Tinh Sạch Và Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Hợp Chất Prodigiosin Từ Chủng Serratia Marcescens Đến Mạng Lưới Nội Chất Tế Bào.doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thị Lệ
TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỢP
CHẤT PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG Serratia marcescens ĐẾN
MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO
LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội – 2020

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thị Lệ
TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA HỢP CHẤT
PRODIGIOSIN TỪ CHỦNG Serratia marcescens ĐẾN MẠNG
LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh
Hà Nội – 2020

LỜI CAM ĐOAN
Luận văn “Tinh sạch và đánh giá ảnh hƣởng của hợp chất prodigiosin
từ chủng Serratia marcescens đến mạng lƣới nội chất tế bào” là do tôi thực
hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh. Tôi xincam đoan tất
cả các kết quả trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung thực và chƣa từng
đƣợc công bố trên bất kì công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 05 tháng 01 năm 2021
Học viên
Nguyễn Thị Lệ

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành công trình nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh, cán bộ phòng Công nghệ sinh học
enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam - thầy hƣớng dẫn khoa học, ngƣời đã định hƣớng và tận tâm
hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ
phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Đồng thời, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Chuyên viên Nguyễn Thị Minh
Tâm và các thầy cô, cán bộ Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Khoa học
và Công nghệ đã tham gia giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt
hai năm học tập và nghiên cứu tại Học viện.Tôi cũng xin chân thành cảm ơn
Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
để tôi đƣợc học tập và nghiên cứu trong suốt hai năm học vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên
cạnhchia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiên tốt nhất cho tôi học tập,
nghiên cứu và hoàn thành khoá luận của mình.
Hà Nội, ngày 05 tháng 01năm
2021
Học viên
Nguyễn Thị Lệ

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATF6 Activating Transcription Factor – 6 (yếu tố dịch mã)
DTT Dithiothreitol
ER Endoplasmic Reticulum (Lƣới nội chất)
1H – NRM Proton Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân)
HPLC High Performance Liquid Chromatography (phƣơng pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao)
IRE1 Inositol Requiring Enzyme 1
mTOR mammakian Target Of Rapamycin
MTT 3 – (4 ,5 – dimethyl – 2 – thiazolyl) – 2,5 – diphenyl – 2H –
tetrazolium bromide
NA Nutrient agar (môi trƣờng thạch dinh dƣỡng)
NB Nutrient borth (môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng)
Pg Prodigiosin
PERK PKR – like Endoplasmic Reticulum kinase (một loại protein
màng lƣới nội chất mang hoạt tính kinaza)
RNase Endoribonuclease
ROS Reactive oxygen species (các gốc oxy hóa tự do trong tế bào)
SD Synthetic destrose
TLC Thin Layer Chromatography (phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng)

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Serratia marcescensVTCC 910027........... 3
Hình 1.2 Các gen tham gia sinh tổng hợp prodigiosin ở một số chủng vi
khuẩn............................................................................................................................................................. 5
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử prodigiosin gồm ba vòng pyrol đặc trƣng.................... 6
Hình 1.4 Các con đƣờng truyền tín hiệu của phản ứng cuộn gập protein........... 16
Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn Prodigiosin............................................................................. 24
Hình 3.1. Bình chiết tế bào bằng hệ dung môi ethyl acetate + 1% HCl (A) và
acetone (B) ................................................................................................................................................ 29
Hình 3.2 Bình rửa dịch chiết Pg trong acetone rửa bằng ethylacetate và nƣớc
lần 1 (A) và lần 3 (B) .......................................................................................................................... 30
Hình 3.3. Bản TLC mẫu dịch chiết chủng S. marcescens VTCC 910027 bằng
hai dung môi acetone và acetate + 1% HCl........................................................................... 31
Hình 3.4 Kết quả TLC dịch chiết Pg bằng các hệ dung môi khác nhau................ 32
Hình 3.5 Kết quả TLC mẫu Pg tinh chế bằng hệ dung môi toluen và ethyl
acetate tỷ lệ lần lƣợt 9:1 (A), 4:1 (B) và 7:3 (C) với cùng thể tích ......................... 34
Hình 3.6 Các phân đoạn đặc trƣng của mẫu tinh sạch từ S. marcescens VTCC
910027 lần 1 (A) và lần 2 (B) ........................................................................................................ 35
Hình 3.7. Kết quả TLC prodigiosin tinh sạch lần 1 (A): LC1 – Dịch lên cột; 1,
2, 3 – phân đoạn sau tinh sạch; và lần 2 (B), 1, 2 – phân đoạn tinh sạch; C –
Pg chuẩn..................................................................................................................................................... 36
Hình 3.8 Kết quả chạy HPLC của dịch chiết Prodigiosin từ chủng Serratia
marcescensVTCC 910026 (A) Pg chuẩn (B)........................................................................ 36
Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của mẫu Prodigiosin tinh sạch.......................................... 37
Hình 3.10. Phổ 1
H NMR .................................................................................................................. 38

Hình 3.11 Cơ chế kích hoạt stress lƣới nội chất của tế bào......................................... 39
Hình 3.12 Biểu đồ hoạt tính β – galactosidase..................................................................... 40
Hình 3.13 Điện di đồ phân tích RNA tổng số của các mẫu thí nghiệm bổ sung
hàm lƣợng Pg khác nhau. Giếng 1: ĐC (-); Giếng 2: ĐC (+); Giếng 3: Hàm
lƣợng Pg 0.2 μg/ml.............................................................................................................................. 41
Hình 3.14Điện di đồ phân tích sự có mặt của mRNA Hac1s. 1 – maker; 2 , 3 ,
4 – hàm lƣợng Pg 0,1 g /ml, 0,15 g /ml và 0,2 g /ml; 5 ĐC (+) DTT; 6 ĐC
(-) knock out Ire1................................................................................................................................... 41
Hình 3.15. Hàm lƣợng Pg đo đƣợc bằng đếm mật độ điểm ảnh.............................. 42

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU..................................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Serratia marcescens VÀ HỢP CHẤT
PRODIGIOSIN........................................................................................................................................ 3
1.1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens........................................................................................... 3
1.1.1.1 Đặc điểm..................................................................................................................................... 3
1.1.1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens......................................... 4
1.1.2 Nguồn gốc, đặc điểm của prodigiosin ........................................................................... 5
1.1.3 Tinh sạch và xác định cấu trúc của prodigiosin....................................................... 6
1.1.4 Hoạt tính sinh học của prodigiosin.................................................................................. 7
1.1.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ............................................................................ 7
1.1.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của prodigiosin............................................. 8
1.1.5 Ứng dụng của prodigiosin.................................................................................................... 10
1.1.5.1 Ứng dụng của prodigiosin trong công nghệ thực phẩm................................. 10
1.1.5.2 Ứng dụng của prodigiosin trong phát triển thuốc.............................................. 11
1.1.6 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescens ở Việt Nam . 12
1.1.7 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescens trên thế giới . 12
1.2 ẢNH HƢỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƢỚI NỘI CHẤT ..14
1.2.1. Mạng lƣới nội chất và hiện tƣợng ER stress.......................................................... 14
1.2.2 Stress lƣới nội chất ở tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae............. 17
1.2.3. Ảnh hƣởng của Prodigiosin lên mạng lƣới nội chất.......................................... 19
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 21
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU.............................................................................................................. 21

2.1.1 Nguyên liệu .................................................................................................................................. 21
2.1.2 Hoá chất.......................................................................................................................................... 21
2.1.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy và đệm.......................................................................... 21
2.1.4 Trang thiết bị ............................................................................................................................... 22
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................................... 22
2.2.1. Hoạt hóa Serratia marcescens......................................................................................... 22
2.2.2. Hoạt hóa chủng nấm men KMY 1516 ........................................................................ 23
2.2.3 Lựa chọn hệ dung môi tách chiết prodigiosin.......................................................... 23
2.2.4 Xây dựng đƣờng chuẩn prodigiosin dựa trên mật độ quang........................... 24
2.2.5 Tinh chế prodigiosin bằng phƣơng pháp sắc ký .................................................... 25
2.2.5.1 Phƣơng pháp sắc ký cột.................................................................................................... 25
2.2.5.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng..................................................................................... 25
2.2.5.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp................................................................................. 26
2.2.6 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của prodigiosin lên mạng lƣới nội
chất tế bào.................................................................................................................................................. 27
2.2.6.1 Phƣơng pháp xác định hoạt tính β – galactosidase .......................................... 27
2.2.6.2 Phƣơng pháp tách chiết, tạo thƣ viện cDNA và đọc trình tự mRNA
tổng số.......................................................................................................................................................... 28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................... 29
3.1 HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TÁCH CHIẾT PRODIGIOSIN.............. 29
3.2 XÁC ĐỊNH HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TINH SẠCH
PRODIGIOSIN....................................................................................................................................... 32
3.2.1 Lựa chọn hệ dung môi thích hợp..................................................................................... 32
3.2.2 Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp ................................................................................. 33
3.3 TINH SẠCH PRODIGIOSIN QUA CỘT SILICAGEL........................................ 34

3.3.1 Tinh sạch........................................................................................................................................ 34
3.3.2 Xác định độ sạch của Pg bằng HPLC........................................................................... 36
3.3.3 Xác định độ sạch prodigiosin bằng phổ 1
H............................................................... 37
3.4 XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƢỚI
NỘI CHẤT TẾ BÀO........................................................................................................................... 38
3.4.1 Ảnh hƣởng của Prodigiosin đến protein màng Ire1............................................. 38
3.4.2 Xác định hàm lƣợng của Hac1 mRNA........................................................................ 40
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 44
4.1. KẾT LUẬN..................................................................................................................................... 44
4.2. KIẾN NGHỊ.................................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................ 45

1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp điều trị ung thƣ đã và đang đƣợc sử
dụng trên thế giới nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp nội tiết, liệu pháp
miễn dịch, liệu pháp tế bào gốc, điều trị cá thể hóa, điều trị hƣớng đích, Tuy
nhiên, mỗi phƣơng pháp đều tồn tại những tác dụng phụ nhất định. Để ngăn
chặn sự phát triển và lây lan của khối u, hóa trị là biện pháp hiệu quả cả ở giai
đoạn sớm và giai đoạn muộn của ung thƣ. Việc nghiên cứu phát triển các
thuốc chống ung thƣ mới với giá thành rẻ đang là mối quan tâm của nhiều
nhà khoa học.
Prodigiosin (Pg) là chất chuyển hóa thứ cấp có màu đỏ có tác dụng
kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn dịch và ngăn cản sự phát
triển của nhiều dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời. Trên thế giới đã có nhiều nghiên
cứu về hoạt tính sinh học cũng nhƣ tiềm năng ứng dụng Prodigiosin từ
Serratia marcescens trong phát triển thuốc.Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có
nghiên cứu chuyên sâu nào về ảnh hƣởng của Pg lên mạng lƣới nội chất
trong tế bào, cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào trong môi trƣờng có chứa Pg.
Chính vì vậy tôi lựa chọn đề tài luận văn “Tinh sạch và đánh giá ảnh
hƣởng của hợp chất Prodigiosin từ chủng Serratia marcescens đến mạng
lƣới nội chất tế bào”.Nghiên cứu này đƣợc tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa
học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106.02-
2018.332. Đề tài luận văn này nhằm mục đích sản xuất, tinh sạch đƣợc
prodigiosin từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens có độ tinh sạch cao, đánh
giá ảnh hƣởng của Pg này đến lƣới nội chất tế bào.
Trong các nghiên cứu trƣớc đây, chúng tôi đã đánh giá hoạt tính sinh
học của Pg tách chiết từ chủng Serratia marcescens, kết quả cho thấy Pg gây
độc dòng tế bào ung thƣ phổi LU – 1 với giá trị IC50 = 1,5 g/mL. Bằng cách
tiếp cận nghiên cứu cơ chế phân tử tác động của Pg đối với lƣới nội chất tế
bào nấm men chúng tôi sẽ tìm đƣợc cơ chế phân tử của Pg đối với tế bào ung
thƣ và tế bào thƣờng. Việc sử dụng sinh vật mô hình là nấm men
Saccharomyces cerevisiae sẽ mang lại khả năng thành công cao hơn bởi hơn
40% trình tự gen bảo tồn ở nấm men đƣợc dự đoán là có mặt trong hệ gen

2
ngƣời, các cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở nấm men hoặc trong các tế bào
khối u tồn tại tƣơng tự với nhiều hơn hoặc ít hơn các chức năng trong tế bào
con ngƣời.Các kết quả nghiên cứu này sẽ góp phần hiểu rõ cơ chế tác động
của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế
ảnh hƣởng của Pg đến tế bào động vật.
Toàn bộ thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học
Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.

