Nghiên Cứu Sử Dụng Vi Sinh Vật Phân Hủy Nhựa Cây Trên Nguyên Liệu Dăm Mảnh Keo Nhằm Ứng Dụng Trong Sản Xuất Bột Giấy Thân Thiện Với Môi Trường.doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Trần Thị Hƣơng
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY
TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY
TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Hƣớng dẫn : Phan Thị Hồng Thảo
Hà Nội - 2020

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa
cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong sản xuất bột giấy
thân thiện với môi trƣờng” là kết quả nghiên cứu của mình không có sự sao
chép của ngƣời khác. Đề tài là sản phẩm mà tôi đã nỗ lực nghiên cứu trong
quá trình học tập tại Học viện và làm việc tại phòng Vi sinh vật đất.
Số liệu và kết quả nghiên cứu thực hiện trong luận văn này là hoàn toàn
trung thực và chƣa từng sử dụng và công bố ở bất kì công trình nào khác. Tất
cả các tài liệu tham khảo sử dụng để viết bài đều có nguồn gốc rõ ràng, dƣới
sự hƣớng dẫn của TS. Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phòng Vi sinh vật đất –
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ.
Tôi xin cam đoan tất cả các điều trên là sự thật, nếu có vấn đề gì tôi xin
chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Học viên

Lời cảm ơn
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đối với TS. Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phòng Vi sinh vật đất, Viện Công
nghê Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học đã hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên
cứu và tận tình giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu làm luận văn tốt
nghiệp.
Em cũng xin cám ơn các thầy, cô trong Ngành Sinh học, Học viện
Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng
thời gian đào tạo tại đây.
Em cũng xin gửi lời cám ơn tới toàn thể cán bộ phòng Vi sinh vật Đất,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tạo điều kiện thuận lợi về phƣơng tiện, hƣớng dẫn em trong suốt quá trình
thực tập.
Em xin cảm ơn kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học
để phân hủy nhựa cây trong dăm mảnh gỗ keo, bạch đàn làm nguyên liệu sản
xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng tại Việt Nam: Mã số: 05/HĐ-
ĐT.05.18/CNSHCB của TS. Phan Thị Hồng Thảo.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm
2020
Học viên

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS
Adt
CMC
DNA
DNSA
pNBP
RBBR
Tris-HCl
U
VSV
: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)
: Tấn khô gió
: Carboxymethyl Cellulose
: Deoxyribonucleic acid
: 3,5-dinitrosalicylic acid
: p -nitrophenyl butyrate
: Remazol Brilliant Blue R
: Tris hydrochloride
: Unit
: Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3. 1. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập ở nhiệt độ 37o
C và 45o
C
trong các mẫu ..................................................................................................31
Bảng 3. 2. Khả năng phân hủy stigmassterol, sinh tổng hợp cellulase và lipase
của vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập .....................................................................36
Bảng 3.3. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng
vi khuẩn phân lập ở 37o
C................................................................................41
Bảng 3. 4. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng
vi khuẩn phân lập ở 45o
C................................................................................42
Bảng 3. 5. Khả năng phân hủy nhựa của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tuyển
chọn .................................................................................................................45
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng
CVSVC1-1 ......................................................................................................48
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng phát triển của
CVSVC1-1 ......................................................................................................48
Bảng 3.8. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng CVSVC1-1 với các loài
vi khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự gen16S rDNA...............................50
Bảng 3. 9. Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng
CVSVC1-1 trên một số môi trƣờng khảo sát .................................................51
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến sinh trƣởng và hoạt tính enzyme
sterol esterase, laccase và cellulase của chủng CVSVC1-1............................55
Bảng 3. 11. Khả năng sinh sterol esterase, laccase và cellulase của chủng
CVSVC1-1 trên dăm mảnh gỗ ở các tỷ lệ giống khác nhau...........................58
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm nhựa trên nguyên
liệu dăm mảnh gỗ keo .....................................................................................59
Bảng 3.13. Hiệu suất nấu bột ở một số mẫu có lƣợng nhựa giảm tốt ............60
Bảng 3. 14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng giảm nhựa của chủng
CVSVC1-1 ......................................................................................................60
Bảng 3. 15. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa của chủng
CVSCV1-1 ......................................................................................................61

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose..........................................................28
Hình 3. 1. Hình ảnh vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng phân lập .............31
Hình 3.2. Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi
trƣờng phân lập lỏng.......................................................................................33
Hình 3.3. Khả năng sinh enzym lipase ngoại bào của một số chủng phân lập34
Hình 3.4. Khả năng sinh cellulase ngoại bào của một số chủng phân lập......34
Hình 3.5. Dăm mảnh gỗ keo đƣợc ngâm ngập trong dịch lên men của các
chủng tuyển chọn ............................................................................................44
Hình 3.6. Quá trình chiết nhựa........................................................................45
Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào vi khuẩn CVSVC1-1 dƣới kính
hiển vi quang học (100x) (B) và kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại (50000X)
(C) và (10000X) (D)........................................................................................46
Hình 3.8. Khả năng sinh bảo tử của chủng vi khuẩn CVSVC1-1 ..................47
Hình 3.9. Khả năng phân hủy một số cơ chất của vi khuẩn CVSVC1-1........49
Hình 3.10. Điện di đồ DNA tổng số (A), sản phẩm PCR (B) trên gel agarose
1,0 % và cây phát sinh chủng loài của vi khuẩn CVSVC1-1 .........................50
Hình 3.11. Khả năng sinh trƣởng của chủng CVSVC1-1 trên các môi trƣờng
khảo sát............................................................................................................51
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh trƣởng
của chủng CVSVC1-1 trên môi trƣờng MPA bổ sung 0,5g/L.......................53
Hình 3. 13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol
esterase và laccase của chủng CVSVC1-1......................................................53
Hình 3. 14. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase
và laccase của chủng CVSVC1-1 ...................................................................54
Hình 3.15. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 ở
các tỷ lệ giống bổ sung khác nhau ..................................................................57
Hình 3.16. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1
sau rửa và sấy ..................................................................................................57
Hình 3.17. Mật độ vi sinh trên mẫu có và không bổ sung chủng CVSVC1-1 ở
nồng độ 105
.....................................................................................................57

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU ..............................................................................6
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................7
MỤC LỤC.........................................................................................................8
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................3
1.1. PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY...........................................3
1.2. NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY .............................................................5
1.2.1. Nhựa cây..................................................................................................5
1.2.2. Tác động của nhựa cây đến quá trình sản xuất bột giấy .........................7
1.3. VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY................................................9
1.3.1. Nấm phân hủy nhựa cây..........................................................................9
1.3.2. Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa cây. ...............................................12
1.3.3. Hệ enzym phân hủy nhựa cây. ..............................................................14
1.3.2.1. Esterase..............................................................................................14
1.3.2.2. Lipase .................................................................................................15
1.3.2.3. Laccase...............................................................................................16
1.3.4. Cơ chế phân hủy lignin và các chất chiết trong gỗ...............................17
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU.............................................................................22
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu...........................................................................22
2.1.2. Thiết bị ..................................................................................................22
2.1.3. Hóa chất.................................................................................................22
2.1.4. Môi trƣờng............................................................................................23
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................23
2.2.1. Chuẩn bị chất chiết nhựa cây ................................................................23
2.2.2. Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa. ...............................23

2.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật đƣợc
tuyển trọn. .............................................................................................24
2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzym.........................25
2.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym ...............................................26
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa cây bằng chiết trong aceton .. 29
2.2.7. Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate .......................................................29
2.2.8. Phƣơng pháp xác định chỉ số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin) .....30
2.2.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê. .........................................................30
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................31
3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY.........................................................31
3.1.1. Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân
hủy nhựa cây.........................................................................................31
3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp sterol esterase, laccase và cellulase của các
chủng tuyển chọn ..................................................................................40
3.1.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhựa
cây 43
3.2. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI
CHỦNG CVSVC1-1...............................................................................46
3.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng vi
khuẩn CVSVC1-1.................................................................................46
3.2.2. Định danh chủng vi sinh vật tuyển chọn bằng phƣơng pháp phân tích
trình tự vùng gen 16S rRNA.................................................................49
3.3. NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP
STEROL ESTERASE CỦA CHỦNG CVSVC1-1................................51
3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp một
số enzym của chủng CVSVC1-1 ..........................................................51
3.3.2. Ảnh hƣởng cả các yếu tố nhiệt độ, pH và tốc độ lắc đến khả năng sinh
trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng CVSVC1-1.......................52
3.4. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BỔ SUNG VI SINH VẬT TUYỂN
CHỌN VÀO DĂM MẢNH GỖ KEO....................................................56
3.4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả năng sinh trƣởng và loại nhựa...........56

3.4.3. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa cây trong dăm mảnh gỗ
61
4.1. Kết luận ...................................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................63

1
MỞ ĐẦU
Sản xuất giấy đƣợc xem nhƣ là một ngành công nghiệp trọng điểm của
nhiều quốc gia trên thế giới. Các sản phẩm từ giấy không chỉ đƣợc sử dụng
trong ngành giáo dục, báo chí, in ấn, hội họa… mà còn đƣợc sử dụng trong
nhu cầu tiêu dùng hàng ngày khác của con ngƣời nhƣ khăn giấy, giấy vệ
sinh, thùng chứa… Ngày nay, các sản phẩm từ giấy còn đƣợc khuyến khích
trong việc sử dụng làm bao bì, giấy gói, dụng cụ dùng một lần v.v. nhằm hạn
chế rác thải nhựa.
Hiện nay, công nghệ sản xuất giấy đã đƣợc cải tiến nhiều kể cả về trang
thiết bị máy móc cũng nhƣ quy trình sản xuất để có thể đáp ứng nhu cầu thị
hiếu của khách hàng. Tuy nhiên, ngành giấy vẫn gặp nhiều vấn đề liên quan
tới tiêu thụ năng lƣợng, nƣớc và ô nhiễm môi trƣờng do phải sử dụng một
lƣợng lớn hóa chất trong sản xuất. Một trong những khó khăn lớn mà ngành
giấy hiện nay đang gặp phải là những ảnh hƣởng của nhựa cây đến quá trình
sản xuất và chất lƣợng của giấy. Mặc dù hàm lƣợng của nhựa cây chỉ chiếm
2-8%, nhƣng với thành phần và đặc điểm cấu tạo các chất nhựa trong gỗ có
thể gây ra những vấn đề nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến hiệu quả của quá trình
công nghệ và chất lƣợng sản phẩm. Nhựa cây đóng cặn làm giảm chất lƣợng
của bột giấy và có thể gây ngừng quá trình nghiền bột, giảm hiệu quả sản xuất
và tăng chi phí để loại bỏ hay kiểm soát nhựa cây. Thành phần nhựa trong gỗ
keo bao gồm: sáp, axit béo, các alkanol, các chất chiết hydroxy, rƣợu béo, các
trygliceride, diglyceride, sterol, steryl ester, phospholipid và một số thành
phần khác. Các thành phần axit béo không xà phòng hóa đƣợc (ví dụ các
alkanol, sterol, este và steryl) và các axit béo chuỗi dài bão hòa và không bão
hòa rất khó xử lý trong quá trình sản xuất giấy vì chúng không đƣợc loại bỏ
trong quá trình nấu, tẩy trắng và rửa bột. Để hạn chế vấn đề nhựa cây, có thể
sử dụng các phƣơng pháp truyền thống, hóa học và sinh học.
Trong những năm gần đây, ứng dụng công nghệ sinh học trong việc sản
xuất bột giấy đƣợc xem nhƣ là một công nghệ sản xuất sạch với mục đích
tăng sản lƣợng và chất lƣợng giấy, thân thiện với môi trƣờng. Phƣơng pháp
này đã thu hút nhiều sự quan tâm, chú ý không chỉ của các nhà nghiên cứu mà

2
còn cả các cấp quản lý và các nhà sản xuất giấy. Trong phƣơng pháp này, các
chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hệ enzym phân hủy nhựa cây đƣợc sử
dụng trong giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa cây
trong nguyên liệu giúp giảm hóa chất sử dụng, bảo vệ môi trƣờng và tăng quá
trình chạy máy. Trong tự nhiên, các loài nấm mốc, nấm dát gỗ, nấm đảm, vi
khuẩn, xạ khuẩn đều là các đối tƣợng đã và đang đƣợc quan tâm trong nghiên
cứu giảm nhựa nhờ hệ enzym phong phú nhƣ esterase, laccase, lipase v.v.
Nấm đảm và nấm dát gỗ trƣớc nay đƣợc xem là hai đối tƣợng đƣợc quan
tâm nhiều nhất, tuy nhiên sức phát triển và khả năng chịu các điều kiện khắc
nghiệt của môi trƣờng là một nhƣợc điểm của chúng. Xuất phát từ thực tế đó,
nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh
vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong
sản xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng”, nhằm giảm ảnh hƣởng của nhựa
cây đến quá trình sản xuất bột giấy.

