Thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của thân rễ cây mỏ quạ, họ dâu tằm của Việt nam.doc

Viết thuê đề tài giá rẻ trọn gói - KB Zalo/Tele : 0973.287.149
Luanvanmaster.com – Cần Kham Thảo - Kết bạn Zalo/Tele : 0973.287.149
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
LÊ THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA THÂN RỄ
CÂY MỎ QUẠ (MACLURA COCHINCHINENSIS (LOUR.)
CORNER), HỌ DÂU TẰM (MORACEAE) CỦA VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Huế, Năm

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
LÊ THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA THÂN RỄ CÂY MỎ QUẠ (MACLURA
COCHINCHINENSIS (LOUR.) CORNER), HỌ DÂU TẰM
(MORACEAE) CỦA VIỆT NAM
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60 44 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN VĂN LỘC
Huế, Năm
i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả
nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử
dụng.
Họ tên tác giả
Lê Thị Thủy
ii

LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học
KH&CN Việt Nam. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến
TS.Trần Văn Lộc, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS.Trần Văn Chiến, GS-TSKH.Trần Văn Sung và
các anh chị ở phòng tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học KH&CN Việt Nam đã giúp đỡ và
hướng dẫn tôi trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học và quý thầy
cô giáo khoa Hóa học trường ĐHSP Huế đã giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày bỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Sở GD&ĐT tỉnh Kon
Tum, Ban Giám hiệu trường THPT Chuyên Nguyễn Tất Thành đã tạo mọi điều kiện
để tôi hoàn thành khóa học.
Cuối cùng, xin kính dâng món quà tinh thần này đến gia đình, bạn bè, đặc biệt
là em Nguyễn Tuấn Thành đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
hoàn thành luận văn.
Huế, tháng 10 năm 2016
Tác giả
Lê Thị Thủy
iii

MỤC LỤC
TRANG PHỤ BÌA……………………...……………..……………………………..i
LỜI CAM ĐOAN.......................................................................................................ii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iii
MỤC LỤC................................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT......................................... 3
DANH MỤC BẢNG, HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ ...................................................... 4
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 6
1. Đặt vấn đề........................................................................................................... 6
2. Đối tượng và mục đích nghiên cứu .................................................................... 7
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................... 7
4. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 7
5. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................ 8
6. Bố cục của luận văn............................................................................................ 8
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 9
1.1. Giới thiệu chung về họ Dâu Tằm (Moraceae)................................................. 9
1.2. Giới thiệu một số loài thuộc chi Maclura ....................................................... 9
1.3. Giới thiệu về cây Mỏ Quạ (Maclura cochichinensis) ................................... 15
1.3.1. Đặc điểm thực vật................................................................................... 15
1.3.2. Ứng dụng trong dân gian ........................................................................ 16
1.3.3. Thành phần hóa học................................................................................ 17
1.3.4. Hoạt tính sinh học................................................................................... 18
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ........................................................................... 23
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................ 23
2.1.1. Nguyên liệu............................................................................................. 23
1

2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu .............................................................. 23
2.1.2.1. Hóa chất............................................................................................... 23
2.1.2.2. Thiết bị ................................................................................................. 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 24
2.2.1. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học ............................................... 24
2.2.1.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định [14], [26]..... 24
2.2.1.2. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ......................................... 26
2.2.2. Phương pháp chiết mẫu thực vật ............................................................ 27
2.2.3. Phương pháp tách và tinh chế chất ......................................................... 28
2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất ............................ 28
2.3. Quy trình xử lý và chiết mẫu thực vật........................................................... 28
2.4. Quy trình phân lập các chất từ cao chiết etylaxetat....................................... 30
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................ 36
3.1. Xác định cấu trúc của các sản phẩm sạch được phân lập.............................. 36
3.1.1. Hợp chất dihydrokaempferol (84) .......................................................... 36
3.1.2. Hợp chất quercetin (85) .......................................................................... 41
3.1.3.Hợp chất MQ9.2 (Gericudranin E, 86).................................................... 44
3.1.4. Hợp chất MC9.3 (87).............................................................................. 47
3.1.5. Hợp chất MC7.01 (88)............................................................................ 50
3.2. Kết quả thử hoạt sinh học.............................................................................. 53
3.2.1. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định................................. 53
3.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ......................................................................... 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 55
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................. 57
PHỤ LỤC................................................................................................................ 63
2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1
H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Spectroscopy proton
13
C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Resonance Spectroscopy cacbon 13
DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT
Polarisation Transfer
COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương quan
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Tương tác dị hạt nhân qua
Correlation nhiều liên kết
HSQC Heteronuclear Single Quantum Tương tác dị hạt nhân qua
Coherence một liên kết
ESI-MS Electrospray Ionization Mass Phổ khối lượng phun mù
Spectrometry điện tử
IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại
δ (ppm) Chemical shift Độ dịch chuyển hoá học
SKLM Sắc ký lớp mỏng
MeOH Metanol
EtOAc Etylaxetat
EtOH Etanol
DCM Diclometan
DMSO Dimetylsunfoxit
s Singlet
d Doublet
t Triplet
dd Doublet of doublet
SKC Sắc kí cột
IC50 50% inhibitor concentration Nồng độ ức chế 50%
MIC Minimum inhibitor concentration Nồng độ tối thiểu ức chế
3

DANH MỤC BẢNG, HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 3.1. Số liệu phổ 13
C-NMR của chất 85 và hợp chất quercetin...................... 43
H- và 13
C-NMR của chất MQ9.2 và gericudranin E......... 46
H- và 13
C-NMR của chất MC9.3 và wighteone................ 49
H- và 13
C-NMR của chất MC7.01 (88) và gancaonin M.. 52
Bảng 3.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao chiết thân và cành cây mỏ quạ 54
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết cây mỏ quạ...... 54
Hình 1.1. Một số hợp chất từ quả Osage orange ..................................................... 10
Hình 1.2. Các chất được phân lập từ dịch chiết CHCl3 của rễ cây
Cudrania tricuspitada .............................................................................................. 12
Hình 1.3. Các chất phân lập được từ dịch chiết CH2Cl2 và EtOAc của quả
C. tricuspidata.......................................................................................................... 13
Hình 1.4. Các chất được phân lập từ dịch chiết cây Maclura tinctoria .................. 15
Hình 1.5. Cây mỏ quạ.............................................................................................. 15
Hình 1.6. Một số chất trong cây mỏ quạ ................................................................. 17
Hình 1.7. Một số hợp chất xanthon và isoprenyl flavonoit từ cây mỏ quạ ............. 19
Hình 1.8. Hợp chất xanthon và flavonoit ................................................................ 20
Hình 1.9. Một số flavonoit từ C. cochinchinensis................................................... 21
Hình 1.10. Isoalvaxanthon (79)............................................................................... 22
Hình 1.11. Cudraphenon A (80), Cudraphenon B (81), Cudraphenon C (82),
Cudraphenon D (83)................................................................................................. 22
Hình 3.1. Phổ ESI-MS của chất 84.......................................................................... 37
Hình 3.2. Phổ 1
H-NMR của chất 84 ....................................................................... 38
Hình 3.3. Phổ 13
C-NMR của chất 84...................................................................... 39
Hình 3.4. Phổ 13
C-NMR (dãn rộng) của chất 84.................................................... 39
Hình 3.5. Phổ 13
C-NMR, DEPT của chất 84.......................................................... 40
Hình 3.6. Phổ 13
C-NMR, DEPT (dãn rộng) của chất 84........................................ 40
Hình 3.7. Phổ IR của chất 85................................................................................... 41
Hình 3.8. Phổ 1
H-NMR của chất 85 ....................................................................... 42
Hình 3.9. Phổ 13
C-NMR của chất 85...................................................................... 42
4