3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Serratia marcescens VÀ HỢP CHẤT
PRODIGIOSIN
1.1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens
1.1.1.1 Đặc điểm
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm thuộc họ
Enterobacteriaceae. Chúng có mặt ở trong đất, nƣớc, thực vật và trong cơ thể
động vật.Trong các loài vi khuẩn thì S. marcescens là loài có khả năng sinh
tổng hợp Pg đƣợc biết đến sớm nhất và đƣợc tìm hiểu từ rất sớm. Trong
mƣời loài Serratia thì chỉ có ba loài có khả năng sinh tổng hợp Pg là S.
plymuthica, S. rubidaea và một số nhóm S. marcescens. S. marcescens hô hấp
tùy tiện, do đó nó có thể sinh Pg cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí.Tuy
nhiên, sắc tố đỏ chỉ xuất hiện trong một phần nhỏ của dịch nuôi cấy riêng biệt
của các chủng S. marcescens. Mỗi chủng có khả năng sảnxuất sắc tố khác
nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ môi trƣờng nuôi cấy, thời gian nuôi
cấy, pH, cacbon, nitơ và các muối vô cơ.Chủng vi khuẩnSerratia
marcescenskhi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (NA)có màu đỏ,
tròn, lồi, bề mặt bóng (hình 1.1).
Hình 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Serratia marcescensVTCC 910027

4
1.1.1.2 Sinh tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens
Khả năng sản xuất Pg của S. marcescens tùy thuộc vào điều kiện nuôi
cấy, nguồn cacbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ. Chủng S. marcescens sinh Pg
trong môi trƣờng pH axit ở nhiệt độ 28o
C và làm môi trƣờng chuyển sang
màu đỏ (Hình 1.1). Ở nhiệt độ 37o
C,S. marcescens không sinh sắc tố đỏ.
Sinh tổng hợp Pg bởi S. marcescens MSK1 đƣợc cảm ứng chỉ bởi
methionine hoặc cysteine với sự có mặt của glucose. Sinh tổng hợp Pg đƣợc
tối ƣu đạt năng suất cao nhất trong môi trƣờng chứa 0,45 manose, 0,01%
methionine, 0,03% cysteine và 0,1% amonium chloride, pH 8 ở 28o
C dƣới
điều kiện nuôi lắc 120 vòng/ phút trong 24 giờ [1].
Shahitha và Poornima (2012)đã sử dụng các môi trƣờng khác nhau và
các nhiệt độ khác nhau để nghiên cứu sinh tổng hợp Pg từ S. marcescens. Sinh
tổng hợp Pg cao nhất đƣợc quan sát thấy ở môi trƣờng bột hạt lạc
(37,6mg/ml) và môi trƣờng bột hạt vừng (16,5mg/ml)khi so sánh với môi
trƣờng canh thang dinh dƣỡng (NB) (0,51mg/ml) và môi trƣờng canh thang
dinh dƣỡng có bổ sung glycerol (0,3mg/ml) ở 28o
C, môi trƣờng canh thang
dinh dƣỡng có bổ sung maltose (1,82mg/ml). Trong số dầu khác nhau, dầu
lạc cho năng suất sắc tố cao (2,72mg/ml)[2].
Môi trƣờng canh thang dinh dƣỡng có bổ sung glycerol đƣợc chọn là
môi trƣờng tổng hợp tốt nhất. Hiệu quả của các thành phần môi trƣờng và các
thông số quá trình khác nhau nhƣ nguồn cacbon và nitơ, nhiệt độ, pH, thời
gian nuôi lắc và các chất bổ sung khác đã đƣợc khảo sát. Hàm lƣợng Pg lớn
nhất đƣợc sinh tổng hợp ở 25o
C, pH 7 và thời gian nuôi lắc 48 giờ. Bổ sung
thêmmôi trƣờng với maltose và peptone cho năng suất Pg cao nhất. Ngoài ra,
việc bổ sung thêm các chất nhƣ muối sắt, phosphat vô cơ cũng cho các kết
quả khả quan [3].
ChủngS. marcescens sinh tổng hợp Pg tốt nhất ở nhiệt độ28o
C hoặc
30o
C, thỉnh thoảng chúng sinh tổng hợp Pg ở nhiệt độ thấp hơn nhƣ ở 25o
C
[3].
Thời gian nuôi cấy các chủng S. marcescens sinh tổng hợp Pg tối ƣu
ngắn nhất có thể là 24 giờ nhƣ S. marcescens MSK1[1], 48 giờ nhƣ S.

5
marcescens[3]; S. marcescens S11[4]; 36 giờ nhƣ S. marcescens MBB05[5];
dài hơn là 72 giờ nhƣ S. marcescens SU – 10 [6], S. marcescens[7], có thể tới
84 giờ nhƣ S. marcescens SR1[8].
Với các thành phần môi trƣờng và các yếu tố nuôi cầy tối ƣu, các
chủng S. marcescens đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau cho năng suất
sinh tổng hợp Pg khác nhau. Chẳng hạn chủng S. marcescens 1,84527 mg/l
[7], chủng S. marcescens SR1 là 0,7651g/l [8].
Pg đƣợc tổng hợp thông qua hai con đƣờng bao gồm: MBC (4-
Methoxy-2,2'-bipyrrole-5-carboxaldehyde) và MAP (2 – methyl – 3 – n –
amylpyrrole) [9].Có hơn 30 gen liên quan đến sinh tổng hợp Pg ở vi khuẩn
Serratia sp. ATCC 39006,điều này cho thấy lợi thế sản xuất Pg của chúng so
với các vi sinh vật sản xuất Pg khác. Mỗi chủng vi khuẩn mang các gen tham
gia vào quá tình sinh tổng hợp Pg khác nhau (hình 1.2).
Hình 1.2 Các gen tham gia sinh tổng hợp prodigiosin ở một số chủng vi
khuẩn[10].
1.1.2 Nguồn gốc, đặc điểm của prodigiosin
Prodigiosin (Pg, PubChem CID: 5351169), là chất chuyển hóa thứ cấp
có màu đỏ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống sốt rét, ức chế miễn
dịch và chống ung thƣ[11,12]đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn Serratia
marcescens, Rubidaea, Vibrio psychroerythrous, gazogenes, Pseudomonas
magneslorubra, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra[13,14]. Trong đó S.
marcescens có hiệu suất sản xuất Pg cao nhất và đƣợc nghiên cứu rộng rãi tại

6
nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Pg đóng vai trò nhƣ một chất chuyển
hóa thứ cấp của S. marcescens, chức năng của nó đối với vi khuẩn vẫn chƣa
đƣợc làm sáng tỏ. Một số nghiên cứu cho rằng Pg liên quan đến hoạt động
kháng khuẩn, kháng nấm, ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất và tăng
cƣờng sự bám dính vi khuẩn lên các bề mặt dẫn tới tăng cƣờng phát tán vi
khuẩn.
Ba thành viên của nhóm prodiginine bao gồm prodigiosin,
undecylprodigiosin (UP) và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG HCl), có
đặc tính ức chế miễn dịch và tác động đến tự chết tế bào ung thƣin vitro và in
vivo. Hiệu ứng độc tế bào của chúng là do sự hiện diện của nhóm thế C – 6
methoxy. Vòng A – pyrolđóng một vai trò quan trọng trong cả hai hoạt động
nuclease và độc tế bào của Pg [15].
Nhóm sắc tố prodiginine đƣợc đặc trƣng bởi cấu trúc ba vòng
pyrol[16]. Cấu trúc hóa học của Pg đã đƣợc làm sáng tỏ bởi nhóm nghiên cứu
của Wasserman (1960) và Hlden (1962)[10].
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử prodigiosin gồm ba vòng pyrol đặc trƣng[17].
Pg đƣợc báo cáo là có đƣờng cong quang phổ khác nhau ở pH axit và
kiềm. Trong môi trƣờng axit, Pg có màu đỏ, đƣờng cong quang phổ từ 510 -
535 nm(đỉnh phổ). Trong môi trƣờng kiềm Pg biểu hiện màu cam, đỉnh phổ
470 nm. Pg không tan trong nƣớc, tan trong alcohol, ete, methanol, acetone,
chloroform, DMSO và dễ bị phân hủy bởi ánh sáng.
1.1.3 Tinh sạch và xác định cấu trúc của prodigiosin
Có nhiều phƣơng pháp chiết và tinh sạch prodigiosin khác nhau. Song
và cộng sự (2006) đã chiết và tinh sạch Pg từ chủng S. marcescens sp. KH –

7
95 từ chất hấp phụ bên trong sử dụng methanol đã axit hóa và tách pha với
nƣớc và chloroform. Tiếp theo, chất đƣợc tinh sạch bằng sắc ký silica gel và
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [18].Chất tinh khiết Pg đƣợc nhận dạng
cấu trúc bằng phân tích NMR.
Ramina và Samira (2009) đã tinh sạch prodigiosin từ dịch chiết thô
chủng S. marcescens UCP1549 bằng phƣơng pháp sắc ký cột sử dụng hệ
dung môi chloroform :methanol tỷ lệ 9:1. Pg đƣợc tinh chế qua cột sắc ký
(50x1cm) sử dụng silica gel làm chất hấp phụ. Sau đó đƣợc hòa vào
chloroform (100ml), rồi loại dung môi bằng cô quay. Sản phẩm đƣợc nhận
dạng bằng đo quang phổ UV ở bƣớc sóng 700 - 200nm trong 95% ethanol và
sau đó khối phổ sử dụng methanol. Kết quả đo khốiphổ cho thấy khối lƣợng
phân tử của Pg từ chủng S. marcescens đƣợc tách chiết bằng acetone và ethyl
acetate, tinh chế bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng TLClà 324 Da
[19].
Sắc tố đỏ từ chủng S. marcescens SU – 10hòa tan trong nƣớc và
đƣợcchiết bằng ethanol và HCl (9,5:0,5) hay với acetone và ethyl acetate
(1:1). Pg đƣợc tiếp tục tinh sạch bằng dung môi hữu cơ và sắc ký lớp mỏng
TLC. Hệ dung môi ethanol: HCl đƣợc cho là có hiệu quả nhất để chiết Pg[6].
Pg đã đƣợc tinh sạch bằng sắc ký silica gel và đƣợc phân tích bằng H - NMR
quang phổ.
1.1.4 Hoạt tính sinh học của prodigiosin
1.1.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
Hoạt tính kháng sinh của Pg đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1946.
Pg có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm mà không hề ảnh hƣởng đến tế bào
bình thƣờng khác [20, 21]. Năm 1969, Gerber cho rằng Pg không có hoạt tính
kháng các vi khuẩn Gram âm nhƣ Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli, Proteus vulgaris và vi nấm Candida albicans, Trichoderma koningi,
Penicillium notatum [9].Tuy nhiên, sau này Pg đƣợc công bố là có có tác
dụng ức chế đối với Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,
Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Echerichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumonia

