Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn Thô Xanh Dạng Lỏng Phục Vụ Chăn Nuôi Lợn.doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-------------
Nguyễn Văn Thế
NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC VI
SINH VẬT PHÙ HỢP CHO LÊN MEN THỨC ĂN
THÔ XANH DẠNG LỎNG PHỤC VỤ CHĂN NUÔI
LỢN
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Hà Nội – tháng 10 năm 2019

2
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------
Nguyễn Văn Thế
NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC VI
SINH VẬT PHÙ HỢP CHO LÊN MEN THỨC ĂN
THÔ XANH DẠNG LỎNG PHỤC VỤ CHĂN NUÔI
LỢN
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Phí Quyết Tiến
Hà Nội - 2019

i
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn là do sự tìm tòi, học hỏi của bản
thân và sự hướng dẫn tận tình của PGS. TS. Phí Quyết Tiến và các đồng nghiệp tại
Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam và Bộ môn Dinh dưỡng động vật – Khoa Chăn nuôi, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam.
Mọi kết quả nghiên cứu cũng như ý tưởng của tác giả khác, nếu có đều được
trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chưa được bảo vệ tại bất kỳ một hội
đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chưa hề được công bố trên bất kỳ một
phương tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Người cam đoan
Nguyễn Văn Thế

ii
Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phí Quyết Tiến đã trực tiếp
định hướng, tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn sự động viên giúp đỡ chỉ bảo tận tình của các cán bộ Phòng
Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, đã tạo hỗ trợ và tạo điều kiện thuận
lợi giúp tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn TS. Trần Hiệp giảng viên Bộ môn Dinh dưỡng động vật –
Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi
hoàn thành luận văn.
Tôi xin trân trong gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo cùng các thầy cô giáo Khoa
Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biêt ơn đến gia đình, người thân, bạn bè và đồng
nghiệp những người đã luôn động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học
này.
Học viên
Nguyễn Văn Thế

iii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Chữ viết tắt Nội dung
ADF Xơ axit
Ash Khoáng tổng số
bp Base pair
CF Xơ thô
CFU
CP
CTAB
DM
DNA
EE
FLF
LAB
ME
Đơn vị hình thành khuẩn lạc
Protein
Cetyltrimethylammonium bromide
Vật chất khô
Axit deoxyribonucleic
Mỡ thô
Fermented Liquid Feed (Thức ăn lên men dạng
lỏng)
Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic)
Năng lượng trao đổi
NDF Xơ trung tính
OD
PCR
rDNA
RPM
Optical Density
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi
polymerase)
Deoxyribonucleic acid ribosome
Revolutions per minute (Tốc độ lắc vòng/phút)
SDS
TATX
TE
v/v
VK
VSV
w/v
Sodium dodecyl sulfate
Thức ăn thô xanh
Đệm Tris – EDTA (Ethylenediaminetetraacetic
acid)
Đơn vị thể tích/thể tích
Vi khuẩn
Vi sinh vật
Đơn vị khối lượng/thể tích

iv
Danh mục các Bảng
Bảng 2.1. Thành phần hóa hóa học của các nguyên liệu thức ăn..................................24
Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu thí nghiệm lên men thức ăn thô xanh kết hợp
với một số nguồn
dinh dưỡng khác 24
Bảng 3.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 38 chủng vi khuẩn thuộc chi
Bacillus 26
Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS (bổ sung 1%
CaCO3) của 24 chủng vi khuẩn lactic 29
Bảng 3.3. Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn .............31
Bảng 3.4. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng tuyển chọn ...............32
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái của 14 chủng nấm men sử dụng trong nghiên cứu........34
Bảng 3.6. Kết quả sàng lọc của 03 chủng vi khuẩn và 01 nấm men được tuyển
chọn ...............................................................................................................................36
Bảng 3.7. Đặc điểm sinh học của 04 chủng vi sinh vật được tuyển chọn.....................37
Bảng 3.8. So sánh trình tự gen 16S rDNA và vùng ITS4 của các chủng VSV
tuyển chọn 39
Bảng 3.9. Giá trị dinh dưỡng của khẩu phần ăn cho lợn sau 120 giờ lên men với
các tỷ lệ phối trộn chế phẩm vi sinh khác nhau 45

v
Danh mục Hình ảnh
Hình 2.1. Đường chuẩn axit lactic ......................................................................17
Hình 3.1. Hoạt tính xylanase (A) và cellulase (B) trên môi trường có cơ
chất của hai chủng đại diện VTX16 và VTX18 27
Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của 26 chủng vi khuẩn được tuyển chọn..............28
Hình 3.3. Đặc tính phân giải CaCO3 trên môi trường MRS của một số
chủng vi khuẩn lactic đại diện trong nghiên cứu 28
Hình 3.4. Phản ứng với thuốc thử Uphenmen của một số chủng vi khuẩn
lactic đại diện 29
Hình 3.5. Hàm lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic .........................30
Hình 3.6. Hình thái tế bào của một số chủng nấm men đặc trưng......................34
Hình 3.7. Khối lượng sinh khối khô và hàm lượng protein thô của các
chủng nấm men 35
Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene mã hóa 16S rRNA
của 03 chủng vi khuẩn tuyển chọn.. 39
Hình 3.9. Khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn sau 3h ủ. 42
Hình 3.10. Động học quá trình lên men của chủng B. subtilis VTX16 (A)
và B. licheniformis VTX18 (B) trên quy mô 5 L/mẻ 43
Hình 3.11. Động học quá trình lên men của chủng L. plantarum LTX28
trên quy mô 5 L/mẻ 44
Hình 3.12. Động học quá trình lên men của chủng S. cerevisiae MTX14
trên quy mô 5 L/mẻ 44

vi
MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................... i
Lời cảm ơn...................................................................................................................... ii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt............................................................................ iii
Danh mục các Bảng....................................................................................................... iv
Danh mục hình ảnh......................................................................................................... v
MỤC LỤC ..................................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3
1.1. THỨC ĂN THÔ XANH VÀ LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG
LỎNG CHO CHĂN NUÔI LỢN.........................................................................3
1.1.1. Nguồn thức ăn thô xanh phù hợp sử dụng lên men thức ăn cho lợn............. 3
1.1.2. Yêu cầu chung của một số nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men
thức ăn thô xanh dạng lỏng .............................................................................. 4
1.1.3. Một số đặc điểm của thức ăn thô xanh lên men dạng lỏng............................. 5
1.2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ NHÓM VI SINH
VẬT SỬ DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG
1.2.1. Vi sinh vật lên men lactic ................................................................................... 6
1.2.2. Vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào....................................................................... 7
1.2.3. Nấm men tích lũy protein đơn bào ................................................................... 8
1.2.4. Yêu cầu về an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong chăn nuôi.................... 9
1.2.5. Một số đặc tính sinh học của nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men
thức ăn chăn nuôi .............................................................................................. 9
1.3. HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN THỨC ĂN
THÔ XANH DẠNG LỎNG............................................................................... 11
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM VI SINH
TRONG LÊN MEN THỨC ĂN CHO LỢN VIỆT NAM ................................. 12
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................15
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ........................................................................................ 15
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật.....................................................................................15
2.1.2. Hóa chất và thiết bị............................................................................................15
2.1.3. Môi trường nghiên cứu .....................................................................................15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 16
2.2.1. Phương pháp phân tích hóa sinh .....................................................................16
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại vi sinh
vật bằng phương pháp sinh học phân tử........................................................20
2.2.3. Lên men vi sinh vật tạo chế phẩm và phối trộn thức ăn thô xanh lên
men.....................................................................................................................22
................. 6

vii
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................................25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................26
3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. SINH
CELLLASE VÀ CÁC ENZYM NGOẠI BÀO
CAO
3.1.1. Sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn
Bacillus spp........................................................................................................26
3.1.2. Xác định hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.................27
3.2.
TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC
CAO
3.2.1. Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit tổng số cao .........................................28
3.2.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit lactic cao ............................................29
3.2.3. Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic ................................30
3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH CỦA
CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN.......................................................................... 32
3.4. TUYỂN CHỌN NẤM MEN TÍCH LŨY PROTEIN ĐƠN BÀO...................... 33
3.4.1. Đặc điểm hình thái, tế bào của các chủng nấm men ......................................33
3.4.2. Tuyển chọn chủng nấm men tích lũy protein đơn bào cao............................35
3.5. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG
ĐƯỢC TUYỂN CHỌN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ................................... 37
3.5.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng VSV được tuyển chọn ..........37
3.5.2. Phân loại các chủng VSV được tuyển chọn bằng phương pháp sinh
học phân tử........................................................................................................38
3.5.3. Khảo sát khả năng chịu muối mật và pH axit của các chủng tuyển
chọn....................................................................................................................41
3.6. NGHIÊN CỨU THU HỒI VÀ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH............................. 42
3.6.1. Nghiên cứu thu hồi sinh khối các chủng được tuyển chọn và tạo chế
phẩm vi sinh ......................................................................................................42
3.6.2. Tạo chế phẩm vi sinh
ứng dụng cho lên men thức
ăn thô xanh...................................................................................................................44
3.7. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH CHO LÊN MEN THỨC ĂN THÔ
XANH DẠNG LỎNG
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................47
KẾT LUẬN ...................................................................................................................47
KIẾN NGHỊ...................................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................48
........................................................................................................ 45
......................................................................................................................................... 28
................................................ 26