Hình 3.10. Phổ DEPT và 13
C-NMR của chất 85.................................................... 43
Hình 3.11. Phổ 1
H-NMR của chất MQ9.2 (86) ...................................................... 44
Hình 3.12. Phổ 1
H-NMR dãn của chất MQ9.2 (86) ............................................... 45
Hình 3.13. Phổ 13
C-NMR của chất MQ9.2 (86)..................................................... 45
C-NMR và DEPT của chất MQ9.2 (86)..................................... 46
Hình 3.15. Phổ 1
H-NMR của chất MC9.3 (87) ...................................................... 48
C-NMR của chất MC9.3 (87)..................................................... 48
Hình 3.17. Phổ 1
H-NMR của chất MC7.01 (88) .................................................... 50
Hình 3.18. Phổ 1
H-NMR (dãn rộng) của chất MC7.01 (88)................................... 51
C-NMR của chất MC7.01 (88)................................................... 51
C-NMR (dãn rộng) của chất MC7.01 (88) ................................. 52
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết thân cành cây mỏ quạ.................................................... 29
Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chất sạch từ phân đoạn chiết EtOAc của thân cây Maclura
cochinchinensis (Lour.) Corner................................................................................ 32
Sơ đồ 2.3. Quy trình tách chất sạch từ phân đoạn MC9 .......................................... 33
5

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay, sự phát triển mạnh mẽ của các ngành công nghiệp dẫn đến rất nhiều
hệ lụy liên quan đến các vấn đề ô nhiễm (không khí, môi trường, ...) gây ảnh hưởng
trực tiếp đến sức khoẻ con người. Từ đó, các loại dịch bệnh cũng ngày một tăng và
diễn biến càng phức tạp hơn. Gần đây thế giới luôn phải đối mặt với những dịch
bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại dịch ở quy mô toàn cầu, chẳng
hạn như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1,
cúm lợn H1N1, tim mạch v.v.... Thực tế đó đã thúc đẩy chúng ta luôn luôn phải tìm
ra các thuốc chữa bệnh mới, có hiệu quả cao, tác dụng chọn lọc và giá thành rẻ hơn.
Một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm
năng, có thể phát triển thành thuốc chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng là đi
từ các hợp chất thiên nhiên. Các hợp chất thiên nhiên rất đa dạng về cấu trúc, có
hoạt tính sinh học phong phú và đặc biệt có độc tính thấp đối với con người. Các
hợp chất thiên nhiên có thể ứng dụng trực tiếp để làm thuốc, hoặc làm nguyên liệu
đầu để tổng hợp ra các chất có hoạt tính tốt hơn có thể ứng dụng làm thuốc.
Họ Dâu tằm (Moraceae) là một họ thực vật lớn. Trên thế giới họ này có khoảng
60 chi và 1.500 loài. Ở Việt Nam, hiện biết có trên 10 chi và khoảng gần 140 loài,
bao gồm cả cây trồng và cây mọc dại, nhiều loài có giá trị kinh tế cao, nhiều loài
mới được phát hiện cho khoa học và có thể là loài đặc hữu của Việt Nam. Họ Dâu
tằm là loài thực vật phân bố rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới,
nhưng ít phổ biến ở các vùng ôn đới. Việt nam là nơi thích hợp cho sự sinh sôi và
phát triển của họ Dâu tằm. Tuy nhiên, các loài trong họ này hầu như chưa được
nghiên cứu một cách đầy đủ về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học.
Cây mỏ quạ (Maclura cochinchinensis (Lour.) Corner), thuộc họ dâu tằm
(Moraceae), là cây thuốc dân gian cho tới nay vẫn chưa được tiến hành nghiên cứu
về hóa thực vật cũng như hoạt tính nổi bật của nó. Vì vậy, trong luận văn này chúng
tôi tiến hành nghiên cứu: Thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của
6

thân rễ cây mỏ quạ (Maclura cochinchinensis (Lour.) Corner), họ dâu tằm
(Moraceae) của Việt nam.
2. Đối tƣ ng và m c đ ch nghiên cứu

Đối tƣ ng nghiên cứu

Thân rễ cây mỏ quạ (Maclura cochinchinensis) thu hái ở Hòa Bình, được chiết
trong các trong dung môi có độ phân cực khác nhau.

M c đ ch nghiên cứu

Nghiên cứu sơ bộ hoạt tính kháng vi sinh vật các dịch chiết từ cây mỏ quạ, và
sơ bộ phân lập một số hoạt chất từ dịch chiết của thân rễ cây mỏ quạ (Maclura
cochinchinensis).
3. Nhiệm v nghiên cứu
- Thu thập và xác định tên khoa học của mẫu.
- Chiết mẫu thực vật với các dung môi có độ phân cực khác nhau.
- Thử hoạt tính sinh học kháng vi sinh vật và ung thư của các dịch chiết.
- Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất thu được từ các dịch chiết có
hoạt tính sinh học.
4. Phƣơng ph p nghiên cứu
- Thu hái mẫu ở tỉnh Hòa Bình, miền Bắc Việt Nam.
- Xác định tên khoa học, so sánh với các tiêu bản đang có ở Việt Nam.
- Xử lý mẫu: làm sạch, sấy khô, xay nhỏ mẫu.
- Tiến hành chiết trong các dung môi có độ phân cực tăng dần.
- Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cao chiết.
- Tiến hành tách, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch bằng
phương pháp: sắc ký cột; đo phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ tử ngoại (UV), phổ
khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và hai
chiều (2D NMR).
7

5. Phạm vi nghiên cứu
Do lượng mẫu rễ thu hái không đủ để tiến hành nghiên cứu nên chúng tôi chỉ
tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của phần
thân cành cây mỏ quạ (Maclura cochinchinensis (Lour.) Corner), họ dâu tằm
(Moraceae) của Việt nam.
6. Bố c c của luận văn
Chương 1: Tổng quan tài liệu (14 trang)
Chương 2: Thực nghiệm (13 trang)
Chương 3: Kết quả và thảo luận (20 trang)
8