3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI
LIỆU 1.1. PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY
Hiện nay có 2 phƣơng pháp chính để sản xuất bột giấy là phƣơng pháp
truyền thống (cơ học) và phƣơng pháp hóa học.
Sản xuất bột giấy bằng phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp đƣợc
áp dụng tại nhiều nhà máy lớn và nhỏ. Trong phƣơng pháp này, nguyên liệu
dăm mảnh đƣợc thu mua và lƣu kho trong thời gian dài. Trong quá trình bảo
quản, dăm mảnh đƣợc tiến hành phun nƣớc giảm hàm lƣợng nhựa. Ƣu điểm
của phƣơng pháp truyền thống là tận dụng nguồn vi sinh vật và các tác nhân
bên ngoài để phân hủy một số thành phần nhựa trong nguyên liệu giúp giảm
chi phí trong quá trình sản xuất. Tuy nhiên, nó lại không kiểm soát đƣợc các
loài vi sinh vật gây hại, do đó, rất dễ gây thất thoát Cellulose, giảm hiệu xuất
thu hồi và ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy. Việc áp dụng phƣơng pháp
truyền thống vào sản xuất bột giấy cũng chỉ giảm tối 20% hàm hƣợng nhựa,
chủ yếu là các hợp chất dễ phân hủy, các thành phần khó phân hủy nhƣ sterol,
sterol este, axit nhựa,… vẫn đƣợc giữ lại trong nguyên liệu gây ra các vấn đề
trong sản xuất bột giấy. Hiệu suất thu hồi bột đạt từ 85 – 98%, chi phí thấp.
Bột giấy sản xuất theo phƣơng pháp này thƣờng có khả năng thấm hút mực
in tốt nên thƣờng đƣợc sử dụng trong một số sản phẩm nhƣ: giấy in báo, giấy
in tạp chí cao cấp (SC), giấy in tạp chí có tráng nhẹ (LWC), giấy dán tƣờng,
giấy làm bao bì (FBB), giấy in giấy viết thông thƣờng... Tuy nhiên, chất
lƣợng bột giấy thƣơng phẩm khi sản xuất bột giấy lại có nhiều điểm hạn chế
nhƣ: giấy thƣờng bị đục, không bền, dễ bị thủng…
Sản xuất giấy bằng phƣơng pháp hóa học là sử dụng hóa chất để biến đổi
nguyên liệu ban đầu thành bột giấy (bột hóa học). Các dăm mảnh gỗ đƣợc xử
lý hóa học bằng cách nấu. Sau khi nấu 12 đến 15 tiếng xơ sợi sẽ đƣợc tách ra
khỏi các thành phần cứng và thu đƣợc sợi cellulose. Bột giấy đƣợc sản xuất
theo phƣơng pháp hóa học đã cải thiện đáng kể về chất lƣợng thành phẩm.
Phƣơng pháp hoá học đã loại bỏ triệt để lignin nên bột giấy hóa học có chất
lƣợng tốt hơn so với bột giấy cơ học. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này cũng có
những mặt hạn chế nhất định đặc biệt là hiệu suất thu hồi bột không cao, chỉ

4
đạt 40 - 50%. Bên cạnh đó việc sử dụng một lƣợng lớn hóa chất gây ảnh
hƣởng đến môi trƣờng xung quanh, tốn kém chi phí trong quá trình xử lý.
Bột Sulfat (bột Kraft): Dịch nấu gỗ gồm (NaOH + Na2S) (có thể bổ sung
xúc tác và các chất trợ nấu), pH từ 13 trở lên, nhiệt độ từ 155-170o
C, thời gian
2 - 4 giờ. Nhƣợc điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là sinh ra hợp chất lƣu
huỳnh có mùi thối, gây tác động lớn đến môi trƣờng xung quanh. Nấu kiềm,
đặc biệt là nấu sunfat, là phƣơng pháp phổ biến nhất hiện nay, sản xuất ra
phần lớn lƣợng bột giấy hằng năm. Hiện nấu sunfat (Kraft) là phƣơng pháp
đƣợc áp dụng ở quy mô lớn tại nhà máy Giấy Bãi Bằng của Tổng Công ty
Giấy VN và tại Công ty cổ phần giấy An Hòa, hai nhà máy có thị phần bột
giấy nấu từ nguyên liệu thô lớn nhất Việt Nam. Nguyên liệu chính dùng trong
sản xuất chủ yếu là gỗ keo và bạch đàn. Tuy nhiên lƣợng gỗ keo chiếm trên
70%. Tại tổng Công ty Cổ phần giấy An Hòa, quy mô sản xuất bột giấy Kraft,
nấu liên tục, tƣơng đối lớn 130.000 tấn/năm, bột giấy đƣợc tẩy trắng theo quy
trình tẩy tiên tiến không sử dụng clo nguyên tố. Hiện tại hai nhà máy này chịu
ảnh hƣởng nặng nề của vấn đề nhựa cây, làm giảm năng suất quá trình sản
xuất bột giấy và tăng giá thành sản xuất.
Hiện nay, ngoài hai phƣơng pháp sản xuất bột giấy trên các nhà máy sản
xuất giấy cũng đang hƣớng đến một phƣơng pháp sản xuất sạch hơn, giảm thiểu
những tác động của nhựa cây đến môi trƣờng. Xử lý giấy bằng phƣơng pháp
sinh học không chỉ giúp loại bỏ nhựa trên nguyên liệu, chúng còn làm giảm
lƣợng hóa chất sử sụng trong quá trình xử lý, giảm năng lƣợng tiêu thụ và chi
phí sản xuất. Phƣơng pháp sinh học thƣờng đƣợc áp dụng trong giai đoạn tiền
xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa, trong giảm năng lƣợng nghiền
hoặc tẩy trắng bột giấy,… Trên thế giới, một số chế phẩn phân hủy nhựa cây đã
đƣợc sử dụng trong xử lý gỗ mềm nhƣ Cartapip 97 đƣợc tạo thành từ các chủng
bạch tạng của Ophiostoma piliferum. Sử dụng chế phẩm Cartapip có thể loại
đƣợc đến 90% hàm lƣợng các triglycerides, cao hơn so với phƣơng pháp lƣu
giữ gỗ, tuy nhiên, hiệu quả loại các axit nhựa, sterol este và sáp trong 2 tuần
tƣơng tự so với bảo quản tự nhiên trong cùng một điều kiện. Ở Việt Nam, sản
xuất bột giấy bằng phƣơng pháp sinh học chƣa đƣợc áp

5
dụng, chúng chỉ là những thử nghiệm của các đề tài, dự án trên các nhà máy,
tuy nhiên, các kết quả thu đƣợc mang lại nhiều triển vọng trong sƣ phát triển
bền vững của ngành Giấy.
1.2. NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY
1.2.1. Nhựa cây
Nhựa cây chỉ chiếm một lƣợng nhỏ 2 – 8% khối lƣợng gỗ nhƣng chúng
lại cần thiết cho sự sống của cây. Trong cây đang sống, nhựa cây đƣợc tạo ra
để bảo vệ cây khỏi bị vi sinh vật tấn công phá hủy các mô gỗ. Tƣơng tự nhƣ
vậy là vai trò của dịch rỉ (exdudates), đƣợc đùn ra ở những chỗ cây bị tổn
thƣơng bởi tác động bên ngoài. Nhựa cây là nhân tố chính góp phần tạo ra
màu sắc, mùi hƣơng và độ bền của gỗ. Một số chất chiết còn có hoạt tính sinh
học nên từ lâu nhiều loại gỗ đã đƣợc dùng làm dƣợc liệu hoặc thuốc [1,2].
Trong công nghiệp chế biến đồ dùng từ gỗ, nhựa cây có ảnh hƣởng tới quá
trình sấy khô, khả năng kết dính, tính hút ẩm và âm thanh của gỗ [1]. Trong
ngành sản xuất vật liệu composite từ chất dẻo và gỗ sử dụng trong xây dựng
và công nghiệp ô tô, thì gỗ cũng đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần gia cố,
tuy nhiên, hàm lƣợng nhựa trong gỗ cao có thể dẫn tới những tính chất không
mong muốn của vật liệu composite [3,4]. Nhựa cây không tan trong nƣớc
nhƣng tan đƣợc trong dầu mỏ và một số dung môi hữu cơ trung tính, có độ
phân cực thấp. Thành phần hóa học của nhựa cây bao gồm các axit béo tự do,
axit nhựa, sáp, các rƣợu béo, steryl este, các sterol, glyceride, ketone và các
hợp chất chứa oxy khác. Theo Black và Ekman (2000), có thể chia các hợp
chất trong thành phần nhựa cây gồm 4 nhóm chính nhƣ [5]:
- Các chất béo (triglyxerit) và axit béo;
- Steryl este và sterol;
- Terpen và terpenoid (các axit nhựa và polyisopren);
- Các chất sáp (ester của rƣợu béo và axit béo).
Nhựa cây đƣợc chứa chủ yếu ở trong các kênh dẫn nhựa (resin canals),
trong các túi nhựa (resin pockets), trong các tế bào nhu mô (parenchyma cells)
hoặc ở một số tế bào chỉ có ở một số loại gỗ cứng nhiệt đới nhƣ các tế

6
bào dầu (oil cells) và các tế bào latex (latex cells). Nhựa trong các kênh dẫn
nhựa thông thƣờng là hỗn hợp vô định hình của các terpen và terpenoit mạch
vòng đƣợc hình thành từ các đơn vị isopren nhờ sự tiếp xúc của các enzyme
tạo mạch vòng xyclaza. Theo một số tài liệu nghiên cứu, hàm lƣợng và thành
phần hóa học của nhựa cây phụ thuộc vào loài cây, độ tuổi, yếu tố về di
truyền, mùa sinh trƣởng, điều kiện phát triển (ánh sáng, độ ẩm, thành phần
dinh dƣỡng của đất,…), khí hậu vùng miền. Các cây trồng ở vùng có khí hậu
ấm áp có lƣợng axit béo bão hòa cao hơn. Thậm chí giữa các bộ phận khác
nhau của cây cũng có sự khác biệt đáng kể. Nhựa cây thƣờng có nhiều trong
tâm gỗ hơn so với ở dát gỗ, tạo nên một môi trƣờng bảo quản tự nhiên cho
tâm gỗ. Trong các kênh dẫn nhựa và tế bào biểu mô chứa nhiều chất chiết có
vai trò quan trọng trong quá trình bảo quản gỗ, giúp duy trì các đặc tính của
gỗ. Nhựa ở gỗ mềm có chứa 90% hàm lƣợng các chất xà phòng hoá cao là
các axit nhựa và axit béo. Các axit nhựa, axit béo, triglyceride, sterol và các
este của chúng là các nhóm chất béo chính của nhựa gỗ vân sam và thông.
Các triglyceride chiếm ƣu thế ở phần dát gỗ của cả vân sam và thông trong
khi ở tâm gỗ thông chứa nhiều axit nhựa, gấp khoảng 2 lần so với phần dát
gỗ. Nhựa của gỗ cứng bạch dƣơng và gỗ dƣơng có nhiều các sterol và các
chất béo không xà phòng hóa hơn so với gỗ mềm mặc dù vẫn chứa nhiều
triglyceride. Các sterol este và sáp cũng có trong nhựa của gỗ dƣơng, nhựa gỗ
bạch dƣơng có triterpenol và các axit béo bão hòa.
Thành phần nhựa có trong gỗ keo bao gồm: đối với gỗ keo trên 5 tuổi
thành phần nhựa chủ yếu là 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl-với hàm lƣợng
lên đến trên 70%, hợp chất này giảm khi độ tuổi tăng. Tuy nhiên, xuất hiện
một số hợp chất mới với hàm lƣợng tƣơng đối nhƣ 1,2-benzenedicarboxylic
acid, bis(2-ethylhexyl) ester (2,5%) ở gỗ keo 6 tuổi và 1,2-
benzenedicarboxylic acid, diisooctyl ester (5,95%), (2-hydroxyethyl)-
triphenylphosphonium chloride (8,06%) trên gỗ keo 7 tuổi. Ngoài ra còn có
các axit béo, axit nhựa (axit n – hexadecanoic, axit octadecanoic) trong thành
phần nhựa cây.

