu của Viện dinh dưỡng Việt Nam, lượng calcium từ bữa ăn hằng ngày của người Việt Nam trung bình là 700mg. Muốn cung cấp đủ calcium cho cơ thể thì lượng thức ăn phải đảm bảo từ 1.200 - 1.300mg calcium/ngày, thậm chí nhiều hơn trong một số trường hợp cần thiết. Hiện nay, các thực phẩm (TP) giàu calcium chủ yếu nhập từ nước ngoài với giá thành cao. Trong khi đó, các nguồn nguyên liệu TP giàu calcium tại Việt Nam rất nhiều, đặc biệt trong phế phẩm động vật như vỏ ghêu, vỏ sò, xương cá, xương gia súc, xương gia cầm, … đang bị bỏ phí, chưa được tận dụng và gây ô nhiễm môi trường (MT). Trong đó, phụ phẩm cá tra được xem như một nguồn tiềm năng cung cấp nguyên liệu giàu calcium và protein rất cần thiết cho con người. Vì vậy, vấn đề xử lý phụ phẩm cá tra hiệu quả, kinh tế và thân thiện với MT đang ngày càng trở nên cấp thiết. Những năm gần đây, việc tận dụng phụ phẩm cá tra đang được sự quan tâm đầu tư của các doanh nghiệp chế biến thủy sản nhằm chế biến ra những mặt hàng có giá trị gia tăng như: đầu, xương chế biến thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi, da cá xuất khẩu sang châu Âu phục vụ công nghiệp TP, dược phẩm, ... Bên cạnh đó việc xử lý loại phụ phẩm này bằng phương pháp sinh học đang rất được quan tâm, đặc biệt là sử dụng VSV, vì đây là một trong những biện pháp thân thiện với môi trường nhằm tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng và giá trị dinh dưỡng cao. Từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein”.  Mục đích của đề tài Nghiên cứu điều kiện tối ưu để xử lý xương cá tra bằng tác dụng của VSV tạo ra nguyên liệu TP giàu calcium và protein.  Đối tượng nghiên cứu Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp.  Nhiệm vụ của đề tài
  • 16. - Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra. - Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện MT nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens và khả năng sinh acid của Lactobacillus casei. - Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens. - Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra (sau khi tách protein) bằng dịch lên men Lactobacillus casei. - Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra đã được xử lý bằng VSV.
  • 17. CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu 1.1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1.1 Đặc điểm chung * Vị trí phân loại Bacillus là giống lớn, đa dạng (có khoảng 48 loài). Theo Ferdinand Cohn (1872), Bacillus (VK tạo nội bào tử) có vị trí phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacilliales Họ: Bacilliaceae Giống: Bacillus (trực khuẩn tạo nội bào tử) Một số loài thường gặp như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus mensentericus, ... Loài Bacillus amylolyquefaciens có quan hệ rất gần gũi với loài Bacilus subtilis là hai loài phụ của nó là Bacillus licheniformis và Bacillus pumilus tạo nên nhóm Bacilus subtilis. Vì vậy có khi người ta còn gọi Bacillus amyloliquenfaciens là Bacillus subtilis subsp. amyloliquefaciens. Danh pháp chủng loại quốc tế của Bacillus amyloliquenfaciens là chủng (Strain) ATCC 23350. [40] * Môi trường sống Bacillus có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên như trong rơm cỏ, mùn thực vật, đất, không khí, trên bề mặt các loại hạt và sản phẩm được chế biến từ hạt, ... [45] [65] Bacillus có mức độ thích nghi cao. Phần lớn Bacillus là VK ưa nhiệt với nhiệt độ tối thích (t0 opt) từ 30 - 450 C, một số chịu nhiệt lên tới 650 C hoặc ưa lạnh với từ 50 C - 250 C nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34 – 370 C. Bacillus sinh trưởng trong khoảng pH rộng từ 2 – 11 [41]. Chúng sinh trưởng tốt ở pH = 7 [33]. Ngoài ra, trong chi này chúng ta có thể gặp một số loài có thể phát triển ở những
  • 18. MT đặc biệt khắc nghiệt như pH cực trị, nhiệt độ rất cao (một số chủng có thể sống ở MT 1000 C trong 30 phút) [45] [65] hoặc rất thấp, và nồng độ muối rất cao mà ít sinh vật nào có thể chịu được là do chúng có khả năng hình thành nội bào tử (nha bào) tồn tại ở trạng thái “ngủ đông” trong thời gian dài [41] [52], và tái tổ hợp DNA bộ gen với DNA lạ [45] [61]. Dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu trong phòng thí nghiệm, Bacillus có thời gian thế hệ là 25phút. [41] * Về hình thái KL khô, không màu hoặc màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra một lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi, lõm nhiều hay ít bám chặt vào môi trường thạch. [5] [45] [65] Tế bào hình que, kích thước 0.3 - 2.2 x 1.2 - 7µm [41], tế bào thường nối với nhau thành chuỗi có độ dài khác nhau hoặc tạo ra lớp riêng rẽ [45] [65]. Bào tử có dạng hình cầu elip hay hình trụ tròn nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào và túi bào tử phồng hoặc không phồng, bào tử có kích thước 0.6 - 0.9 x 1.0 - 1.5µm. [43] [68] * Về sinh lý, sinh hóa Bacillus là loại trực khuẩn Gram dương, phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi trong chu trình sống của nó, chỉ những tế bào còn non mới chắc chắc là Gram dương. Chúng có sinh bào tử [43], khác với tế bào dinh dưỡng, vách bào tử mỏng, không bắt màu phẩm nhuộm được bao bọc bởi vỏ trong có cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài nên nó bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu, bền với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác. Tế bào khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao. [1] Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện. Là những sinh vật hóa dị dưỡng thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ, chúng có khả năng sử dụng chất hữu cơ do nhiều nguồn cơ chất khác nhau cung cấp như tinh bột, đường, protein đến chất béo, một số VK tự dưỡng không bắt buộc (Bacillus schlegelli). Chúng có khả năng phát triển trong MT chỉ có CO2 và tạo ra ATP thông qua quá trình lên men butandiol cũng như amon hóa nitrate. [36] [46]
  • 19. Chu trình sống của Bacillus được chia ra làm 3 giai đoạn: tăng trưởng sinh dưỡng, hình thành bào tử và nảy mầm. Tăng trưởng tế bào sinh dưỡng xảy ra khi các chất dinh dưỡng dồi dào và tăng trưởng theo hàm số mũ. Khi chất dinh dưỡng cạn kiệt chúng bắt đầu hình thành bào tử. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo một bào tử, bào tử này có khả năng chịu nhiệt, chịu tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm. Vì vậy, Bacillus có thể chịu được nhiều sinh cảnh khắc nghiệt như cát sa mạc, suối nước nóng, môi trường đất ở Bắc Cực và có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm [43]. Tuy nhiên sự phát triển bào tử không phải là sự phát triển tùy chọn của tế bào sinh dưỡng mà nó cũng có thể theo những trình tự thay đổi khác nhau, việc biểu hiện các gen là cần thiết để đáp ứng lại các điều kiện bất lợi của MT hoặc tìm kiếm các chất dinh dưỡng khác và tăng cường khả năng cạnh tranh chống lại các loài khác [39]. Việc hình thành bào tử là một quá trình phức tạp tiêu tốn nhiều năng lượng, tế bào cần giảm nhu cầu sử dụng chất dinh dưỡng để đảm bảo đủ chất dinh dưỡng cho quá trình hình thành bào tử (Gonzalez – Pastor et al, 2003). Trong điều kiện đó, chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme như amylase, chitinase, hemicellulase, glucanase, lipase, protease, ... [43] [37] và các chất chuyển hóa sơ cấp như chất kháng sinh, inosinic acid, guanilic acid, nucleotide acid, các hợp chất thứ cấp, ... [1] 1.1.1.2 Một số ứng dụng và tác hại của Bacillus * Ứng dụng của Bacillus Bacillus được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: - Trong công nghiệp: + Bacillus có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp như được ứng dụng nhiều trong α - amylase, protease, phytase, ... có vai trò trong công nghệ thực phẩm như amylase dùng để đường hoá tinh bột hay hệ enzyme của Bacillus subtilis được ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa và sản xuất enzyme công nghiệp. Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp lysine khá cao (15 - 20%) từ tinh bột nên được ứng