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về họ Dâu Tằm (Moraceae)
Việt Nam thuộc vùng có khí hậu nhiệt đới, mưa theo mùa, do đó hệ thực vật rất
đa dạng và phong phú. Có khoảng trên 12.000 loài thực vật có mạch, khoảng 3.200
loài thuộc gần 1.200 chi được sử dụng làm thuốc ở Việt Nam [2]. Họ Dâu Tằm
(Moraceae) là một họ lớn trong số các thực vật có mạch. Họ này chứa từ 40-60 chi
và khoảng 1.000-1.500 loài thực vật phân bố rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và cận
nhiệt đới, ít phổ biến ở các vùng ôn đới; trong họ này, nhiều loài có rễ mọc từ cành,
cắm xuống đất (ví dụ: các loài trong chi Ficus). Một số chi thuộc họ Dâu Tằm ở
Việt Nam như: Fatoua, Pseudotrophis, Morus, Streblus, Taxotrophis, Maclura,
Malaisia, Plecospermum,… [4].
1.2. Giới thiệu một số loài thuộc chi Maclura
Maclura pomifera (Osage orange): Maclura pomifera là một loài thực vật
có hoa trong họ Moraceae; cây bụi nhỏ rụng lá hoặc cây bụi lớn, có khi cao từ 8-15
m. Cây trưởng thành cao dao động từ 12 đến 18 mét với thân ngắn và tán tròn đứng
đầu. Cây có nguồn gốc Đông Nam Á và Đông Á. M. pomifera còn được trồng ở Ý,
Nam Tư cũ, Romani, Liên Xô cũ, và Ấn Độ. Trước đây, bộ lạc comanche sử dụng
dịch nước của rễ để chữa các bệnh về mắt, người Mỹ bản địa sử dụng cây như là
thuốc chống ung thư, ở Bolivia nhựa của cây đã được sử dụng để điều trị đau răng,
vỏ cây và lá được dùng để điều trị chảy máu tử cung.
Maclura pomifera (Rafin.) Schneider phát triển ở khu vực Trung và Nam nước
Mỹ, quả thì không ăn được, nhưng dịch chiết của nó kháng khuẩn, chống viêm, gây
độc tế bào, trị đái tháo đường, chống sốt rét và chống côn trùng.
Rất nhiều các hợp chất phenolic được phân lập và xác định từ nhiều bộ phận
của cây, cụ thể là các isoflavonoit từ quả, các flavonol và các xanthon từ tâm gỗ và
vỏ thân cây, các flavanon và các xanthon từ vỏ rễ. Trong đó osajin và pomiferin có
hoạt tính kháng khuẩn, nhưng điều đáng quan tâm là hoạt tính kháng oxi hóa của
các isoflavon này [17]. Ngoài ra, người ta còn ứng dụng peptidaza từ quả của
9

Maclura pomifera cho việc sản xuất peptit có hoạt tính sinh học từ whey protein [6].
Một số thành phần hóa học được xác định trong Maclura pomifera:
Macluraxanthon (1) [50], este lupeol của axit hexadecanoic (3), este lupeol của axit
3-hidroxihexadecanoic (axit β-hydroxipanmitic) (4), dấu vết của lupeol (2), este
butyrospermol của axit hexadecanoic (6), butyrospermol axetat (7), và dấu vết của
butyrospermol (5). Và bằng cách chiết với axeton của nguyên liệu Maclura có chất
béo tự do, thu được các isoflavonoit osajin (8) và pomiferin (9). [17]
Hình 1.1. Một số h p chất từ quả Osage orange

Maclura tricuspidata: Được gọi là Dâu gai hay mỏ quạ ba mũi. Cây bụi, thân mềm
yếu, nhiều cành vươn dài tạo thành bụi, có nhựa mủ trắng, chịu khô hạn. Vỏ thân màu xám
có chấm trắng. Rễ hình trụ có nhiều nhánh, mọc ngang rất dài, có

thể xuyên qua đá nên có tên là Xuyên phá thạch. Lá mọc so le, hình trứng thuôn, hai
đầu nhọn, mặt lá nhẵn bóng, mép nguyên. Cụm hoa hình cầu, đường kính 7-10 mm,
10

màu vàng nhạt, mọc thành đôi hay mọc đơn ở kẽ lá. Hoa đơn tính, đực cái khác gốc.
Quả màu hồng hợp thành quả kép.
Cudrania tricuspidata (carr.) Bur. (Moraceae) là một loại cây gai nhỏ, cây có
nguồn gốc Đông Á và phân bố chủ yếu ở phía Nam của Hàn Quốc [39]. Lá cây tươi
có thể giã nhỏ hoặc nấu cao đắp chữa các vết thương phần mềm. Cudrania
tricuspidata (carr.) Bur. (Moraceae) có vỏ và vỏ rễ được sử dụng để chữa bệnh lậu,
bệnh vàng da, viêm gan, viêm dây thần kinh và viêm. Rất nhiều các prenylxanthon
và flavonoit được phân lập từ rễ cây của chi Cudrania có hoạt tính gây độc tế bào,
kháng nấm, kháng oxi hóa, chống xơ vữa động mạch, kháng viêm và hoạt tính bảo
vệ gan và tác dụng ức chế oxi hóa monoamin [27]. Trong y học dân gian Trung
Quốc, rễ của nó được dùng để điều trị bệnh lậu, bệnh thấp khớp, vàng da, viêm gan,
nhọt, ghẻ, bầm tím và đau bụng kinh [38].
Toàn cây Cudrania tricuspidata trở thành loại thuốc dân gian quan trọng nhất
để chữa ung thư ở Hàn Quốc trong vài thập kỷ qua và nó cũng được sử dụng trong y
học cổ truyền để trị rối loạn thần kinh và viêm ở Châu Á. Các nghiên cứu trước đây
cho thấy nó chứa các xanthon, các flavonoit và benzenoit có hoạt tính sinh học. Và
dịch chiết clorofom của vỏ rễ của C. tricuspitada cho thấy gây độc tế bào đáng kể
dòng tế bào gây ung thư ở người [36].
Các hợp chất phân lập từ rễ cây Cudrania tricuspitada chủ yếu là các hợp chất
isoprenylxanthon, các flavonoit, trong đó cudraxanthon H (21), macluraxanthon B
(22) và macluraxanthon C (14) có tác dụng ức chế với bốn dòng tế bào ung thư
người: colon carcinoma (HCT-116), hepatocellular (SMMC-7721) và gastric
carcinoma (SCG-7901 và BGC-823) với giá trị IC50 từ 2,70-12,66 µM (Hình 1.2)
[57].
11

Hình 1.2. C c chất đƣ c phân lập từ dịch chiết CHCl3 của rễ cây Cudrania tricuspitada
Các chất gồm: cudratricusxanthon I (10); cudraflavanon C và D (11 và 12); 1,7-dihydroxy-3,6-
dimetoxyxanthon (13); macluraxanthon C (14); cudraxanthon E, K và L (15, 16 và 17);
cudraflavanon A (18); cudraflavon C (19); 2,3,6,8-tetrahydroxy-1-(3-methylbut-2-enyl)-5-(2-
metylbut-3-en-2-yl)-9H-xanthen-9-on (25); macluraxanthon B (26) và cudraxanthon L (27)
[40], [41].
12