7
1.2.2. Tác động của nhựa cây đến quá trình sản xuất bột giấy
Trong sản xuất bột giấy, nhựa cây là thành phần không mong muốn nên
cần đƣợc loại bỏ một cách triệt để.
Trong quá trình nấu bột giấy sunfat, một phần axit béo, axit nhựa tự do,
triglyxerit, steryl ester phản ứng với xút, đƣợc xà phòng hóa và tan vào trong
dịch nấu. Tuy nhiên, nhựa đã xà phòng hóa vẫn có thể kết hợp với các thành
phần nhựa không xà phòng hóa, rất dễ kết tủa tạo ra cặn nhựa trên bề mặt các
bộ phận của thiết bị trong dây chuyền khi điều kiện của quá trình sản xuất (độ
pH và nhiệt độ) thay đổi [6]. Hơn nữa, các hợp chất hữu cơ trong nhựa
thƣờng tƣơng tác với nhau và với các hóa chất trong quá trình nấu bột và làm
giấy, tạo ra cặn nhựa (pitch deposit). Cặn nhựa dính vào các lƣới lô rửa làm
giảm hiệu quả rửa bột giấy, gây đóng cặn ở các thiết bị chƣng bốc dịch đen,
nhất là thiết bị chƣng bốc màng rơi, làm giảm năng suất do phải dừng để rửa
thiết bị và tiêu tốn thêm nhiên liệu. Nhựa cây liên kết với lignin trong dịch
đen, kết thành mảng dày trên bề mặt bể, gây khó khăn cho công đoạn oxy hóa
dịch đen [7,8]. Mặt khác, các chất chiết nhựa này trong bột sau nấu và rửa vẫn
có thể bám trên xơ sợi, cản trở sự liên kết giữa các xơ sợi và làm giảm độ bền
của giấy trong quá trình xeo vì gây đứt giấy. Trong quá trình tẩy trắng bột
giấy, các chất nhựa này đƣợc tách ra và tích lũy trong nƣớc trắng, nhƣng dễ
kết hợp với các hóa chất khác (nhƣ cacbonat canxi) tạo thành các hạt màu đen
bám lên thành đƣờng ống, bể chứa và bề mặt của các thiết bị và có thể tạo
thành mảng lớn rơi vào dòng bột. Trong quá trình sản xuất bột giấy Kraft và
tẩy trắng bằng ClO2 có tới 80% axit béo của gỗ keo vẫn còn lƣu lại trong bột
giấy tẩy trắng, vì vậy có khả năng tạo cặn nhựa rất cao [9]. Cặn nhựa còn lại
trong bột sẽ làm giảm chất lƣợng của giấy sản phẩm nhƣ đốm đen, đứt gẫy
giấy, thủng, mỏng (ở vị trí có nhựa cây) và tạo ra vùng giấy không bám mực
khi in ấn [10]. Ở những nhà máy có mức độ tuần hoàn nƣớc sản xuất cao thì
vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng hơn. Nhƣ vậy, nếu không loại bỏ tối đa
đƣợc nhựa cây trong các giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu và nấu bột thì sẽ làm
giảm hiệu quả hoạt động của thiết bị, giảm chất lƣợng giấy và hiệu quả kinh
tế. Bên cạnh đó, trong nƣớc rửa bột, 20-70% độc tính đƣợc xác định là do các

8
axit nhựa từ nguyên liệu gỗ, rất khó bị phân hủy và thƣờng tạo thành các keo
tụ. Các hợp chất này và dẫn xuất của chúng, nhƣ dehydroabietin hay
tetrahydroretene, đƣợc xác định là rất độc hại cho động vật thủy sinh trong
các lƣu vực nhận dòng thải từ nhà máy.
Trong quá trình sản xuất bột giấy, nhựa cây tiếp tục đƣợc giảm thiểu
bằng hóa chất, làm tăng lƣợng hóa chất cần phải xử lý trong nƣớc tuần hoàn
và nƣớc thải. Nƣớc thải từ các nhà máy giấy và bột giấy có chứa nồng độ cao
lignin và các axit nhựa bị tích tụ từ quá trình xử lý hóa và cơ học của gỗ, và
lắng đọng lại trong nƣớc, gây ra ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Axit
nhựa (là một chất chiết xuất trong nhựa cây và có thể chiếm 0,2-0,8% tổng
trọng lƣợng của gỗ) trong nƣớc thải từ các nhà máy sản xuất bột giấy hóa học
là nguồn gây độc tính chính (chiếm 70% tổng số các chất gây độc) gây ảnh
hƣởng đến cá và các loài động vật thủy sinh khác [11].
Hiện nay, ngành sản xuất bột giấy và giấy đang chịu áp lực nặng nề do
yêu cầu giảm xả thải các hợp chất hữu cơ (axit béo, axit nhựa v.v.) có độc tính
cao vào môi trƣờng. Để hạn chế sự tạo cặn nhựa trong dây chuyền sản xuất
và giảm xả thải, cần phải loại bỏ đƣợc các hợp chất này trong nguyên liệu gỗ
trƣớc khi sản xuất bột giấy. Thông thƣờng, nhựa cây trong nguyên liệu đƣợc
loại bớt bằng cách lƣu giữ trên sân bãi từ 15 – 45 ngày trƣớc khi đƣa vào
nấu. Trong quá trình bảo quản, các axit béo và rƣợu béo sẽ bị thủy phân bởi
các yếu tố môi trƣờng, một số steryl este và sterol, các axit nhựa ester của
rƣợu béo và axit béo cũng đƣợc loại bỏ bởi vi sinh vật tạp nhiễm.
Ngoài ra, độ tuổi, mùa khai thác cũng quyết định hàm lƣợng nhựa trên
nguyên liệu. Thời gian bảo quản của nguyên liệu gỗ bạch đàn có tỷ lệ giảm hàm
lƣợng nhựa sau 03 tháng bảo quản cao nhất từ 56,5 % (5 tuổi) đến 72,2% (6
tuổi), nguyên liệu gỗ keo hàm lƣợng nhựa giảm sau 03 tháng bảo quản từ 55,2%
(6 tuổi) và 43% (7 tuổi). Mức giảm hàm lƣợng nhựa trung bình có trong nguyên
liệu giảm 10 – 20% sau 30 ngày bảo quản đối với các loại nguyên liệu, độ tuổi
cây và mùa khai thác. Hàm lƣợng nhựa có xu hƣớng tăng khi độ tuổi của cây
nguyên liệu tăng và mùa khai thác là một trong những yếu tố ảnh hƣởng rất quan
trọng đến hàm lƣợng nhựa trong nguyên liệu. Nguyên

9
liệu gỗ keo, bạch đàn khai thác vào mùa xuân có hàm lƣợng nhựa cao hơn so
với mùa hạ, mùa thu và mùa đông. Khai thác vào mùa thu và mùa đông hàm
lƣợng nhựa trong nguyên liệu (bạch đàn, keo) giảm từ 10 – 30% so với
nguyên liệu (bạch đàn, keo) khai thác vào mùa xuân. Hàm lƣợng nhựa trong
nguyên liệu khai thác vào mùa hạ giảm từ 1 – 5% so với nguyên liệu đƣợc
khai thác vào mùa xuân. Các phƣơng pháp giảm nhựa trên chủ yếu là giải
pháp tạm thời vì lƣợng nhựa giảm khá ít, hàm lƣợng nhựa giảm chủ yếu là
các axit béo dễ bị tác động bởi nhiệt độ, độ ẩm, các chất sterol este hầu nhƣ
không bị ảnh hƣởng nhiều. Không những thế, việc giảm nhựa bằng phƣơng
lƣu kho sẽ làm mất kiểm soát đối với sự phát triển và tác động của vi sinh vật
gây thất thoát cellulose ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy bị giảm sút
1.3. VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY
1.3.1. Nấm phân hủy nhựa cây
Nấm mốc
Nấm mốc có khả năng phân hủy các chất chiết trên nhựa nhƣng sự phát
triển trên gỗ kém hơn các loại nấm khác. Chúng phát triển tốt trên gỗ ƣớt
hoặc gỗ lƣu trữ ở độ ẩm cao trong thời gian dài. Đối với gỗ mềm nấm mốc
phát triển chủ yếu trên bề mặt, còn đối với gỗ cứng, mốc có thể xâm nhập vào
mô mềm hở hoặc tế bào vỡ, rồi phát triển trong khối gỗ. Nấm mốc phát triển
trên gỗ chủ yếu thuộc chi Penicillium, Trichoderma, Rhizopus và Aspergillus.
Tuy nhiên, sự phát triển của nấm mốc trên gỗ làm giảm chất lƣợng nguyên
liệu, do chúng phân hủy đồng thời cellulose.
Nấm dát gỗ
Một nhóm nấm túi nhỏ hay còn gọi là nấm dát gỗ, phát triển và xâm
nhập qua các tế bào nhu mô và kênh dẫn nhựa. Chúng gây ra sự thay đổi màu
sắc trên các mô nhựa do khả năng sinh sắc tố melanin trên sợi nấm [8] nhƣng
chúng lại có khả năng thủy phân môt số thành phần nhựa thành các chất hòa
tan trong nƣớc [12]. Do hầu hết các hợp chất lipophilic đều tích tụ và tập
trung ở các tia gỗ và kênh nhựa, nên nấm dát gỗ là ứng cử viên đầu tiên cho
việc sử lý nhƣa. Với khả năng xâm nhiễm nhanh trên cả nguyên liệu không
vô trùng, chúng có thể hạn chế sự phát triển của vi sinh vật tạp nhiễm và kiểm

10
soát sinh học cao [8]. Các loài nấm dát gỗ, đại diện là Ophiostoma,
Ceratocystis, Leptographium và Sphareopsis, sử dụng axit béo, triglycerid,
carbohydrat đơn giản, và các thành phần khác của gỗ [13]. Một số ít loài nấm
trong nhóm này không có khả năng sinh sắc tố melanin, còn đƣợc gọi là các
chủng nấm bạch tạng, các loài này thƣờng thuộc chi Ophiostoma nhƣ
Ophiostoma valdivianum, O. piliferum, Ophiostoma ainoae… có khả năng
giảm nhựa tốt, không gây biến đổi màu sắc của nguyên liệu và không gây ảnh
hƣởng đến các thành phần chính của gỗ nhƣ cellulose, lignin và phân hủy
nhẹ hemicellulose. Hiện nay, loài O. piliferum đã đƣợc ứng dụng trong sản
suất chế phẩm Cartapip 97, là sản phẩm của công ty Parrac Ltd. (New
Zealand) dùng trong xử lý nguyên liệu gỗ thông. Chế phẩm Cartapip 97 có
khả năng loại bỏ 60% sterol tự do trên gỗ mềm, tuy nhiên, hiệu quả trong việc
loại bỏ nhựa trên gỗ cứng còn hạn chế [14,15].
Nấm đảm (basidiomycetes)
Nấm đảm loài loài nấm lớn có khả năng hình thành quả thể trong điều
kiện tự nhiên. Ở giai đoạn sinh dƣỡng, các loài nấm đảm phát triển thành
dạng sợi bám sát bề mặt hoặc ăn sâu vào trong thân gỗ. Giai đoạn sinh sản,
chúng hình thành các bào tử đảm chứa trong những thân hình dùi gọi là đảm
(quả thể). Các loài nấm mục trắng (white-rot fungi), nấm mục nâu (brown-rot
fungi) và nấm mục mềm (soft-rot fungi) đều thuộc ngành nấm đảm, chúng có
khả năng phát triển nhanh trên gỗ. Một số loài nấm đảm có khả năng phân
hủy các hợp chất nhựa, lignin.
Nấm mục nâu phân hủy gỗ khá mạnh, chúng ƣu tiên phân hủy
polysaccharide, phân cắt mạch cellulose do đó làm giảm mức độ trùng hợp
của mạch sợi và làm suy giảm hàm lƣợng cellulose đáng kể nên chúng
thƣờng không đƣợng sử dụng trong vẫn đề loại nhựa trên gỗ.
Các loài nấm mục mềm thƣờng ƣu tiên phân hủy carbohydrate trong
thành tế bào gỗ mềm và gỗ cứng. Nấm tấn công từ trên bề mặt gỗ, làm cho
các lớp ngoài có màu đen hoặc đen xám, trơn mềm và bị nứt ngang thớ khi gỗ
khô. Chúng lấy Nitơ cố định từ gỗ hoặc môi trƣờng xung quanh để sinh tổng