  • 20. dụng để sản xuất lysine, lên men đậu nành [38]. Bacillus amyloliquefaciens được thế giới sử dụng để sản xuất α – amylase và protease ở quy mô công nghiệp. + Ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da. Việc xử lý da bằng cách sử dụng enzyme là tốt nhất vì nó mang lại nhiều lợi thế: dễ kiểm soát, nhanh chóng và giảm được chất thải. Xử lý bằng enzyme sẽ tiêu hủy các sắc tố không mong muốn, từ đó có được da sạch [42]. George và cộng sự (1995) sử dụng protease kiềm của B. amyloliquefaciens cho việc làm rụng lông và da. - Trong nông nghiệp: Do Bacillus có khả năng tạo bào tử, sinh các loài enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus pyogenes, E. coli, Salmonella, Vibrio sp, ... nên được sử dụng làm probiotic. [25] [35] Ví dụ như Bacillus subtilis bổ sung trong thức ăn chăn nuôi nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng, giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi [38]. Yerra Koteswara Rao và cộng sự (2006) đã nghiên cứu và chứng minh được chủng Bacillus amyloliquefaciens B128 là một tác nhân kiểm soát sinh học đối với Botrylis elliptica (mầm bệnh màu xám mốc trên hoa huệ). - Bảo vệ môi trường: Một số loài thuộc chi này có khả năng sinh protease và cellulase với hoạt tính khá cao như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacien, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, ... người ta sử dụng chúng làm phân bón hữu cơ để thủy phân protein thực vật và động vật có trong rác hữu cơ hoặc sử dụng để xử lý rác thải [38][23]. Ngoài ra, chúng còn là một trong những thành phần của sản phẩm dùng để xử lý môi trường nuôi tôm và thức ăn bổ sung cho tôm. Thành phần của các sản phẩm này là các VSV (Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Lactic bacteria, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodosporidium toruloides) mà trong đó mỗi loại giữ một chức năng riêng và tổng của các sản phẩm là hệ VSV có ích, giúp cho con tôm phát triển khoẻ mạnh, chống lại được một số bệnh và điều kiện khắc nghiệt [50]. - Trong y dược: Bacillus được ứng dụng tạo ra nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu như: Bacillus subtilis được đóng thành từng ống 10ml hoặc gói dạng bột gọi là
  • 21. subtilin (Humfeld and Feustel, 1943) để điều trị bệnh tiêu chảy cho người do Coliforms gây ra, bệnh đường ruột do lị trực trùng hoặc dùng để đắp vết thương ngoài da [38]. Từ Bacillus subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh như Subtilin (Humfeld and Feustel, 1943), Eulycin (Johnson and Durdon, 1946), Bacillomin (Shtikell and Poplavskii, 1955) * Tác hại của Bacillus - Đa số các loài thuộc chi Bacillus là vô hại, một số có hại là do chúng có khả năng tạo bào tử. Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là: + Bacillus subtilis có thể sống sót trong độ nóng rất cao đó là tác nhân chính làm bánh mì bị hư, gây hỏng một số thực phẩm đồ hộp làm thực phẩm đồ hộp có mùi thối chua rất khó chịu, là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa bánh ngọt, chocolate, kẹo có nhân được bảo quản khi khí hậu nóng, gây bệnh “chảy nhớt khoai tây” và “chảy nhớt bánh mì” được Laurent phát hiện đầu tiên 1885. [52] + Bacillus coagulans có thể phát triển ở mức pH = 4.2 và gây ra vị chua nặng ở thức ăn đóng hộp và các thức ăn có tính acid mà bình thường khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất. - Ngoài ra bào tử của loài Bacillus cereus phân bố khắp nơi trong đất, không khí, ... thường phát triển trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm. [26] 1.1.2 Vi khuẩn lactic 1.1.2.1 Đặc điểm chung * Vị trí phân loại Theo khóa phân loại của Bergey (1957), VK lactic thuộc: [44] Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus, Pediococcus Họ: Enterococcaceae
  • 22. Giống: Enterococcus Họ: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Ho: Streptococcaceae Giống: Streptococcus, Lactococcus Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic [47] * Môi trường sống Trong tự nhiên, VK lactic thường gặp trong đất, nước, không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật (rau, quả, ...) và các sản phẩm lên men (sữa chua, nem chua, dưa muối chua, ...). Chúng tồn tại trong đường ruột (có nhiều VK lactic thuộc Enterococcus và Lactobacillus, trong đó VK Lactobacillus chiếm số lượng nhiều nhất) và miệng của cơ thể người và động vật [20]. VK lactic không thể phát triển được trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose, NH4 + . Đa số chúng cần hàng loạt vitamin và các acid amin. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của VK lactic ưa ấm là 25 - 350 C, ưa nhiệt 40 - 450 C và ưa lạnh là thấp hơn 50 C. Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800 C thì hầu hết chúng bị chết sau 10 - 30phút. * Đặc điểm hình thái
  • 23. KL tròn, nhỏ, màu trắng sữa, nhẵn bóng, lồi trên bề mặt thạch, có mép đều hoặc rìa xung quanh bám vào môi trường thạch [17]. Tế bào có dạng hình que (trực khuẩn) kích thước 1 - 8µm, xếp thành cặp hay chuỗi với chiều dài khác nhau; hoặc hình cầu (cầu khuẩn) kích thước 0.5 - 1.5 µm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. [20] * Đặc điểm sinh lý, sinh hóa VK lactic là VK Gram dương (tế bào còn non cho kết quả Gram dương, và trở thành Gram âm khi về già, không sinh bào tử (tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ VK lactic có khả năng tạo bào tử) và hầu hết không có khả năng di động. VK lactic không hô hấp do không có cytochrom và catalase âm tính. Là VK có khả năng sống được trong MT có oxy và không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2, H2O và tạo ra 36 hoặc 38 ATP; trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP, do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng sinh. Trong điều kiện hiếu khí sinh khối của VK phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí. LAB có khả năng tổng hợp peroxydase rất mạnh, chúng phân giải H2O2 để tạo H2O và O2 để phát triển. 1.1.2.2 Phân loại Việc phân loại VK lactic khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm hoặc phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. VK lactic trao đổi chất chủ yếu bằng quá trình lên men. VK lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, disaccharid, protein tan, pepton, ... Phần lớn chúng không lên men tinh bột và các polisaccharid khác. Khi nghiên cứu về khả năng lên men lactic từ nguyên liệu chứa đường, người ta thấy có hai nhóm VK
  • 24. lactic chuyển hóa đường hoàn toàn khác nhau: VK lactic đồng hình và VK lactic dị hình [20]. * VK lactic đồng hình - Lactobacillus casei [6] [20] [67] + Là những trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn. Chúng có thể tạo thành chuỗi, không chuyển động, Gram dương. + Yếm khí tuỳ tiện; lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8% - 1% axit lactic; và không tạo catalase. Hình1.2: Lactobacillus casei + Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Chúng thuỷ phân casein và gelatin rất yếu. + Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 10o C, t0 opt từ 28 - 320 C.