Từ dịch chiết CH2Cl2 và EtOAc của quả cây C. tricuspidata, ba hợp chất
isoprenylisoflavon mới: 29, 30, và 31; và benzyldihydroflavonol mới: 5,7,4′-
trihydroxy-8-p-hydroxybenzyldihydroflavonol (32), cùng sáu flavonoit đã biết (33-
38) đã được phân lập. Trong đó các hợp chất 29, 30, 33, 34, 35, 36 và 38 thể hiện
hoạt tính ức chế sự sản sinh oxit nitơ (NO) bị cảm ứng bởi LPS trong các tế bào
RAW264,7 với giá trị IC50 = 11,8-41,8 µM (Hình 1.3) [27].
Hình 1.3. C c chất phân lập đƣ c từ dịch chiết CH2Cl2 và EtOAc của quả C. tricuspidata.
Maclura tinctoria (L.) STEUD; Tên đồng danh: Chlorophora tinctoria (L.)
Benth. & Hook. F; Maclura mora Griseb; Morus tinctoria L.; Maclura

13

(Chlorophora) tinctoria L. (Gaud.) (Moraceae) là một cây trồng trong các rừng
nhiệt đới ẩm ướt và khô Trung và Nam Mỹ. Cây được sử dụng rộng rãi bởi người
bản địa như làm thuốc, vật liệu, và thực phẩm. Nhựa của cây được sử dụng chữa
đau răng cũng như làm chất màu; quả của nó có thể ăn được và ăn bởi các thợ săn
bản địa trong rừng [12], [35].
Thành phần hóa học chính từ cây là các chalconglycozit, flavonoit, triterpen,
stilben và prenylxanthon với hoạt tính chống HIV từ vỏ thân cành của Maclura
tinctoria [16], [35], trong khi các chalcon thể hiện khả năng kháng nấm từ bộ phận
lá cây. Hợp chất morin phân lập từ gỗ của cây cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa, bảo
vệ các tế bào cơ, tế bào nội mô và hồng cầu chống lại các gốc oxi hóa [16].
14

Hình 1.4. C c chất đƣ c phân lập từ dịch chiết cây Maclura tinctoria
Các chất gồm: 5,7,3',4'-tetrahydroxyisoflavon (orobol) (40); 5,7,2',4'-tetrahydroxyflavanon
(steppogenin) (41); 3,5,7,4'-tetrahydroxyflavanonol (aromadendrin) (42); 3,5,7,2',4'-
pentahydroxyflavanonol (dihydromorin) (43); orobol 7- O-β-D-glucozit (44); steppogenin 4'- O-β-
D-glucozit (45); orobol 5,3'-di-O-methyl-8-C-glucozit (46); 4′-O-β-D-(2′′-p-
coumaroyl)glucopyranozyl-4,2′,3′-trihydroxychalcon (47); 4′-O-β-D-(2′′-pcoumaroyl-6′′-
acetyl)glucopyranozyl-4,2′,3′-trihydroxychalcon (48); 3′-(3-methyl-2-butenyl)-4′-O-β-D-
glucopyranozyl-4,2′-dihydroxychalcon (49); 4′-O-β-D-(2′′-axetyl-6′′-cinnamoyl)glucopyranozyl-
4,2′,3′-trihydroxychalcon (50); eriodictyol 7-O-β-D-glucopyranozit (51); naringenin (52); và
naringenin 4′-O-β-D-glucopyranozit (53) [12], [16].
1.3. Giới thiệu về cây Mỏ Quạ (Maclura cochichinensis)
1.3.1. Đặc điểm thực vật
Hình 1.5. Cây mỏ quạ
15

Cây mỏ quạ, còn được gọi là cây Hoàng lồ, Vàng lồ hay Xuyên phá thạch, là
cây thuốc dân gian có tên khoa học Maclura cochinchinensis (Lour.) Corner thuộc
họ dâu tằm (Moraceae). Cây mỏ quạ là cây bụi, có cành dài mềm, thân có nhựa mủ
trắng như sữa. Vỏ thân màu xám có nhiều lỗ bì màu trắng. Thân và cành có nhiều
gai cong quặp xuống trông như mỏ con quạ. Lá mọc so le, hình trứng thuôn, dài 3-8
cm, rộng 2-3,5 cm, gốc nhọn, nhẵn bóng ở mặt trên; cuống lá mảnh, có lông. Cụm
hoa hình đầu, đơn tính, khác gốc, mọc ở nách lá, màu vàng nhạt. Quả nạc hình cầu
mềm hơi cụt ở đầu, khi chín màu vàng, hạt nhỏ. Ra hoa tháng 4-5, có quả tháng 10-
12 (Hình 1.5). Phân bố ở các nước nhiệt đới như châu Á, Ðông Âu, châu Úc. Ở
nước ta, cây mọc hoang ở đồi núi, ven đường và được trồng làm hàng rào từ Lào
Cai, Vĩnh Phú đến Quảng Trị, Lâm Ðồng và Ðồng Nai. Thu hái quanh năm, dùng
tươi hoặc nấu cao.
1.3.2. Ứng d ng trong dân gian
Theo kinh nghiệm dân gian, lá mỏ quạ tươi được dùng chữa vết thương phần
mềm ngoài da. Rễ mỏ quạ thường được dùng chữa phù thũng, chữa ho ra máu hoặc
khạc ra đờm lẫn máu. Ngoài ra, rễ cũng được dùng làm thuốc khứ phong, hoạt huyết
phá ứ, chữa ứ tích lâu năm, bị đả thương, phụ nữ kinh bế dưới dạng thuốc sắc [1],
[3].
Cây mỏ quạ cũng được phân bố rộng rãi ở một số nước châu Á như Trung
Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Bản, Indonesia. Ở Đài Loan,
cây mỏ quạ được dùng điều trị các chứng bệnh đau thần kinh, bệnh thấp khớp, bệnh
gan và vết thương bầm tím. Ở Trung Quốc, cây mỏ quạ cũng được sử dụng bảo vệ
gan, chống viêm nhiễm và làm lành vết thương. Dịch nước ngâm rượu từ cây mỏ
quạ được sử dụng điều trị bệnh lậu, bệnh thấp khớp, vàng da, bệnh gan, mụn nhọt,
bệnh ghẻ và vết thương bầm tím [15], [28].
Lá của Cudrania cochinchinensis (Moraceae), có truyền thống được sử dụng ở
Việt Nam như một bài thuốc dân gian để chữa lành vết thương. Lá được sử dụng
rộng rãi bởi các bác sĩ cổ truyền trong suốt kháng chiến chống pháp, từ 1945 đến
1954, để điều trị vết thương mô mềm và vết thương chiến tranh, và đã được chấp
nhận bởi các bác sĩ trong Viện Y học cổ truyền năm 1966; lá có thể dùng lá tươi
16

hoặc dịch chiết. Trong nghiên cứu In vitro với dịch chiết lá mỏ quạ, phương pháp
được dùng để điều trị vết thương là thấm dịch chiết vào gạc khô và áp vào vết
thương, làm hằng ngày sau khi rửa sạch vết thương với dung dịch muối hoặc dịch
chiết nước của lá trầu [28].
1.3.3. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu từ cây mỏ quạ cho thấy thành phần hóa học trong cây chủ yếu
là các dẫn xuất của xanthon, benzophenon, các isoprenoit, polyphenol và flavonoit
(Hình 1.6). Tuy nhiên, không phát hiện thấy có sự hiện diện của các alkaloit [8], [9],
[10], [20], [29], [53], [54], [55].
Hình 1.6. Một số chất trong cây mỏ quạ
Các chất gồm: (6s, 12S, 13R)-1-metoxycyanomaclurin (54); 1,3,5-trihydroxy-4-(3’
-hydroxy-
3’
-metylbutyl)xanthon (55); 1,3,6-trihydroxy-4-prenylxanthon (56); 1,3,6-trihydroxy-5-
metoxyxanthon (57); 1,3,5,6-tetrahydroxyxanthon (58); oxyresveratrol (59); 1,6,7-trihydroxy-4-
(1,1-dimetylallyl)-3-metoxyxanthon (60); 1,5,6-trihydroxy-4-(1,1-dimetylallyl)-3-metoxyxanthon
(isocudraniaxanthon B, 61); ( )2,3-cis-dihydromorin (62).
17