8
nhƣng hoạt tính kháng vi khuẩn gram dƣơng cao hơn vi khuẩn gram âm [22].
Trong khi tỉ lệ kháng kháng sinh thông thƣờng (aminoglycoside,
chloramphenicol, lincosamide, macrolide, quinolone, tetracycline) của
Staphylococcus aureus kháng oxacillin ngày càng tăng thì Pg đƣợc chứng
minh là có hiệu quả ức chế đối với chủng vi khuẩn gây bệnh này, hơn cả
kháng sinh tiêu chuẩn [16]. Do đó, Pg là một sản phẩm tự nhiên có tiềm năng
ứng dụng cao trong điều trị nhiễm khuẩn.
Cơ chế kháng khuẩn của Pg đƣợc lý giải bằng khả năng chui qua màng,
xâm nhập vào trong tế bào và ức chế các enzyme DNA gygase, topoisomerase
I, II và IV, ức chế tổng hợp vật chất di truyền trong tế bào vi khuẩn chủ [9,
23].
1.1.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của Prodigiosin
Pg đƣợc biết là gây ra apoptosis trong một loạt các dòng tế bào ung thƣ.
Pg đã đƣợc thử nghiệm chống lại hơn 60 dòng tế bào ung thƣ với giá trị IC50
trung bình là 2,1 μM. Chúng kích hoạt apoptosis trong các loại tế bào ác tính
khác nhau nhƣng có độc tính thấp trên các tế bào bình thƣờng[24]. Pggây ratự
thực bào mạnh mẽ trong các dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời bao gồm ung thƣ bạch
cầu, ung thƣ máu, ung thƣ vú, ung thƣ đại trực tràng và ung thƣdạ dày[25].Pg
có thể ức chế tín hiệu Wnt/β-cateninvà kích hoạt hoạt động chống ung thƣ trong
tế bào ung thƣ vú và có thể kích hoạt lại hoạt động phiên mã phụ thuộc họ p53
trong các tế bào ung thƣ ruột kết thiếu p53[14, 26].
Khả năng kháng ung thƣ của Pg đƣợc nghiên cứu trên tế bào ung thƣ
cổ tử cung bằng phân tích 3 – (4 ,5 – dimethyl – 2 – thiazolyl) – 2,5 –
diphenyl – 2H – tetrazolium bromide (MTT) và neutral red uptake (NRU) cho
thấy hàmlƣợng Pg càng tăng thì càng làm giảm tỷ lệ phát triển của dòng tế
bào HeLa – 299.Kết quả này cho thấy Pg có hoạt tính kháng ung thƣ biểu mô
cổ tử cung ở ngƣời [27].
Yongze Liu và cộng sự đã tiến hành điều trị tế bào ung thƣ biểu mô
vòm họng ở ngƣời bằng Pg, kết quả cho thấy prodigiosin có thể ức chế sự
tăng sinh, di cƣ và xâm lấn của các tế bào ung thƣ biểu mô vòm họng [23].Pg
cũng đã đƣợc xác định là một chất gây cảm ứng tự thực bào trong các tế bào

9
ung thƣ biểu mô khoang miệng [25]. Năm 2010, Kavitha và cộng sự đã công
bố Pg có hoạt tính chống ung thƣ và hoạt tính tự chết mạnh đối với các tế bào
ung thƣ biểu mô cổ tử cung HeLa – 299[28]. Pg tách chiết từ chủng S.
marcescens SER1 có khả năng ức chế tế bào ung thƣ kháng thuốc nhƣ
MDR1, BCRP và MRP2[29].
Cơ chế gây apoptosis của Pg hiện nay vẫn đang đƣợc làm sáng tỏ.
Trong mô hình in vivo Pg đã đƣợc chứng minh nhắm đích các tế bào ung thƣ
một cách độc lập với p53 trong khi p53ít hoặc không có tác dụng đối với tế
bào bình thƣờng. Ngoài ra, Pg có tác dụng ở các tế bào ung thƣ với kiểu hình
đa kháng thuốc và các khiếm khuyết trong con đƣờng tự chết tế bào [30].
Pg liên kết với miền BH3 trong một số họ protein BCL – 2đóng vai trò
quan trọng trong việc tự chết tế bào. Đặc biệt, kết quả của Hosseini và cộng
sự năm 2013 cho thấy Pg có một ái lực lớn đối với MCL – 1, một thành phần
chống sự tự chết của họ protein BCL – 2. Trong các tế bào khối u ác tính, các
tác giả chứng minh rằng Pg kích hoạt con đƣờng tự chết ty thể bằng cách phá
vỡ phức hợp MCL – 1/BAK [31].
Pg từ chủng S. marcescens B – 1231 ức chế miễn dịch qua trung gian tế
bào lympho T nhƣ concanavalin – A, gây tăng sinh tế bào, đáp ứng tế bào
lympho hỗn hợp, gây ra đáp ứng kháng thể phụ thuộc T ở các nồng độ không
độc.Tuy nhiên, Pg không ảnh hƣởng đến chức năng miễn dịch qua trung gian
tế bào lympho B nhƣ tăng sinh tế bào và sản xuất kháng thể đa dòng ở các
nồng độ tƣơng tự. Prodiogiosin không gây chết đối với tế bào lympho trong
ống nghiệm ở nồng độ 10 và 30 mg/kg thể trọngvà cũng không cho thấy độc
tính với cơ quan bạch huyết trong cơ thể ở liều lƣợng trên[32].
Những tác động của dịch nuôi chứa Pg từ chủng S. marcescens 2170
(CS – 2170) đến sự sống sót của các dòng tế bào ung thƣ máu khác nhau
(Jurkat, NSO, Hl-60 và Ramos) và các dòng lành tính (NIH 3T3 và MDCK)
đã đƣợc nghiên cứu. Sử dụng thử nghiệm MTT cho thấy có sự giảm nhanh
chóng (4 giờ) về số lƣợng các tế bào sống. Kết luận từ mô hình phân mảnh
DNA, nhuộm Hoechst và phân tích sự biểu hiện phosphatidylbởi FACS cho
thấy hiệu ứng độc tế bào này là do quá trình tự chết. Sự tự chết này bị chặn lại

10
khi sử dụng chất ức chế capase Z – VAD cho thấy có sự tham gia của capase.
Sự tham gia của Pg trong quá trình tự chết này còn đƣợc tác giả chứng minh
bằng thí nghiệm sử dụng chủng đột biến S. marcescens (OF, WF và 933)
không sinh tổng hợp Pg qua phân tích quang phổ của Pg phân lập từ S.
marcescens. Những kết quả này chỉ ra rằng Pg là một thể ức chế miễn dịch,
gây ra tự chết trong tế bào ung thƣ tạo máu và không có độc tính đáng kể đối
với tế bào lành tính. Do đó Pg có khả năng sử dụng để điều trị ung thƣ[33].
Pg đã đƣợc chứng minh là gây ra các stress trong tế bào nhƣ tổn
thƣơng DNA bằng cách ức chế topoisomerase I và II, thay đổi pH nội bào
bằng điều chỉnh nồng độ H+
/ Cl-
, ức chế chu kỳ tế bào bằng cách điều chỉnh
lại p21WAF/CIP1
và stress lƣới nội chất[22], tất cả điều này có thể dẫn tới
apoptosis. Sam M.R. và Pourpak R.S.cho rằng cơ chế làm chết tế bào ung thƣ
của Pgbao gồm: cảm ứng phụ thuộc caspase, kích hoạt các con đƣờng protein
kinase và khởi phát chu kỳ tế bào. Prodigiosin có nguồn gốc từ Serratia
marcescens có thể làm tăng nồng độ caspase – 3trong các tế bào ung thƣ bạch
cầu cấp tính.Ở tế bào ung thƣ gan HepG2, nồng độ caspase – 3có thể tăng đến
330% sau 48 giờ xử lý với Pg [14, 34].Shu –YuCheng và cộng sự đã tiến hành
điều tra cơ chế gây chết tế bào của Pg trong u nguyên bào thần kinh đệm
(Glioblastoma multiforme), kết quả cho thấy rõ ràng Pg làm giảm đáng kể khả
năng sống sót của tế bào và khả năng hình thành tế bào thần kinh của các
dòng tế bào glioblastoma ở ngƣời U87MG và GBM8401.Hơn nữa, Pg với tín
hiệu huỳnh quang đã đƣợc phát hiện trong mạng lƣới nội chất và đƣợc tìm
thấy để gây ra stress quá mức. Những phát hiện này đã đƣợc xác nhận bằng
cách quan sát sự hình thành punctaLC3 và nhuộm màu cam acridine. Pg gây
ra cái chết tế bào bằng cách kích hoạt con đƣờng JNK và giảm con đƣờng
AKT/mTOR trong các tế bào glioblastoma [22].
1.1.5 Ứng dụng của prodigiosin
1.1.5.1 Ứng dụng của prodigiosin trong công nghệ thực phẩm
Ngày nay, nhu cầu về chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày
càng cao. Với ƣu điểm về tốc độ sinh trƣởng nhanh, thời gian thế hệ ngắn, vi
sinh vật là một trong các nguồn sản suất sắc tố nhanh và hiệu quả nhất. Trong

11
suốt những thập kỷ gần đây, ngƣời ta đã nghiên cứu lên men các chủng vi
sinh vật sản xuất prodigiosin phục vụ ngành công nghệ thực phẩm. Mặc dù
các sắc tố của vi sinh vật nói chung có một số hạn chế về độ nhạy với ánh
sáng, độ hòa tan, độ ổn định ngắn khi tiếp xúc với pH, nhiệt độ cao. Tuy
nhiên, các biện pháp nhƣ bao gói bằng kappa – carrageenanhay maltodextrin
đã đƣợc áp dụng nhằm mục đích bảo quản Pg đƣợc lâu hơn. Các nhà khoa
học chỉ ra rằng độ ẩm, kích thƣớc hạt và cƣờng độ màu của prodigiosin
không bị ảnh hƣởng nếu chúng đƣợc đóng gói bởi kappa – carrageenanvà
maltodextrin [9].Theo cách này, prodigiosin đã đƣợc ứng dụng thành công
làm chất màu cho sữa chua và đồ uống có ga.
1.1.5.2 Ứng dụng của prodigiosin trong phát triển thuốc
Với hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào và ức chế miễn dịch nổi bật, từ
lâu Pg và các dẫn xuất của chúng đã đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu và phát
triển thuốc. Năm 1997 Sang Bae Han và cộng sự tại Viện nghiên cứu khoa
học và công nghệ sinh học Hàn Quốc đã tiến hành thử nghiệm in vitro so sánh
tác dụng dƣợc lý của Pg với các thuốc ức chế miễn dịch đặc hiệu khác nhau
của tế bào lympho T nhƣ cyclosporin A và tacrolymus. Kết quả cho thấy Pg
có hiệu quả tƣơng đƣơng, thậm chí hơn cả cyclosporin A và tacrolymus đối
với tế bào T [32]. Nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu sử dụng Pg
làm thuốc ức chế miễn dịch trong nghiên cứu lâm sàng và miễn dịch sau
này.Năm 2009, một loại thuốc có bản chất là dẫn xuất của Pg là obatoclax
(tên khác là GX15 – 070) đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng pha I và II trong điều
trị ung thƣ tuyến tụy và cho kết quả quả rất khả quan [30].Hiện nay, Pg cũng
đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng trong điều trị ung thƣ tuyến tụy ở Trung
Quốc dƣới sự giám sát của Aida Pharmaceuical [35].
Nhìn chung, tiềm năng ứng dụng của Pg trong nghiên cứu phát triển
thuốc điều trị ung thƣ hƣớng đích vẫn còn đang bỏ ngỏ. Đây là một trong
những hƣớng đi mới đầy triển vọng cho ngành công nghiệp dƣợc phẩm trong
tƣơng lai.