  • 25. - Lactobacillus bulgaricus [6] [20] [51] + Là trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, Gram dương, không có khả năng di chuyển. + Nhiệt độ phát triển tối ưu t0 opt từ 45 - 620 C. + Chúng có khả năng lên men glucose, lactose tạo độ axit cao (3,7% axit lactic). Không lên men được xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin. Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus + Chúng không có khả năng tạo nitrite và nitrat. - Streptococcus cremoris [19] [20] [70] + KL tròn, có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng mịn và tạo chất nhày, bề mặt KL lồi và thường nhỏ hơn 1mm. Tế bào cò dạng hình tròn hoặc hình trứng (oval) đường kính 0.5 - 1µm thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc tạo thành chuỗi dài. Cầu khuẩn Gram dương, không nha bào, không di động, và thường không tạo sắc tố. + Thường phát triển t0 opt từ 250 C - 300 C. + Lên men glucose, galactose. Khi lên men sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic, … (Gunsalus and Niven, 1942) * VK lactic dị hình - Lactobacillus pasteurianus [20] + Là trực khuẩn Gram dương có kích thước 0.5 - 1.0µm x 7.0 - 35µm. Trong tự nhiên chúng tồn tại riêng rẽ, không di động. + Nhiệt độ thích hợp là 290 C - 330 C. + pH thích hợp 8.0.
  • 26. + Có khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, rafinose, trehalose, mannitol, dextrin. Trong quá trình lên men tạo một loạt sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic. - Lactobacilus brevis [20] [54] + Là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0.7 - 1.0µm x 2.0 - 4.0µm, chúng liên kết với nhau thành chuỗi, không di động. + Chúng có nhiều trong sữa, kefia, dưa chua. Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat calcium như nguồn cung cấp cacbon. Hình 1.4: Lactobacillus brevis + Chúng có khả năng lên men các loại đường như arabinose, xylose, glucose, fructose, galactose, maltose. + Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300 C. - Streptococcus cumoris [20] + Là cầu khuẩn Gram dương, trong tự nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài. + Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 300 C. + Chúng không phát triển được ở nồng độ NaCl 4%. + Khi lên men đường tạo acid acetic, diacetyl, CO2. + Chúng có khả năng tạo các chất kháng khuẩn. 1.1.2.3 Quá trình lên men lactic [6] [20] [30] Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường tạo acid lactic dưới tác dụng của VK lactic. Do các VK lactic khác nhau tham gia có cơ chế khác nhau và sản phẩm chính phụ khác nhau nên lên men lactic được chia thành hai loại: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.
  • 27. Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt) [51] (1) lactate dehydrogenase; (2) alcohol dehydrogenase * Lên men lactic đồng hình Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic, chiếm 90 - 98% tổng sản phẩm lên men. Ngoài ra còn một lượng nhỏ acid bay hơi, rượu ethanol và các sản phẩm khác. Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình: C6H12O6 → 2CH3-CHOH-COOH Các VK lên men lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường Embden - Mayerhof, nhưng chúng không có đủ enzyme carboxylase nên acid pyruvic không Glucose ATP ADP ATP ADP Acetaldehyde Glucose - 6 - P Fructose - 6 - P Fructose - 1,6 - bis P 6 - Phosphogluconate Xylulose - 5 - P NAD- NADH ATP ADP NADH NAD+ CO2 Glyceraldehyde - 3 - P Dihydroxyacetone - P Glyceraldehyde - 3 - P Acetyl - P 2 Pyruvate 2 Lactate 2NADH 2NAD+ Pyruvate Lactate 2NADH 2NAD+ Ethanol NADH NAD+ NADH NAD+ 2NAD+ 2NADH 4ADP 4ATP 2H2O NAD+ NADH 2ADP 2ATP H2O (1) (1) (2)
  • 28. bị phân giải tiếp tục mà chỉ nhận hydro để tạo thành acid lactic, một phần nhỏ acid lactic bị decarboxyl để tạo một lượng nhỏ sản phẩm phụ nói trên. Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghệ thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Các chủng VK tham gia trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống: Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricum, Lactobacillus plantarum, …) và Streptococcus (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, …). * Lên men lactic dị hình Quá trình lên men tạo sản phẩm đa dạng, ngoài acid lactic còn hang loạt các sản phẩm khác với tỉ lệ khá cao như: acid lactic 40%, acid sucxinic và ethanol 20%, acid acetic 10% , các chất khí (CO2, H2) 20%, … Phương trình tổng quát lên men dị hình: C6H1206 → CH3-CHOH-COOH + COOH-(CH)2-COOH + CH3COOH + C2H2OH + CO2 + H2 … Quá trình lên men dị hình là sự lên men khá phức tạp, những VK lên men kiểu này có men decarboxylase để phân huỷ acid pyruvic ra CO2 và CH3CHO. Tuy nhiên enzyme này không phân giải hết được acid pyruvic, nên một phần acid này được chuyển thành acid lactic và acid sucxinic. Trong hệ VK lactic dị hình, thiếu các enzyme chủ yếu của con đường Embden - Mayerhof, đó là adolase và triosephosphate isomerase nên glucose sẽ chuyển hóa theo chu trình pentosephosphate qua hàng loạt sản phẩm trung gian để tạo xilulose 5-phosphate, sau đó bị phân ly thành aldehyde và acetyl phosphate. Từ aldehyde, phosphoglycerinic chuyển tiếp tạo thành acid succinic và acid lactic, còn acetyl phosphate tiếp tục chuyển hóa theo hai hướng để tạo ethanol và acid acetic. Quá trình lên men dị hình tạo nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém. Tuy nhiên quá trình này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến một số loại thực phẩm. VK lactic dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn.