PHỤ LỤC ......................................................................................................................56

1
MỞ ĐẦU
Theo báo cáo của Cục Chăn nuôi, nước ta hiện có đàn lợn khoảng 29 triệu
con, đứng đầu ASEAN, đứng thứ 2 ở châu Á và nằm trong nhóm 15 nước có
đàn lợn lớn nhất thế giới. Tốc độ tăng trưởng đàn lợn trong giai đoạn 2007 –
2017 đạt trung bình 0,91%/năm. Sản lượng thịt lợn trong năm 2016 đạt mức kỷ
lục 3,36 tấn, tăng 5% so với năm 2015 và đứng thứ 7 trên thế giới sau Trung
Quốc, Mỹ, Đức, Tây Ban Nha, Brazil và Nga. Lợn thịt xẻ chính ngạch mới được
xuất sang thị trường Hong Kong và Malaysia khoảng 15-20 ngàn tấn (tương
đương 200.000 con) trong giai đoạn từ năm 2013 - 2016. Các số liệu thống kê
trên cho thấy, tình hình xuất khẩu thịt lợn Việt Nam hoàn toàn không tương
xứng với năng lực sản xuất trong nước. Nguyên nhân chính thịt lợn Việt Nam
không thể cạnh tranh với thịt lợn xuất khẩu của các nước do giá thành sản xuất
cao, phụ thuộc vào thức ăn công nghiệp, chất lượng thịt không bảo đảm, dư
lượng kháng sinh vượt ngưỡng cho phép. Năm 2017 đặc biệt khó khăn với
ngành chăn nuôi Việt Nam khi việc xuất lợn hơi theo đường tiểu ngạch giảm
mạnh do nhu cầu thịt lợn của Trung Quốc sụt giảm, chi phí chăn nuôi lợn cao
hơn giá bán, nguồn cung cao hơn cầu dẫn tới nhiều chuồng trại chăn nuôi lợn bỏ
trống.
Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi phí và là yếu tố chính
quyết định chất lượng, giá thành sản phẩm. Năm 2017, Việt Nam nhập khẩu 1,5
triệu tấn thức ăn chăn nuôi thành phẩm từ nước ngoài, và nhập khẩu 16,3 triệu
tấn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi trong khi nguồn nguyên liệu nội địa chỉ
đáp ứng 16,3 triệu tấn. Như vậy ngành chăn nuôi trong nước thực tế đang mang
lợi nhuận chủ yếu cho các công ty sản xuất thức ăn. Đây cũng là lý do giá thịt
lợn sản xuất trong nước cao và dự kiến hạn chế lợi thế cạnh tranh với sản phẩm
nhập khẩu khi Hiệp định Đối tác xuyên Thái Bình Dương (TPP) được thực hiện.
Ở các nước nhiệt đới, việc sử dụng thức ăn thô xanh trong chăn nuôi lợn ngày
càng phát triển so với hệ thống chăn nuôi thâm canh do giảm chi phí đầu vào.
Một số nghiên cứu công bố lên men thức ăn thô xanh sẽ nâng cao được hàm
lượng protein của thức ăn giàu xơ nhờ tăng sinh khối nấm men. Manivanh và
Preston (2015) công bố lên men thân cây chuối và dọc khoai nước đã cải thiện
được lượng protein thu nhận được và tốc độ tăng trọng ở lợn.
Để nâng cao được dinh dưỡng của các loại thức ăn thô xanh đáp ứng nhu
cầu phát triển chăn nuôi thâm canh, cần thiết phải áp dụng đồng thời công nghệ

2
chế biến và lên men thích hợp. Để hạ giá thành thức ăn chăn nuôi, tăng tỷ lệ chất
xơ cần sử dụng, một số nghiên cứu đã sử dụng vật liệu thô xanh như bã sắn, bã
rong riềng, thân/vỏ chuối, bèo tây, cỏ voi… để thay thế một phần ngũ cốc. Theo
một số nghiên cứu, trong các mẻ lên men thì hỗn hợp thức ăn có thành phần
dinh dưỡng cân đối kết hợp với nước sẽ tạo ra hỗn hợp thức ăn lỏng (Liquid
Feed, LF) cho lợn và không cần sử dụng thêm các loại thức ăn bổ sung
(Scholten et al., 2002). Ưu điểm của quá trình lên men thức ăn này là dễ dàng
kiểm soát và giúp cho thức ăn không bị hỏng nhờ quá trình lên men lactic, thời
gian lên men không dài và tạo ra loại LF có chất lượng tốt.
Nhóm vi sinh vật (VSV) chủ yếu sử dụng trong công nghệ trên gồm nấm
men Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp., Lactobacillus spp. Chất lượng của
thức ăn được lên men tự nhiên có thể được cải thiện bằng cách bổ sung các loại
vi khuẩn lactic (Lactobacillus plantarum và Pediococcus spp.), nấm men và vi
sinh vật khác vào môi trường lên men đồng thời giúp giảm pH của thức ăn, tăng
lượng axit lactic giúp bảo quản thức ăn (Scholten et al., 2002). Do tầm quan
trọng và tiềm năng sử dụng vi sinh vật cho lên men thức ăn thô xanh cho chăn
nuôi lợn, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc tính sinh học của các vi
sinh vật phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh dạng lỏng phục vụ chăn nuôi
lợn” với mục tiêu tuyển chọn các VSV phù hợp cho việc tạo chế phẩm để lên
men chế biến thức ăn thô xanh (TATX) dạng lỏng cho chăn nuôi lợn, với các nội
dung chính sau đây:
1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus spp. sinh celllase và các
enzym ngoại bào cao;
2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao;
3. Tuyển chọn các chủng nấm men tích lũy protein đơn bào cao;
4. Đánh giá đặc tính ức chế vi sinh vật gây bệnh, chịu muối mật, kháng
kháng sinh của các chủng tuyển chọn;
5. Nghiên cứu lên men, thu hồi sinh khối VSV và tạo chế phẩm vi sinh;
6. Bước đầu ứng dụng chế phẩm vi sinh cho lên men thức ăn thô xanh
dạng lỏng.