11
hợp enzym. Trong tự nhiên, nấm mục mềm phân hủy gỗ kém hơn nấm mục
trắng.
Nấm mục trắng đƣợc biết đến là những tác nhân phân hủy lignin mạnh
trong điều kiện tự nhiên nhờ có hệ enzym oxy hóa mạnh và tính đặc hiệu cơ
chất thấp. Một số loại nấm mục trắng phân hủy lignin và hemicellulose nhƣng
không gây thất thoát cellulose. Ngoài ra một số loài nấm mục trắng còn có
khả năng phân hủy các chất chiết nhựa trong cả gỗ mềm và gỗ cứng [8]. Theo
một báo cáo về sự phân hủy hợp chất nhựa, nấm mục trắng có khả năng loại
bỏ hoàn toàn triglyceride, chất béo, axit, este sterol và sáp trong gỗ thông,
thậm chí cả sterol và axit nhựa cũng bị phân hủy mạnh [8]. Nấm mục trắng và
hệ enzym của chúng là chất xúc tác sinh học mạnh hơn có khả năng loại lipid
khó phân hủy. Nhờ có hệ enzym oxi hóa mạnh nhƣ esterase, laccase, lignin
peroxidase, magan peroxidase, lipase,… nấm mục trắng vừa có khả năng phân
hủy đƣợc nhựa cây vừa loại bỏ lignin còn tồn dƣ. Do đó hỗ trợ hiệu quả cho
quá trình tẩy trắng bột giấy hoàn toàn không chlorine (TCF) [16]. Nhựa cây
gây ra sự ức chế khả năng phát triển của nhiều loài nấm trên gỗ. Tuy nhiên,
nhiều loài nấm mục trắng có khả năng chịu độc tố của chất chiết nhƣ
Bjerkandera sp. và Trametes versicolor. Kết quả phân tích gỗ đã ủ với các
chủng Bjerkandera sp. và Trametes versicolor cho thấy lƣợng chất chiết béo
giảm tới 90%, đồng thời độc tố giảm từ 7-17% [8]. Nấm Trametes versicolor
làm giảm 40% axit nhựa, 100% các triglycerides và làm giảm độc tố trong
môi trƣờng nƣớc của gỗ Vân Sam sau 4 tuần nuôi ủ [17]. Thậm chí, một số
loài nấm mục trắng có thể loại bỏ hoàn toàn các chất chiết chính trong gỗ
bạch đàn. Nấm Phlebia và Ceriporiopsis có thể phân hủy hoàn toàn các sterol
tự do và sterol ester hóa, vốn là những thành phần rất phổ biến trong gỗ bạch
đàn.
Ngoài ra, một số chủng nấm men nhƣ Trichosporon pullulans,
Cryptococcus albidus, Sporobolomyces salmonicolor và Debaryomyces
occidentalis var. occidentalis đã loại đƣợc 60% nhựa cây gỗ thông, chủ yếu
là các axit nhựa, steryl este và triglyceride [8].

12
1.3.2. Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa cây.
Trong tự nhiên, bên cạnh các loài nấm phân hủy gỗ và các chất chiết trong
cây, còn có nhiều loài vi khuẩn và xạ khuẩn trong đất, trong nƣớc thải nhà máy
giấy và đống ủ compost cũng có khả năng phân hủy nhanh các axit nhựa. Chúng
có tốc độ phát triển nhanh hơn nấm, nhiều loài có khả năng tạo bào tử và chịu
đƣợc nhiệt độ cao nên dễ dàng sử dụng trong công nghiệp [18].
Vi khuẩn phân hủy nhựa cây.
Vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa cây đã đƣợc chứng minh, mặc dù
số lƣợng công bố là ít hơn so với nấm. Một số có khả năng sinh tổng hợp
nhiều loại enzym và sinh trƣởng trên các loại gỗ có chất chiết với nồng độ
axit nhựa cao. Một số vi khuẩn phân lập từ đất, gỗ và các nguồn nƣớc tự
nhiên nhƣ Arthrobacter sp., Alcaligenes eutrophus, Pseudomonas sp., và
Flavobacterium resinovorum đều có khả năng phát triển trên axit
dehydroabietic nhƣ nguồn carbon duy nhất. Một số vi khuẩn Gr (-) cũng có
khả năng phân hủy các axit nhựa khác nhau trong gỗ cũng đã đƣợc công bố
nhƣ chi Sphingomonas Cornamonas, Alcaligenes và Pseudomonas... Hơn
75% axit nhựa đã bị phân hủy trong vòng 8 ngày bởi Sphingomonas sp. và Z.
ramigera. Chi Sphingomonas sp. có thể sử dụng nhiều loại cacbon thƣờng
thấy trong nƣớc thải của nhà máy bột giấy và có thể phát triển trên axit nhựa
nhanh hơn trên glucose. Các loài Pseudomonas đã đƣợc công bố là có thể
phát triển trên nguồn carbon duy nhất là axit isopimaric. Ngoài ra, chúng có
thể phát triển trên axit pimaric và dehydroabietic và axit abietic. Trong một số
nghiên cứu về các vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải sản xuất bột giấy kraft, hai
trong số 9 vi khuẩn phân lập có thể phân hủy trên 50% axit dehydroabietic (ở
nồng độ ban đầu là 40 pg mL-l) trong vòng 24 giờ. Các vi khuẩn còn lại có
khả năng phân hủy khoảng 30% axit dehydroabietic trong cùng khoảng thời
gian. Tuy nhiên, các loài vi sinh vật khác nhau thì khả năng phân hủy các
thành phần axit nhựa là khác nhau [11].
Theo Burnes và cộng sự (2000) tiền xử lý gỗ thông không cần khử trùng
với các chủng P. fluorescens NRRL B21432 và Pseudomonas sp. UM-74 đã
làm giảm 40 và 34%, tƣơng ứng chất chiết nhựa trên các loại dăm mảnh tƣơi.

13
Trong đó, các axit nhựa giảm 25% và các axit béo giảm 36%, tƣơng tự khi xử
lý dăm mảnh gỗ với các chủng nấm bạch tạng. Bên cạnh đó, sử dụng các
chủng vi khuẩn làm giảm hàm lƣợng các chất chiết trong gỗ trƣớc khi sản
xuất bột giấy dẫn đến giảm các vấn đề về nhựa trong suốt quá trình sản xuất
giấy và giảm nồng độ các axit nhựa trong dòng thải [19]. Các vi sinh vật này
có tiềm năng ứng dụng cao do có khả năng chịu nhiệt, sinh trƣởng và phát
triển trong môi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm mà nấm phân hủy gỗ không
sinh trƣởng đƣợc. Bên cạnh đó, sử dụng vi khuẩn có thể mang lại hiệu quả
cao do khả năng phát triển nhanh trên gỗ không cần khử trùng và lấn át đƣợc
sự phát triển của các loài nấm tạp nhiễm.
1.3.1.3. Xạ khuẩn phân hủy nhựa cây.
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, G(+), phân bố rộng rãi trong tƣ
nhiên (đất, nƣớc) tham gia vào quá trình chuyển tự nhiên của nhiều hợp chất
có trong đất. Xạ khuẩn có hệ enzym phân hủy giúp làm giảm các hợp chất
hữu cơ có trong thực vật (axit nhựa, lignin) và chitin. Xạ khuẩn có khả năng
sinh enzym phân hủy nhựa cây nhựa esterase, lipase, một số chủng xạ khuẩn
nhƣ Streptomyces griseus, Streptomyces cyaneus, Streptomyces coelicolor,
Streptomyces ipomoea, Streptomyces sviceus, Streptomyces sp. còn có khả
năng sinh laccase phân hủy các hợp chất vòng nhân thơm, cắt đứt các liên kết
este có trong thành phần nhựa cây. Cấu trúc của enzym laccase trong xạ
khuẩn có điểm rất khác so với nấm và vi khuẩn. Thay vì cấu trúc 3 miền
enzym laccase trọng xạ khuẩn chỉ có cấu trúc 2 miềm nên đƣợc gọi là laccase
nhỏ [20].
Trong một số nghiên cứu cho thấy, xạ khuẩn có khả năng sinh trƣởng
nhanh và thích nghi tốt với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Khi nhiệt độ
tăng cao xạ khuẩn hình thành nên các thể bào tử để thích nghi tốt hơn với điều
kiện môi trƣờng. Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trƣởng trên môi
trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm mà một số loài nấm phân hủy khó có thể phát
triển đây đƣợc xem nhƣ tiềm năng ứng dụng cao do của xạ khuẩn. Bên cạnh
đó, với khả năng phát triển nhanh trên gỗ, và sinh một số hoạt chất kháng

14
khuẩn, kháng nấm, xạ khuẩn có thể át đƣợc sự phát triển của các loài nấm tạp
nhiễm mà không cần khử trùng.
1.3.3. Hệ enzym phân hủy nhựa cây.
1.3.2.1. Esterase
Các esterase sterol (EC 3.1.1.13) là các hydrolases đƣợc tìm thấy trong
vi khuẩn, nhƣ Pseudomonas aeruginosa, nấm men, Candida rugosa và nấm
dát gỗ thuộc chi Ophiostoma, Melanocarpus albomyces, Trichoderma sp.
Chúng có khả năng phân cắt các ester của Sterol và axit béo chuỗi dài. Trong
một số nghiên cứu cho rằng các enzyme esterase sterol từ P. aeruginosa, C.
rugosa, M. albomyces, hoặc O. piceae, cũng có khả năng thuỷ phân các chất
lipase điển hình và carboxylesterase điển hình [21]. Enzyme tiết ra bởi O.
piceae là một chất xúc tác sinh học mạnh mẽ có khả năng thủy phân hỗn hợp
tinh khiết hoặc tự nhiên của este sterol có trong gỗ cứng và mềm, liên quan
đến sự hình thành các chất lắng không mong muốn trong quá trình sản xuất
bột giấy sản xuất giấy, nhƣng nó cũng là một chất xúc tác sinh học hiệu quả
trong phản ứng tổng hợp để tạo ra estrogen phytosterol, hợp chất đƣợc công
nhận để làm giảm LDL cholesterol [21].
Sterol esterase có khối lƣợng phân tử 56,5 kDa, điểm đẳng điện là 3,3,
phạm vi pH hoạt động 6 – 8 , pH tối ƣu từ 6,2 – 7, nhiệt độ thích hợp 37 o
C
[22]. Khi có cơ chất, sterol esterase sẽ thủy phân cắt các liên kết ester theo
phản ứng
Sterol esterase
este steryl + H2O sterol + axit béo.
Esterase thủy phân các liên kết ester của ester acyl tan trong nƣớc và
glycerolester đƣợc nhũ hóa với các nhóm acyl chuỗi ngắn (≤C8 [23]. Esterase
thuộc nhóm siêu cấu trúc α /-hydrolase với các chuỗi song song chúng đƣợc
bao quanh bởi các kết nối xoắn ốc. Enzyme này cũng chứa một bộ ba xúc tác
đƣợc tạo thành từ dƣ lƣợng serine, histidine và aspartate / glutamate trong
chuỗi polypeptide; dƣ lƣợng serine của enzym nằm ở trung tâm của chuỗi