  • 29. Các chủng VK chủ yếu lên men lactic dị hình: Bacterium aeogenes, Bacterium pentoacetium, Lactobacillus brevis, ... 1.1.2.4 Một số ứng dụng và tác hại của VK lactic VK lactic là nhóm VK có rất nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia vào tất cả hoạt động sống của con người nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: * Công nghệ thực phẩm - Bacteriocin: Việc lên men thực phẩm bằng cách sử dụng VK lactic là phương pháp bảo quản truyền thống dựa vào sự đối kháng các loại VSV khác nhau. Một trong những đặc điểm quan trọng của VK lactic là khả năng tạo các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn gọi là bacteriocin (Klaenhammer, 1987) [49]. Một vài loại bacteriocin từ VK lactic như Nisin (Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454), Pediocin A (Pediococcus pentosaceus FBB61 và L - 7230), Pediocin AcH (Pediococcus acidilactici H), Leucocin (Leuconostoc gennlidum), ... Các bacteriocin có khả năng kìm hãm sự phát triển của các VK gây bệnh hay gây hư hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp, Enterococcus spp [48]. - Probiotics: là những VSV sống mà khi đưa vào cơ thể người hay động vật nó có những tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ và làm tăng khả năng hoạt động hệ VSV của vật chủ (Hevenaar và Huis in’t Veld, 1992). Một số VK lactic được sử dụng như probiotics là: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, ....(Conway, 1996). - Trong quá trình lên men, VK lactic có khả năng tạo ra acid lactic và acid acetic cùng với một số loại acid hữu cơ khác. Chính vì thế chúng được ứng dụng để sản xuất dưa chua, sản xuất tương, sản xuất đậu phụ, sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa, .... * Trong y dược - VK lactic được dùng trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất sản phẩm mang tên là Biolactyl chuyên trị tiêu chảy bằng VK lactic [20]. Có nhiều
  • 30. nghiên cứu để chữa bệnh tiêu chảy, kết quả cho thấy chủng Streptococcus boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng Lactobacillus acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006). Tính hiệu quả của phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng VSV được sử dụng và liều lượng, có thể giảm đến 50% mức độ của bệnh. Các loại thực phẩm bổ sung VK lactic được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp, giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em và tiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002). - Mặc dù vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên VK lactic được cho là có một số hiệu ứng có lợi cho chức năng miễn dịch. VK lactic có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh bằng sự ức chế cạnh tranh báo hiệu cho tế bào chủ làm giảm đáp ứng viêm; tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và Martha, 2003); tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA - kháng thể chính trong cơ thể; hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ lympho - T (Reid et al., 2003), Ouwehand et al., 2002); kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (O'Toole và Cooney, 2008). - VK lactic ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặp khi dùng kháng sinh. Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" trong khi VK lactic lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản ứng với lây nhiễm mới. * Một số ứng dụng khác - VK lactic được ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid lactic. Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo và các loại muối lactate (các loại lactat kim loại được sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal và của hãng mỹ phẩm Punac có tác dụng chống lại các VSV có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da) [20]. - Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi [6].
  • 31. Ngoài mặt có lợi ra, trong một số ngành công nghiệp quá trình lên men lactic lại rất có hại. Nếu bị nhiễm khuẩn lactic thì quá trình sản xuất rượu vang, rượu, nước giải khát, đồ hợp, sản xuất đường, mật tinh bột bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Do đó, phải dùng nhiều phương pháp khác nhau để chống sự hư hỏng này [18]. 1.2. Giới thiệu về cá tra 1.2.1 Vị trí phân loại Phân loại khoa học [58] Giới: Animalia Ngành: Chordata Phân ngành: Vertebrata Lớp: Actinopterygii Phân lớp: Neopterygii Liên bộ: Ostariophysi Bộ: Siluriformes Hình 1.5: Cá tra Họ: Pangasiidae 1.2.2 Đặc điểm chung Cá tra là một loài cá có giá trị kinh tế quan trọng và nuôi rộng rãi ở các tỉnh ĐBSCL, phân bố trong tự nhiên ở vùng hạ lưu sông Mêkong. Cá tra là cá da trơn, thân dài, dẹp ngang, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to. Vây lưng cao, có một gai cứng có răng cưa. Vây ngực có ngạnh, bụng có 8 tia phân nhánh, trong khi các loài khác có 6 tia (Phạm Văn Khánh, 1996). Mẫu thu được lớn nhất trong tự nhiên dài 90cm, nặng 17kg. [34] [65]
  • 32. Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được Tổng năng lượng cung cấp (Calori) Chất đạm (g) Tổng lượng chất béo (g) Chất béo chưa bão hòa (có DHA, EPA) (g) Cholesterol (%) Natri (mg) 124.52 23.42 3.42 1.78 0.025 70.6 Trong thành phần dinh dưỡng của cá tra có chứa các axit béo chưa bão hoà. Các chất này rất hữu ích trong việc bảo vệ màng tế bào và giúp làm giảm Cholesterol trong máu, từ đó sẽ làm giảm các bệnh tim mạch. Bên cạnh đó, trong cá tra còn có DHA (acid docohexanoic) và EPA (acid écosapentaenoic) hay còn gọi là Omega - 3 có thể giúp làm giảm hàm lượng triglyceride cao trong máu, một yếu tố gây nên bệnh tim. Theo Hiệp hội Tim Hoa Kỳ, chất béo Omega - 3 giúp bảo vệ cơ thể chống lại chứng rối loạn nhịp tim, từ đó giảm nguy cơ đột tử. Ngoài ra, chất béo Omega - 3 còn giúp ngăn ngừa quá trình xơ cứng động mạch (là nguyên nhân dẫn đến chứng xơ vữa động mạch), làm giảm nguy cơ bị lão hóa não, tăng cường hoạt động của trí nhớ, ... [64] 1.2.3 Tình hình sử dụng phụ phẩm cá tra Trong quy trình sản xuất cá tra philê đông lạnh xuất khẩu, người ta chỉ lấy phần nạc của cá, các bộ phận còn lại như da cá, mỡ cá, xương cá, nội tạng, … chiếm trên dưới 70% khối lượng nguyên liệu, được bán với giá rất rẻ. [60] Trong khi đó, theo kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Lan Chi và cộng sự (2009) các phần của phụ phẩm cá tra có hàm lượng protein cao (đầu tới 42,68%), xương sống, đuôi, vây lại có hàm lượng tro và calcium khá cao.