1.3.4. Hoạt tính sinh học
Các nghiên cứu từ dịch chiết của cây mỏ quạ đều thể hiện được hoạt tính sinh
học khá cao. Dịch chiết clorofom từ rễ cây mỏ quạ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn
mạnh với S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis và ức chế cả một số loại khuẩn gây
nấm da [33], [43]. Ngoài ra, các dịch chiết từ EtOAc và MeOH cho thấy khả năng
kháng virut herpes loại 1 và 2 (HSV 1, 2) khá mạnh (EC50 = 38,5 và 50,8 µg/ml)
[5]. Thêm vào đó, các dịch chiết từ cây mỏ quạ cũng cho thấy khả năng chống loét
đường tiêu hóa, giải nhiệt, hạ sốt, chống dị ứng, nhiễm trùng da, và sự thất thường
của hạch bạch huyết [13], [23], [24], [32], [39], [52].
Nhiều phân đoạn của dịch chiết etanol của rễ cây Cudraniaco chinchinensis
var.gerontogea (Moraceae) cũng đã được đánh giá về tính kháng viêm, hoạt tính
bảo vệ gan của chúng. Các phân đoạn (n-hexan, CHC13, EtOAc, n-BuOH, và H20 )
cho thấy dấu hiệu hoạt tính ức chế; hoạt tính kháng viêm tốt hơn với dịch chiết
trong n-BuOH; các phân đoạn n-BuOH và EtOAc có tác động lớn nhất trong bảo vệ
gan; phân đoạn CHCl3 có tác động tốt nhất chống lại sự nhiễm độc trong D-GalN,
được so sánh với silymarin, như một thuốc được công nhận bảo vệ gan [40].
Người ta cũng phân lập được Serin Proteaza từ quả của Cudrania
cochinchinensis (Lour.) Kudo et Massam [48].
Một số thành phần hóa học chính được tách ra từ các dịch chiết khác nhau
của cây mỏ quạ đã thể hiện được các hoạt tính sinh học lý thú, trong đó nổi bật
nhất là các hoạt tính như:

Hoạt t nh kh ng nấm:
18

Hình 1.7. Một số h p chất xanthon và isoprenyl flavonoit từ cây mỏ quạ
Các hợp chất isoprenylflavonoit tách ra từ cây mỏ quạ, cudraxanthon S (63),
cudraflavanon B (64), toxyloxanthon C (65) và wighteon (66) (Hình 1.7), thể hiện
hoạt tính kháng chọn lọc một số loài nấm như C. neoformans, C. albicans và
Aspergillus fumigates (MIC = 2-8 µg/ml). Riêng hợp chất 63 và 66 đã thể hiện được
hoạt tính kháng lại nấm Candida glabrata (MIC = 4-8 µg/ml) [18].
Ngoài ra, một số benzophenon tách được đều có hoạt tính kháng nấm C.
neoformans. Các xanthon, gerontoxanthon A-I, osajaxanthon, cudraniaxanthon,
cudraxanthon A, cudraxanthon K tách từ dịch chiết EtOH của rễ cây mỏ quạ
cũng thể hiện hoạt tính kháng nấm Cryptococcus neoformans, Aspergillus
fumigatus và A. nidulans (MICs = 2-8 µg/ml) [7], [30].

Hoạt t nh kh ng khuẩn:

Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hợp chất xanthon tách ra từ rễ cây mỏ
quạ có hoạt tính đối với các dòng khuẩn cầu ruột kháng vancomycin (VRE),
Bacillus subtilis hoặc tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus-
MRSA) (MICs = 1,56 µg/ml).
Các xanthon như gerontoxanthon I (67), toxyloxanthon C (65), cudraxanthon S
(63), và 1,3,7-trihydroxy-2-prenylxanthon đều thể hiện hoạt tính yếu hơn trên các
19

dòng vi khuẩn B. subtilis, MSSA, MRSAs (10 dòng) và M. luteus (MIC = 3,13 ± 6,25
g/ml) [18], [19], [20], [39], [43].

Hoạt t nh kh ng viêm

Từ dịch chiết EtOH của cây mỏ quạ, một số chất khung xanthon và flavonoit
cũng đã được phân lập như: 1,3,5-trihydroxy-4-prenylxanthon (68), 1,3,7-
trihydroxy-4-prenyl-xanthon (69), 3,4’,5,7-tetrahydroxy-dihydroflavonol (70),
kaempferol (71). Khả năng kháng viêm dựa trên cơ chế kìm hãm quá trình sản
sinh NO cho thấy của các chất tách ra từ cây mỏ quạ cho thấy, cả 4 hợp chất này
với (IC50 = 8,8; 23,2; 27,1; 11,9 µM) đều ức chế sự sản sinh NO bị cảm ứng bởi
LPS trong RAW264.7 mạnh hơn so với hợp chất được so sánh aminoguanidin
(IC50 = 28,6 µM) [11], [41].
Hình 1.8. H p chất xanthon và flavonoit

Hoạt t nh ức chế

Dịch chiết thân của C. cochinchinensis chứa nhiều chất tự nhiên với hoạt tính
ức chế cao với Tyrosin trong nấm (IC50 = 36,3 µg/mL). Một hỗn hợp raxemic
mới ( )2,3-cis-dihydromorin (62), và 15 hợp chất phenolic đã biết:
dihydrokaempferol 7-O-β-D-qlucopyranozit, skimmin, quercetin-7-O-β-D-
glucozit, 2,3-dihydroquercetin 7-O-β-D-glucozit, kaempferol-7-O-β-
20

glucopyranozit, quercetin-3,7-di-O-β-D-glucozit, morin-7-O-β-D-glucozit,
1,3,5,8-tetrahydroxyxanthen-9-on, 2,3-trans-dihydromorin, aromadendrin,
oxyresveratrol, genistin, axit protocatechuic, kaempferol-3,7-di-O-β-
glucopyranozit, và naringenin đã được phân lập. Trong đó hoạt tính ức chế của (
)2,3-cis-dihydromorin (IC50 = 31,1 µM), 2,3-trans-dihydromorin (IC50=21,1
µM), và oxyresveratrol (65) (IC50 =2,33 µM), có hiệu lực hơn axit Kojic (IC50 =
50,8 µM), một chất ức chế Tyrosin đã công nhận [54].