15
trình tự pentapeptide có tính bảo tồn gồm Gly-X-Ser-X-Gly, trong đó X có thể
là bất kỳ axit amin nào [24].
Sterol esterase có tính đặc hiệu cơ chất thấp, ngoài việc tham gia phân
cắt este sterol chúng còn tham gia thủy phân chất béo trung tính và p-
nitrophenyl khác nhau. Tuy nhiên, khả năng thủy phân este sterol là đƣợc coi
là một đặc điểm điển hình của nhóm này [8]. Trong xử lý nhựa cây trong dăm
mảnh, Sterol esterase tham gia vào quá trình phân cắt este các axit nhựa,
Stigmasterol, Steryl este và sterol, các gốc rƣợu béo, axit béo, triglyceride,…
thành các nhóm acyl chuỗi ngắn dễ thủy phân.
Esterase đã đƣợc công nhận là chất xúc tác sinh học hữu ích vì sự linh
hoạt của chúng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp các ứng dụng, bao gồm việc
sử dụng chúng trong chất tẩy rửa hoặc nhƣ chất phụ gia trong ngành công
nghiệp thực phẩm (Harwood 1989, Jaeger và Reetz 1998) [25].
1.3.2.2. Lipase
Lipase (EC 3.1.1.3) thuộc nhóm Enzyme lipolytic (EC 3.1.1.-), phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là một nhóm hydrolase đa dạng xúc tác cho sự phân
tách hoặc hình thành liên kết ester [26]. Lipase đƣợc tìm thấy ở một số loài vi
khuẩn Pseudomonas euruginosa, Staphylococcus hyicus, Bacillus
stearothermophilus, Geobacillus zalihae,… [27].
Khác với esterase tham gia vào phân cắt acyl chuỗi ngắn thì lipase lại
tham gia vào quá trình thủy phân các este acyl không tan trong nƣớc và chất
nền nhũ hóa với các nhóm acyl chuỗi dài [24]. Lipase xúc tác quá trình thủy
phân triacylglycerol thành glycerol và axit béo tự do dƣới dạng lipid-nƣớc,
trong đó chất nền lipolytic là trạng thái cân bằng giữa monomeric, micellar và
nhũ hóa [28]. Hai tiêu chí đƣợc sử dụng để nhận biết lipase thực sự là sự xuất
hiện nhũ tƣơng khi thủy phân triglyceride hoặc nó phải tạo vòng kết tủa bề
mặt tại vị trí hoạt động của enzyme. Quá trình thủy phân glycerolester có
chiều dài chuỗi acyl <10 nguyên tử carbon với Tributyrylglycerol (Tributyrin)
làm chất nền tiêu chuẩn thƣờng cho thấy sự có mặt của các ester [29]. Mặc dù
vai trò sinh lý của nhiều lipase ở vi sinh vật vẫn chƣa rõ ràng, nhƣng ở vi

16
khuẩn, hầu hết các lipase là các enzyme ngoại bào đƣợc tiết ra và thực hiện
các phản ứng phân hủy các hợp chất lipid [26]. Ngày nay, Lipase đã đƣợc
thƣơng mại hóa bởi Novozymes A / S (Bagsvaerd, Đan Mạch). Chế phẩm
thƣơng mại này có tên gọi là Resinase A2X đƣợc sử dụng thành công ở quy
mô nhà máy để kiểm soát nhựa trong nghiên bột cơ ở Nhật Bản. Ở châu Âu,
Lipase đƣợc dùng trong các thử nghiệm loại bỏ chất chiết trong quá trình sản
xuất bột giấy sunfit từ gỗ mềm cũng mang lại những kết quả đầy hứa hẹn.
1.3.2.3. Laccase
Laccase (p- benzenediol:oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) đƣợc tìm
thấy trong một số loài vi khuẩn Bacillus tequilensis [30], B. subtilis, E. coli
[31], xạ khuẩn S. griseus [32], nấm T. versicolor, Phlebia fascicularia, P.
floridensis, D. squalens, …
Laccase (Lac) thuộc nhóm enzym oxidase (polyphenol oxidase). Phân tử
laccase thƣờng là monomeric protein (chỉ một số là oligomeric protein) có
khối lƣợng phân tử dao động trong khoảng 32 – 90 kD, hoạt động tối thích ở
phổ pH từ 4 – 6, bền ở nhiệt độ 30o
C – 50o
C và nhanh chóng mất hoạt tính ở
nhiệt độ trên 60o
C.
Laccase tham gia các phản ứng xúc tác trùng hợp các monome, phân hủy
polyme và oxy hóa các hợp chất phenolic. Laccase có thể tác động lên các
hợp chất không phenol bằng cách sử dụng các chất trung gian, trải qua chu
trình oxy hóa - khử, do đó, chuyển các electron giữa hợp chất không phenol
và enzyme. Các hệ thống trung gian laccase (LMS) này đã đƣợc sử dụng
trong một số quy trình bao gồm phân lớp bột giấy và oxy hóa các chất ô
nhiễm hữu cơ. Bên cạnh việc đƣợc sử dụng thƣơng mại trong tẩy trắng,
laccase cũng đã đƣợc áp dụng trong việc khử màu và biến đổi thuốc dệt
nhuộm và xử lý ô nhiễm môi trƣờng do thuốc nhuộm [33]. Trong nghiên cứu
của Gutie hungrrez, 2006, laccase từ nấm Pycnoporus cinnabarinus đã loại bỏ
95 – 100% sterol liên hợp khi nấu bột từ gỗ bạch đàn theo chu trình Kraft, 65
-100% triglyceride, axit nhựa và sterol từ cây vân sam (bột giấy TMP) và 40 -
100% rƣợu béo, ankan và sterol [8]. Việc loại bỏ lipid bằng cặp laccase-HBT
là hiệu quả, tổng hàm lƣợng lipid của bột giấy giảm đáng kể, và nhiều hợp

17
chất béo đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn. Trong nghiên cứu bổ sung laccase vào
trong quá trình tẩy trắng bột giấy từ gỗ bạch đàn, các sitosterol tự do và liên
hợp đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn và độ sáng của bột giấy cũng đƣợc cải thiện
do đã loại bỏ đƣợc lignin [34]. Khảo sát các chất chiết nhựa trong cả gỗ cứng,
gỗ mềm và bột giấy phi gỗ, sau 2 giờ xử lý với laccase-HBT các hợp chất axit
abietic, trilinolein, axit linoleic và oleic, sitosterol, cholesteryl palmitate,
oleate, linoleate đã giảm 60% đến 100%, các lipit không bão hòa giảm 20 -
40% và axit abietic giảm 95% so với ban đầu, các cholesteryl palmitate và
sitosterol không bị ảnh hƣởng [35].
Cho đến nay, chỉ có Laccase nấm có liên quan đến một số ngành công
nghiệp, tuy nhiên chúng lại bị một số nhƣợc điểm, nhƣ thiếu biểu hiện chức
năng hoặc hiệu quả trong các vật chủ dị hợp, thời gian lên men tƣơng đối dài
và năng suất tƣơng đối thấp. Laccase từ vi khuẩn thích hợp cho biểu hiện dị
thể ở E. coli, enzyme có thể dễ dàng đƣợc điều chỉnh bằng cách sử dụng các
kỹ thuật mới [36]. Dựa trên các đặc tính bên trong của Laccase từ vi khuẩn,
các enzyme này có tiềm năng lớn làm chất xúc tác sinh học cho các phản ứng
oxy hóa, vì chúng hoạt động trong dung môi nƣớc ở pH trung tính đến pH cơ
bản, ổn định nhiệt độ, độc lập với cofactor và ít sản phẩm phụ [37].
1.3.4. Cơ chế phân hủy lignin và các chất chiết trong gỗ
Cơ chế phân hủy lignin và các chất chiết trong gỗ của các loài vi sinh vật
là dựa vào khả năng chúng sinh trƣởng và phát triển trong các tế bào gỗ, tấn
công vào các kênh dẫn nhựa, ống nhựa, tế bào nhu mô. Trong quá trình phát
triển, chúng sinh tổng hợp các enzym phân hủy lignin và chất chiết nhựa, nhờ
đó chúng xâm nhập sâu vào các tế bào gỗ. Sự xâm nhập và làm rỗng một phần
tế bào gỗ bị bít bởi các hợp chất nhựa và làm thay đổi thành tế bào gỗ nhƣ
cellulose, hemicellulose, lignin và làm yếu các liên kết này, từ đó tạo điều
kiện cho hóa chất nấu thẩm thấu dễ dàng vào nguyên liệu. Vì vậy, việc sử
dụng các chủng vi sinh vật trong tiền xử lý gỗ sẽ giúp giảm lƣợng nhựa, giảm
hóa chất nấu, thời gian nấu, tăng độ trắng của giấy, giảm năng lƣợng nghiền
và toàn bộ quá trình sản xuất hiệu quả hơn [38,39]. Bên cạnh đó, sự giảm
lƣợng nhựa và chất béo trong quá trình tiền xử lý nguyên liệu cũng sẽ làm

18
giảm lƣợng nhựa bị clo hóa và axit béo tạo ra trong quá trình tẩy trắng bột
giấy và làm giảm các dẫn xuất clo khó phân hủy hơn trong nƣớc thải [38].
Nấm mục trắng sinh ra một số loại enzyme peroxidase chứa nhân heme
có chức năng khởi phát quá trình phân hủy lignin. Trƣớc đây, khi chƣa phát
hiện đƣợc những dạng đồng đẳng với các enzyme nói trên ở vi khuẩn thì
dƣờng nhƣ nhóm peroxidase phân hủy lignin thuộc liên họ (superfamily)
peroxidase của thực vật chỉ thấy có ở nấm bậc cao. Tuy nhiên, những nghiên
cứu gần đây cho thấy vi khuẩn sản sinh khá nhiều enzyme thuộc loại
peroxidase khác, đƣợc gọi là peroxidase khử màu thuốc nhuộm (EC
1.11.1.19), viết tắt là DyPs [40]. DyPs là nhóm enzyme peroxidase chứa nhân
heme mới đƣợc phát hiện và đƣợc chú ý bởi chúng có khả năng phân hủy
lignin và nhiều hợp chất khác. Năm 1988 enzym này đƣợc phát hiện từ
Streptomyces viridosporus và năm 1999 ở Bjerkandera adusta. Gần đây, rất
nhiều enzyme DyPs của vi khuẩn đã đƣợc mô tả, cho thấy rằng vi khuẩn có
nguồn gen rất phong phú mã hóa cho DyPs. Tuy có cấu trúc phân tử khác với
peroxidase của nấm, nhƣng DyPs của vi khuẩn lại có những điểm tƣơng tự
nhƣ của nấm, đó là sự tiết enzyme ra ngoài tế bào bằng cơ chế Tat (Twin
Arginine Translocation) và đặc tính xúc tác. Enzyme DyP ở vi khuẩn và xạ
khuẩn có phổ cơ chất rộng, bao gồm một số nhóm thuốc nhuộm tổng hợp, các
hợp chất monophenol, veratryl alcohol, carotene, Mn+2
và hợp chất lignin.
Gần đây, một số peroxidase kiểu DyP của vi khuẩn đƣợc ứng dụng để phân
hủy lignin và những hợp chất giống lignin [41, 42]. Bên cạnh đó, một số
enzyme DyP của vi khuẩn, nhƣ Pseudomonas fluorescence Pf-5 lại có hoạt
tính đối với lignin Kraft kiềm. Enzyme vi khuẩn bền nhiệt và chịu kiềm
SviDyP đã đƣợc ứng dụng thành công trong khử màu của bột giấy Kraft bạch
đàn [41]. DyPB, một peroxidase của vi khuẩn phân hủy lignin từ
Rhodococcus jostii RHA1, có gốc Asn246 đƣợc thay thế bằng alanine
(N246A), có hoạt tính biến đổi kraft lignin của gỗ cứng và các phân đoạn
chiết trong dung môi, tạo thành 2 sản phẩm chính là 2,6-
dimethoxybenzoquinone and 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde [43].