  • 33. Bảng 1.2: Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra (% tính trên vật chất khô) [4] Chỉ tiêu (%) Đầu Xương sống Đuôi Vây Protein 42,68 37,91 30,36 37,23 Lipid 28,79 37,91 45,10 41,57 Tro 23,13 20,11 15,24 18,47 Ẩm 62,77 59,72 47,89 57,61 Carbohydrate 5,40 4,57 9,31 2,74 Calcium 3,98 4,49 2,76 3,70 Phosphor 3,87 3,80 2,99 3,05 Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng ta thấy được phụ phẩm cá tra là nguồn nguyên liệu có tiềm năng lớn cho việc chế biến những sản phẩm có giá trị gia tăng hiện nay. Từ phụ phẩm cá tra khi sản xuất phile có thể tận dụng và chế biến thành nhiều sản phẩm giá trị như: [4] - Bột cá làm nguyên liệu cho thức ăn chăn nuôi. - Mỡ cá chế biến thành dầu cá bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Ngoài ra còn được dùng để sản xuất biodiesel, một nguyên liệu thân thiện với môi trường. - Chất khoáng (calcium, phosphor) từ xương bổ sung vào thực phẩm cho động vật nuôi. - Gelatin, collagen từ da cá được sử dụng trong ngày dược phẩm và mỹ phẩm. - Thu nhận enzyme từ nội tạng cá (Kim và Mendis (2006), Shahidi (2007), Nguyễn Thị Yến (2006)). 1.3 Tổng quan về TP giàu calcium và protein 1.3.1 Giới thiệu về calcium * Vai trò của calcium [53] Calcium là một khoáng chất có nhiều nhất, chiếm khoảng 1.5 - 2% thể trọng. Trong cơ thể con người 99% calcium tồn tại trong xương, răng, móng, 1% tồn tại
  • 34. trong máu, trong tổ chức tế bào và dịch ngoài tế bào nhưng có nhiều nhiệm vụ rất quan trọng. Vai trò chính yếu của calcium là phối hợp với sinh tố D để cấu tạo bộ xương và hàm răng vững chắc. Bên cạnh đó calcium cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống các enzyme, sự co cơ, phóng thích chất dẫn truyền thần kinh, duy trì nhịp tim bình thường, quá trình đông máu, … đều chịu ảnh hưởng của calcium. Nhu cầu calcium khác nhau theo từng lứa tuổi. Theo tổ chức y tế thế giới WHO, nhu cầu calcium tối thiểu của cơ thể con người: - Trẻ sơ sinh: 300 - 400mg/ngày. - Nhi đồng: 600 - 800 mg/ngày. - Thanh thiếu niên: 1000 mg/ngày. - Người lớn 24 - 50 tuổi: 800mg/ngày. Người cao tuổi, phụ nữ có thai: 1200 mg - 1500 mg/ngày. Theo Walloc (1991), nếu ăn uống thiếu calcium con người có thể bị mắc 147 bệnh. Vì thế, calcium là khoáng chất cần thiết cho sự sống. * Khả năng đồng hóa của calcium [12][57] Calcium là nguyên tố khó đồng hóa bởi cơ thể. Độ đồng hóa của nó phụ thuộc vào mối tương quan giữa những hợp phần khác của thức ăn như chất béo, chất xơ, magiesium, phospho. Vitamin D là chất điều hòa đồng hóa calcium. Chất béo: điều kiện thuận lợi để hấp thụ calcium tốt khi tỉ lệ calcium ứng với 1g chất béo có trong thức ăn là 0.04 - 0.08g. Thừa hay thiếu chất béo đều không tốt,thiếu chất béo thì sẽ chuyển toàn bộ calcium thành muối calcium của chất béo, thừa chất béo thì không đủ acid mật (inozitphosphoric, oxalic) để chuyển hóa muối calcium của acid béo thành phức hòa tan mà cơ thể có thể hấp thụ được. Do đó, phần lớn sẽ thải ra ngoài cùng với phân. Chất xơ: Việc hấp thu calcium có thể thay đổi tùy thuộc vào bản chất, nguồn gốc của chất xơ. Nhiều loại chất xơ từ các loại rau xanh, đậu quả, quả có màu vàng, chuối, ... không ảnh hưởng tới việc hấp thu calcium. Song ngược lại, chất xơ trong
  • 35. vỏ lúa mạch, vỏ ngũ cốc lại làm giảm hấp thu của calcium. Chất xơ khi kết hợp các thành phần khác của thức ăn như phytat và oxalat cũng sẽ làm giảm sự hấp thu calcium thức ăn. Magnesium: thừa magnesium trong khẩu phần ăn cũng ảnh hưởng xấu đến sự hấp thụ calcium. Để hòa tan muối calcium cũng như muối magnesium đòi hỏi phải kết hợp chúng với acid muối mật, do đó muối magnesium càng nhiều thì acid mật còn lại để kết hợp với muối calcium càng ít, vì thế sẽ làm giảm quá trình hấp thụ calcium của cơ thể. * Nguồn cung cấp calcium Theo các nhà nghiên cứu thì nguồn thức ăn có calcium tốt nhất là sữa và các chế phẩm từ sữa. Sữa không chỉ chứa nhiều calcium mà cơ thể còn dễ hấp thu. Bên cạnh đó, rau xanh và các loại đậu, đặc biệt là đậu tương, vừng, hạt dưa, rong biển, tôm, cua, sò huyết là những thực phẩm chứa nhiều calcium. [61] Trong bột xương và vỏ trứng lượng calcium chiếm đến 20% và khả năng hấp thụ lên tới 70%, chính vì vậy đây cũng là thực phẩm tốt dành cho những người thiếu calcium. Hình 1.6: Sữa giàu calcium [56] [69] Người ta còn có thể bổ sung calcium cần thiết cho cơ thể dưới dạng viên thuốc, dịch hoặc sử dụng thực phẩm có bổ sung calcium. Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng calcium thông qua thực phẩm có lợi hơn là thông qua uống viên calcium, vì hấp thụ tốt hơn và tránh hiện tượng lắng đọng tạo sỏi thận [53].