3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. THỨC ĂN THÔ XANH VÀ LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG
LỎNG CHO CHĂN NUÔI LỢN
1.1.1. Nguồn thức ăn thô xanh phù hợp sử dụng lên men thức ăn cho
lợn
Thức ăn thô xanh ở nước ta rất đa dạng và phong phú, bao gồm thân lá
của cây, cỏ trồng hoặc mọc tự nhiên, sinh trưởng trên cạn hoặc dưới nước, đây
là nguồn cung cấp thức ăn quan trọng cho gia súc ở nước ta. Thức ăn thô xanh
chứa hầu hết các chất dinh dưỡng cần thiết cho vật nuôi, phần lớn giàu protein,
các vitamin, khoáng đa lượng, vi lượng cần thiết. Cỏ Voi được sử dụng làm thức
ăn thô xanh do năng suất thu hoạch cỏ cao, năng suất từ 100-300 tấn/ha/năm và
có thể lên đến 500 tấn/ha/năm. Sau khi trồng 3 tháng có thể thu lứa đầu, sau đó
40-45 ngày thì cắt lần tiếp theo. Ở Việt Nam thời điểm cắt tốt nhất là 80 ngày
(cao 80-100 cm). Giá trị dinh dưỡng của cỏ voi bao gồm 20% vật chất khô,
trong đó có 9% protein thô, 28,6% xơ thô, 14,8% khoáng, 1,1% NN và 46,5%
NFE so với vật chất khô (Gohl 1975). Tại các vùng nông thôn bèo tây từ lâu đã
được tận dụng làm thức ăn để chăn nuôi lợn. Bèo tây tồn tại tự nhiên ở các mặt
nước ao, hồ, đầm. Bèo tây có hàm lượng chất khô thấp (6 – 7%) nhiều xơ (trên
200 g/kg chất khô), giàu khoáng 180 – 190 g/kg chất khô và giá trị năng lượng
thấp (1800 – 1900 Kcal/kg chất khô; hay 7,6 – 8,0 MJ/kg chất khô). Cây rau
muống là thực vật có tốc độ sinh trưởng nhanh trong mùa mưa, kém chịu lạnh,
được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi lợn. Hàm lượng chất khô ở rau muống
trung bình 100 g/kg rau tươi. Trong 1 kg chất khô có 2450 – 2500 kcal (10,3 –
10,5 MJ) năng lượng trao đổi là 170 – 250 g protein thô, 130 – 200 g đường, 100
– 115 g khoáng tổng số. Rau muống dùng làm thức ăn xanh cho lợn rất tốt, thích
hợp với các mô hình chăn nuôi nông hộ. Cây khoai lang ngoài mục đích trồng để
lấy củ là chính còn có mục đích trồng để cung cấp thức ăn thô xanh cho vật
nuôi. Khoai lang nếu được chăm sóc tốt có khả năng tái sinh nhanh, thu cắt được
nhiều lần trong năm và cho năng suất cao. Giá trị dinh dưỡng của thân lá khoai
lang khi thu hoạch non sẽ đạt mức khá. Protein trong thân lá đạt trung bình
khoảng 15 – 16% vật chất khô, xơ thô khoảng 16 – 17%, đây là nguồn thức ăn
rất tốt cho gia súc dạ dày đơn (Điền Văn Hưng 1975).
Với ưu thế là một nước nhiệt đới quanh năm cây trái xanh tốt, ngành chăn
nuôi Việt Nam luôn sẵn có nguồn nguyên liệu phong phú. Song song với nguồn

4
thức ăn xanh phong phú và đa dạng là nguồn phụ phẩm công, nông nghiệp cũng
rất dồi dào như: bã bia (vật chất khô (92,5-93%), protein thô (23,5-27%), lipit
(6,2-6,5%), xơ thô (14,0-15,5%), khoáng (3,7-4%)), bã sắn (hàm lượng tinh bột
từ 8%, xơ chiếm khoảng 15 - 20%), rất phù hợp làm nguyên liệu chế biến thức
ăn gia súc nhưng lại nghèo chất đạm) và bã dong riềng (hàm lượng protein thô
của bã dong riềng ướt là 0,9%, bã dong riềng khô là 3,45%, hàm lượng lipid thô
là 0,1% ở bã dong riềng ướt, 1% ở bã dong riềng khô và tỉ lệ xơ trong bã ướt và
bã khô lần lượt là 2,7% và 8,28%) (Điền Văn Hưng 1975).
1.1.2. Yêu cầu chung của một số nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên
men thức ăn thô xanh dạng lỏng
Mật độ VSV trong thức ăn lên men dạng lỏng (Fermented Liquid Feed,
FLF) thông thường đạt 106
- 107
CFU/ml (Royer et al., 2003). Lên men thức ăn
cho lợn hoàn chỉnh thường thông qua 3 pha: Pha 1 là trộn nguyên liệu với nước
pH > 6, thời điểm này cho phép sự tăng nhanh của trực khuẩn đường ruột; Pha 2
là sau lên men thức ăn, pH xuống ~ 4.0 giúp hạn chế sự phát triển của các vi
khuẩn thuộc chi Enterobacteriaceae và các vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác;
Pha 3 quần thể LAB giúp ổn định pH, mật độ nấm men trong thức ăn tiếp tục
tăng nhờ sử dụng các nguồn protein trong nguyên liệu thô xanh giúp thức ăn ổn
định và tăng cường hàm lượng protein nấm men đơn bào trong thức ăn (Odunfa,
Oyeyiola 1985, Russell et al., 1996). Năm 2010, đã tìm thấy 146 chủng vi khuẩn
có khả năng kiểm soát Salmonella có trong FLF. Vi khuẩn LAB thường được sử
dụng trong sản xuất FLF là Lactobacillus plantarum và Pediococcus spp.
(Missotten et al., 2010).
Đa dạng nấm men trong FLF khá cao và đã được công bố trong một số
nghiên cứu. Tại Châu Âu, khi lên men sản xuất FLF từ ngũ cốc, phế phụ phẩm
nông nghiệp các loài nấm men chủ yếu được phân lập và bổ sung vào mẻ lên
men sau chủ yếu gồm các loài Pichia galeiformis, P. membranifaciens và P.
anomala. Trong một vài nghiên cứu khác, nấm men chủ yếu sử dụng là P.
fermentans. Tuy nhiên, một số nghiên cứu tại Châu Á sản xuất FLF từ nguyên
liệu thức ăn thô xanh sử dụng chủ yếu Candida milleri (60%), Kazachstania
bulderi (20%), Saccharomyces cerevisiae (20%). Đối với vi sinh vật phân giải
chất xơ, vi khuẩn thuộc chi Bacillus, chủ yếu là Bacillus subtilis, B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens được sử dụng. Nhóm vi khuẩn này vừa có

5
hoạt tính phân giải chất xơ, giàu enzyme thủy phân và có hoạt tính probiotic
(Gori et al., 2011)
Năm 2002 sử dụng hai chế phẩm: chất A có L. plantarum và
Enterococcus faccium và chất B là L. plantarum và Bacillus subtilis để ủ chua
cây cao lương tại Trung Quốc cho thấy tác dung rõ rệt khi ủ đơn chủng, cụ thể là
làm giảm nhanh độ pH, tăng hàm lượng axit lactic (Wutai et al., 2002). Dùng
probiotic cho lợn với L. acidophilus (lô 1), Streptococcus faecium (lô 2), hoặc
phối hợp giữa L. acidophilus với S. faecium (lô 3), hoặc giữa L. acidophilus với
S. faecium, L. casei, LactoBacillus fermentum và L. plantarum (lô 4). Để kiểm
tra sự tồn tại trong hệ tiêu hóa của lợn của VK E. coli Q157, ông đã trộn các VK
trên với liều 6 x l06
CFU/kg thức ăn liên tục trong 7 tuần. Kết quả cho thấy lô 4
có sự tồn tại trong hệ tiêu hóa của lợn của VK E. coli trong phân cao hơn các lô
khác. Khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng
probiotic (Lema et al., 2001). Đã sử dụng 2 chủng L. plantarum và L.
acidophilus được phân lập từ ruột lợn để sử dụng làm chế phẩm probiotic
(Balasingham et al., 2017). Nghiên cứu sự ảnh hưởng của VK probiotic L.
reuteri ZJ625, L. reuteri VB4, L. salivarius ZJ614 và Streptococcus salivarius
NBRC13956 trong chăn nuôi lợn. Kết quả cho thấy khi sử dụng các chủng VK
này đã làm giảm hiệu chứng tiêu chảy của lợn sau cai sữa (Dlamini et al., 2017).
1.1.3. Một số đặc điểm của thức ăn thô xanh lên men dạng lỏng
Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của thức ăn lỏng lên men. Các yếu
tố ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm cuối cùng bao gồm các loại VSV ban
đầu, số lượng và chất lượng cơ chất cũng như các thông số lên men khác nhau.
Số lượng vi khuẩn lactic (LAB) có mặt thực tế trong thức ăn chăn nuôi hoặc số
lượng LAB được thêm vào quyết định đến mức độ sản sinh axit lactic. Số lượng
LAB nhiều sẽ làm sự sản sinh vi khuẩn lactic diễn ra nhanh hơn so với quá trình
sản sinh các vi khuẩn gây bệnh như Salmonella hoặc E. coli. (Missotten et al.,
2010, Missotten et al., 2015). Thành phần các loài vi khuẩn trong lên men thức
ăn chăn nuôi dạng lỏng thay đổi trong suốt quá trình lên men, họ chỉ ra rằng
Pediococus pentosaceus có mật độ chủ yếu khi bắt đầu xảy ra sự lên men, nhưng
sau 3 ngày, LactoBacillus plantarum trở thành loài có mật độ chủ yếu (Olstorpe
et al., 2008)
Sự phân bố và có mặt của nấm men cũng làm ảnh hưởng đến chất lượng
của thức ăn lên men cả tích cực và tiêu cực. Nấm men có khả năng gắn kết các