12
1.1.6 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescensở
Việt Nam
Ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu về Pg từ S. marcescens và thử nghiệm
hoạt tính apoptosis của Pgđối với các dòng tế bào ung thƣ.
Năm 2017, nhóm tác giả Nguyễn Thành Trung và cộng sự tại Viện
Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tìm thấy vi khuẩn S.
marcescens trong thịt, trứng cơm tại Hà Tĩnh, Nghệ An, Quảng Ngãi [36].
Mặc dù tác giả đã đánh giá đƣợc khả năng sinh sắc tố đỏ của chủng vi khuẩn
này, tuy nhiên, các thông tin về dịch tễ học của S. marcescens ở Việt Nam và
các hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thƣ vẫn chƣa đƣợc công bố.
Kể từ năm 2014 đến nay, nhóm tác giả Nguyễn Sỹ Lê Thanh và cộng
sự đã phân lập đƣợc hai chủng S. marcescens sản xuất Pg với hiệu suất cao
làS. marcescensVTCC 910026 (cao nhất 645mg Pg/L), và chủng S.
marcescensM10 VTCC 910027 (cao nhất 485 mg Pg/L). Chế phẩm Pg thu
đƣợc có độ tinh khiết 98% với hệ dung môi n – hexan:toluen(1:1) kết hợp với
hệ dung môi toluen: ethyl acetate (9:1).Trong điều kiện in vitro chế phẩm Pg
này có khả năng ức chế mạnh dòng tế bào ung thƣ vú ngƣời MCF- 7(IC50 7,5
μM),dòng tế bào ung thƣ phổi LU – 1(4,6 μM), dòng tế bào ung thƣ vòm
họng KB (9,5 μM), tế bào ung thƣ thanh quản Hep2 (27 μM) và dòng tế bào
ung thƣ phổi (23 μM)[37].
Hiện tại Pg vẫn chƣa đƣợc thử nghiệm trong điều trị ung thƣ tiền lâm
sàng tại Việt Nam.
1.1.7 Tình hình nghiên cứu prodigiosin từ Serratia marcescenstrên
thế giới
Từ cuối thế kỷ XIX, Coley đã bắt đầu nghiên cứu về Pg và bệnh ung
thƣ[38]. Cho đến nay, rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về hoạt tính sinh
học cũng nhƣ ứng dụng Pg trong điều trị tiền lâm sàng và lâm sàng.
Năm 2002, Ruiz và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng gây chết, sự
biến đổi hình thái biểu hiện của quá trình tự chết trên dòng tế bào ung thƣ dạ
dày HTG – 1 bằng phƣơng pháp MTT (3-(4,5 – dimethylthiozol – 2-yl)-2,5-
diphenyl tetrezolium bromide), sự phân mảnh của DNA, nhuộm Hoechest

13
33342 và nghiên cứu về cấu trúc sợi actin. Các tế bào đƣợc xử lý với Pg đã
cho thấy có sự sụt giảm số lƣợng tế bào bởi quá trình apoptosis. Phân tích
hình thái tế bào xử lý bằng Pg cho thấy Pg gây ra co rút tế bào, ngƣng kết
nhiễm sắc thể, cấu trúc lại sợi actin, tách rời các tế bào từ chất nền nuôi
cấy.Từ các kết quả trên cho thấy Pg tác động tới quá trình apoptosis trong tế
bào ung thƣ dạ dày HTG – 1và Pg có khả năng đƣợc sử dụng nhƣ một loại
thuốc hóa trị liệu mới [15].
Năm 2009, Eric và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm, đặc tính dƣợc lý
của của Pg và các dẫn xuất của Pg, bao gồm các dẫn xuất Pg tổng hợp mới có
độc tính thấp hơn nhƣ GX15-070(Obatoclax)[39]. Cơ chế đích phân tử của
các hợp chất này đã cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị lâm sàng.
Năm 2012, Mu-Yun Pan và cộng sự tại Viện Khoa học y sinh Đài Loan
đã chỉ ra rằng Pg làm chết tế bào ung thƣ bằng cách gây ra stress lƣới nội
chất dẫn tới apoptosis [30]. Các con đƣờng kích hoạt phản ứng stress lƣới nội
chất đƣợc Renata Sano và John C. Reed thảo luận chi tiết trong “ER stress –
induced cell death mechanisms”[40].
Năm 2017, Yenkejeh và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính của Pg trên
dòng tế bào ung thƣ tế bào gan (HepG2) ở ngƣời và quan sát sự biến đổi hình
thái tế bào, số lƣợng tế bào, ức chế tăng trƣởng, biểu hiện sống sót, kích hoạt
caspase – 3, tỷ lệ apoptosis bằng kính hiển vi soi ngƣợc, buồng đếm tế bào,
phƣơng pháp MTT, Reverse Transcription – PCR, kiểm tra enzyme miễn dịch
huỳnh quang. Kết quả cho thấy sau prodigiosin đã làm biến dạng tế bào và
phá vỡ các kết nối tế bào. Đồng thời, hợp chất này ức chế tăng trƣởng và
giảm hoạt động trao đổi chất, ức chế tồn tại của mRNA, tăng kích hoạt
caspase-3 ở các tế bào HepG2. Từ đó có thể thấy sử dụng Pg là một hƣớng
tiếp cận mới trong điều trị hƣớng đích ung thƣ gan [34]. Cơ chế điều chỉnh
capase-3 của Pg cũng đƣợc làm sáng tỏ bởi Mohammad Reza Sam và
Somayyeh Ghoreishi năm 2018 [41].
Năm 2019, Chee – HooYip cũng đã thảo luận về triển vọng ứng dụng
Pg trong phát triển thuốc kháng sinh, chống sốt rét và chống ung thƣ trong
điều trị lâm sàng [24].

14
Hiện nay, các nghiên cứu về prodigosin ngày càng nhiều và tập trung
theo hƣớng: sàng lọc các chủng S. marcescens có hiệu suất sản xuất Pg cao;
tối ƣu hóa quy trình lên men, tách chiết và tinh sạch Pg; thử nghiệm hoạt tính
gây độc tế bào. Từ đó mở ra nhiều hƣớng thử nghiệm cơ chế đích phân tử của
Pg trên các dòng tế bào ung thƣ khác nhau.
1.2 ẢNH HƢỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƢỚI NỘI CHẤT
1.2.1. Mạng lƣới nội chất và hiện tƣợng ER stress
Mạng lƣới nội chất (ER – Endoplasmic Reticulum) là hệ thống xoang
dẹt gắn liền với màng nhân, tổng diện tích lƣới nội chất chiếm hơn một nửa
tổng số màng nội bào trong tế bào nhân thực. Các xoang lƣới nội chất chứa
cacbohydrate, glycoprotein, enzyme khử độc… Dựa vào cấu tạo và chức
năng, lƣới nội chất đƣợc chia thành hai loại: lƣới nội chất trơn – màng không
gắn ribosome và lƣới nội chất hạt gắn các hạt ribosome. Trong đó, lƣới nội
chất hạt đóng vai trò quan trọng trong việc đóng gói các protein của tế bào.
Các ribosome trên bề mặt lƣới nội chất hạt tham gia vào quá trình xử lý
và phân loại protein. Trong quá trình dịch mã tại ribosome, một peptide tổng
hợp sẽ đƣợc định hƣớng đivào ER dựa trêntrình tự tín hiệu. Sau đó, chuỗi tín
hiệu đƣợc phân tách, và protein đƣợc giải phóng vào khoang của ER. Protein
sau khi đƣợc đƣa đếnER để hình thành cấu trúc có thể đƣợc tiết ra ngoại bào
hoặc tồn đọng trong ER. Bất kể đích đến cuối cùng của protein là ở đâu,
chúng cũng phải trải qua các quá trình khác nhau trong các xoang dẹt của lƣới
nội chất. Chúng liên quan đến việc cuộn xoắn tạo thành cấu trúc bạc cao, tập
hợp thành phức hợp đa đơn vị, hình thành liên kết disulfua, glycosyl hóa và
bổ sung glycolipid. Khoảng một phần ba số protein trong tế bào là protein tiết,
trong đó protein xuyên màng đƣợc trƣởng thành trong ER. Các chức năng
của nó đòi hỏi môi trƣờng trong ER phải có tính oxy hóa và giàu canxi và các
phân tử đóng vai trò cuộn xoắn protein khác. Nhu cầu về số lƣợng protein tiết
và tốc độ tổng hợp protein tiết khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào. Đặc biệt là
các tế bào có chức năng bài tiết, chúng có cấu tạo giàu ER để đáp ứng nhu cầu
của cơ thể. Các protein tiết đƣợc cuộn xoắn bởi chaperones và các phân tử
chuyển động khác, giúp gấp lại chính xác cấu hình ban đầu của chúng khi đi

15
qua ER. Tuy nhiên, đôi khi các tế bào có thể gặp phải các điều kiện bất lợi
khiến việccuộn xoắn protein ER quá nhiều. Sau đó, các chức năng cuộn xoắn
protein ER sẽ bị ảnh hƣởng bởi các nhiễu loạn khác nhau nhƣ nhiễm virus,
ung thƣ, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đƣờng, viêm nhiễm, bệnh gấp protein
và các sai lệch khác ở cấp độ tế bào. Điều này dẫn đến sự tích tụ của các
protein không đƣợc cuộn xoắn hoặc cuộn xoắn sai trong lƣới nội chất, đƣợc
gọi là stress ER.
Hiện tƣợng stress lƣới nội chất đƣợc kích hoạt bởi nhiều yếu tố bao
gồm thiếu glucose, sai hỏng glycoprotein, thiếu ion Ca2+
từ ống dẫn của lƣới
nội chất, tồn đọngcác protein không đƣợc cuộn xoắn hoặc các protein cuộn
gập sai trong xoang ER [35, 42, 43].
Những sự kiện trong tế bào nhƣ thiếu oxy, thiếu glucose, thiếu hụt ion
Ca2+
trong ER, stress oxy hóa, nhiễm virus và đột biến làm suy giảm protein có
liên quan đến sự khởi đầu của stressER. Tuy nhiên, tế bào đã phát triển một cơ
chế để phát hiện những thay đổi này và khôi phục cân bằng nội môi bằng cách
kích hoạt các đƣờng dẫn truyền tín hiệu, đƣợc gọi là Unfolder Protein Respone
(UPR). Quá trình này đƣợc bảo tồn từ nấm men sang ngƣời. Ban đầu, hệ thống
UPR cố gắng khôi phục cân bằng nội môi bằng cách tạo ra phiên mã của các
enzyme cuộn gấp, chaperone, các chất oxy hóa và giảm quá trình dịch mã
protein. Trong trƣờng hợp thất bại của quá trình thích ứng này do stress kéo dài,
UPR sẽ kích hoạt các con đƣờng chết theo chƣơng trình của tế bào để loại bỏ
các tế bào bị stress ER nhƣ một quá trình sinh lý bình thƣờng. Nếu sự chết theo
chƣơng trình này không kiểm soát đƣợc sẽ trở thành bệnh lý, dẫn đến mất tế bào
ở các cơ quan thiết yếu [44]. Do đó, UPR là một quá trình cơ bản thiết yếu trong
việc kiểm soát chất lƣợng của protein không chỉ trong giai đoạn stress ER mà
còn trong điều kiện tăng trƣởng bình thƣờng.
Tế bào động vật có vú phản ứng với stress ER bằng cách kích hoạt phản
ứngcuộn gập protein trong lòng lƣới nội chất. Phản ứngnày đƣợc cảm ứng bởi
hai loại proein: protein liên kết miễn dịch có tên là BiP (binding immunoglobulin
protein) và GRP78 (glucose regulated protein 78). Các protein không đƣợc cuộn
xoắn này khiến BiP tách khỏi các protein màng lƣới nội chất

16
là inositol requiring enzyme 1 (Ire1), PKR – like ER kinase (PERK) và
activating transcription factor-6 (ATF6), từ đó kích hoạt các protein này[45].
PERK photphoryl hóa eIF-2α dẫn đến làm giảm dịch mã mRNA cục
bộ, đồng thời làm tăng dịch mã của một số mRNA, bao gồm cả yếu tố phiên
mã ATF6. ATF6 kích hoạt sự biểu hiện của một số gen bao gồm gen biểu
hiện các chất vận chuyển axit amin, chaperone và homologous protein C/EBP
(gọi chung là CHOP). CHOP cũng tạo ra biểu hiện của GADD34, liên kết với
protein phosphatase 1 (PP1) để khử photphoryl hóa eIF-2α , do đó tiếp tục
dịch mã.Ire1α có hoạt tính kép kinase và endoribonuclease. Khi Ire1α bị
photphoryl hóa sẽ kích hoạt hoạt tính endoribonuclease để cắt nối Xbp1
mRNA, tạo ra yếu tố phiên mã hoạt động sXbp1. Khi kích hoạt Ire1α cũng
kích hoạt con đƣờng Jun N – terminal kinase (JNK).Sau khi tách khỏi BiP,
ATF6α chuyển đến khoang golgi và bị phân tách bởi protein nội bào tạo ra
một yếu tố phiên mã hoạt động hòa tan (hình 1.4).
Hình 1.4 Các con đƣờng truyền tín hiệu của phản ứng cuộn gập protein[45].