19
Laccase (EC 1.10.3.2) là nhóm enzyme oxidase có chứa 4 ion đồng ở
tâm heme, có chức năng oxi hóa các hợp chất hữu cơ thành các gốc tƣơng
ứng, sau đó các gốc này đƣợc oxi hóa hoặc chuyển hóa tiếp. Laccase rất phổ
biến trong tự nhiên, có ở trong thực vật, nấm, vi khuẩn và côn trùng. Laccase
có trọng lƣợng phân tử và cấu trúc khác nhau tùy theo xuất xứ của chúng
[44]. Nhóm enzyme này thƣờng là ngoại bào, xúc tác các phản ứng polymer
hóa hoặc phân giải polymer [45]. Tƣơng tự laccase của nấm, nhiều loại
laccase của vi khuẩn cũng đƣợc tiết ra ngoài tế bào nhờ hệ thống Tat. Tuy
nhiên, khác với nhóm enzyme oxy hóa-khử, phản ứng xúc tác của laccase
không cần có cofactor. Và cũng khác với nhóm enzyme oxy hóa, phản ứng
không tạo ra H2O2. Trƣớc đây, những enzyme của nhóm laccase đƣợc phát
hiện, nghiên cứu và ứng dụng trong phân hủy lignin đều có nguồn gốc từ nấm.
Tuy vậy, những năm gần đây thì laccase của vi khuẩn đƣợc chú ý hơn vì tiềm
năng của chúng trong phân hủy lignin và nhiều ứng dụng khác. Trong tự
nhiên, trong quá trình phân hủy lignocellulose, vai trò của laccase của vi
khuẩn là làm thay đổi đặc tính của lignin để cho các hệ enzyme khác tiếp cận
cellulose và hemicellulose.
Laccase của vi khuẩn đầu tiên đƣợc phát hiện ra năm 1995, nhƣng tới
nay đã có một số lƣợng lớn laccase của vi khuẩn đƣợc xác định [40, 44, 46,
47], đồng thời vai trò và hiệu quả của chúng trong phân hủy lignin đang đƣợc
đẩy mạnh nghiên cứu [48]. Laccase của vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất
là ở xạ khuẩn, đặc biệt là các loài Streptomyces (Fernandes et al., 2014) nhƣ
Laccase chịu mặn (SilA) của chủng S. ipomoea CECT 3341, và 4 laccase từ
Streptomyces (S. coelicolor A3(2), S. lividans TK24, S. viridosporus T7A) và
Amycolatopsis sp. 75iv2. Những enzyme này có độ ổn định hoạt tính cao
trong dải pH rộng từ 3-10, là những tác nhân xúc tác tiềm năng trong công
nghiệp giấy.
Thông báo đầu tiên về ứng dụng laccase của vi khuẩn trong sản xuất bột
giấy và giấy là trƣờng hợp của chủng siêu chịu nhiệt Thermus thermophilus.
Laccase tái tổ hợp của chủng này đƣợc dùng để tẩy trắng bột giấy từ rơm lúa
mỳ, làm tăng độ sáng lên 3.3% ISO và giảm chỉ số kappa 5,6 U, giảm 25%

20
lƣợng dùng H2O2 trong công đoạn tẩy trắng tiếp theo. Khi bổ sung 5 mM
ABTS thì độ sáng tăng thêm 1,5% ISO mà không ảnh hƣởng tới xơ sợi [49].
Các loài Bacillus sinh ra laccase chịu nhiệt độ cao và môi trƣờng kiềm, tuy
nhiên đa số là enzyme nội bào. Laccase ngoại bào đƣợc phát hiện ở chủng B.
tequilensis SN4 đƣợc phân lập từ nƣớc thải của nhà máy bột giấy [30].
Enzyme của chủng này có nhiệt độ tối ƣu ở 80-90 o
C, thậm chí còn một phần
hoạt tính ở 100 o
C, và pH tối ƣu là 8 và độ ổn định hoạt tính cao. Laccase của
chủng này làm giảm 28% chỉ số kappa và tăng độ sáng của bột giấy lên 7,6%.
Khi bổ sung một lƣợng nhỏ (2 mM) chất hỗ trợ N-hydroxybenzotriazole
(HBT) thì hiệu quả tăng lên rõ rệt.
Ngoài ra, một số enzyme của vi khuẩn nhƣ etherase phụ thuộc
glutathione, superoxide dismutase và dioxygenase cũng có vai trò trong biến
đổi/ phân hủy lignin và các hợp chất hữu cơ khác trong nhựa cây. Năm 2013,
một enzyme ngoại bào đặc biệt đƣợc phát hiện ở Streptomyces, có một vùng
dioxygenase và một vùng gắn lignin [40]. Enzyme này có hoạt tính nhƣ
dioxygenase đối với một số dẫn suất của catechol, đồng thời lại có ái lực đối
với một số phân tử lignin tổng hợp.
Nhìn chung, vai trò của nấm trong phân hủy lignin và các hợp chất hữu
cơ trong nhựa cây đã đƣợc nghiên cứu từ nhiều thập kỷ và ứng dụng có hiệu
quả. Vi khuẩn, xạ khuẩn tuy không có hệ enzyme peroxidase thông thƣờng
nhƣ ở nấm, nhƣng lại có hệ enzyme rất phong phú và đa dạng, bao gồm
những enzyme đã biết nhƣ DyP, laccase, etherase, dismutase, dioxygenase, và
còn nhiều enzyme chƣa đƣợc phát hiện. Tất cả đều tham gia vào quá trình
biến đổi phân tử lignin và phân hủy các axit béo, axit nhựa và các hợp chất
hữu cơ khó phân hủy khác trong nhựa cây. Vi khuẩn có lợi thế hơn nấm mục
trắng ở chỗ có thể nhanh chóng phát triển sau khi cấy vào nguyên liệu gỗ nên
giảm nguy cơ gỗ bị nhiễm các vi sinh vật không mong muốn khác. Bên cạnh
đó, vi khuẩn và xạ khuẩn có thể phát triển trong điều kiện có nồng độ oxy
thấp mà nấm không phát triển đƣợc. Và cộng đồng hỗn hợp vi khuẩn sẽ có
khả năng phân hủy lignin và các hợp chất trong gỗ tốt hơn các loài riêng lẻ.
Do đó, việc tìm kiếm và phối hợp các chủng vi sinh vật trong tiền xử lý dăm

21
mảnh nguyên liệu gỗ sản xuất bột giấy và giấy sẽ khiến cho giải pháp này
càng trở nên khả thi và hiệu quả hơn trong thực tiễn sản xuất. Đây là một
hƣớng giúp cho sản xuất an toàn mà không cần đầu tƣ lớn cho các nhà máy
hiện hành.

22
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu.
Các mẫu VSV đƣợc phân thập từ các mẫu mùn đất, dăm gỗ thu thập
xung quanh nhà máy giấy Bãi Bằng - Tổng Công ty Giấy Việt Nam, huyện
Phù Ninh, tỉnh Phú Thọ.
2.1.2. Thiết bị
- Kính hiển vi quang học Olympius (Model CHD, Nhật Bản).
- Máy đo pH (Metter Toledo, Thụy Sỹ).
- Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản)
- Tủ ấm vô trùng, tủ sấy Memmert (Trung Quốc)
- Cân điện tử (Metteler Toledo, Thụy Sỹ)
- Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc)
- Bốc vô trùng Nuaire (Mỹ)
- Máy ly tâm Hettich (Đức)
- Pipet, máy sấy, đĩa petri, ông đong, bình thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml,
1000ml, ống falcon, ống eppendorf 1,5 ml...
- Các dụng cụ khác...
2.1.3. Hóa chất
Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose...
của hãng Merck (Đức) và Trung Quốc.
- Các loại muối: K2HP)4, MgSO4.7H2O,NaH2PO4, Na2HPO4, CaCl2,
FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, (NH4)2 SO4, CaCO3, MnCl2,
Na2SO3,ZnCl2, Tris HCl, Tris Base, EDTA, Isomylalcohol, chloroform,
isopropanol, glacial acetic acid, ethidium bromide, agarose... có xuất sứ từ
Đức Đức và Trung Quốc có độ tinh khiết cao.
- Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone, p -nitrophenyl butyrate (p-
NPB) (Merck), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)
(ABTS), 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA), agar, tinh bột tan, casein,

23
Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Carboxymethyl Cellulose (CMC) của
Nhật, Trung Quốc.
- Các hóa chất khác đƣợc sử dụng trong thí nghiệm có độ tinh khiết cao và
đảm bảo sử dụng trong phân tích.
2.1.4. Môi trƣờng
Môi trƣờng phân lập (g/l): NaNO3: 3g, K2HPO4: 1g, MgSO4.7H2O:
0,5g KCl: 0,5g, FeSO4.7H2O: 0,01g. pH=7,0. Bổ sung 100mg stigmasterol.
MT1 (g/l) Môi trƣờng giữ và nhân giống (môi trƣờng Bennet): Cao
nấm men: 1g Cao thịt: 1g, casein thủy phân: 2g, Glucose: 10g, CoCl2.6H2O:
0.01g, thạch: 18g, pH=7.
MT2 (g/l): Môi trƣờng khoáng NaNO3: 3g, K2HPO4: 1g,
MgSO4.7H2O: 0,5g KCl: 0,5g, FeSO4.7H2O: 0,01g, 0,2% pepton, 0,5%
glucose và 0,5% chất chiết nhựa cây.
MT3 (ISP2) (g/l): Môi trƣờng nhân giống và xác định đặc điểm sinh
học Glucoza: 10g, Cao nấm men: 4g, Cao Malt: 4g, pH=7.
MPA (g/L) (Meat-peptone agar): cao thịt 3,0; pepton 5,0. pH 7,0.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Chuẩn bị chất chiết nhựa cây
Chất chiết nhựa đƣợc tách từ dăm gỗ nghiền theo phƣơng pháp chiết
trong aceton. Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện nhƣ mục 2.2.7. Nhựa cây
sau khi làm bay hơi aceton sẽ đƣợc thu hồi và dùng cho các mục đích thí
nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa.
Mẫu mùn thu thập từ nhà máy giấy Bãi Bằng đƣợc pha loãng đến nồng
độ thích hợp theo phƣơng pháp pha loãng tới hạn và trang đĩa trên môi
trƣờng khoáng có bổ sung stigmasterol làm nguồn cơ chất. Các đĩa phân lập
đƣợc ủ ở 37oC và 45ºC trong 3 ÷ 5 ngày. Tách và làm sạch các chủng VSV
xuất hiện trên đĩa.

24
Xác định sự phát triển của vi sinh vật trên stigmasterol lỏng: Các chủng
VSV đƣợc nuôi cấy trên các ống nghiệm lỏng chứa 5 ml môi trƣờng phân lập.
Sau 48 giờ nuôi cấy tiến hành kiểm tra khả năng phát triển của các chủng.
Những chủng không phát triển trên môi trƣờng sẽ đƣợc loại bỏ.
Xác định khả năng sinh tổng hợp lipase (phương pháp định tính): là
phƣơng pháp thử nghiệm kết tủa sử dụng môi trƣờng thạch có chứa Tween
20 để xác nhận hoạt động lipolytic. Môi trƣờng xác định sự có mặt của lipase
(g/L); 10g peptone, 5g NaCl 2; 0,1g CaCl2. 2H2O, 20g agar và 10ml (v/v)
tween 20. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc kết tủa muối canxi. Sự thủy
phân của tween 20 sẽ giải phóng các axit béo liên kết với canxi trong môi
trƣờng để tạo thành các tinh thể không hòa tan xung quanh điểm tiêm chủng.
Các sinh vật đƣợc cấy vào các đĩa và đƣợc ủ ở 37°C trong 2 - 4 ngày. Một
lƣợng kết tủa sẽ xuất hiện xung quanh khuẩn lạc cho thấy dấu hiệu hoạt động
của lipase [50].
Kiểm tra khả năng phân giải cellulose: Các vi sinh vật chọn lọc đƣợc ở
trên đƣợc kiểm tra khả năng phân hủy Cellulose bằng kiểm tra vòng phân hủy
trên môi trƣờng thạch chọn lọc. Cấy chấm điểm các chủng vi sinh vật trên đĩa
Petri chứa 1% CMC và 1% tinh thể cellulose trên môi trƣờng khoáng phân
lập. Các chủng phân lập tạo thành vòng phân hủy lớn và rõ trên môi trƣờng
có tinh thể cellulose khi bổ sung thuốc thử công gô đỏ 0,5% ở 50o
C trong 2
giờ và rửa lại bằng NaCl 0,9% sẽ đƣợc loại bỏ.
2.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật
đƣợc tuyển trọn.
Quan sát hình thái vi sinh vật: Hình thái vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới
kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử JSM-5410LV (Jeol - Japan).
Phương pháp kiểm tra khả năng sinh bào tử: Thí nghiệm kiểm tra khả
năng sinh nội bào tử của chủng vi khuẩn đƣợc thực hiện bằng cách giữ chủng
trong dung dịch nƣớc muối sinh lý và ủ ở 80o
C trong 15 phút. Sau khi ủ ở
80o
C trong 15 phút và kiểm tra bằng cách cấy trải trên môi trƣờng Bennet.