6
vi khuẩn có trong ruột trên bề mặt của chúng, bằng cách gây trở ngại trong gắn
kết các vi khuẩn này với biểu mô ruột. Do đó, nồng độ nấm men cao trong thức
ăn chăn nuôi lên men dạng lỏng sẽ làm giảm các bệnh về đường tiêu hóa.
Các thông số khác như nhiệt độ lên men, pH, tỷ lệ nước trong thức ăn
cũng có thể ảnh hưởng đến các đặc điểm của thức ăn chăn nuôi lên men dạng
lỏng. Một số nghiên cứu báo cáo rằng nên lên men thức ăn chăn nuôi ở nhiệt độ
ít nhất là 20°C với pH < 4.5 vì các nguồn bệnh từ ruột như E. coli và Salmonella
không chịu được giá trị pH < 4.5 (Jensen 1998). Trong nghiên cứu về ảnh hưởng
của nhiệt độ lên men đến sự loại trừ Salmonella, kết quả cho thấy thời gian yêu
cầu để hạn chế các vi khuẩn này ở 30o
C ngắn hơn nhiều so với ở 20o
C. Do đó,
dù nhiệt độ tối thiểu được lựa chọn tối ưu cho lên men thức ăn chăn nuôi dạng
lỏng là 20o
C thì ở nhiệt độ 30o
C vẫn thích hợp hơn cho phép sản sinh axit lactic
nhanh hơn và sự loại trừ các nguồn bệnh liên quan đến ruột cũng diễn ra nhanh
hơn (Jensen 1998).
Lượng nước trong quá trình ủ men cũng ảnh hưởng đến chất lượng thức
ăn lên men. Tỷ lệ nước trong thức ăn thường được sử dụng cho sản xuất thức ăn
dạng lỏng hoặc lên men thức ăn dạng lỏng có thể dao động giữa 1:1,5 và 1:4,0
(Missotten et al., 2010, Missotten et al., 2015)
1.2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ NHÓM VI SINH
VẬT SỬ DỤNG LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH DẠNG LỎNG
1.2.1. Vi sinh vật lên men lactic
Trong quá trình lên men, VK lactic sinh ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic
và ức chế sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản
phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng
bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển
chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm
pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm ngưng quá trình trao đổi chất, gây chết những tế
bào nhạy cảm với axit lactic, loại trừ những VSV gây hại trong đường ruột.
Chẳng hạn như các VSV gây bệnh như E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và
trẻ em), Salmonella Typhimurium, Salmonella cholerasuis (gây sốt thương
hàn),… (Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo 1996, Kiều Hữu Ảnh 1999)

7
1.2.2. Vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào
Đối với vi sinh vật phân giải chất xơ, vi khuẩn thuộc chi Bacillus có hoạt
tính phân giải chất xơ, giàu enzyme thủy phân và có hoạt tính probiotic (Gori et
al., 2011) là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus. Nhiều loài VK cũng có
khả năng này nhưng số lượng và thành phần các loại enzyme không đầy đủ, chủ
yếu chỉ sinh endoglucanase. Riêng Bacillus là chi sinh cellulose khá cao, chúng
chủ yếu được phân lập từ đất vườn nơi có nguồn xác bã hữu cơ (rơm, rạ, mụn
dừa,..) dồi dào. Ví dụ như, cellulase từ B. subtilis (Gori et al., 2011). … Đặc biệt
là đối với một số vật nuôi ăn thực vật thì hệ vi khuẩn đường ruột như Bacillus,
PaeniBacillus… có khả năng phân hủy cellulose rất tốt (Schwarz et al., 2001).
Rút ngắn thời gian phân hủy thức ăn thô xanh.
Các chủng Bacillus spp., có vai trò quan trọng nhờ khả năng tổng hợp
nhiều sản phẩm thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và đặc
biệt là enzyme,....(Smith et al., 2000). Bacillus có thể tiết ra hoạt tính cao của
nhiều loại enzyme như protease, lipase, amylase và cellulase. Ví dụ, B.
amyloliquefaciens là chủng vi khuẩn có lợi, tiềm năng quan trọng đã được thấy
tiết ra cellulase và được áp dụng cho nhiều loại thức ăn của động vật có vú để
cải thiện môi trường vi khuẩn đường ruột của chúng. Trong số các VSV sinh α-
amylase, Bacillus gần như có số loài lớn nhất. Hầu như các loài thuộc chi này
đều có thể tìm thấy các chủng sinh α-amylase, ví dụ như B. subtilis , B.
stearothermophilus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. circulans, B.
coagulan, B. caldoliticus, B. acidocodaricus, B. megaterium…, trong đó B.
subtilis, B. stearothermophilus, B. licheniformis và B. amyloliquefaciens, được
biết đến là những loài sản xuất amylase tốt và được sử dụng rộng rãi trong sản
xuất thương mại cho các ứng dụng khác nhau (Sundarram, Murthy 2014). Ngoài
ra, trong quá trình sinh trưởng, chi Bacillus còn sinh các loại enzyme ngoại bào
khác như alkaline phosphatase, galactosidase, chitinase, isomerase, glucanase,
urease... đây là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus (Priest 1977).
Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng, Bacillus có khả năng kiểm soát một số
vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên lợn, điều này có thể là do khả năng sinh một
số enzyme ngoại bào của chúng. Một số chế phẩm vi sinh có Bacillus được bổ
sung vào khẩu phần của lợn như Toyocerin® đã làm giảm mức độ nghiêm trọng
của bệnh tiêu chảy, giảm tỷ lệ mắc bệnh ở lợn con trong thử nghiệm với vi
khuẩn gây bệnh đường ruột E. coli (Williams et al., 2009). Rotease và cellulase

8
cũng ức chế sự tăng trưởng của một số vi sinh vật gây bệnh vì thành tế bào của
chủng VSV gây bệnh đó có thành phần là cellulose, protein, điển hình là B.
licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, và B. majovensis (Son, Kim
2002)
Nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm vi khuẩn Bacillus có thể chuyển
hóa các chất như cellulose, tinh bột, protein thành các axit amin và glucose dễ
hấp thụ, góp phần cải thiện dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật
nuôi tăng trọng nhanh, đặc biệt là lợn con ở giai đoạn sau cai sữa. Do vậy, có thể
nói khả năng sinh enzyme thủy phân các hợp chất hữu cơ là một đặc tính rất cần
thiết trong việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo chế phẩm probiotic tiềm
năng trong chăn nuôi.
1.2.3. Nấm men tích lũy protein đơn bào
Sinh khối nấm men được sử dụng rộng rãi như nguồn cung cấp protein
cho người và động vật trong thức ăn chăn nuôi hoặc các sản phẩm bổ sung cho
con người. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng chủng nấm men S. cerevisiae để sản
xuất protein đơn bào, glucan, carotenoid (Mata-Gómez et al., 2014). Nhiều phế
phụ phẩm công-nông nghiệp đã được sử dụng làm nguồn cơ chất để sản xuất
sinh khối nấm men trên quy mô công nghiệp, đặc biệt là rỉ đường. Hiện nay,
Saccharomyces cerevisiae là chủng nấm men không chỉ được ứng dụng rộng rãi
trong ngành lên men đồ uống và sản xuất protein đơn bào mà còn được bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi.
Thuật ngữ protein đơn bào mới hình hành trong giới khoa học từ những
năm 50 của thế kỷ trước. Thực tế loài người đã biết sử dụng loại protein này và
các chất có trong tế bào VSV từ rất lâu. Protein đơn bào (SPC-Single cell
protein) là thuật ngữ chỉ một loại chất dinh dưỡng có trong tế bào và chỉ sản xuất
từ VSV, được sử dụng làm thức ăn cho người và động vật. Thuật ngữ này không
chỉ đơn giản là protein từ tế bào của cơ thể đơn bào, vì rất nhiều VSV không
phải là cơ thể đơn bào mà người ta vẫn khai thác chúng. Do đó, thuật ngữ này
nên hiểu là nguồn dinh dưỡng chứa nhiều protein từ VSV khác nhau, cả đơn bào
lẫn đa bào (từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tảo) (Nasseri, Khaviari 2011).
Được sử dụng trước hết là nguồn protein trong dinh dưỡng động vật, chủ yếu là
trong chăn nuôi.