17
Cả 3 con đƣờng truyền tin này phối hợp đồng bộ để tăng khả năng
cuộn gập protein trong khoang lƣới nội chất bởi chaperone, giảm protein bị
thiếu và giảm tải protein mới vào lƣới nội chất nhằm thiết lập lại sự cân bằng
trong khoang bào quan này. Tuy nhiên, hiện tƣợng ER stress kéo dài làm tăng
hàm lƣợng oxy hoạt động (ROS) trong lƣới nội chất và chuyển đổi bản chất
thích nghi của phản ứng cuộn gập protein trong lƣới nội chất thành phản ứng
chết tế bào, chủ yếu thông qua các con đƣờng trung gian của Ire1, JNK và
PERK, yếu tố phiên mã CHOP (phiên mã các gen liên quan đến cái chết của
tế bào và kích hoạt JNK) [40].
1.2.2 Stress lƣới nội chất ở tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae
Nấm men Saccharomycescerevisiae có kích thƣớc hệ gen nhỏ (khoảng
12Mb trên tổng số 16 nhiễm sắc thể[45], thời gian thế hệ ngắn, hơn 40% trình
tự gen bảo tồn ởnấm men đƣợc dự đoán là có mặt trong hệ gen ngƣời, các cơ
chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở nấm men hoặc trong các tế bào khối u tồn tại
tƣơng tự với nhiều hơn hoặc ít hơn các chức năng trong tế bào ngƣời[47]. Do
đó S.cerevisiae đƣợc sử dụng làm sinh vật mô hình của sinh vật nhân chuẩn
trong nghiên cứu các khía cạnh sinh lý, sinh hóa, di truyền, và sinh học phân
tử.
Ire1α là protein xuyên màng loại I chức năng kép với các hoạt tính kinase
protein Ser/Thr và hoạt tính endoribonuclease (RNase). Đây là nhánh cổ điển và
đƣợc bảo tồn nhất của phản ứng cuộn gập protein trong khoang lƣới nội chất.
Ban đầu, gen Ire1 đƣợc phân lập từ sàng lọc các đột biến di truyền của nấm
menS. cerevisiae đƣợc biết đến nhƣ một đặc trƣng cần thiết cho sự biểu hiện
của chaperones lƣới nội chất và thích nghi với stress lƣới nội chất trong nấm
men. Sau đó, hai gen động vật có vú là Ire1α và Ire1β đã đƣợc xác định, với sự
tƣơng đồng đáng kể với nấm men ở đầu C và phân nhánh ở đầu N. Ire1α và
Ire1β khác nhau về trình tự axit amin vùng luminal không đƣợc bảo tồn, đặc biệt
là liên quan đến protein BiP.Ire1α đƣợc biểu hiện rộng rãi ở khắp các tế bào, còn
Ire1β chỉ biểu hiện giới hạn ở biểu mô ruột [48], hay niêm mạc đƣờng hô hấp
[49]. Hai protein này khác nhau cả về mặt chức năng và tính đặc hiệu cơ chất
theo miền RNase của chúng. Ire1α có miền

18
lumal ER – terminal, vùng xuyên màng và miền carboxy – terminal mang cả
hoạt tính xúc tác kinase và RNase. Sau khi phân tách từ liên kết BiP, Ire1α
làm giảm dần, chuyển nhóm photpho và kích hoạt RNase. Hoạt tính RNase
của Ire1α rất cần thiết cho việc cuộn xoắn protein. Trình tự axit amin của
vùng cảm biến, vùng kinase và vùng RNase trên Ire1α và Ire1β của con ngƣời
có độ tƣơng đồng lần lƣợt là 48%, 80% và 61% so với nấm men [50].
Hoạt tính RNase của Ire1 ảnh hƣởng đến yếu tố phiên mã Hac1 mRNA
ở nấm men và Xbp1 mRNA ở động vật có vú. Ire1α kích hoạt yếu tố phiên
mã hộp Xbp1 thông qua một sự kiện nối exon không theo quy luật trong khi
Ire1β làm giảm một phần sản phẩm dịch mã bằng cách cắt intron 28sRNA và
Xbp1 [50]. Sau khi kích hoạt, Ire1α cắt intron ở nucleotide thứ 252 của
mRNA Hac1 dịch chuyển khung đọc mã và xuất hiện một codon kết thúc mới
trong trình tự mã hóa [51].
Hơn nữa, Ire1α hoạt hóa cũng làm tăng các gốc oxy hóa tự do (ROS)
gây ra stress lƣới nội chất. Khi Ire1α hoạt hóasẽ làm tăng hàm lƣợng ROS
trong tế bào dẫn đến stress ER. Sự mất cân bằng ROS trong tế bào gây ra cái
chết của tế bào dẫn tới kết cục apoptossis [52].
Mặc dù chức năng của Ire1 rất đa dạng, tuy nhiên, chúng chủ yếu liên
quan đến đáp ứng ER. Sự khác nhau về loại mô tế bào, thuộc tính bệnh lý,
cƣờng độ stress và sự liên kết hay phân ly của các phân tử làm nhiệm vụ cuộn
xoắn protein sẽ quyết định bản chất của hoạt động Ire1. Các phân tử protein
màng ER linh hoạt này kiểm soát các chức năng khác nhau của tế bào, bao
gồm sự hình thành tế bào, truyền tín hiệu, bài tiết và điều chỉnh nhiều bệnh
mãn tính. Sự biểu hiện Ire1 trong tế bào phải đƣợc điều hòa một cách nghiêm
ngặt vì sự biểu hiện quá mức Ire1α và Ire1β ở động vật có vú gây ra quá trình
apoptosis [53]. Khi tình trạng stress càng nghiêm trọng, hoạt động của Ire1
càng tăng, điều này kích hoạt phân tử cảm ứng apoptosis và dẫn đến chết tế
bào. Các cơ chế điều hòa khác nhau của Ire1α trong các điều kiện sinh lý và
các mức độ căng thẳng khác nhau vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ.
Việc sử dụng sinh vật mô hình là nấm men Saccharomyces cerevisiae
giúp tiết kiệm đƣợc rất nhiều thời gian và chi phí nghiên cứu.Các kết quả

19
nghiên cứu của luận văn này sẽ góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến
tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hƣởng
của Pg đến tế bào động vật.
1.2.3. Ảnh hƣởng của prodigiosin lên mạng lƣới nội chất
Prodigiosin kích hoạt cả ba nhánh tín hiệu của UPR gây ra stress ER.
Pg ảnh hƣởng cục bộ với ER và gây ra tự thực bào. Năm 2012, Pan và cộng
sự báo cáo rằng đích tác động của Pg là yếu tố phiên mã CHOP và gây ra
stress ER trong nhiều dòng tế bào ung thƣ vú ở ngƣời bởi cơ chế này. CHOP
đƣợc công nhận là một trong những trung gian phân tử trung tâm chịu trách
nhiệm cho quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào do stress ER. Việc ức
chế BCL – 2 phụ thuộc CHOP là một bƣớc trung gian của Pg để gây ra cái
chết tế bào qua trung gian stress ER [35].
Pg gây chết tế bào tự thực bào bằng cách kích hoạt con đƣờng JNK.
Prodigiosin cũng điều chỉnh giảm đáng kể con đƣờng AKT / mTOR và gây ra
hoạt động caspase – 3[40].Prodigiosin có tƣơng quan mạnh với calnexin –
protein chaperone gắn màng ERliên quan đến stress ER [22]. Tự thực bào là
một phản ứng tế bào quan trọng để duy trì cấu trúc và chức năng của ER.
Thông thƣờng, tực thực bào có cả tác động tích cực và tiêu cực. Chẳng hạn,
khi các tế bào ung thƣrơi vào stress ở các mức độ khác nhau, phản ứng stress
ER cho phép sự sống của tế bào. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng
sựthực bàoquá mức gây chết tế bào thông qua các cơ chế khác hơn là chết
theo chƣơng trình và chết tế bào hoại tử. Cheng và cộng sự (2018)đã quan sát
thấy sự tích lũy của LC3 puncta, một dấu hiệu tự phát, tăng trong vòng vài
phút sau khi ủ tế bào u nguyên bào thần kinh đệm với Pg. Họ đã phát hiện các
dấu hiệu stress ER đƣợc điều hòa theo biểu thức BiP/ GRP78 và sXbp1 trong
cả hai tế bào u nguyên bào thần kinh đệm U87MG và GBM8401[22]. Những
kết quả này đã chứng minh rằng prodigiosin nằm trong ER và gây ra stress
ER.
Tác động đến phản ứng cuộn xoắn protein gây apoptosis đang là hƣớng
đi tiềm năng trong nghiên cứu thuốc điều trị ung thƣ hƣớng đích. Trong
nghiên cứu này, tôi cung cấp cơ chế prodigiosin gây chết tế bào nấm men

20
thông qua gây stress mạng lƣới nội chất bởi sự tác động đến protein màng
Ire1 và sự biểu hiện của Hac1 mRNA. Những phát hiện của tôi trong luận văn
này góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ
sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hƣởng của Pg đến tế bào động vật và
ngƣời.

21
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1 Nguyên liệu
Chủng vi khuẩn S. marcescensVTCC910027 và nấm men KMY 1516
lƣu trữ tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các chủng đƣợc giữ giống
trong ống thạch nghiêng trên môi trƣờng NA ở 4o
C và bảo quản bằng
glycerol 25% ở –80o
C.
2.1.2 Hoá chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là có độ tinh sạch cao thuộc các
hãng uy tín nhƣ: Pg (Sigma), PBS trypsin – EDTA0,025% (Gibco, Mỹ), cao
nấm men, cao thịt, peptone, glycerol, NaCl (Meck), dầu lạc (Việt Nam).
Các dung môi tuyệt đối đƣợc mua từ Trung Quốc: n-hexan, toluen,
ethyl acetate, acetone. Các dung môi nhƣ EtOAc, MeOH, n-hexan, acetone
đƣợc cất lại và làm khan trên hạt rây phân tử (3A, 4A) trƣớc khi sử dụng.
2.1.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy và đệm
Thành phần một số môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong
nghiên cứu đƣợc pha theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các thành phần môi trƣờng và đệm
Tên môi trƣờng Thành phần
SD lỏng 2% glucose, 0,66% yeast nitrogen base, 0,015% uracine
SD đặc 2% glucose, 0,66% yeast nitrogen base, 2% bactoagar,
0,015% uracine
NA 5g peptone; 3g cao nấm men; 5g NaCl; 15g agar; pH 7
NB 5g peptone; 3g cao nấm men; 5g NaCl; pH 7 – 7.5
Agarose 1,5% 1,5g agarose, 100ml TBE 1X

22
2.1.4 Trang thiết bị
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Box cấy vi sinh clean beach Trung tâm chuyển giao công nghệ, Việt
Nam
Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ)
Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)
Máy đo pH Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc nuôi cấy Certomat HK(Đức)
Máy li tâm lạnh Miikro 22R Hettich (Đức)
Máy quang phổ UV – 2500 LaboMed Inc (Mỹ)
Máy cô quay Buchi Buchi (Đức)
Máy ly tâm Sorvall Legend XTR (Nhật)
Nồi khử trùng ES – 315 Tomy (Nhật)
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Hoạt hóavà lên men thu sinh khối chủng Serratia marcescens
Chủng S. marcescens VTCC 910027lƣu giữ trong glycerol 25% ở -
80o
C đƣợc lấy ra đặt trong khay lạnh -20o
C và chuyển vào buồng cấy. Dùng
tăm vô khuẩn lấy một ít tế bào từ ống giống cấy ria 3 pha trên đĩa môi trƣờng
NA thạch. Ủ đĩa ở 28o
C trong 24 giờ sẽ xuất hiện khuẩn lạc màu đỏ. Chọn
các khuẩn lạc riêng rẽ nuôi trong 3ml môi trƣờng NB có bổ sung 2% dầu
vừng, lắc 200 vòng/ phút ở 28o
C trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 1