25
Sau 24-48 giờ chủng vi khuẩn phát triển trở lại trên môi trƣờng kiểm tra thì
có khả năng sinh bào tử.
Tách chiết DNA và phân tích trình tự vùng gen 16S rDNA
Phƣơng pháp tách chiết DNA đƣợc tiến hành theo Sambrook và
Russell [51]. Gen 16S rRNA đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 27f (5'-
TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và 1492R (5’-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94o
C trong 5 phút, 30
chu trình (94o
C trong 60 giây, 60o
C trong 60 giây, 72o
C trong 90 giây), 72o
C trong
10 phút, giữ mẫu ở 4o
C. Trình tự 16S rDNA nucleotide đƣợc phân tích dựa trên
dữ liệu Ngân hàng gen của NCBI. Độ tƣơng đồng về trình tự đƣợc xác định
và so sánh với các trình tự khác đƣợc so sánh trên nhân hàng GenBank bằng
BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). Mức độ tƣơng đồng di truyền của các
chủng đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm CLC DNA workbench 6.6.
Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào: Khả năng
sinh tổng hợp các enzym ngoại bào của các chủng nấm đƣợc khảo sát trên
môi trƣờng khoáng, có bổ sung 1% các nguồn cơ chất khác nhau nhƣ: tinh
bột tan, casein, xylan, RBBR (Remazol Brilliant Blue R) và Guaiacol, nuôi ở
nhiệt độ 28°C. Khả năng sinh enzym ngoại bào đƣợc quan sát và đo đƣờng
kính vòng phân hủy xung quanh khuẩn lạc.
2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzym
Nuôi cấy trong môi trường lỏng: Thực hiện trên bình nón dung tích 250
ml với 75 ml môi trƣờng khoáng phân lập có bổ sung thêm 0,2% pepton và
0,5% glucose. Các bình môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 121 o
C trong 30 phút,
và đƣợc làm nguội về nhiệt độ phòng, tiến hành bổ sung 0,5 % (w/v) chất
chiết nhựa thu nhận từ gỗ keo và 2% (v/v) giống, các bình đƣợc nuôi cấy ở
tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau 3-5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, tiến
hành ly tâm thu dịch nổi để xác định hoạt tính các enzyme.
Phương pháp nuôi cấy trên dăm gỗ: Nuôi cấy vi sinh vật trên dăm gỗ
đƣợc thực hiện theo Su et al. (2011) với một vài thay đổi nhỏ. Dăm gỗ keo thu
nhận tại nhà máy có kích thƣớc từ 1-2 cm2
, đƣợc làm ẩm đến 60% (v/w) và
khử trùng 121o
C trong vòng 15 phút. 2 kg gỗ đƣợc bổ sung giống vi sinh vật

26
ở tỷ lệ kiểm tra và đƣợc ủ trong 7, 14 và 21 ngày. Mẫu đối chứng đƣợc xử lý
tƣơng ứng bằng nƣớc [52].
Phương pháp thu nhận enzyme thô: Lấy ra 10 gram dăm mảnh gỗ đƣợc
ủ với vi sinh vật cho vào trong 100ml dung dịch đệm và lắc trên máy có tốc
độ vòng 200 vòng/ phút trong vòng 2 giờ. Thu dịch và tiến hành xác định hoạt
độ các enzym (laccase, sterol esterase, cellulase).
2.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym
Phương pháp xác định hoạt tính sterol esterase
Nguyên tắc: Dựa trên sự thuỷ phân của pNBP thành sản phẩm oxy hoá
hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 410nm [53]. Dung dịch phản ứng bao gồm pNBP
2 mM pha trong đệm Tris-HCl (pH 7) và dịch enzyme tỷ lệ 1:1. Phản ứng
diễn ra ở nhiệt độ phòng khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch pNBP 2 mM trong
15 phút. Dừng phản ứng bằng cách ủ trong đá lạnh 5 phút. Đo giá trị hấp thụ
ánh sáng ở bƣớc sóng 410nm. Mẫu đối chứng dịch enzyme đƣợc thay bằng
dung dịch đệm Tris-HCl (pH 7) không có bổ sung cơ chất. Một đơn vị hoạt độ
(U) esterase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme cần thiết để oxy hóa 1 µmol
pNBP trong một phút ở nhiệt độ phòng.
Công thức tính:
Hoạt tính = ( ) (U/ml)
Trong đó:
t: thời gian phản ứng (phút);
V: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml);
v: thể tích dịch enzym thô (ml);
ε: hệ số hấp thụ (15.200 M-1cm-1).
Phương pháp xác định hoạt tính laccase
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hoá 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-
sulphonic acid) (ABTS) thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng
460nm. Dung dịch phản ứng bao gồm 1,5 ml đệm acetat 50 mM pH 4,8, 0,5

27
ml ABTS 0,4 mM và 0,5 ml dịch enzym. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng
khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch cơ chất ABTS 0,4 mM. Đọc giá trị hấp thụ
ở 460 nm sau 3 phút ở nhiệt độ 30o
C. Mẫu đối chứng, enzyme phản ứng đƣợc
bất hoạt ở 100o
C trong 15 phút [54].
Một đơn vị hoạt độ laccase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzym cần thiết
để oxy hóa 1 µmol ABTS trong một phút ở điều kiện phản ứng.
Công thức tính:
Hoạt tính = ( ) (U/ml)
Trong đó: Trong đó:
t: thời gian phản ứng (phút);
V: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml);
v: thể tích dịch enzym thô (ml);
ε: hệ số hấp thụ 36000 (M-1cm-1)
Phương pháp xác định hoạt tính cellulase
Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi
cellulase. Lƣợng đƣờng khử sinh ra phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid
(DNSA) cho dung dịch có màu vàng cam. Dung dịch màu này đƣợc xác định
bằng phƣơng pháp so màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 540 nm. Lƣợng
đƣờng khử tạo ra đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn glucose đƣợc xây dựng
trƣớc. Đơn vị hoạt tính cellulase (U/L) đƣợc xác định nhƣ là lƣợng enzyme
phân giải tạo ra lƣợng đƣờng khử trong điều kiện thí nghiệm.
Phương pháp: Dung dịch phản ứng chứa 1 ml dung dịch enzyme và
1ml dung dịch cơ chất nồng độ 1%. Giữ các ống phản ứng ở 50o
C trong 30
phút. Lấy 1ml dịch phản ứng, bổ sung thêm 1 ml dung dịch DNSA, sau đó
đem đun sôi trong 10 phút. Để lạnh trong 5 phút. Tiến hành đo OD ở bƣớc
sóng 540 nm. Đối với mẫu đối chứng tiến hành giống nhƣ trên nhƣng không
có ủ ở 50o
C trong 30 phút. Hàm lƣợng glucose đƣợc xác định bằng phƣơng
trình đƣờng chuẩn chuẩn glucose [55].

28
Xây dựng phương trình đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 10 mg/ml để làm dung
dịch gốc. Tiến hành pha dãy ống nghiệm có nồng độ glucose liên tiếp từ 0 – 1
mg/ml, bằng cách bổ sung nƣớc cất theo tỷ lệ:
Nồng độ (mg/ml) Glucose (ml) Nƣớc cất (ml)
0 0 1
0,05 0,005 0,995
0,1 0,01 0,99
0,15 0,015 0,985
0,2 0,02 0,98
0,25 0,025 0,975
0,3 0,03 0,97
Bổ sung vào từng ống nghiệm 1ml thuốc thử DNSA, đun sôi trong 10
phút, tiến hành làm lạnh nhanh. Đo độ hấp thụ màu của các ống bằng máy
quang phổ ở bƣớc sóng 540nm. Dựng đƣờng chuẩn glucose ở dạng phƣơng
trình y = ax +b với R2
≥ 0,99 (Hình 2.1)
Hình 2. 1. Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose
Hoạt tính Cellulase đƣợc tính toán theo công thức
U/L = ×1000
Trong đó: X: Lƣợng đƣờng khử tƣơng đƣơng đƣợc tạo ra (mg/ml)

29
D: Hệ số pha loãng enzyme
V: Thể tích enzyme (ml)
T: Thời gian phản ứng
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa cây bằng chiết trong
aceton
Dăm mảnh gỗ ủ với vi sinh vật đƣợc rửa bằng nƣớc cất khử trùng, sấy
ở 60 o
C trong 2 giờ, chẻ nhỏ mảnh rồi nghiền thành bột gỗ kích thƣớc 0,3 -
0,4 mm. Hàm lƣợng chất chiết đƣợc xác định theo phƣơng pháp chiết
Soxhlex bằng aceton trong 6 giờ theo Martinez-Inĩgo et al. (2000a) và TAPPI
T204-2007 với vài thay đổi nhỏ [56].
Các bƣớc tiến hành:
- Cho mẫu vào bộ Soxhlex cùng với 150 ml axeton.
- Đặt bộ Sohlex vào bếp cách thủy ở nhiệt độ 72o
C, thời gian chiết 6 giờ.
- Lấy bình chứa dung dịch chiết ra khỏi Soxhlex rồi mang đi sấy ở 105 o
C
trong thời gian 2 giờ.
- Đặt bình chứa dung dịch chất chiết vào bình hút ẩm để nguội và cân chính
xác tới 0,0001g.
Tiến hành thí nghiệm trắng: Để 150 ml dung môi bay hơi tới khô và
tiến hành cân chính xác tới 0,0001g. Hiệu chỉnh khối lƣợng chất chiết với
khối lƣợng cân đƣợc trong thí nghiệm trắng.
Hàm lƣợng các chất chiết đƣợc tính theo công thức sau:
AE
W
c W
b .100
W
p
Trong đó:
- Wc: khối lƣợng chất chiết
- Wb: Khối lƣợng chất chiết còn lại trong thí nghiệm trắng (g)
- Wp: Khối lƣợng mẫu thử khô tuyệt đối (g)
2.2.7. Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate
Dăm mảnh sau khi xử lý với chế phẩm sinh học đƣợc tiến hành nấu theo

30
phƣơng pháp Sunphat trong nồi nấu thí nghiệm 4,5 lít, gia nhiệt gián tiếp
bằng điện theo các điều kiện công nghệ nhất định. Quy trình nấu bột giấy
đƣợc lựa chọn tƣơng tự nhƣ quy trình nấu hiện đang áp dụng tại Tổng Công
ty Giấy Việt Nam. Tuy nhiên, một số yếu tố nhƣ thời gian tăng ôn và thời
gian bảo ôn dài hơn phụ thuộc vào yêu cầu của thiết bị nấu trong phòng thí
nghiệm tại Viện Công nghiệp Giấy và Xenluylô. Hóa chất và quy trình thực
hiện: NaOH, 20%; sulfide, 25%; mảnh/nƣớc, 1:4; nhiệt độ nấu, 170 o
C; thời
gian nấu, 150 phút. Bột giấy sau nấu đƣợc rửa trên các lƣới rửa với số mắt
lƣới là 40 mesh và 100 mesh. Bột giấy hợp cách qua lƣới 40 mesh đƣợc vắt
khô, bảo quản để sử dụng cho các công đoạn thí nghiệm tiếp theo. Bột giấy
thu đƣợc đem đi xác định hiệu suất, trị số Kappa, tàn kiềm và hàm lƣợng
nhựa trong bột sau nấu.
2.2.8. Phƣơng pháp xác định chỉ số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin)
Định nghĩa: Chỉ số Kappa của bột là số ml của dung dịch kali
permanganat 0,02 mol/l tiêu hao cho 1 g bột (đƣợc tính trên cơ sở sấy khô)
trong điều kiện quy định.
Nguyên tắc: Bột đƣợc đánh tơi sẽ đƣợc phản ứng với một lƣợng dung
dịch kali permanganat quy định trong một thời gian nhất định. Số lƣợng bột
đƣợc chọn để sao cho khoảng 50 % tổng khả năng ôxi hóa của permanganat
còn lại không tiêu thụ hết vào cuối thời gian phản ứng.
Chỉ số kappa của bột nấu đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn TCVN
4361:1907, ISO 302:1904, liên quan trực tiếp đến lƣợng lignin (độ cứng)
hoặc khả năng tẩy trắng của bột.
2.2.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê.
Tất cả các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện 3 lần. Số liệu đƣa ra trong báo
cáo này là giá trị trung bình theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai
(ANOVA), tiếp theo là so sánh giữa các nhóm thông qua tính khác biệt nhỏ
nhất có ý nghĩa (Least significant difference – LSD) ở mức ý nghĩa p < 0,05,
sử dụng phần mền thống kê phân tích dữ liệu Excel.