9
Protein đơn bào là tế bào khô của vi sinh vật, được sử dụng làm chất bổ
sung protein trong thức ăn của con người hoặc thức ăn chăn nuôi. Các vi sinh
vật như tảo, nấm, nấm men và vi khuẩn, sử dụng nguyên liệu và chất thải không
tốn kém như nguồn carbon và năng lượng để tăng trưởng để sản xuất sinh khối,
protein cô đặc hoặc axit amin. Vì protein chiếm một phần quan trọng về số
lượng của các tế bào vi sinh vật, các vi sinh vật này, còn được gọi là protein đơn
bào như là tập trung protein tự nhiên. Với sự tiêu tốn về thức ăn chăn nuôi công
nghiệp, việc sử dụng sinh khối vi sinh vật như thức ăn được quan tâm hơn
(Suarez, Guevara 2018). Một số loài chủ yếu sử dụng trong quá trình lên men
thức ăn thô xanh là Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii, S. unisporus
(Bhattacharya et al., 2014).
1.2.4. Yêu cầu về an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong chăn
nuôi
Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của Cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh
học, nhóm tác nhân sinh học vi sinh vật được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong
đó chỉ các VSV ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất. Các loài thuộc
Bacillus bài tiết các enzyme thủy phân có khả năng phá vỡ vách tế bào, sinh
tổng hợp một loạt các loại thuốc kháng sinh như iturin, surfactin (Tsuge et al.,
2001), fengycin (Phister et al., 2004), bacillomycin và mycosubtilin
(Ramarathnam et al., 2007). Về tính an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong
chăn nôi: Các chủng probiotic sử dụng cho động vật thủy sản được sử dụng hiện
nay chủ yếu là các chủng L. acidophilus, B. subtilis, S. cerevisiae, dùng bổ sung
vào thức ăn. Vi khuẩn lactic được xem là vi sinh vật an toàn (Generally
Recognized as Safe, GRAS) và được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp
thực phẩm, dược phẩm và y tế,... LactoBacillus plantarum là một trong những
loài LAB phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực
phẩm, chăn nuôi (Saboda et al., 2014).
1.2.5. Một số đặc tính sinh học của nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên
men thức ăn chăn nuôi
Đặc tính ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Bacteriocin, được sinh tổng hợp
bởi LAB, là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng hợp
theo con đường ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Bacteriocin
không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người. Do tính an toàn và
những đặc tính đặc biệt nên không những chỉ vi khuẩn LAB mà còn cả

10
bacteriocin do vi khuẩn này sinh tổng hợp ra được nghiên cứu rộng rãi
(Bromberg et al., 2004). Sinh enzyme ngoại bào: trong quá trình sống, các nhóm
vi sinh vật thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học cần thiết để thích
ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện MT sống. Ngoài cellulase chúng còn có
khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như protease, amylase, alkaline
phosohatase, glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose, isomerase,
glucanase, lipase, urease... đây một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus. Trong
đó, Bacillus là một trong số các VSV có khả năng sinh protease nhiều nhất, đặc
biệt là protease kiềm tính. Đặc biệt, so với amylase lấy từ động vật và vi nấm thì
amylase từ Bacillus bền hơn trong môi trường axit của dạ dày (Gupta, Westney
2003). Sự cạnh tranh sinh học. Trong môi trường tự nhiên luôn có sẵn hệ vi sinh
vật ở trạng thái cân bằng tạo nên hệ sinh thái đặc trưng bản địa để duy trì sự
sống. Trong ruột động vật có hơn 500 loài vi sinh vật cộng sinh có tác dụng hỗ
trợ tiêu hóa, cung cấp chất dinh dưỡng và điều biến miễn dịch. Sự mất cân bằng
hệ sinh thái đường ruột xảy ra khi vi khuẩn gây bệnh có điều kiện phát triển
mạnh hơn.
Khả năng chịu pH axit và muối mật (0,3%) là một trong những tiêu chí
quan trọng cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn cho lên men thức ăn vì đây là
những yếu tố chính quyết định khả năng sống sót của vi khuẩn trong dạ dày
(Saarela et al., 2000). Chủng L. plantarum ZlP001 phân lập từ ruột lợn cho thấy
khả năng sống sót tới 85,3;61,4 và 9,4% khi tiếp xúc với 0,1;0,3 và 0,5% muối
mật trong môi trường nuôi cấy (Wang et al., 2012). Các chủng L. plantarum 03,
L. plantarum 06, L. plantarum 21, L. plantarum 28 và L. plantarum 30 đã chịu
đựng muối mật với hàm lượng lên tới 0,3% (Dowarah et al., 2018). Một số tác
giả cũng đưa ra khả năng chịu pH thấp của hai chủng L. reuteri BFE1058 và L.
johnsonii BFE1061 phân lập từ phân lợn có thể phát triển ở pH thấp 3,0 và 4,0
trong 6 giờ ở 37°C (Du Toit et al., 1998). Các chủng L. lactis và Enterococcus
faecium cho thấy khả năng chịu đựng pH axit tốt hơn L. casei và P. acidilactici
(Guerra et al., 2007). Chủng Lacp29 có khả năng sống sót ở pH axit nhưng
không thể tồn tại ở môi trường chứa 0,3% muối mật (Dowarah et al., 2018). B.
racemilacticus và B. coagulans có thể chịu đựng được nồng độ muối mật trên
0,3% (Dowarah et al., 2018); một vài chủng khác như B. pasteurii, B.
seohaeanensis, B. pantothenticus,… có thể ST ở nồng độ NaCl 10%. Đặc biệt,
nhờ khả năng sinh bào tử mà rất nhiều loài Bacillus có khả năng sinh trưởng và
sống sót trong MT axit cũng như trong MT kiềm. Ví dụ như chủng B.

11
laevolacticus DSM 6475 có thể phát triển ở pH 2-3. Còn B. alcalophilus và B.
pasteurii có thể ST tốt ở pH 8-11 (Dowarah et al., 2018). Chính nhờ những đặc
tính ưu việt nêu trên cùng với khả năng dễ bảo quản ở điều kiện thường,
Bacillus, LAB được đánh giá là một trong những đối tượng giàu tiềm năng khai
thác trong lĩnh vực sản xuất chế phẩm vi sinh ứng dụng trong chăn nuôi.
1.3. HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN THỨC ĂN
THÔ XANH DẠNG LỎNG
Một số nghiên cứu cũng cho rằng, thức ăn lên men dạng lỏng là một trong
những cách làm cho lợn ăn hiệu quả nhất để thay thế việc sử dụng các chất kích
thích tăng trưởng kháng sinh. Tác dụng có lợi đã được quan sát ở lơn sữa, lợn
cai sữa và lợn đang trưởng thành. Sự cải thiện đáng kể này là liên quan đến tỷ lệ
mầm bệnh có trong dạ dày và ruột lợn. (Kil, Stein 2010)
Lợn con mới sinh có đường ruột sạch, ít vi sinh, hệ sinh vật rất đặc trưng
nhờ tiếp xúc với mẹ và môi trường (Konstantinov et al., 2006). Giai đoạn ngay
sau khi sinh là quan trọng nhất để thiết lập hệ vi khuẩn có lợi, có thể dẫn đến 1
hệ vi sinh ổn định, lâu dài. Vì vậy, chế độ ăn của lợn nái rất ảnh hưởng đến quần
thể vi khuẩn trong ruột của con non (Kenny et al., 2011). Lợn con có lợn mẹ
được cho ăn thức ăn lên men dạng lỏng có số lượng VK Coliform trong phân
thấp hơn so với lợn con từ lợn mẹ chỉ được cho ăn thức ăn lỏng không lên men
hoặc chế độ ăn khô. Ngoài ra, số lượng LAB cao hơn trong phân của lợn con
cũng từ lợn mẹ được cho ăn thức ăn lên men lỏng so với các Lợn con khác. Đây
có thể là một dấu hiệu cho thấy việc sử dụng đúng chủng vi khuẩn sinh học để
sản xuất thức ăn lên men dạng lỏng có thể dẫn đến việc hình thành hệ vi sinh của
lợn con trong suốt chu kỳ sống.
Hiệu quả sử dụng thức ăn lên men dạng lỏng cho lợn đang phát triển và
lợn cai sữa là khác nhau. Các tác giả Jensen và Mikkelsen đã tóm tắt kết quả của
9 thử nghiệm in vivo, kết quả cho thấy, sự cải thiện về hiệu suất ở lợn trưởng
thành không cao bằng lợn cai sữa, nhưng có một số lợi ích về chất lượng thân
thịt (Jensen 1998, Mikkelsen, Jensen 1998). Sự có mặt của thức ăn lên men dạng
lỏng đã được chứng minh là làm thay đổi sự chuyển đổi của tryptophan trong
ruột thành dạng indole thay vì skatole, dẫn đến nồng độ skatole giảm trong mỡ
lưng của lợn đực và do đó làm giảm chất béo của lợn đực (Kjeldsen 1993).