  • 36. Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium [54] [62] [66] Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium [71] 1.3.2 Giới thiệu về protein Protein (Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptid (gọi là chuỗi polypeptid). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. * Vai trò dinh dưỡng: protein là hợp phần chủ yếu, quyết định toàn bộ các đặc trưng của khẩu phần thức ăn. [59] [63] - Cung cấp các nguyên liệu cho sự tạo máu, bạch huyết, hormone, enzyme, kháng thể, … Cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt vitamin và chất khoáng. - Là nguồn năng lượng cho cơ thể: đáp ứng 10 - 15% năng lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4Kcal. Về nhiệm vụ cung cấp năng
  • 37. lượng có thể thay thế protein bằng các chất dinh dưỡng khác nhưng về mặt tạo hình không có chất dinh dưỡng nào có thể thay thế. - Protein chiếm 19% trọng lượng cơ thể. + Protein là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống, chúng giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển, duy trì sự sống và phục hồi của tế bào và các mô. + Khi thiếu protein trong chế độ ăn hằng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu cho sức khỏe như suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn (đối với trẻ em), giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đỡ của cơ thể đối với một số bệnh. + Thiếu protein sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh. + Thiếu protein cũng sẽ làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái của xương (lượng calcium giảm, lượng magnesium tăng cao). Do vậy mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong thức ăn cho mọi lứa tuổi. * Cơ sở của quá trình thủy phân protein [31] Sự thủy phân protein cũng như mọi phản ứng hóa học khác đều là sự trao đổi điện tử giữa các nguyên tử nhất định của các phân tử phản ứng. Việc thủy phân các phân tử dẫn đến làm đứt liên kết peptit nối nguyên tử carbon của một gốc acid amin này với nguyên tử nitơ của gốc kia và các nhóm amin được giải phóng theo phương trình: H+ C R H H2N C O N H C H R C O N C R H COOH OH- C H H H2N C N CH COOH R O H + C H H2N H COOH * Nguồn protein trong TP [15] Hàm lượng protein trong các thức ăn không giống nhau. - TP có nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều về số lượng, cân đối về thành phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu.
  • 38. - TP có nguồn gốc thực vật (đậu nành, các loại đậu khác, …) là nguồn protein quan trọng. Hàm lượng acid amin thiết yếu cao trong đậu nành còn các loại đậu khác thì hàm lượng acid amin thiết yếu không cao, sự cân đối về thành phần các acid amin thiết yếu thấp hơn protein có nguồn gốc động vật. Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng Tên thực phẩm Lượng protein (g/100g) Tên thực phẩm Lượng protein (g/100g) Đậu nành 34 Tôm đồng 18.4 Đậu phộng 27.5 Trứng vịt 15 Đậu xanh 23.4 Ngô mảnh 8.5 Đậu đen 24.2 Gạo tẻ 7.6 Mè 20.1 Bột mì 11 Thịt trâu, bò 21 Bánh mì 7.9 Thịt gà 21.4 Khoai tây 2 Cá chép 16 Khoai sọ 1.8 Cá lóc 18.2 Khoai lang 0.8
  • 39. CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. - Bacillus amyloliquefaciens - Lactobacillus casei 2.1.2 Nguyên liệu Phụ phẩm cá tra: Công ty trách nhiệm chế biến thủy sản Minh Qúy - cụm công nghiệp Tân Mỹ Chánh - TP. Mỹ Tho - tỉnh Tiền Giang. Dịch tương đậu nành: cơ sở sản xuất đậu phụ Bách hóa tổng hợp - quận Thủ Đức - TP. Hồ Chí Minh. Cà chua, bắp mỹ, giá, đậu nành, nước mắm 350 N, agar, sucrose mua tại chợ An Đông (34 - 36 An Dương Vương phường 9 - Quận 5 - TP. Hồ Chí Minh) 2.1.3 Hóa chất D - glucose, peptone, cao nấm men, cao thịt, casein, peptone, CH3COONa, K2HPO4, MnSO4.4H2O, Amonium citrate, Tween 80, NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaCl, FeSO4.7H2O, H2O2, HCl đặc, NaOH, acid trichloracetic, Na2HPO4, FeCl3, Trilon B (EDTA), H2SO4 đặc, CuSO4, K2SO4, KCN, tyrosin, phenol, murexid, crystal violet, lugol, fuschin, xanh metylen, folin, phenolphthalein, metyl đỏ. 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh cung cấp gồm: 2.1.4.1 Thiết bị
  • 40. Tủ sấy (Memmert - Đức), cân phân tích điện tử (Scientech - Đức), nồi hấp vô trùng (Huxley - Đài Loan), tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ ấm (Binder - Đức), tủ lạnh (National - Nhật Bản), máy đo pH (Hana - Trung Quốc), máy lắc (Gerhardt - Đức), máy li tâm (Hettich - Đức), bể lắc nhiệt (Grant - Anh), kính hiển vi (Olympus - Nhật), máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus - Nhật), máy khuấy từ, máy chưng cất đạm (Gerhardt, Đức), máy phá mẫu (Gerhardt, Đức), máy trung hòa khí (Gerhardt, Đức), máy đo quang phổ UV (Amersham Biosciences, Thụy Điển), máy lắc ống nghiệm, nồi nấu môi trường, bếp điện. 2.1.4.2 Dụng cụ Bình tam giác (50ml, 100ml, 250ml), ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tinh (100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), ống đong (10ml, 100ml, 500ml), ống ly tâm, bình định mức (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), bình hút ẩm, đèn cồn, diêm quẹt, que gạt, que cấy (que cấy vòng, que cấy nhọn), khoan nút chai, pipetman (0,1ml, 1ml, 5ml, 10ml), thước đo, giấy lọc, khăn lọc, bông mỡ, bông thấm nước, lame, lamel, ... 2.2 Môi trường nghiên cứu MT1 (MT giữ giống Bacillus amyloliquefaciens: MT cá peptone): nước mắm 350 N 30ml, peptone 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [7] MT2 (MT giữ giống Lactobacillus casei: MT MRS (de Man, Rogosa and Sharp)): D - glucose 20g, peptone 10g, cao nấm men 5g, cao thịt 10g, CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g, Tween 80 1ml, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [22] MT3 (MT nhân giống Bacillus amyloliquefaciens và Lactobacillus casei, khảo sát hoạt tính và hoạt độ protease: MT sữa đậu nành): sữa đậu nành 1000ml (đậu nành 100g ngâm trương nước từ 4 - 6 giờ → xay nhuyễn → lọc → bổ sung nước cất đến 1000ml), sucrose 20g. MT4 (MT định tính khả năng sinh protease): pepton 5g, cao nấm men 2.5g, casein 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [27]
  • 41. MT5 (MT cà chua: MT khảo sát khả năng sinh acid): Nước ép cà chua 400ml, D - glucose 10g, cao nấm men 10g, dung dịch muối A 5ml (K2HPO4 2,5g, KH2PO4 2,5g, nước cất 250ml), dung dịch muối B 5ml (MgSO4.7H2O 10g, NaCl 5g, FeSO4.7H2O 5g, MnSO4.4H2O 5g, nước cất 250ml), agar 20g, nước cất bổ sung đến: 1000ml. [7] MT6 (MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, nước chiết bắp bổ sung 1000ml. [20] MT7 (MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, nước chiết giá đậu bổ sung đủ 1000ml. [13] MT8 (MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, dịch tương đậu nành bổ sung đủ 1000ml. [12] 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm
  • 42. Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu TP giàu calcium và protein Dịch nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens Thủy phân Phụ phẩm cá tra Bột xương cá tra Phân tích sinh hóa Nguyên liệu TP giàu Calcium và protein Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei Dịch lên men Lactobacillus casei Xương đã tách protein Ngâm trích ly calcium Xác định các điều kiện thích hợp Dd protein Phân tích sinh hóa
  • 43. 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra Tiến hành xác định các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng Ca2+ , Nitrogen tổng số (NTS), protein tổng, Nitrogen formol (NF), Nitrogen ammoniac (NNH3). 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens  Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1 - Chuẩn bị các bình tam giác (50ml) chứa 5ml MT3 đã vô trùng. - Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2 - Chuẩn bị bình tam giác (250ml) chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ.  Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens * Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Cấy 1% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy: 24giờ, 48giờ, 72giờ thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn thời gian thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các tỷ lệ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nồng độ sucrose
  • 44. Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các nồng độ sucrose: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn nồng độ sucrose thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định pH ban đầu của MT thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các nhiệt độ: 300 C, 350 C, 400 C, 450 C. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Động thái học của quá trình lên men Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các các điều kiện đã chọn. Cứ 6giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hoạt độ protease.