Hoạt t nh kh ng oxi hóa

Nhiều thành phần có hoạt tính sinh học từ C. cochinchinensis, bao gồm
flavonoit, xanthon và benzophenon, đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu.
Hai 2 dẫn xuất benzyl flavanol mới: 6-p-hydroxybenzyl kaempferol (72) và 6-p-
hydroxybenzyl quercetin (73), cùng với 6 hợp chất đã biết: kaempferol (71),
quercetin (74), dihydrokaempferol (75), taxifolin (76), 8-p-hydroxybenzyl quercetin
(77), và 6-p-hydroxybenzyl dihydroquercetin (78) (Hình 1.9), được phân lập từ rễ
cây Cudrania cochinchinensis. Trong số chúng, hợp chất 73, 74, 77 cho biểu hiện
về hoạt tính kháng oxi hóa [56].
Hình 1.9. Một số flavonoit từ C. cochinchinensis
21


Hoạt t nh kh ng ung thƣ:

Trong nghiên cứu mới nhất về khả năng chống ung thư từ các lớp chất được
tách ra từ cây mỏ quạ, hợp chất isoalvaxanthon (79) (Hình 1.10) cho thấy khả năng
kìm hãm sự di căn của tế bào ung thư ruột kết (SW620), cũng như ngăn chặn sự di
chuyển và xâm lấn ra vùng lân cận của tế bào ung thư, thông qua việc ức chế Rac1
và AP-1 cũng như nhân tố sao chép nhân tế bào (NF-κB), theo mức độ phụ thuộc
liều (IC50 = 5-10 µM) [21], [45], [46], [49]. Bên cạnh đó, isoalvaxanthon cũng cho
thấy khả năng ức chế mạnh sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư [42].
µM
Hình 1.10. Isoalvaxanthon (79)
Các dẫn xuất benzophenon (cudraphenon A-D) (Hình 1.11) cũng thể hiện được
độc tính với tế bào ung thư miệng (HSC-2) [CC50 = 0.17, 0.036, 0.092, 0.052
(mM)], và tế bào ung thư lợi (HGF) [CC50 = 0,43; 0.09; 0.19; 0.19 (mM)] [29].
Hình 1.11. Cudraphenon A (80), Cudraphenon B (81), Cudraphenon C (82),
Cudraphenon D (83)
22

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu cây mỏ quạ (phần thân cành) được thu hái vào tháng 11/2015 tại tỉnh Hòa
Bình, miền Bắc Việt Nam. Tiêu bản được lưu giữ tại phòng Tổng hợp Hữu cơ -
Viện Hóa học -Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu do Th.s Thực
vật học Nguyễn Thế Anh xác định có tên khoa học là Maclura cochinchinensis
thuộc họ Dâu tằm (Moraceae).
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất
- Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 GF254, độ dày
0,2 mm.
- Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel cỡ
hạt 0,040 – 0,063 mm Merck pha thường và pha đảo, Sephadex LH – 20. Các
loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.
- Thuốc thử phun lên bản mỏng chủ yếu sử dụng vanilin 1% trong dung dịch
MeOH – H2SO4 đặc (vanilin 1,2 g, MeOH 200 ml, CH3COOH 25 ml, H2SO4
11 ml), sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 110o
C.
- Dung môi dùng chạy cột và triển khai sắc ký lớp mỏng bao gồm n-hexan, DCM,
EtOAC và MeOH tinh khiết đã được cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng
để loại bỏ tạp chất và chất làm mềm.
2.1.2.2. Thiết bị
Các thiết bị xác định cấu trúc chất:
- Phổ hồng ngoại (FT – IR) đo dưới dạng viên nén KBr trên máy quang phổ
IMPACT 410 của hãng Nicolet, Hoa Kì tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
23

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H–NMR, 13
C-NMR đo trên máy Bruker Avance –
500 MHz của Đức tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
chất nội chuẩn là TMS.
- Phổ MS được ghi trên máy Agilent 6310 Ion Trap tại Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên. Hệ thống HPLC Alliance series 2695, detector PDA 2996 của
hãng Waters-Mỹ.
- Cân phân tích Adam AAA 160L (d = 0,0001).
- Đèn tử ngoại (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254 nm và 360 nm dùng để soi
bản mỏng đặt tại phòng Tổng hợp Hữu Cơ, Viện Hóa học, Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Ngoài ra còn dùng một số trang thiết bị khác như máy quay cất chân không của
hãng Buchi Thụy Sĩ, máy sấy, máy siêu âm, các dụng cụ thủy tinh, v.v… của CHLB
Đức.
2.2. Phƣơng ph p nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng ph p thăm dò hoạt tính sinh học
Các dịch chiết cây mỏ quạ được thử hoạt tính sinh học tại phòng Hóa sinh ứng
dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với các
phép thử: thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và thử hoạt tính gây độc tế bào.
2.2.1.1. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định [14], [26]

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp hệ
nồng độ trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật
kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử
thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minimum inhibitor concentration -
nồng độ tối thiểu ức chế), IC50 (50% inhibitor concentration - nồng độ ức chế
50%), MBC (Minimum bactericidal concentration - nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
24


Các chủng vi sinh vật dự tính được kiểm định

Một số chủng vi sinh vật sẽ được kiểm định bao gồm những vi khuẩn và nấm
gây bệnh ở người như:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh.
- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng,
gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên
men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như
viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm
trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm
màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm
trùng đường ruột ở người và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh
phụ khoa.

Môi trường nuôi cấy

MHB (Mueller-Hinton Broth); MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy
Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth)
và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm.

Cách tiến hành



Pha loãng mẫu thử

Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy
05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết
là 256g/ml và với chất sạch là 128g/ml.

Thử hoạt tính

25

Lấy 10l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào 96 đĩa giếng, thêm 200l dung
dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105
CFU/ml, ủ ở 37o
C/24h.

Xử lý kết quả


- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự
phát triển của vi sinh vật.
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy
bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
- Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch.

Chất tham khảo


- Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) với các giá trị MIC
trong khoảng 0,004 – 1,20g/ml.
- Kháng sinh Cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram (-) với giá trị MIC trong
khoảng 0,07 – 19,23g/ml.
- Kháng nấm Nystatin cho chủng nấm với giá trị MIC trong khoảng 2,8 -
5,0g/ml.
2.2.1.2. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào được thử theo phương pháp của Scudiero D.A.
và cộng sự [51]. Đây là phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được viện
Ung thư Quốc gia (NCI) Maryland, Hoa kỳ xác nhận là phép thử độ độc tế
bào chuẩn, nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát
triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.

Các dòng tế bào ung thư ở người dự tính thử nghiệm

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm có:
- Human epidemic carcinoma (KB): Ung thư biểu mô.
- Heptatocellular carcinoma (Hep–G2): Ung thư gan.
- Human lung carcinoma (LU): Ung thư phổi.
- Human breast carcinoma (MCF–7): Ung thư vú.
26


Môi trường nuôi cấy

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường
cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành
phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37o
C; độ ẩm 98%; vô
trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời
gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha lỏng sẽ được sử
dụng để thử độc tính.