12
Những cải thiện đáng kể về khả năng tiêu hóa các chất hữu cơ, nitơ và
canxi đã được báo cáo. Một số giả thuyết cho rằng, sự caỉ thiện này là việc cho
ăn thức ăn lên men dạng lỏng đã làm thay đổi hình thái của đường tiêu hóa.
Scholten và cộng sự đã báo cáo rằng lợn được cho ăn thức ăn lỏng lên men có
chiều dài lông nhung lớn hơn đáng kể và tỷ lệ lông/diện tích lớn hơn, cả hai đặc
điểm đều có liên quan đến khả năng tiêu hóa. Quá trình lên men của thức ăn đã
được chứng minh là cần phốt pho, vì vậy photpho được lấy từ phytate bằng cách
kích hoạt phytase nội sinh, kết quả trong nghiên cứu của Lyberg báo cáo tỷ lệ
tiêu hóa ở lợn được cho ăn thức ăn lên men dạng lỏng cao hơn so với thức ăn
khô (30 so với 48%) (Scholten et al., 2002).
Một ưu điểm khác của thức ăn lên men lỏng là khả năng làm giảm hàm
lượng các yếu tố kháng dinh dưỡng khác nhau có trong thức ăn, theo báo cáo
của chế độ ăn lên men dựa trên hạt cải dầu đã báo cáo là giảm 17%
isothiocyanates sau 1 ngày lên men và giảm 68% sau 3 ngày lên men. Lên men
đậu trong 96 giờ làm giảm nồng độ các yếu tố chống dinh dưỡng như α
galactoside, phytate, chất ức chế trypsin, tannin và saponin (Chiang et al., 2009).
Điều này cũng được thấy trong nghiên cứu của cho quá trình lên men của đậu
đũa và đậu tương. Tuy nhiên, trong quá trình lên men đậu nành, chất ức chế có
trypsin tăng nhẹ (Egounlety, Aworh 2003).
Ngoài ra, việc lượng bụi được giảm trong chuồng lợn trong quá trình xử
lý và cho ăn thức ăn dạng lỏng đã được ghi nhận. Việc giảm như vậy không chỉ
cải thiện môi trường cho lợn và con người mà còn có thể giúp làm giảm tác động
của các bệnh về đường hô hấp của lợn.
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM VI SINH
TRONG LÊN MEN THỨC ĂN CHO LỢN VIỆT NAM
Tại Việt Nam, đa số chế phẩm sinh học áp dụng thành công đều chứa đa
enzyme, probiotics, nấm men có khả năng thủy phân và phân giải tinh bột, xơ
(xylanase, amylase, protease, glucanase, phytase, pectinase, cellulase, mannase).
Sử dụng chế phẩm sinh học để lên men thức ăn chăn nuôi đều cho hiệu quả kinh
tế cao: tăng trọng lượng trung bình của động vật lên 5-10%, giảm thức ăn trên
một kg trọng lượng, tăng năng suất đẻ trứng, tăng năng suất sữa, tăng khả năng
hấp thụ protein và giảm ô nhiễm môi trường. Năm 2004, Trần Thạnh Phong
(Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ-TP HCM) đã thực hiện đề tài
“Khảo sát khả năng sinh tổng hợp xylanase từ Trichoderma reesei và A. niger

13
trên môi trường lên men bán rắn”. Kết quả nghiên cứu đã đã tạo chế phẩm sinh
học từ bã mía dùng bảo quản cỏ xanh làm thức ăn cho gia súc, tận dụng nguồn
phế liệu bã mía kết hợp với cám mì, dùng phương pháp công nghệ sinh học (lên
men bán rắn) để tổng hợp thành chế phẩm sinh học chủ yếu là xylanase. Chế
phẩm này kết hợp với chế phẩm VEM (chứa nhóm vi khuẩn lactic và nấm men)
dùng vào việc ủ cỏ xanh (hoặc các phế phẩm nông nghiệp khác như bắp, đậu) có
tác dụng duy trì giá trị dinh dưỡng của cỏ như lúc mới thu hoạch trong thời gian
dài. Giải pháp này đã thiết thực đáp ứng cho vấn đề bảo quản dự trữ nguồn thức
ăn cho gia súc. Năm 2007- 2010, PGS. TS. Quyền Đình Thi đã thực hiện đề tài
cấp Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng
chế phẩm đa enzym có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng
cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”. Nhóm nghiên cứu đã sàng lọc được
một số chủng tự nhiên và tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp
các xylanase, protease, glucanase và mannanasecao. Từ đó đã xây dựng được
các quy trình tạo chế phẩm đa enzyme từ chủng tái tổ hợp bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi (Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên 2007-2010). Tuy nhiên chế phẩm
này vẫn đang tiếp tục được phát triển nhằm ứng dụng vào thị trường thức ăn
trong chăn nuôi trong nước.
Năm 2006-2009, Trần Quốc Việt và cs đã thực hiện đề tài "Nghiên cứu
sản xuất probiotic và emzym tiêu hoá dùng trong chăn nuôi", trong đó đã phân
lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích, bước đầu các xác định điều
kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vậttuyển chọn và tạo tổ hợp
các chủng vi khuẩn hữu ích có các đặc tính probiotic. Chế phẩm probiotic đa
chủng dạng bột có thành phần chính gồm 6 chủng vi khuẩn có ích (04 chủng vi
khuẩn lactic, 01 chủng vi khuẩn Bacillus và 01 chủng nấm men). Sử dụng chế
phẩm vi sinh vật bổ sung trực tiếp vào thức ăn chăn nuôi đã cải thiệntốc độ sinh
trưởng ở lợn và gà từ 5-16%, giảm tỷ lệ tiêu chảy ở lợn 32%. Ngoài ra, đề tài đã
sản xuất chế phẩm đa enzyme dạng bột có thành phần chính gồm amylase (2210
IU/g); protease (110IU/g); cellulase (1116 IU/g); beta-glucanase (200 IU/g) và
xylanase (1000 IU/g) giúp cải thiệntốc độ sinh trưởng ở lợn và gà từ 6-11%,
tăng hiệu quả sử dụng thức ăn ở lợn và gà từ 5-9% (Trần Quốc Việt 2008).
Năm 2012-2013, TS. Lê Văn Ty thực hiện đề tài cấp Sở khoa học tỉnh
Sơn La “Nghiên cứu lên men lõi ngô với nấm mốc Aspergillus, sản xuất chế
phẩm đa enzyme, bổ sung làm gia tăng mức tiêu hóa hấp thu, giảm tiêu tốn thức

14
ăn trong chăn nuôi gia cầm và gia súc”. Trong đề tài nhóm tác giả đã tạo ra
được quy trình sản xuất chế phẩm Sonlazyme từ chủng A. oryzae VTCC F0187
có chứa 4 loại xylanase, protease, glucanase và mannanase hoạt lực cao bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi.
Nhìn chung, cho đến nay chưa có đề tài nghiên cứu nào khai thác tạo chế
phẩm sinh học giúp chuyển hóa thức ăn thô xanh thành thức ăn có chất lượng
đáp ứng yêu cầu phát triển chăn nuôi lợn hữu cơ thâm canh.
Trong thời gian vừa qua, nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ sinh học
kết hợp với Đại học Bách khoa Hà Nội đã bước đầu nghiên cứu sàng lọc các
chủng vi sinh vật chức năng theo các đặc tính trên để xử lý thức ăn thô xanh kết
hợp với nguồn nitơ từ vỏ đỗ, nitơ vô cơ cùng các thảo dược ức chế vi sinh vật
tạp nhiễm. Thức ăn dạng lỏng bước đầu khảo sát trên đàn lợn quy mô 5 con/mô
hình tại Công ty CP Chăn nuôi T&T 159 cho kết quả khả quan về hiệu quả sản
xuất thức ăn (giá thành <5.000 đồng/kg thức ăn khô; tỷ lệ tăng trọng tương
đương với mô hình sử dụng thức ăn công nghiệp (giá thành >10 nghìn/kg thức
ăn khô). Ngoài ra, khi sử dụng FLF, doanh nghiệp đánh giá hiệu quả về kinh tế,
không sử dụng kháng sinh và chất bảo quản độc hại, chất lượng thịt của đàn lợn
tương đương với sử dụng thức ăn công nghiệp. Đặc biệt, công nghệ nuôi giảm
mùi hôi trong chất thải và nước thải chăn nuôi do có thể do các vi sinh vật
probiotics còn tồn tại trong chất thải. Theo đánh giá chung, quy trình tạo chế
phẩm vi sinh vật và FLF từ nguồn thức ăn thô xanh cần nghiên cứu thêm đáp
ứng nhu cầu sản xuất tập trung và mở rộng ứng dụng.
Xuất phát từ các luận điểm trên, việc thực hiện đề tài nghiên cứu sản xuất
chế phẩm vi sinh phù hợp và quy trình áp dụng xử lý thức ăn thô xanh thành
thức ăn lỏng cho chăn nuôi có ý nghĩa thực tế, đáp ứng yêu cầu thực tế của
doanh nghiệp và các hộ chăn nuôi.