23
Dịchnuôi giống (3%) đƣợc chuyển vào các bình tam giác có mấu chứa
500ml môi trƣờng NB có bổ sung 2% dầu vừng, nuôi lắc ở 200 vòng/ phút ở
28o
C trong 24 giờ.
Giống sau khi đƣợc nuôi cấy trong bình tam giác đƣợc kiểm tra mức
độ đồng đều của tế bào bằng cách soi dƣới kính hiển vivà khẳng định mẫu là
thuần khiết để chuyển sang nhân giống cấp 2.
Nhân giống cấp 2
Chuyển 3% giống cấp 1 vào thiết bị lên men dung tích 3 lít chứa 2 lít
môi trƣờng NB có bổ sung 2% dầu vừng, nuôi cấy lắc 300 vòng/phút ở 28o
C
trong 72 giờ, sau đó thu sinh khối để tách chiết Pg thô.
2.2.2. Hoạt hóa chủng nấm menKMY 1516
Chủng nấm men KMY 1516đƣợc hoạt hóa trên đĩa thạch môi trƣờng
SD ở 28o
C từ 3 đến5 ngày. Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào lọ chứa 3ml
môi trƣờng SD có bổ sung 1% uracil, nuôi lắc ở 28o
C trong 24 giờ. Tiếp 5%
giống vào bình tam giác chứa 150ml môi trƣờng SD có bổ sung 1% uracil,
tiếp tục nuôi ở 28o
C trong 16 –18giờ.
2.2.3. Lựa chọn hệ dung môi tách chiết Prodigiosin
Tách chiết prodigiosin từ chủng S. marcescens VTCC 910027
Chiết lần 1
Dựa theo phƣơng pháp của Shahitha và cộng sự 2012 [2]có cải biến.
Sinh khối tế bào đƣợc cho vào lắc chiết trong acetone với tỉ lệ tế bào :
acetone là 1 : 1 (w/v). Mẫu đƣợc chiết bằng cách lắc 150 vòng/ phút ở nhiệt
độ 28o
C trong 3 giờ, sau đó chuyển sang bình chiết để 15 phút cho lắng
xuống. Bình chiết đƣợc phân thành 2 lớp: lớp dịch nổi phía trên là dung môi
chứa Pg, lớp cặn phía dƣới là cặn tế bào còn lẫn Pg. Thu dịch nổi phía trên,
phần bên dƣới còn lại mang đi ly tâm 4000 vòng/ phút/ 5 phút, thu dịch nổi,
cặn đỏ còn lại mang đi chiết bằng acetone, lặp lại nhƣ ban đầu.
Mẫu dịch chiết lần 1 và lần 2 đƣợc kiểm tra bằng TLC. Tra mỗi mẫu
3 l, chạy với hệ dung môi toluen : ethyl acetate tỉ lệ 1:1. Bản TLC cho thấy

24
với cùng thể tích tra mẫu, mẫu dịch chiết lần 1 các băng trong đó có băng đỏ
ngang chuẩn Pg, đậm đặc hơn nhiều so với mẫu chiết lần sau.
Chiết lần 2
Dịch Pg chiết trong acetone sau đó đƣợc rửa lại trong ethyl acetatetheo
tỉ lệ thể tích 1:1, lắc đều trong phễu chiết, sau đó thêm 5 - 10 lần thể tích nƣớc
so với mẫu để loại bỏ acetone tan trong lớp nƣớc phía dƣới. Nếu lớp dịch
phía dƣới vẫn còn đỏ thì chiết lại trong 200ml ethyl acetate cho đến khi hết
đỏ. Lớp dịch đỏ phía trên đƣợc ly tâm 4000 vòng/ phút/ 5 phút để thu lớp Pg
tan trong ethyl acetate ở pha trên. Dịch chiết thu đƣợc đem đo OD535 để định
lƣợng Pg.
Dịch chiết Pg trƣớc và sau khi rửa, dịch loại acetone trong nƣớc cũng
đƣợc giữ lại để TLC kiểm tra với hệ dung môi ethyl acetate : toluen tỉ lệ 1:1.
2.2.4 Xây dựng đƣờng chuẩn prodigiosin dựa trên mật độ quang
Nguyên lý phƣơng pháp dựa trên kết quả đo OD (giá trị mật độ quang)
ở bƣớc sóng 535 nm, đây là bƣớc song mà Pg hấp thụ tối đa. Đƣờng chuẩn
đƣợc xác định dựa trên hàm lƣợng prodigiosin chuẩn (100 g/ml) đƣợc pha
loãng ở các nồng độ khác nhau vfa đo ở bƣớc sóng 535 nm.. Đƣờng chuẩn
prodigiosin đƣợc dựng dựa vào hàm lƣợng prodigiosin pha loãng và giá trị
OD ở các nồng độ pha loãng đó.
0.25
0.2
y = 0.0562x - 0.0005
R² = 0.9923
0.15
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4
Nồng độ Pg (mg/L)
Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn prodigiosin

25
Pha ống Pg gốc 1 mg/ml: Cân 1 mg Pg hòa với 1 ml methanol. Từ ống
gốc pha loãng với methanol ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0;
1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 g/ml. Sử dụng máy quang phổ để đo hấp thụ
ở bƣớc sóng 535 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang theo
nồng độ Pg chuẩn và xác định đƣờng chuẩn. Từ đƣờng chuẩn tính toán hàm
lƣợng Pg theo phƣơng trình y= 0,0562x- 0,0005 (Hình 2.1).
2.2.5 Tinh chế prodigiosin bằng phƣơng pháp sắc ký
2.2.5.1 Phương pháp sắc ký cột
Cột silica gel với kích thƣớc 4x20cm đƣợc sử dụng để tinh sạch mẫu
chứa Pg. Hạt silica gel(60g) đƣợc hòa tan trong methnol để tạo cột. Sau đó,
cột đƣợc cân bằng với hệ dung môi toluen và n – hexan. Mẫu chiết ban đầu
đƣợc đƣa lên cột silica gel. Mỗi phân đoạn thu 20ml. Ban đầu, mẫu đƣợc
đƣợc đẩy bằng hệ dung môi toluen và n – hexan tỉ lệ thể tích 1:1 để loại các
băng khác. Sau đó mẫu đƣợc thôi bằng hệ dung môi toluen và ethyl acetate tỉ
lệ thể tích 9:1 và tiếp tục thôi với tỉ lệ 6:4. Cuối cùng, mẫu đƣợc thôi hoàn
toàn bằng methanol. Mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng chạy
trên bản TLC. Các phân đoạn tƣơng đối sạch, không còn băng trên sẽ đƣợc
gom lại để lên cột tinh sạch lần 2.
Mẫu gom lần 1 đƣợc sử dụng để tinh sạch lần 2 cũng bằng cột silica
gel 60F254. Mẫu đƣợc thôi bằng hệ dung môi toluen và ethyl acetate tỉ lệ thể
tích 9:1. Sau đó đƣợc thôi tiếp bằng toluen và ethyl acetate tỉ lệ thể tích 1:1 và
đƣợc thôi hoàn toàn bằng methanol. Từ đó các phân đoạn đƣợc kiểm tra,
đánh giá độ sạch trên bản TLC.
2.2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Nguyên lý: Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography
– TLC) dùng để tách các chất trong hỗn hợp, đƣợc tiến hành để cho pha động di
chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là một lớp
mỏng có các chất hấp phụ, thƣờng là silca gel, aluminium oxide, hoặc cellulose
đƣợc phủ trên mặt phẳng một chất trơ. Pha động là một hệ dung môi đơn thuần
hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ quy định. Trong quá trình di chuyển qua lớp
hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển

26
trên lớp mỏng theo hƣớng pha động với tốc độ khác nhau. Kết quảthu đƣợc
một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự phân tách có thể là cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của
nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm
pha động.
Cách tiến hành: Pg đƣợc đánh giá độ tinh sạch trên bản mỏng silica gel
60F254 dày 0,25mm với pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ silica gel.
Dung môi sử dụng làm pha động là hỗn hợp dung môi ethyl acetate : toluen tỉ
lệ thể tích 1:1. Sắc ký đồ đƣợc hiện màu bằng phƣơng pháp nhuộm iodine
trong 5 – 10 phút.
2.2.5.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Pg sau khi tinh sạch qua cột sắc ký silica gel đƣợc xác định độ tinh
sạch bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
Cơ sở lý thuyết: Phƣơng pháp HPLC dựa trên hiện tƣợng trong cùng
một điều kiện, mỗi cấu tử trong hỗn hợp tƣơng tác với môi trƣờng xung
quanh khác với tất cả các cấu tử khác. Sự phân tách đƣợc thực hiện ở cả hai
pha, pha động là dung môi và pha tĩnh chứa trong cột chất rắn.
Các bƣớc tiến hành: Dựa theo phƣơng pháp của Wang và cộng
sự(2013). Pg tinh sạch đƣợc hòa tan trong methanol với nồng độ 0,3mg/ml.
Sau đó 10 l của dịch này đƣợc đƣa vào bộ phận tiêm mẫu và hỗn hợp đƣợc
đƣa lên cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng một dung môi (pha động).
Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt sắc ký có diện tích bề mặt lớn.
Các cấu tử trong mẫu liên tục tƣơng tác với pha tĩnh và di chuyển dọc trên cột
với các tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lƣợt thoát ra khỏi cột và đi
vào detector 535nm, ở đây tín hiệu đƣợc ghi lại, xử lý và chuyển ra ngoài một
sắc ký đồ cho biết sự hiện diện của mỗi cấu tử dƣới dạng một peak. Khi đó
lƣợng cấu tử có trong mẫu đƣợc tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích
peak của nó.
Hàm lƣợng Pg đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC. HPLC là quá
trình tách một hỗn hợp chất trong cột sắc ký ở trạng thái lỏng. Các chất mẫu

27
phân tích phải đƣợc hòa tan trong một chất lỏng phù hợp, thƣờng chính làpha
động chạy sắc ký.
Các mẫu Pg đƣợc phân tích bằng HPLC với hệ dung môi pha động là
MeOH : H2O gradient lần lƣợt các bƣớc: MeOH : H2O20:80 trong 2phút;
MeOH : H2O 20 – 100/ 80 – 0 trong 17 phút; MeOH : H2O 20:80 trong 5
phút; MeOH : H2O 100:0 trong 8 phút. Hàm lƣợng Pg đƣợc xác định trên sắc
ký đồ HPLC của chuẩn Pg tại nồng độ xác định.
2.2.6 Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của prodigiosin lên mạng
lƣới nội chất tế bào
2.2.6.1 Phương pháp xác định hoạt tính β-galactosidase
Phƣơng pháp xác định hoạt tính β – galactosidase đƣợc thực hiện theo
protocol của Kaiser và cộng sự năm 1994.
Nguyên lý: Hoạt độ β – galactosidaseđƣợc xác định bằng cách cho
enzyme này tác dụng với cơ chất tổng hợp o – nitrophenyl – β – D
galactosidase (oNPG). Dƣới tác dụng của β – galactoside, oNPG sẽ bị thủy
phân thành galactose và o – nitrophenol(ONP). ONP khi giải phóng sẽ chuyển
hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ ở bƣớc sóng cực đại 420nm. Tế
bào đƣợc bổ sung vào 900 L, bổ sung thành phần đệm Z, 20 L SDS 0,1% và
50 L chloroform để phá vỡ tế bào, votex trong 20 giây và ủ ở 28o
C trong 5 -
10 phút. Bổ sung oNPG. Phản ứng đƣợc dừng bằng cách cho thêm 0,5 mL
1M Na2CO3. ONPđƣợc đo ở bƣớc sóng 420nm. Hoạt tính β – galactosidelà
lƣợng enzyme β – galactoside cần thiết để phân giải oNPG thành 1 nmol
ONP trong một phút ở điều kiện phản ứng
Công thức tính hoạt tính β – galactosidase:
HT = (
A
420
x375
) : OD600
t
Trong đó: t là thời gian phản ứng

28
2.2.6.2 Phương pháp tách chiết, tạo thư viện cDNA và đọc trình tự
RNA tổng số
Phƣơng pháp phenol nóng đƣợc sử dụng để tách chiết ARN tổng số từ
tế bào nấm men. Dịch tế bào nấm men KMY 1516 đƣợc ly tâm ở 3000
vòng/phút trong 5 phút, thu tế bào và bảo quản trong nitơ lỏng ở - 80o
C. Hòa
tế bào trong 400 L dung dịch đệm chiết ARN có chứa 50 mM natri axetat
(pH5,3) và 10 mM EDTA. Chuyển tế bào sang ống eppendoft, thêm 40 L
10% SDS và votex 10 giây. Sau đó thêm 400 L phenol bão hòa nóng, ủ trong
bể ổn nhiệt 65 °C trong 1 giờ. Sau đó, dung dịch đƣợc làm lạnh ở - 80 °C
trong 90 phút. Sau khi rã đông, dung dịch đƣợc ly tâm ở 15000 vòng/ phút
trong 10 phút và thu pha nƣớc phía trên. Sau đó, pha nƣớc đƣợc chiết xuất
bằng 100 L dung dịch phenol-cloroform hai lần. ARN tổng số đƣợc kết tủa từ
phần nƣớc thu đƣợc bằng cách thêm 1/10 thể tích natri axetat 3 M (pH5,3) và
2,5 lần thể tích etanol. Sau khi rửa bằng etanol 70% và làm khô, ARN đƣợc
hòa tan vào 20 đến 30 L nƣớc.
Phản ứng reverse transcription – PCR đƣợc sử dụng để kiểm tra mức
độ biểu hiện của Hac1 – mRNA. Phản ứng reverse transcription– PCR sử
dụng cặp mồi Hac1 có trình tự là “TACAGGGATTTTCAGAGCACG” (mồi
xuôi) và “TGAAGTGATGAAGAAATCATTCAATTC” (mồi ngƣợc).