31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY.
3.1.1. Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng
phân hủy nhựa cây
Cơ chất sterol là thành phần đƣợc đánh giá rất khó phân hủy trong các
chất chiết nhựa. Nó là nguyên nhân gây nhiều vấn đề lớn cặn nhựa trong sản
xuất giấy. Trong nguyên liệu gỗ stigmasterol là thành phần sterol có mặt trong
hầu hết các loại gỗ, vì vậy đƣợc sử dụng làm cơ chất tuyển chọn các chủng có
tiềm năng phân hủy nhựa trong nghiên cứu này.
Từ 19 mẫu mùn đất phân lập đƣợc 162 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn (92
chủng phát triển ở nhiệt độ 37o
C và 70 chủng phát triển ở 45 o
C). Các chủng
này đƣợc tách, làm sạch trên môi trƣờng phân lập và giữ giống trên môi
trƣờng Bennet (Bảng 3.1).
Hình 3. 1. Hình ảnh vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng phân lập
Bảng 3. 1. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập ở nhiệt độ 37o
C và 45o
C
trong các mẫu
Mẫu
Nhiệt độ phân lập 37
o
C Nhiệt độ phân lập 45
0
C
Vi khuẩn Xạ khuẩn Vi khuẩn Xạ khuẩn
VSBG-1, VSBG-2,
XBG-2, XBG-3,
BG VSBG-3 VSBG-4, CVSBG-2, CVSBG-3 CXBG-23
XBG-4, XBG-5
VSBG-5
Đ1 VSĐ1-1, VSĐ1-4, - CVSĐ1-6 -
VSĐn-1, VSĐN-2,
ĐN VSĐn-3, VSĐn-4, XĐN-1 CVSĐN-1, CVSĐN-2 CXĐN-1, CXĐN-3
VSĐn-5
D1
VSD1-1, VSD1-2, XD1-1, XD1-2,
CVSD1-4, CVSD1-1
CXD1-1,
VSD1-3, VSD1-4 XD1-3 CXD1-4

32
D2 VSD2-1, VSD2-3 XD2-2, XD2-3
CVSD2-1, CVSD2-2,
CXD2-15, CXD2-17
CVSD2-3, CVSD2-4
D3
VSD3-1, VSD3-2,
XD3-1, XD3-2 CVSD3-4 CXD3-1, CXD3-2
VSD3-3, VSD3-4
VSD4-1, VSD4-2,
D4 VSD4-3, VSD4-4, - CVSD4-1 CXD4-1, CXD4-2
VSD4-5
S1
VSS1-1, VSS1-2,
XS1-2, XS1-4 CVSS1-1, CVSS1-2 CXSS1-1
VSS1-3
S2
VSS2-1, VSS2-2,
XS2-2, XS2-3 CVSS2-1 CXS2-2, CXS2-3
VSS2-3
S3 VSS3-1, VSS3-3 XS3-1, XS3-2 CVSS3-2, CVSS3-1, CXS3-1, CXS3-3
M1
VSM1-1, VSM1-2, XM1-1, XM1-2,
CVSM1-1, CXM1-20
VSM1-3, VSM1-4 XM1-3
M2 VSM2-3, VSM2-2 XM2-1, XM2-2
CVSM2-1, CVSM2-2,
CXM2-2, CXM2-3
CVSM2-3, CVSM2-4
M3 VSM3-1, -
CVSM3-1, CVSM3-2,
CXM3-2
CVSM3-3,
M4
VSM4-1, VSM4-2, XM4-1, XM4-2 CVSM4-1, CVSM4-2, CXM4-3, CXM4-4,
VSM4-2, VSM4-3 XM4-3 CVSM4-3 CXM4-5
M6
VSM6-1, VSM6-2,
- CVSM6-1 CXM6-2
VSM6-3
MT
VSMT-1, VSMT-2,
XMT-1
CVSMT-1, CVSMT-2,
-
VSMT-3, VSMT-4 CVSMT-3
CVSMT2-1,
MT2
VSMT2-1, VSMT2-
-
CVSMT2-2,
-
2, VSMT2-3 CVSMT2-3,
CVSMT2-4
VC1
VSVC1-1, VSVC1- XVC1-1, XVC1- CVSVC1-1, CXVC1-2, CXVC1-
2, VSVC1-3 3, XVC1-2 CVSVC1-2 1
VSVC2-1, VSVC2-
CVSVC2-1,
CXVC2-1, CXVC2-
VC2 - CVSVC2-2,
2, VSVC2-3 25
CVSVC2-3
Ghi chú: (BG) Mẫu được lấy cạnh nguồn nước thải. (Đ1, Đn): Mẫu đất được lấy xung
quanh khu vực nhà mấy giấy bãi bằng, (D1, D2, D3, D4): dăm mảnh gỗ, (S1, S2, S3): mẫu
trong khu vực xuất hiện lignin, (M1, M2, M4, M5, M6): Mẫu mùn trong bãi gỗ nguyên
liệu, (MT, MT2): mạt cưa, (VC1, VC2): vỏ cây.
Các chủng vi sinh vật tách từ môi trƣờng phân lập ban đầu đƣợc kiểm
tra khả năng phát triển trên môi trƣờng phân lập lỏng. Sau 48 giờ nuôi cấy, có
104 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phát triển trên môi trƣờng này (trong đó có
51 chủng phân lập ở 37o
C và 53 chủng phân lập ở 45o
C (Hình 3.3 và Bảng
3.2). Một số chủng VSM4-3, VSD1-2, VSD1-3, VSD2-1, VSD4-4, VSD4-5,

33
VSBG-3, VSS1-2, VSS3-3, VSVC2-2, CVSMT2-4, CVSM2-3, CVSVC2-3,
CVSD2-1, CXD2-17 phát triển nhanh và tốt nên chúng đƣợc xem là những
chủng có triển vọng trong những ứng dụng loại bỏ chất chiết nhựa.
Hình 3.2. Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi
trƣờng phân lập lỏng
Bên cạnh đó các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập, đƣợc đánh giá
khả năng sinh lipase và khả năng phân hủy cellulose (1% CMC và tinh thể
cellulose) bằng các vòng phân hủy xuất hiện trên môi trƣờng kiểm tra. Kết
quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.3, 3.4 và Bảng 3.2.
Trong số 162 chủng phân lập, 17 chủng có khả năng sinh lipase, đáng
chú ý nhất là các chủng VSMT-1, XM4-3, VSD3-4, VSBG-3 tạo vòng kết tủa
lớn xung quanh điểm cấy (đƣờng kính vòng phân hủy > 20 mm) (Hình 3.3 và
Bảng 3.2). Lipase là một enzym trong nhóm hydrolase tham gia vào quá trình
thủy phân của chất triacylglycerol có trong nhựa cây. Sự hoạt động của lipase

34
đƣợc nhận biết dựa trên nguyên tắc kết tủa của muối canxi. Lipase thủy phân
Tween 20 có trong môi trƣờng giải phóng các axit béo liên kết với canxi trong
môi trƣờng tạo thành các tinh thể không hòa tan xung quanh điểm cấy [50].
Hình 3.3. Khả năng sinh enzym lipase ngoại bào của một số chủng phân lập
Hình 3.4. Khả năng sinh cellulase ngoại bào của một số chủng phân lập

35
Trong ngành công nghiệp sản xuất bột giấy, việc thất thoát cellulose có
ảnh hƣởng lớn đến hiệu suất và chất lƣợng sản phẩm, giảm hiệu quả kinh tế.
Chính vì thế, các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn có khả năng
phân hủy nhựa phải không hoặc ít làm ảnh hƣởng đến hàm lƣợng cellulose có
trong gỗ. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng sàng lọc nhận thấy, các chủng
XM1-1, VSM6-2, XD1-2, XBG-3, VSS1-3, XS2-2, XS3-2, VSVC1-3,
XVC1-2, VSVC2-1, VSVC2-2, VSVC2-3, CVSM1-1, CVSM2-1, CVSM3-3,
CXM3-2, CXM4-4, CVSM4-1, CXM6-2, CVSĐN-2, CXD4-2, CXS3-3, là
những chủng tạo vòng phân hủy lớn (>20mm) (Hình 3.4 và Bảng 3.2), do đó
các chủng này có khả năng sinh cellulase nên không đƣợc tuyển chọn. Các
chủng còn lại có vòng phân hủy cellulose nhỏ hoặc không đƣợc lựa chọn.
Thông qua quá trình sàng lọc ban đầu từ 162 chủng phân lập lựa chọn
đƣợc 87 chủng tiềm năng (42 chủng phát triển ở nhiệt độ 37o
C và 45 chủng
phát triển ở 45o
C). Các chủng này đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi
trƣờng có bổ sung stigmasterol, một số chủng có khả năng sinh tổng hợp
enzyme phân hủy lipase và không hoặc ít phân hủy cellulose. Các chủng này
đƣợc sử dụng để khảo sát trong các thí nghiệm tiếp theo.

36
Bảng 3. 2. Khả năng phân hủy stigmassterol, sinh tổng hợp cellulase và lipase của vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập
Các chủng phân lập ở 37
o
C Các chủng phân lập ở 45
o
C
STT
Mẫu Chủng
Stigmasterol
Cellulase Lipase
STT
Mẫu Chủng
Stigmasterol
Cellulase Lipase
lỏng lỏng
1 XMT-1 - + - 93 CVSMT-1 + +/- -
2 VSMT-1 - - +++ 94 MT CVSMT-2 + - -
3 MT VSMT-2 - - - 95 CVSMT-3 - + -
4 VSMT-3 + - - 96 CVSMT2-1 + - -
5 VSMT-4 + - - 97
MT2
CVSMT2-2 + + -
6 VSMT2-1 + - - 98 CVSMT2-3 + + -
7 MT2 VSMT2-2 + - - 99 CVSMT2-4 ++ - -
8 VSMT2-3 + - - 100
M1
CVSM1-1 + ++ -
9 XM1-1 - ++ - 101 CXM1-20 + + -
10 XM1-2 - + - 102 M2 CVSM2-2 + - -
11 XM1-3 - - + 103 CXM2-2 + + -
12 M1 VSM1-1 - - - 104 CVSM2-1 - ++ -
13 VSM1-2 - - - 105 CVSM2-3 ++ - -
14 VSM1-3 + - - 106 CVSM2-4 + - -
15 VSM1-4 + - + 107 CXM2-3 + + -
16 VSM2-2 + - - 108 CVSM3-1 + +/- -
17
M2
VSM2-3 + - - 109 M3 CVSM3-2 + - -
18 XM2-1 - - ++ 110 CVSM3-3 + ++ -
19 XM2-2 - + - 111 CXM3-2 + ++ -
20 M3 VSM3-1 + - - 112 CXM4-3 + + -
21 VSM4-2 + - 113 M4 CXM4-4 + ++ -
22 VSM4-3 ++ - - 114 CXM4-5 + + -
23
M4
XM4-1 - + - 115 CVSM4-1 + ++ -
24 VSM4-1 - - - 116 CVSM4-2 - - -
25 XM4-2 - +/- - 117 CVSM4-3 - - -
26 XM4-3 - +/- +++ 118 CVSM6-1 + - -
27
M6
VSM6-1 + +/- - 119 M6 CXM6-2 + ++ -
28 VSM6-2 - ++ ++ 120 CVSĐN-2 + ++ -

Nghiên Cứu Sử Dụng Vi Sinh Vật Phân Hủy Nhựa Cây Trên Nguyên Liệu Dăm Mảnh Keo Nhằm Ứng Dụng Trong Sản Xuất Bột Giấy Thân Thiện Với Môi Trường.doc

Nghiên Cứu Sử Dụng Vi Sinh Vật Phân Hủy Nhựa Cây Trên Nguyên Liệu Dăm Mảnh Keo Nhằm Ứng Dụng Trong Sản Xuất Bột Giấy Thân Thiện Với Môi Trường.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên Cứu Sử Dụng Vi Sinh Vật Phân Hủy Nhựa Cây Trên Nguyên Liệu Dăm Mảnh Keo Nhằm Ứng Dụng Trong Sản Xuất Bột Giấy Thân Thiện Với Môi Trường.doc

Similar to Nghiên Cứu Sử Dụng Vi Sinh Vật Phân Hủy Nhựa Cây Trên Nguyên Liệu Dăm Mảnh Keo Nhằm Ứng Dụng Trong Sản Xuất Bột Giấy Thân Thiện Với Môi Trường.doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (18)

Nghiên Cứu Sử Dụng Vi Sinh Vật Phân Hủy Nhựa Cây Trên Nguyên Liệu Dăm Mảnh Keo Nhằm Ứng Dụng Trong Sản Xuất Bột Giấy Thân Thiện Với Môi Trường.doc