15
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật
Bốn mươi bẩy chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, 24 chủng vi khuẩn
lactic, 14 chủng nấm men có nguồn gốc phân lập từ 10 mẫu phân lợn trưởng
thành, khỏe mạnh và 10 mẫu thức ăn ủ chua phụ phẩm nông nghiệp trên địa bàn
tỉnh Phú Thọ trong bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công
nghệ sinh học.
Thức ăn xanh: Cỏ voi, rau lang được trồng và thu hoạch tại Khoa Chăn
nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
Các chủng vi khuẩn kiểm định: Salmonella enterica subsp. enterica
serovar Typhimurium ATCC 14028 (Salmonella Typhimurium ATCC 14028),
Escherichia coli ATCC 11105, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 nhận
từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất: Cao nấm men (Himedia, Ấn Độ); (Chameleon, Nhật Bản);
Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)
(BioLabs, Mỹ); Phenol (Trung Quốc), Isoamylalcohol (Trung Quốc), Glycerol
(Trung Quốc), Ethanol (Trung Quốc), Chloroform (Trung Quốc), Agarose
(Merck, Đức); Thạch (Việt Nam) và một số hóa chất khác.
Thiết bị nghiên cứu: tủ nuôi (Biotek, Mỹ), máy ly tâm (Eppendorf, Đức),
lò vi sóng (Sam Sung, Hàn Quốc), máy lắc ổn nhiệt (CPT inc, Hàn Quốc), máy
chạy điện di (Mupid, Nhật Bản), máy PCR (Applied biosystems, Mỹ), máy đo
OD (S-300 nano, Optima, Nhật Bản), máy đọc Elisa (Biotek, Mỹ), nồi hấp khử
trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản); Máy đo pH (Nhật Bản); Tủ sấy (Mỹ) và một
số thiết bị nghiên cứu khác.
2.1.3. Môi trường nghiên cứu
Các môi trường được sử dụng trong tuyển chọn chủng nuôi cấy, đánh giá
khả năng kháng VSV kiểm định và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng
VSV (Phụ lục 1).

16
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân tích hóa sinh
1) Nhuộm Gram
Nhộm Gram được mô tả theo phương pháp của Garrity et al., (2004).
2) Xác định hoạt tính catalase
Hoạt tính catalase được mô tả theo phương pháp của Garrity et al.,
(2004).
3) Xác định hoạt tính các enzyme ngoại bào
Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn được kiểm tra bằng
phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa môi trường khoáng MK có bổ
sung các cơ chất tương ứng trong thời gian 1 - 3 ngày ở 37o
C như sau: Bổ sung
1 % (w/v) casein để kiểm tra hoạt tính protease; bổ sung 1% CMC (cacboxyl
metyl cellulose) để kiểm tra hoạt tính cellulase; bổ sung 1 % (w/v) xylan để xác
định hoạt tính xylanase (Brooks 2003). Hoạt tính enzyme được xác định bằng
chỉ số D-d (mm) sau 1 - 3 ngày nuôi cấy (D là đường kính vòng phân giải, d –
độ lớn của các khuẩn lạc vi khuẩn phát triển) (Gusils et al., 2002).
4) Xác định hoạt tính cellulase
Hoạt độ cellulase trong dịch nuôi cấy được xác định bằng phương pháp
axit dinitrosalicyclic (DNS) (Miller 1959). Một đơn vị hoạt độ enzyme được
định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để thủy phân cơ chất giải phóng ra 1 μM
glucose trong một phút dưới điều kiện phản ứng (Gusils et al., 2002).
5) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic
a) Xác định khả năng sinh axit tổng số bằng phương pháp cấy chấm điểm
trên môi trường có bổ sung CaCO3 (Chiang et al., 2015)
b) Định tính khả năng sinh axit lactic bằng thuốc thử Uphenmen
Chủng giống được nuôi trong môi trường MRS lỏng ở 37o
C trong 48 giờ.
Ly tâm 5000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men. Cho
50 µl dịch lên men vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Uphenmen, ống đối
chứng: 2 ml thuốc thử Uphenmen. Quan sát và ghi nhận sự chuyển màu của
thuốc thử: Màu vàng tạo thành càng đậm chứng tỏ lactic axit được tạo ra càng
nhiều (Trần Thị Ái Liên 2011).

17
c) Định lượng axit lactic bằng phương pháp quang phổ
* Cơ sở của phương pháp là dựa vào sự thay đổi bước sóng hấp thu cực
đại của phản ứng giữa sắt (III) clorua và dung dịch axit lactic dẫn đến sự hình
thành sắt (III) lactat màu vàng, được hấp phụ cực đại ở bước sóng 390 nm. Hàm
lượng axit lactic được xác định thông qua đường chuẩn axit lactic
(Borshchevskaya et al., 2016).
12
(g/l)
10 y = 12,253x - 0,3215
R² = 0,9991
lactic
8
acid
6
4
độ
Nồng
2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Giá trị hấp phụ cực đại tại 390 nm
Hình 2.1. Đường chuẩn axit lactic
* Xác định hàm lượng axit lactic của chủng vi khuẩn
Nuôi lắc các chủng VK trên MRS lỏng ở 37o
C trong 48 giờ. Ly tâm 5000
vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch lên men. Tiến hành phản
ứng: 50 µl dịch lên men + 2 ml FeCl3 (0,2%); trộn đều. Sau đó hỗn hợp được đo
độ hấp phụ quang phổ ở bước sóng 390 nm. Hàm lượng axit lactic của chủng
VSV được tính theo công thức sau:
Y (mg/ml) = (12,253 X ∆ - 0,3215) X D
Trong đó: ∆: giá trị hấp phụ cực đại ở bước sóng 390 nm.
D: hệ số pha loãng.
6)Xác định lượng sinh khối khô
Các chủng nấm men được nuôi trong ống nghiệm Hansen lỏng (10 ml) ở
30ºC, lắc 200 vòng/phút. Sau 48 giờ, li tâm thu sinh khối và xác định lượng sinh
khối khô bằng cách sấy 80ºC và cân đến khối lượng không đổi (Rajashree,
Muthukumar 2013).