29
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TÁCH CHIẾT PRODIGIOSIN
Hầu hết các chất chuyển hóa thứ cấp của vi sinh vật đƣợc tiết ra ngoài
hoặc tồn tại trong nội bào. Ở vi khuẩn S. marcescens, các chất chuyển hóa thứ
cấp trong tế bào đƣợc bao bọc vững chắc bởi hai lớp màng peptidoglican và
liopolysaccharide. Do đó, để chiết suất các chất nội bào từ S. marcescens cần
sử dụng phƣơng pháp pháp đặc biệt để vỡ tế bào.
Theo các nghiên cứu trƣớc đây,dung môi ethyl acetate có bổ sung 1%
HCl là hệ dung môi tối ƣu cho việc tách chiết Pg từ dịch lên men lỏng chủng
S. marcescens (cả dịch và tế bào). Tuy nhiên, cũng có một số tác giả công bố
rằng dung môi acetone là tối ƣu để tách chiết Pg từ dịch lên men vi khuẩn. Do
đó, tế bào chủng S. marcescens VTCC 910027thu đƣợc từ lên men đƣợc
nghiên cứu tách chiết với dung môi acetone cùng với hệ dung môi ethyl
acetate + 1% HCl.
A B
Hình 3.1. Bình chiết tế bào lần 1 bằng hệ dung môi ethyl acetate + 1%
HCl (A) và acetone (B)
Khi chiết bằng hệ dung môi ethyl acetate + 1% HCl, tế bào sau khi
chiết bị trƣơng nên khi ly tâm thu đƣợc ít dịch (Hình 3.1A). Sau đó khi bổ
sung dung môi để chiết tiếp lần 2, hỗn hợp ngậm dung môi nhiều hơn và mỗi
lần chiết thu đƣợc rất ít dịch chứa Pg. Từ 10 g tế bào thu đƣợc từ 1L môi
trƣờng nuôi cấy, sau khi chiết tổng số Pg thu đƣợc đạt khoảng 300 mg/L môi
trƣờng (Hình 3.1A).

30
Trong khi đó với hệ dung môi acetone, dịch chiết đƣợc phân thành 2
lớp rõ rệt, lớp dung môi chứa Pg phía trên và lớp cặn tế bào bên dƣới (Hình
3.1B). Gạn thu lớp dịch trong phía trên, còn phần dịch đục đem ly tâm 4000
vòng/phút/5 phút thu lớp dịch trong phía trên. Cặn tế bào đƣợc tiếp tục chiết
thêm mộtlần nữa trong acetone theo tỷ lệ thể tíchacetone: mẫu là 1:1. Hiệu
quả chiết Pg sau mỗi lần chiết cũng tốt hơn so với hệ dung môi ethyl acetate
có bổ sung 1% HCl. Chỉ sau hailần chiết trong acetone, Pg đã đƣợc chiết hết
khỏi tế bào, cặn tế bào có màu trắng. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu
của Park và cộng sự (2012) về lựa chọn dung môi thích hợp để tách chiết Pg
từ tế bào chủng H. chejuensis M3349. Từ cặn tế bào thu đƣợc sau khi lên men
lỏng với các hệ dung môi hexane, toluen, chloroform, ethyl acetate, ethanol,
methanol, acetone, acetonitrile và nƣớc biển, Park và cộng sự đã chỉ ra rằng
acetone là dung môi tối ƣu nhất cho việc tách chiết Pg từ tế bào chủng H.
chejuensis M3349 [54].
A B
Hình 3.2 Bình rửa dịch chiết Pg trong acetone rửa bằng ethylacetate và
nƣớc lần 1 (A) và lần 3 (B)
Dịch chiết Pg trong acetone sau đó đƣợc rửa lại trong ethyl acetate và
nƣớc để loại bỏ acetone tan trong lớp nƣớc phía dƣới (Hình 3.2). Kết quả rửa
trên Hình 3.2 cho thấy lớp dịch phía trên đỏ có chứa Pg tan trong ethyl
acetate, lớp dịch phía dƣới màu nhạt, đục có thể do chứa nƣớc, acetone lẫn

31
một số chất bị loại ra. Lớp dịch đỏ phía trên lại tiếp tục đƣợc rửa lại bằng
nƣớc thêm hai lần nữa, sau đó lớp dịch đỏ phía trên đƣợc ly tâm 4000
vòng/phút/5 phút để thu lớp Pg tan trong ethyle acetate ở lớp trên. Mẫu thu
đƣợc sau chiết và xác định hàm lƣợng Pg. Kết quả thu đƣợc đạt khoảng 600
mg/L môi trƣờng, cao hơn gấp hai lần so với khi chiết Pg bằng hệ dung môi
ethyl acetate. Kết quả tách chiết này cũng giống với nghiên cứu của Park và
cộng sự năm 2012 [54].
Pg
1 2 C
Hình 3.3. Bản TLC mẫu dịch chiết chủng S. marcescens VTCC 910027
bằng hai dung môi acetone và acetate + 1% HCl. Dịch chiết bằng bằng dung
môi acetone (1); Dịch chiết tế bào bằng hệ dung môi ethyl acetate + 1% HCl
(2); Pg chuẩn (C).
Kết quả kiểm tra TLC dịch chiết Pg bằng hai hệ dung môi (Hình 3.3)
cũng cho thấy mẫu dịch chiết bằng ethyl acetate + 1% HCl (làn 2) và mẫu
dịch chiết ban đầu trong acetone (làn 1) khá giống nhau, đều có băng đỏ
ngang chuẩn Pg và nhiều dải băng phụ, đặc biệt nhiều băng đậm ở mép trên
cùng bản TLC và ở chân chỗ điểm chấm mẫu TLC.
Nhƣ vậy, khi chiết rửa với dung môi acetone thu đƣợc hàm lƣợng Pg
cao hơn và sạch hơn hệ dung môi ethyl acetate. Kết quả này sẽ thuận lợi hơn
cho việc tinh sạch Pg sau này.

32
3.2 XÁC ĐỊNH HỆ DUNG MÔI THÍCH HỢP ĐỂ TINH SẠCH
PRODIGIOSIN
3.2.1 Lựa chọn hệ dung môi thích hợp
Để xác định hệ dung môi phù hợp để tinh sạch Pg từ dịch chiết Pg thô,
trƣớc tiên mẫu Pg thô đƣợc chạy TLC trên bản silica gel 60 với các hệ dung
môi khác nhau. Từ đó đƣa ra đƣợc hệ dung môi có thể phân tách các hợp chất
khác nhau có trong dịch chiết Pg thô từ dịch lên men chủng S. marcescens
VTCC 910027 một cách tốt nhất.
Năm 2006, Song và cộng sự đã tách chiết Pg bằng hệ dung môi n –
hexan: ethyl acetate, tỷ lệ 2:1 [v/v] và chạy TLC với hệ dung môi
chloroform:methanol: diethyl ether, tỷ lệ 6:2:2 [18]. Đến năm 2014, Zang và
cộng sự đã tinh sạch Pg qua cột sắc ký silica gel 60 bằng hệ dung môi toluen :
ethyl acetate tỷ lệ 9:1 [55].
Ba hệ dung môi khác nhau đƣợc xây dựng để đánh giá khả năng phân
tách Pg với các hợp chất khác trong dịch chiết Pg thô bằng TLC trên bản
silica gel 60 bao gồm toluen : ethyl acetate (9:1), methanol : ethyl acetate :
chloroform (6:3:1), methanol : chloroform : acetone (4:3:2).
C M C M CM
Pg
Pg
Pg
1 2 3
Hình 3.4 Kết quả TLC dịch chiết Pg bằng các hệ dung môi khác nhau
1. Toluen : ethyl acetate (9:1); 2. Methanol : ethyl acetate : chloroform
(6:3:1); 3. Methanol : chloroform : acetone (4:3:2). C – Pg chuẩn; M – Pg từ
mẫu dịch chiết.

33
Kết quả TLC thu đƣợc ở hình 3.4 cho thấy từ cùng một dịch chiết Pg
thô khi chạy TLC trên bản silica gel 60 ở mỗi hệ dung khác nhau sự phân tách
các chất là khác nhau. Trong đó, hệ dung môi toluen : ethyl acetate (9:1) có
khả năng phân tách các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp dịch chiết Pg thô là
tốt nhất, đặc biệt là các hợp chất chạy phía trƣớc có Rf thấp hơn so với Pg. Ở
các hệ dung môi còn lại nhƣ methanol : ethyl acetate : chloroform (6:3:1),
methanol : chloroform : acetone (4:3:2) hầu nhƣ không phân tách đƣợc Pg
với các chất khác trong hỗn hợp, các chất chạy liền nhau, phân tách không rõ
ràng.
Nhƣ vậy hệ dung môi toluen : ethyl acetate là phù hợp nhất để phân
tách các hợp chất có trong dịch chiết Pg thô từ dịch lên men chủng S.
marcescens VTCC 910027. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Zang và
cộng sự [55].
3.2.2 Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp
Sau khi lựa chọn đƣợc hệ dung môi thích hợp nhất là toluen :
ethyl acetate, tiến hành xây dựng các tỷ lệ dung môi khác nhau để tách Pg ra
khỏi các hợp chất khác trong dịch chiết Pg thô.
Sau khi chạy TLC mẫu trên bản silica gel bằng hệ dung môi toluen :
ethyl acetate với các tỉ lệ khác nhau, kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong
hình 3.5.

34
A B C
Pg
Pg Pg
M C MC M C
Hình 3.5 Kết quả TLC mẫu Pg tinh chế bằng hệ dung môi toluen và ethyl
acetate tỷ lệ lần lƣợt 9:1 (A), 4:1 (B) và 7:3 (C) với cùng thể tích.
Kết quả TLC cho thấy tỉ lệ toluen càng cao thì khả năng phân tách các
hợp chất có Rf lớn hơn Pg càng tốt. Đặc biệt là ở tỉ lệ toluen : ethyl acetate là
9:1, các hợp chất có Rf lớn hơn sẽ dễ dàng đƣợc đẩy ra tại những phân đoạn
đầu (Hình 3.5 A), trong khi với tỉ lệ toluen thấp hơn và ethyl acetate cao nhƣ
tỷ lệ 4:1 và 7:3 với Rf của prodigiosin lần lƣợt là 0,38 và 0,72 thì các chất sẽ
bị đẩy nhanh hơn cùng với prodigiosin, do đó mức độ để tinh sạch sẽ kém hơn
(Hình 3.2 B, C).
Nhƣ vậy, với kết quả thu đƣợc có thể thấy hệ dung môi toluen : ethyl
acetate với tỉ lệ 9:1 (v/v) có Rf của Pg là 0,125 là thích hợp nhất cho việc tinh
sạch Pg từ dịch dịch nuôi cấy S. marcescens VTCC 910027 bằng sắc ký cột
silica gel 60.
3.3 TINH SẠCH PRODIGIOSIN QUA CỘT SILICAGEL
3.3.1 Tinh sạch
Hạt silica là hạt phân cực các chất không phân cực có thể bị đẩy ra khỏi
cột bởi các dung môi phân cực yếu nhƣ toluen, n – hexan, iso – octane. Còn
những dung môi có tính phân cực tốt nhƣ ethyl acetate, ethyl ether, acetone
hay methanol đƣợc dùng để đẩy các chất phân cực nhƣ Pg ra khỏi cột.