Cách tiến hành

Quy trình thử độc tế bào: Cho 200 μg dung dịch tế bào pha loãng nồng độ
ở 3 104
tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI
1640 cho các dòng tế bào Hep–G2, MCF7, KB; môi trường DMEM cho dòng
tế bào LU. Mẫu thử được xử lý với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau
sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 μg/ml; 32 μg/ml; 8 μg/ml; 2 μg/ml;
0,5 μg/ml ủ ở 37o
C, 5% CO2 3 ngày. Giếng điều khiển gồm 200 μl dung dịch
tế bào nồng độ 3 104
tế bào/ml ủ ở 39o
C, 5% CO2 3 ngày, thêm 50 μl MTT
(1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ ở 37o
C trong 4
giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 μl DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng
540 nm trên máy spectro photometer Genios TECAN.
Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% số tế bào thử) được tính trên chương
trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ
khác nhau của chất thử và giá trị OD (mật độ quang) đo được trên máy.
2.2.2. Phƣơng ph p chiết mẫu thực vật
Mẫu cây mỏ quạ, sau khi đã sấy khô và xay nhỏ được cân chính xác và ngâm
chiết với etanol (chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ ở nhiệt độ 70o
C). Cất loại dung môi dưới
áp suất thấp ở nhiệt độ 45-50o
C (bằng máy quay cất chân không) thu được dịch
chiết EtOH. Dịch chiết EtOH được chiết lần lượt với các dung môi khác nhau: n-
hexan, EtOAc. Các dịch chiết được cất loại dung môi đến khô sẽ thu được các cao
chiết tương ứng.
27

2.2.3. Phƣơng ph p t ch và tinh chế chất
Các cao chiết thu được từ các dung môi khác nhau sẽ được phân tích định tính
bằng sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp và được tinh chế bằng phương
pháp sắc kí cột silica gel. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH20
hoặc pha đảo RP18. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc
dùng phương pháp kết tinh phân đoạn để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của
các chất cũng như kiểm tra quá trình chạy cột bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) với
nhiều hệ dung môi khác nhau để xác định Rf tối ưu (Rf 0,4-0,6).
2.2.4. Phƣơng ph p x c định cấu trúc hóa học của các chất
Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch phân lập được được thực hiện
thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR),
phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D
NMR: 1
H, DEPT, COSY, HSQC và HMBC). Các loại phổ được đo tại Viện Hoá
học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu của các chất đều được
so sánh với các dữ liệu phổ của các chất đã được công bố.
2.3. Quy trình xử lý và chiết mẫu thực vật
Mẫu cây mỏ quạ (thân cành) được cắt nhỏ và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 50-
60o
C. Mẫu sau khi sấy khô, được xay nhỏ thành bột (2,6 kg) và được chiết với
etanol 80%. Quy trình chiết được trình bày tóm tắt trong sơ đồ 2.1.
28

Dịch chiết
n-hexan
Mẫu cây mỏ quạ (thân cành)
(2,6 kg)
Chiết EtOH 80%, 700
C, 3 h (8 L x 3)
Dịch chiết EtOH
Cất loại dung môi
Cồn thu
hồi
Dịch nước
Chiết n-hexan,
(DN1)
3 lần ( 2 L x 3)
Cô quay
Cặn n-Hexan
(25,5 g)
Dịch nước
(DN2)
Chiết EtOAc
3 lần (2L x 3)
Dịch nước
(DN3)
Dịch EtOAc
Cất loại dung môi
Cặn EtOAc
(46,5 g)
Cô quay
Cặn nước
(120 g)
Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết thân cành cây mỏ quạ

Chiết tổng


- Chiết lần 1: Lấy 2,6 kg mẫu mỏ quạ (đã được xay nhỏ), ngâm trong 8 lít
cồn/nước (80% cồn) được đun nóng ở 70o
C và khuấy trong bình chiết (3 lít).
Thời gian đun và khuấy là 3 tiếng. Sau đó lọc dịch chiết nước 1.
- Chiết lần 2: Cho 8 lít cồn/nước (80% cồn) vào bã nước 1 để chiết tiếp. Nước 2
được khuấy và đun trong 3 tiếng ở 70o
C Sau đó lọc lấy dịch chiết nước.
29

- Chiết lần 3: Cho 8 lít cồn/nước (80% cồn) vào bã nước 2 để chiết tiếp. Nước 3
được khuấy và đun trong 3 tiếng ở 70o
C Sau đó lọc lấy dịch chiết nước.
Gộp dịch chiết lần 1 + lần 2 + lần 3. Quay cất dung môi, được dịch nước (DN1),
để nguội đến nhiệt độ phòng để chiết phân bố.

Chiết phân bố

Chiết với n-hexan
Dịch chiết tổng (DN1) được chiết phân lớp với n-hexan (lặp lại 3 lần) để loại
các chất kém phân cực. thu được dịch nước (DN2) và dịch chiết n-hexan. Dịch chiết
n-hexan được cô quay cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân
không, thu lại dung môi cho những lần chiết sau. Sau cô quay thu được 25,5 g cao
chiết n-hexan.
Chiết với etylaxetat
Sau khi chiết phân lớp với n-hexan, dịch nước (DN2) được chiết với etylaxetat
(lặp lại 3 lần), thu được dịch nước (DN3) và dịch chiết EtOAc. Dịch nước (DN3),
sau khi đem cất quay dưới áp suất thấp bằng máy quay cất chân không thu được 120
g cặn chiết tương ứng. Dịch chiết EtOAc, tương tự được cô quay cất loại dung môi
dưới áp suất thấp thu được 46,5 g cặn EtOAc.
2.4. Quy trình phân lập các chất từ cao chiết etylaxetat
Cao chiết từ dịch chiết EtOAc (45 g) được chạy trên cột sắc ký silica gel với hệ
dung môi gradient (DMC/EtOAc , 100/0 → 5/95). Các phân đoạn thu được được
kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) với hệ dung môi DMC/EtOAc và được
quan sát dưới đèn hồng ngoại UV, ở bước sóng λ = 360 nm. Sau khi gộp các phân
đoạn giống nhau lại thu được 15 phân đoạn chính, được ký hiệu từ MC1 đến
MC15, với khối lượng tương ứng (như trình bày trong sơ đồ 2.2).
Phân đoạn MC7 (20 g) được đưa vào tinh chế lại trên cột silica gel, với hệ dung
môi rửa giải n-hexan/EtOAc (10/1 → 1/5) thu được các phân đoạn F1 đến F13. Sau
khi kiểm tra bằng SKLM, phân đoạn F6 + F7 (3,5 g) được tiếp tục cho tinh chế lại
30

trên cột sắc ký silicagel (n-hexan /EtOAc;15/1), thu được chất sạch ký hiệu là
MC7.01 (20 mg).
Phân đoạn MC9 (2,5 g) chạy lại trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi
DMC/EtOAc (30/1) thu được 9 phân đoạn khác nhau (FMC9.1-FMC9.9). Trong đó
phân đoạn FMC9.9 được kết tinh lại trong DCM/EtOAc thu được hợp chất
quercetin. Phân đoạn FMC9.3 (80 mg) được tinh chế lại trên cột silica gel hệ dung
môi DCM/EtOAc (25/1), thu được các chất sạch là MC9.3 và dihydrokaempferol.
Phân đoạn FMC9.6 được chạy lại trên cột sephadex LH-20 (MeOH) thu được chất
MQ9.2.
Quy trình tách các chất sạch được trình bày tóm tắt trong sơ đồ 2.2; sơ đồ 2.3.
31