  • 45. Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei  Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1 - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT3 đã vô trùng. - Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang ống nghiệm MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430 C trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2 - Chuẩn bị bình tam giác chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430 C trong 24giờ. Bacillus amyloliquefaciens Tỷ lệ giống/MT 1% 2% 3% 4% 5% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ pH ban đầu 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 300 C 350 C 400 C 450 C Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5% Hoạt độ protease Chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp
  • 46.  Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei * Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT2 dịch thể. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 24giờ, 48giờ, 72giờ, 96giờ, 120giờ thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn thời gian thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của MT nuôi cấy Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT (gồm các loại MT khác nhau: MT5, MT6, MT7, MT8). Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn MT thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Cấy vào bình tam giác chứa 50ml MT với các tỷ lệ giống: 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo. * Ảnh hưởng của nồng độ surose Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn với các nồng độ surose: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn nồng độ surose thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo. * Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định pH MT ban đầu thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
  • 47. Cấy giống vào bình tam giác chứa 50 ml MT với các điều kiện đã chọn, nuôi ở các nhiệt độ: 200 C, 250 C, 300 C, 350 C, 400 C, 450 C. Sau thời gian thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định nhiệt độ thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Động thái học của quá trình lên men Nuôi VK với các điều kiện thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trên. Cứ 12giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hàm lượng acid. Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei Chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp Hàm lượng acid Lactobacillus casei Tỷ lệ giống/MT 1% 3% 5% 7% 10% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ pH ban đầu 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 200 C 250 C 300 C 350 C 400 C 450 C Môi trường MT5 MT6 MT7 MT8 Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5%
  • 48. 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens Với điều kiện tối ưu để thu dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens cho hoạt độ protease cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens. * Tỷ lệ nước Bổ sung 3% dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens và các tỷ lệ nước khảo sát như sau: 0%, 10%, 30%, 50%, 70%, 100% vào xương cá tra, tiến hành thủy phân trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ nước tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Tỷ lệ dịch nuôi cấy Với tỷ lệ nước tối ưu đã xác định, xương cá tra được thủy phân với tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens khác nhau: 1%, 3%, 5%, 7%, 10% trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch nuôi cấy tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Nhiệt độ thủy phân Với tỷ lệ nước và dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đã xác định, tiến hành thủy phân xương cá tra trong 24giờ ở các nhiệt độ: 400 C, 450 C, 500 C, 550 C. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra nhiệt độ tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Thời gian thủy phân Với các điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens từ 4 - 40giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để
  • 49. tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens Thủy phân bằng dịch lên men Bacillus amyloliquefaciens Bột xương cá tra Tỷ lệ dịch lên men/cơ chất 1% 3% 5% 7% 10% Tỷ lệ nước/cơ chất 0% 10% 30% 50% … Nhiệt độ 300 C 350 C 400 C 450 C 500 C 550 C Thời gian 0 giờ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ … Đo các chỉ số đạm Hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan Chọn điều kiện thủy phân thích hợp
  • 50. 2.3.2.5 Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei Với điều kiện tối ưu để thu dịch lên men Lactobacillus casei cho hàm lượng acid cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra đã tách protein bằng dịch lên men Lactobacillus casei. Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ … Xương cá tra đã tách protein Ngâm trích ly calcium bằng dịch lên men Lactobacillus casei Tỷ lệ dịch nuôi cấy/cơ chất 1:1 1.5:1 2:1 2.5:1 3:1 Xác định hàm lượng calcium Chọn điều kiện trích ly thích hợp
  • 51. * Tỷ lệ dịch lên men Xương cá tra đã tách protein được ngâm bằng dịch lên men Lactobacillus casei với các tỷ lệ 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3 trong 72giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thu mẫu để xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch lên men tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Thời gian trích ly Với tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đã xác định, tiến hành khảo sát thời gian ngâm trích ly calcium từ xương cá tra từ 0 - 120giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2.6 Thí nghiệm 6: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV Tiến hành xác định các chỉ tiêu về hàm lượng Ca2+ , NTS, protein tổng, NF, NNH3 của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV. 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38]  Nguyên tắc Trong điều kiện lạnh sẽ làm giảm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV. Đồng thời ngăn cản sự sinh trưởng của chúng để đảm bảo không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống.  Cách tiến hành Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa MT giữ giống đã vô trùng. Dùng que cấy vòng vô trùng, cấy zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 - 48giờ cho tạo sinh khối, sau đó bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40 C. Giống được cấy truyền hàng tháng. 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 2.4.2.1 Phương pháp quan sát KL [23]
  • 52. Quan sát và miêu tả KL của VK về: - Khả năng phát triển của KL. - Màu sắc KL - Đặc điểm hình thái, kích thước và tính chất bề mặt KL. 2.4.2.2 Phương pháp nhuộm Gram [20] [32]  Nguyên tắc Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà vi khuẩn được chia làm 2 nhóm: - Nhóm vi khuẩn Gram dương (G+): vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn etylic. - Nhóm vi khuẩn Gram âm (G-): không giữ nguyên màu của thuốc nhuộm khi xử lý bằng cồn etylic và bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung.  Cách tiến hành * Làm tiêu bản - Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. - Dung bút bông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lam để đánh dấu vết khuẩn phía trên lam. - Nhỏ dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn. - Dung que cấy khử trùng để nguội đặt nhẹ KL (VK nuôi cấy từ 24 - 48giờ trong ống thạch nghiêng), đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam. - Dàn mỏng thành vết bôi, cố định vết bôi bằng cách để khô trong không khí hoặc hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn. * Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi. - Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để từ 1-2 phút, rửa bằng nước cất. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa bằng nước cất.