35
Hệ dung môi toluen và ethyl acetate có khả năng đẩy tốt các chất tƣơng
tác mạnh hơn trên silicagel. Ngoài ra, hệ dung môi này có khả năng phân tách
tốt các hợp chất không phân cực ra khỏi hợp chất phân cực. Pg là một chất
phân tách tốt trên hệ dung môi không phân cực.
A B
Hình 3.6 Các phân đoạn đặc trƣng của mẫu tinh sạch từ S. marcescens
VTCC 910027 lần1 (A) và lần 2 (B).
Do đó, hệ dung môi toluen và n – hexan(phân tách kém) đƣợc sử dụng
để loại các chất không phải Pg – tƣơng tác kém lên hạt silicagel. Sau đó tiếp
tục sử dụng hệ dung môi toluen và ethyl acetate để phân tách hoàn toàn Pg.
Kết quả ở hình 3.6cho thấy, hệ dung môi toluen và n-hexan đã đẩy các
chất không phải prodigiosin có màu tím, nâuđất, vàng, trắng và xanh tím
(hình 3.6B từ mẫu số 1 đến số 9). Các phân đoạn này khi chạy TLC kiểm tra
cho thấy không có băng Pgso với băng Pg chuẩn.
Mẫu tiếp tục đƣợc thôi bằng hệ dung môi toluen và ethyl acetate với tỷ lệ
9:1 (v/v) để thu mẫu chứa Pg với màu đỏ thẫm, đỏ cam và cam nhạt. Khi chạy
TLC các phân đoạn này có chứa Pg và đã không còn xuất hiện các băng phía trên
băng Pg. Tuy nhiên, mẫu lại chứa các băng phía dƣới Pg so với băng chuẩn
(hình 3.6 A). Những phân đoạn chứa hàm lƣợng Pg cao (hình 3.6A từ mẫu số 10
đến 13) đƣợc gom lại và đƣợc lên cột tinh sạch lần 2 (hình 3.6B)sử dụng hệ
dung môi toluen và ethyl acetate tỷ lệ 9:1 (v/v) để loại các băng dƣới.
Kết quả tinh sạch lần 2 cho thấy, ở phân đoạn đầu, mẫu chứa dải băng
màu xanh tím và tới các phân đoạn sau, mẫu đã chứa prodigiosin sạch với
màu đỏ đặc trƣng. Kết quả chạy TLC xuất hiện một băng duy nhất là băng Pg
so với băng chuẩn với Rf đạt 0,56 (Hình 3.7 B).

36
Pg
Pg
LC112 3 C C 1 2
A B
Hình 3.7. TLC prodigiosin tinh sạch lần 1 (A): LC1 – Dịch lên cột; 1, 2, 3 –
phân đoạn sau tinh sạch; và lần 2 (B), 1, 2 – phânđoạn tinh sạch; C –
Pgchuẩn.
3.3.2 Xác định độ sạch của Pg bằng HPLC
Các phân đoạn prodigiosin sạch sau khi đánh giá trên sắc ký lớp mỏng
(TLC) đã đƣợc thu lại để kiểm tra mức độ sạch bằng HPLC.
A
B
Hình 3.8 Kết quả chạy HPLC của dịch chiết prodigiosin từ chủng S.
marcescens VTCC 910027 (A) Pg chuẩn (B)
Kết quả sắc ký đồ hình 3.9 cho thấy, Pg tinh sạch đã có một peak duy

37
nhất có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu của Pg chuẩn. Mẫu prodigiosin
sạch đã đạt gần 99%.
Hình 3.9. Sắc ký đồ HPLC của mẫu prodigiosin tinh sạch
3.3.3 Xác định độ sạch prodigisin bằng phổ 1
H
Để xác định độ tinh khiết của Pg, chúng tôi tiến hành đo phổ phổ 1
H
NMR. Các phổ 1
H NMR 1D và 2D đƣợc đo trên máy Bruker AV 500 MHz
trong dung môi CDCl3 (Deuterated chloroform). Phổ 1
H NMR đƣợc đo
tƣơng ứng tại 500MHz. Chất chuẩn nội là tetramethylsilane (TMS). Các tín
hiệu đƣợc đƣa dƣới dạng s (singlet), d (doublet), dd (doublet doublet), t
(triplet), quint (quintet) và m (multiplet).
Phổ 1
H NMR (Hình 3.10) của chất phân lập đƣợc từ chủng S.
mercescens VTCC 910027 có các tín hiệu dƣới dạng singlet từ (broad singlet)
của 2 hydrogen gắn với N tại 12,57 ppm (1H) và 12,70 ppm (1H), tƣơng ứng
với H-1và H-1’. Trong vùng của hydrogen thơm và olefin có 6 tín hiệu cộng
hƣởng tƣơng ứng với 6 proton, trong đó có 3 tín hiệu singlet tạiH 6,96,
6,68, và 6,08 ppm. 3 tín hiệu còn lại tƣơng ứng với 3 proton thuộc cùng một
hệ spin.

38
Ở vùng trƣờng cao có tín hiệu của một nhóm OMe (s, 4,00), một nhóm
Me tạiH 2,5 (s), một nhóm Me đầu mạch cacbon (t, 0,90), 2 nhóm CH2 (t,
2,39 và 1,54) và 2 nhóm CH2 dƣới dạng multiple trùng lên nhau tạiH 1,32.
Hình 3.10.Phổ 1
H NMR
Phổ 1
H NMR cho thấy các peak xuất hiện tƣơng đƣơng với cấu trúc
của Pg, chứng tỏ Pg sau khi tinh sạch không lẫn các hợp chất lạ.
3.4 XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƢỚI
NỘI CHẤT TẾ BÀO
3.4.1 Ảnh hƣởng của prodigiosin đến protein màng Ire1
Mức độ stress của ER đƣợc đánh giá thông qua hoạt tính β-
galactosidase. Hệ thống biểu hiện của nấm men KMY1516 đã đƣợc thiết kế
để đánh giá mức độ biểu hiện của yếu tố dịch mã Hac1 thông qua hoạt tính β-
galactosidase. Ở trạng thái bình thƣờng, các protein màng Ire1 nằm riêng rẽ ở
quanh mạng lƣới nội chất của tế bào, chaperone BiP gắn vào gần vị trí xuyên
màng của Ire1và ở trạng thái này Ire1 không hoạt động.

39
Hình 3.11 Cơ chế kích hoạt stress lƣới nội chất của tế bào
Khi tín hiệu gây stress gây ra sự ứ đọng quá nhiều của các protein cuộn
gập sai trong khoang lƣới nội chất sẽ khởi động hệ thống chống lại stress và
kích hoạt protein màng Ire1. Chaperone BiP tách khỏi Ire1 sau đó gắn vào các
đoạnprotein không đƣợc cuộn xoắn, giúp cho các protein này cuộn xoắn đúng
cấu trúc. Khi proteinkhông đƣợc cuộn xoắn tích tụ quá nhiều sẽ gây ra hiện
tƣợng ER stress. Khi đó các đoạn này sẽ bắt cặp vào vùng nằm trong lƣới nội
chất của Ire1 và làm cho vùng nằm trong tế bào chấtcủa Ire1 sẽ tự động
oligomer hóa và phosphoryl hóa. Dạng phosphoryl hóa sẽ hoạt hóa hoạt tính
RNase đặc hiệu đối với Hac1 mRNA dẫn tới quá trình cắt intron ở Hac1 pre –
mRNA (Hac1u) và ghép nối exon để trở thành mRNA Hac1s, sau đó dịch mã
tạo ra protein Hac1. Từ đó kích hoạt sự biểu hiện β – galactosidase. Mức độ
stress của tế bào càng cao thì mức độ hoạt động của Ire1 càng tăng kèm theo
sự tăng hoạt tính β – galactosidase nội bào.
Thuốc thử Dithiothreitol (DTT) đã đƣợc công bố rằng có khả năng phá
vỡ liên kết disunfate (–S-S-) trong cấu trúc protein gây ra sự cuộn xoắn sai.
Các protein không đƣợc cuộn xoắn sẽ kết tủa cùng nhau trong khoang lƣới

40
nội chất và gây stress ER. Do đó, DTT đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng
trong phản ứng này.
Kết quả thí nghiệm cho thấy hoạt tính β – galactosidase tăng dần ở các
hàm lƣợng Pg đậm đặc hơn so với đối chứng âm không chứa Pg. Do đó, rất
có khả năng Pg đã ảnh hƣởng đến sự hoạt động của Ire1 và gây ra stress trong
khoang lƣới nội chất.
30
25
20
15
10
5
0
DC (-) DC (+) 0.1 0.15 0.2
Hàm lƣợng Pg(μg/ml)
Hình 3.12 Biểu đồ hoạt tính β – galactosidase
Hàm lƣợng Pg càng tăng dẫn tới gia tăng stress lƣới nội chất (Hình
3.12). Ở hàm lƣợng Pg 0,1 μg/ml hoạt tính β – galactosidase bằng 50,39% đối
chứng dƣơng. Khi tăng hàm lƣợng Pg lên 0,2 μg/ml thì hoạt tính β –
galactosidase tăng lên bằng 60,22% đối chứng dƣơng.
Bên cạnh đó, prodigiosin cũng là một tác nhân gây oxy hóa mạnh, do
đó, sự hiện diện của có thể Pg khiến các gốc oxy hóa tự do trong tế bào tăng
cao, gây ra stress lƣới nội chất.
3.4.2 Xác định hàm lƣợng của Hac1 mRNA
Để kiểm tra lại khả năng gây stress mạng lƣới nội chất tế bào nấm men,
mức độ biểu hiện của mRNA Hac1s đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di.

41
Hình 3.13 Điện di đồ phân tích RNA tổng số của các mẫu thí nghiệm bổ sung
hàm lƣợng Pg khác nhau. Giếng 1: ĐC (-); Giếng 2: ĐC (+); Giếng 3: Hàm
lƣợng Pg 0.2 μg/ml
RNA tổng số của các mẫu thí nghiệm đƣợc tách chiết và điện di trên
gel agarose 1,5% cho thấy các vệt băng RNA tổng số bắt màu thuốc nhuộm
sáng và đủ điều kiện để thực hiện các bƣớc tiếp theo.
1 2 3 4 5 6
1000 kDa
Hac1u
Hac1s
Hình 3.14 Điện di đồ phân tích sự có mặt của mRNA Hac1s. 1 –
maker; 2 , 3 , 4 – hàm lƣợng Pg 0,1 g /ml, 0,15 g /ml và 0,2 g/ml; 5 ĐC
(+) DTT; 6 ĐC (-) knock out Ire1
Tiến hành phản ứng reverse transcription – PCR mẫu mRNA đã tinh
sạch để xác định hàm lƣợng của mRNA Hac1 có intron và không có intron.

Tinh Sạch Và Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Hợp Chất Prodigiosin Từ Chủng Serratia Marcescens Đến Mạng Lưới Nội Chất Tế Bào.doc

Tinh Sạch Và Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Hợp Chất Prodigiosin Từ Chủng Serratia Marcescens Đến Mạng Lưới Nội Chất Tế Bào.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Tinh Sạch Và Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Hợp Chất Prodigiosin Từ Chủng Serratia Marcescens Đến Mạng Lưới Nội Chất Tế Bào.doc

Similar to Tinh Sạch Và Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Hợp Chất Prodigiosin Từ Chủng Serratia Marcescens Đến Mạng Lưới Nội Chất Tế Bào.doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Tinh Sạch Và Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Hợp Chất Prodigiosin Từ Chủng Serratia Marcescens Đến Mạng Lưới Nội Chất Tế Bào.doc