Cao EtOAc
(MC, 45g)
SKC silica gel
DMC/EtOAc
(100/0 - 5/95)
MC1
(0.1 g)
MC2
(0,8 g)
MC3 MC4 MC5 MC6 MC7 MC8 MC9 MC10 MC11 MC12 MC13
(0,64g) (0,5 g) (0,33g) (0,31g) (26g) (8,5g) (2,5 g) (0,68g) (1,65 g) (3,2g) (2,75g)
MC7 (20 g), chạy cột sillica gel
n-hexan/EtOAc (10/1 đến 1/5)
MC14
(2,8 g)
MC15
(1,5 g)
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13
F6+F7 (3,5 g), chạy cột sillica gel
n-hexan/EtOAc (15/1)
MC7.01 (20 mg)
Sơ đồ 2.2. Quy trình t ch chất sạch từ phân đoạn chiết EtOAc của thân cây Maclura cochinchinensis (Lour.) Corner
32

MC9
(2,5g)
SKC silica gel
DMC/EtOAc (30/1)
FMC9.1 FMC9.2 FMC9.3 FMC9.4 FMC9.5 FMC9.6 FMC9.7
FMC9.3 (80 mg), SKC silica gel Sephadex LH-20
DMC/EtOAc (25/1) (MeOH)
MQ9.2
dihydrokaempferol MC9.3
FMC9.8 FMC9.9
Kết tinh trong
DCM/EtOAc
Quercetin
Sơ đồ 2.3. Quy trình t ch chất sạch từ phân đoạn MC9
33

Số liệu phổ của c c h p chất đã phân lập đƣ c

H p chất dihydrokaempferol (84)

Phổ 1
H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H2’-
H6’); 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H3’- H5’); 4,55 (1H, d, J = 11,5 Hz, H3); 5,94 (1H,
d, J = 2.0 Hz, H8); 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz, H6); 5,0 (1H, d, J = 11,5 Hz, H2).
Phổ 13
C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 198,5 (C-4); 168,7 (C-7); 165,3
(C-5); 164,5 (C-9); 159,2 (C-4’
); 130,3 (C-2’
, C-6’
); 129,3 (C-1’
); 116,1 (C-3’
, C-
5’
); 101,8 (C-10); 97,3 (C-6); 96,3 (C-8); 84,9 (C-2); 73,6 (C-3).

H p chất quercetin (85)

Phổ 1
H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,75 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’);
7,65 (1H, dd, J = 8,5 Hz, H-6’); 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 6,4 (1H, s, H-8);
6,20 (1H, s, H-6).
Phổ 13
(C-5) ; 158,2 (C-9); 148,8 (C-4’); 148,0 (C-2); 146,2 (C-3’); 137,2 (C-3); 124,1 (C-
1’); 121,7 (C-6’); 116,2 (C-5’); 115,9 (C-2’); 104,5 (C-10); 94,4 (C-8); 99,2 (C-6).

H p chất MQ9.2 [6-p-hydroxybenzyldihydrokaempferol (Gericudranin E)]
(86)

Phổ 1
H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-
6’); 7,13 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2”, H-6”); 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’); 6,65
(2H, d, J = 8,5 Hz, H-3”, H-5”); 5,96 (1H, s, H-8); 5,0 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-2);
4,55 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-3); 3,78 (2H, s, H-11).
Phổ 13
(C-5, C-9); 159,2 (C-4’); 156,0 (C-4”); 133,8 (C-1”); 130,6 (C-2”, C-6”); 130,3 (C-
2’,C-6’); 129,4 (C-1’); 116,1 (C-3”, C-5”); 115,7 (C-3’, C-5’); 110,7 (C-6); 101,6
(C-10); 95,7 (C-8); 84,9 (C-2); 73,7 (C-3); 27,5 (C-11).

H p chất MC9.3 (87, Wighteone)

Phổ 1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 8,26 (1H, s, H-2); 6,45 (1H, s,
H-8); 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′ và H-6′); 6,81 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′ và H-5′);
34

3,22 (2H, d, J = 6,5 Hz, H-1"); 5,17 (1H, t, J = 7,2 Hz, H-2"); 1,72 (3H, s, H-4");
1,62 (3H, s, H-5"); 13.20 (1H, s, OH).
Phổ 13
C- NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 153,6 (C-2); 122,2 (C-3);
180,2 (C-4); 158,8 (C-5); 111,1 (C-6); 162,3 (C-7); 92,0 (C-8); 155,4 (C-9); 104,2
(C-10); 122,1 (C-1′); 130,1 (C-2′); 115,0 (C-3′); 157,4 (C-4′); 115,0 (C-5′); 130,6
(C-6′); 21,0 (C-1"); 121,4 (C-2"); 130,6 (C-3"); 17,7 (C-4"); 25,5 (C-5").

H p chất MC701 (88)

Phổ 1
H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,75 và 1.31( 6H, s, 2xCH3); 3,47
(2H, d, J = 7 Hz, H-1’’); 3,84 (3H, s, OCH3); 5,25(1H, t, J = 7 Hz, H-2’’); 6,3 (1H,
s, H-6); 6,93 (2H, d, J = 8,5 Hz, H3',5'); 7,45 (2H, d, J = 8,5 Hz, H2',6'); 7.91(1H, s,
H-2); 12,8 (1H, s, OH-5).
Phổ 13
C- NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 155,1 (C-9); 152,7 (C-2); 181,95
(C-4); 160,8 (C-7); 160,6 (C-5); 99,6 (C-6); 106,3 (C-10); 105,4 (C-8); 134,8 (C-
3’’); 121,2 (C-2’’); 159,8 (C-4’); 123,0 (C-1’); 123,3 (C-3); 130,1 (C-2’,6’); 114,1
(C-3’,5’); 17,9 và 25.8 (C-4’’,5’’); 21,6 (C-1’’); 55,4 (OCH3).
35

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của thân rễ cây mỏ quạ, họ dâu tằm của Việt nam.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của thân rễ cây mỏ quạ, họ dâu tằm của Việt nam.doc

Similar to Thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của thân rễ cây mỏ quạ, họ dâu tằm của Việt nam.doc (19)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói 🥰🥰 Liên hệ ZALO/TELE: 0917.193.864 ❤❤

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói 🥰🥰 Liên hệ ZALO/TELE: 0917.193.864 ❤❤ (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của thân rễ cây mỏ quạ, họ dâu tằm của Việt nam.doc