  • 53. - Tẩy màu bằng cồn 960 từ 15-20 giây. Rửa bằng nước cất. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Fuschin trong 1 phút, rửa bằng nước cất. - Làm khô tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu. 2.4.2.3 Phương pháp nhuộm bào tử [20] [32]  Nguyên tắc Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ.  Cách tiến hành * Làm tiêu bản: tương tự mục 2.4.2.2 nhưng VK được nuôi cấy khoảng 2 tuần trên MT thạch nghiêng. * Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhỏ xanh Metylen thấm ướt hết giấy lọc, hơ nóng phía dưới và giữ trong 1 phút, rửa kỹ bằng nước cất đến khi hết màu. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ đỏ trung tính 0.5% trong 1 phút, rửa bằng nước cất. - Làm khô tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu. 2.4.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh catalase [28]  Nguyên tắc Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Catalase thủy phân H2O2 (hydrogen perioxide) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2 sẽ xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí.  Cách tiến hành
  • 54. Nhỏ trực tiếp 1 giọt dd H2O2 3% lên trên KL, hoặc chuyển một lượng VSV lên lam rồi thử bằng dd H2O2 3%. Ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí nếu có.  Đọc kết quả Thử nghiệm là dương tính: khi có hiện tượng sủi bọt khí xảy ra do O2 được tạo thành. Thử nghiệm là âm tính: khi không có hiện tượng sủi bọt xảy ra. 2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33]  Nguyên tắc Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của VK. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh xác định VK.  Cách tiến hành * Bước 1 - Lấy một ít KL được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch huyền phù. - Tiến hành tách chiết ADN bằng cách: đun sôi 5phút, để nguội 5phút, ly tâm 5phút, sau đó lấy dịch nổi. * Bước 2 - Cho dịch nổi thu được, primer, Taq, dNTP, Mg2+ vào PCR mix để khuếch đại gen 16s rARN. - Phản ứng PCR gồm 3 bước: + Biến tính: Trong một dd đầy đủ thành phần cho sự sao chép, ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94 - 950 C trong vòng 30giây - 1phút. + Lai: Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700 C và kéo dài 30giây - 1phút.
  • 55. + Tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên đến 720 C để ADN polimerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự ADN thường kéo dài từ 30giây đến vài phút. * Bước 3: Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose để xác định sản phẩm PCR. * Bước 4: Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEX II của Qiagen. * Bước 5: Giải trình tự đoạn rARN 16s, nhằm xác định trình tự acis nucleic. Có 2 phương pháp xác định: - Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử ADN, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide. - Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ ADN polimerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các dideoxynucleotide thông thường. Kết quả cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn ADN có kích thước chênh nhau 1 nucleoide. Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn ADN sẽ được phân tích trên điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ điện di. * Bước 6: Xuất kết quả trình tự để phân tích. Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH xác định tên VK cần định danh. 2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32]  Nguyên tắc Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù VSV lên MT thạch trong đĩa Petri. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các KL có thể quan sát được bằng mắt thường. Đếm số KL mọc trên môi trường (trên cơ sở xem mỗi KL hình thành từ một TB). Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã lấy và hệ số pha loãng ta có thể suy ra số khuẩn lạc trong 1ml mẫu khảo sát ban đầu.  Cách tiến hành Chuẩn bị đĩa Petri có chứa MT1.
  • 56. Pha loãng mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý với các độ pha loãng khác nhau: 10-1 , 10-2 , 10-3 , … lắc đều mẫu và dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù cho lên bề mặt thạch trong đĩa Petri. Dùng que gạt vô trùng dàn đều dịch huyền phù trên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô. Lật úp đĩa thạch vừa cấy và đặt vào tủ ấm. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 48 - 72 giờ. Với mỗi độ pha loãng tiến hành gieo cấy 3 đĩa Petri, sử dụng 1 pipet vô trùng và 1 que gạt cho mỗi độ pha loãng. Thực hiện cho 3 dung dịch mẫu với các độ pha loãng liên tiếp nhau.  Tính kết quả Đếm tổng số các KL trên các đĩa Petri. Chọn tất cả các đĩa Petri có từ 25 đến 250 KL. KL đếm trên các đĩa Petri có độ pha loãng khác nhau cần phải tuân theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số KL đếm được trên đĩa Petri phải càng ít. Nếu không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm. Mật độ tế bào được tính theo công thức: Trong đó: M: mật độ tế bào ở các độ pha loãng khác nhau. A: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa. D: Độ pha loãng. V : Thể tích dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa. 2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]  Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzyme của VK phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn của MT trong suốt thể hiện hoạt tính của enzyme. A * D M (CFU/ml) = V
  • 57.  Cách tiến hành Thu dịch nuôi cấy - Chuẩn bị 50ml MT3 nuôi VK trong bình tam giác 250ml, đem hấp khử trùng 1210 C trong 30 phút. - Dùng pipetman lấy một thể tích giống cấp 2 sao cho mật độ tế bào 106 - 107 /ml nuôi cấy vào bình tam giác chứa MT3. - Đặc bình tam giác lên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Ly tâm dịch nuôi cấy 15phút, tốc độ 5000vòng/phút. Loại bỏ sinh khối thu được dịch enzyme thô. Chuẩn bị các đĩa Petri có MT4. Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 9mm) khoan các lỗ thạch trên MT4 tương ứng trong các đĩa. Dùng pipetman vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào các lỗ khoan. Giữ các đĩa petri trong tủ lạnh 40 C trong 2 - 4giờ, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24giờ. Nhỏ dung dịch HgCl2 10% lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải.  Kiểm tra kết quả VK sinh ra protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do HgCl2 phản ứng với protein tạo kết tủa.  Đánh giá khả năng tạo enzyme Đặt sấp đĩa petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính lỗ khoan (d). Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng nấm sợi. Quy ước: - (D - d) ≥ 25mm: enzyme có hoạt tính rất mạnh - (D - d) ≥ 20mm: enzyme có hoạt tính mạnh - (D - d) ≥ 10-19,5mm: enzyme có hoạt tính trung bình - (D - d) ≤ 10mm: enzyme có hoạt tính yếu
  • 58. 2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20]  Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt độ phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enyme.  Cách tiến hành * Dựng đường chuẩn tyrosine Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dd tyrosin chuẩn 1mM/l (ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dd HCl 0.2N (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Dd NaOH 0.5N (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 Lắc và để yên trong 10 phút, đem đo mật độ quang ở bước sống 660nm Ống 1 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng tyrosin (µmol) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODKC) * Định lượng protease trong mẫu Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Ống thí nghiệm Ống kiểm chứng Dd casein 1% (ml) 5 5 Dd TCA 10% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 300 C trong 30 phút TCA 5% (ml) 5 0 Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1