18
7) Xác định hàm lượng protein thô trong tế bào
Để sàng lọc các chủng nấm men tạo ra hàm lượng protein cao, mỗi chủng
được nuôi cấy trong 10 ml Hansen lỏng và được ủ ở 30ºC trong 48 giờ. Các tế
bào nấm men được thu thập bằng cách ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút trong
10 phút. Các tế bào được rửa bằng nước cất ba lần và được tái huyền phù trong
dung dịch đệm ly giải. Sau đó, huyền phù tế bào được ủ trong 20 phút trong điều
kiện lắc ở nhiệt độ phòng để tách tế bào. Sau khi ủ, mẫu được siêu âm trong 5
phút với đệm đồng nhất (Cole-Parmer Dụng cụ, Vernon Hills, Illinois, Hoa Kỳ)
để tăng phá tế bào và giải phóng protein. Hàm lượng protein sau đó được xác
định bằng phương pháp nhuộm Bradford (Shi, Li 2012).
8) Tuyển chọn các chủng có hoạt tính probiotic
a) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
* Nguyên tắc: Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy
VK vào môi trường thạch, hoạt tính ức chế dịch nuôi VK là tạo vòng vô khuẩn
quanh lỗ đục (Damayanti et al., 2014).
* Cách tiến hành
Nuôi lắc các chủng lactic trên MRS lỏng ở 37o
C trong 48 giờ và Bacillus
trên MPA lỏng ở 37o
C trong 24 giờ. Ly tâm 5000 vòng/phút (2 phút) để loại bỏ
sinh khối, thu dịch lên men của chủng VK lactic và chủng Bacillus. Cấy trang
VSV kiểm định lên môi trường MPA. Dùng khoan nút chai vô trùng (đường
kính d= 6 mm) khoan lỗ ở giữa đĩa chứa VSV kiểm định. Bổ sung dịch lên men
của chủng VK lactic, Bacillus nghiên cứu vào lỗ khoan. Đặt mẫu trong tủ lạnh
từ 4 – 8 giờ để dịch từ các lỗ khoan khuếch tán ra môi trường nuôi cấy VSV.
Sau đó để tủ nuôi 24 giờ. Quan sát vòng kháng khuẩn. Hoạt tính đối kháng được
xác định bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn theo công thức D – d
(mm).
Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
d: Đường kính lỗ thạch (mm)
b) Khả năng kháng kháng sinh
* Nguyên tắc: Các chất kháng sinh có thể khuếch tán trên môi trường
thạch, ức chế các VSV mẫn cảm với chúng và tạo ra vòng vô khuẩn. Những

19
VSV nào có khả năng kháng với chất kháng sinh thì có thể sinh trưởng và phát
triển (Damayanti et al., 2014).
* Cách tiến hành:
Giống khảo sát được hoạt hóa trên MRS lỏng ở 37o
C trong 48 giờ và
Bacillus trên MPA lỏng ở 30o
C trong 24 giờ. Trang 5 µl dịch nuôi cấy VK lên
đĩa chứa môi trường thạch MRS và trên môi trường thạch MPA. Đặt các khoanh
giấy đã được tẩm kháng sinh lên mặt thạch và để tủ lạnh trong 4 giờ. Sau đó để
tủ nuôi 37o
C và 30o
C. Quan sát kết quả sau 48 giờ nuôi cấy đối với VK lactic và
24 giờ đối với Bacillus. Độ nhạy kháng sinh được xác định bằng cách đo đường
kính vùng ức chế D – d (mm) như mô tả trước đó (Williams 1989). Chủng VK
được coi là nhạy cảm (S) với kháng sinh khi D – d > 10 mm, trung gian (I) khi
5,0 < D – d < 9,9 mm hoặc kháng (R) khi D – d < 4,9 mm.
c) Khả năng chịu muối mật
* Nguyên tắc: muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu
hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, VSV
probiotic khi qua ruột non chịu tác động của muối mật. Ở ruột non, nơi dịch mật
toàn phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2%. Khả năng sống sót sau
tác dụng của muối mật là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của VSV
probiotic.
* Cách tiến hành: Tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật với các
nồng độ muối mật 0,3%; 0,5%; 1%; 2%; 3% ở những thời điểm 0; 6; 12; 24 giờ
đối với VK lactic và những thời điểm 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ đối với VK Bacillus.
Chuẩn bị giống: LAB được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS lỏng, VK
Bacillus được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường MPA lỏng. Chuẩn bị môi
trường MRS lỏng và MPA lỏng có bổ sung mật lợn (Becton, Dickinson and
Company, USA) ở các nồng độ 0% (đối chứng); 0,3%; 0,5%; 1%, 2%. Dùng
pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107
– 108
tế bào/ml môi trường) vào môi
trường MRS lỏng và MPA lỏng có bổ sung mật lợn ở các nồng độ 0,3; 0,5; 1; 2
và đối chứng 0% (không chứa mật lợn). Nuôi ở nhiệt độ 37o
C và 30o
C. Tiến
hành đo OD ở bước sóng 630 nm ở các thời điểm 0; 6; 12; 24 giờ đối với VK
lactic và 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ đối với VK Bacillus. Ghi nhận kết quả. Tính tỷ lệ
tế bào sống sót thông qua mối tương quan giữa giá trị OD với mật độ tế bào tại
mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm (Menconi et al., 2014).

20
d) Khả năng chịu pH axit
* Nguyên tắc: dựa vào khả năng chịu pH axit (1 - 3) của các chủng
probiotic. Do vậy, chúng tôi khảo sát khả năng chịu đựng pH axit ở pH 1; 2; 3
tại các thời điểm từ 0; 6; 12; 24 giờ đối với VK lactic và 0; 3; 6; 9; 12; 24 giờ
đối với VK Bacillus
* Cách tiến hành: VK lactic được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường MRS
lỏng và VK Bacillus được nuôi cấy 24 giờ trong môi trường MPA lỏng. Chuẩn
bị môi trường MRS lỏng và MPA lỏng với pH 1; 2; 3 và mẫu đối chứng (pH 7).
Dùng pipet vô trùng hút 5 µl dịch nuôi cấy (107
– 108
tế bào /ml môi trường) vào
các môi trường đã chuẩn bị. Nuôi ở nhiệt độ 37o
C và 30o
C. Tiến hành đo OD ở
bước sóng 630 nm ở các thời điểm từ 0; 6; 12; 24 giờ. Ghi nhận kết quả. Tính tỷ
lệ tế bào sống sót thông qua mối tương quan giữa giá trị OD với mật độ tế bào
tại mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm (Menconi et al., 2014).
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại vi
sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử
a) Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Các chủng VSV được nuôi cấy trên môi trường thạch tương ứng ở 30o
C
(vi khuẩn trêm môi trường MPA và nấm men trên môi trường Hansen), vi khuẩn
lactic trên môi trường MRS (37o
C). Hình thái khuẩn lạc và khả năng phát triển
của chủng được quan sát sau 24 giờ và 48 giờ nuôi cấy (Dowarah et al., 2018).
b) Quan sát hình thái tế bào
Chủng VSV được nuôi trong môi trường lỏng MPA, MRS, Hansen ở
nhiệt độ 30o
C, 37o
C trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 18 - 20
giờ. Tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lactic trong dịch nuôi cấy được nhuộm Gram
và quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học Olympus BH2 (Dowarah et
al., 2018).
c) Xác định khả năng sử dụng nguồn carbon, nito
Khả năng sử dụng nguồn carbon của chủng vi khuẩn nghiên cứu được xác
định trên môi trường thạch MK trong các ống nghiệm có bổ sung 1% (w/v) các
nguồn đường/ nguồn nito khác nhau. Khử trùng các ống nghiệm chứa môi
trường thạch theo phương pháp Pasteur. Tiếp đó, cấy vi khuẩn vào các ống thạch
nghiêng và nuôi 1 - 3 ngày ở nhiệt độ 30o
C (đối với vi khuẩn, nấm men),

21
37o
C (đối với vi khuẩn lactic). Môi trường khoáng MK được lựa chọn làm đối
chứng âm. Quan sát khả năng phát triển trên các môi trường để xác định khả
năng sử dụng các nguồn carbon, nito khác nhau của các chủng VSV (Bayane et
al., 2006).
d) Xác định khả năng chịu muối và dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh
trưởng của vi khuẩn
Để xác định khả năng phát triển của VSV ở các nồng độ muối khác nhau,
VSV được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA (đối với vi khuẩn), MRS (đối
với vi khuẩn lactic) và Hansen (đối với nấm men). Các môi trường có bổ sung
NaCl nồng độ tăng dần từ 1 - 10% ở 25o
C (đối với nấm men), 37o
C (đối với vi
khuẩn và vi khuẩn lactic). Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường
sau 1 - 3 ngày nuôi cấy.
Để xác định dải nhiệt độ và pH thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn,
chủng vsv được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA (đối với vi khuẩn), MRS
(đối với vi khuẩn lactic) và Hansen (đối với nấm men) ở các nhiệt độ khác nhau
(10, 20, 30, 37, 40, 45 và 50o
C) và dải pH khác nhau (từ pH 2,0 – pH 12,0).
Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sau 1 - 3 ngày nuôi cấy
(Menconi et al., 2014)
e) Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật được tuyển chọn dựa trên
phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA (đối với vi khuẩn) và vùng ITS rDNA
(đối với nấm men)
DNA tổng số của vi khuẩn được tách theo phương pháp của Dowarah et
al. (2018). DNA tổng số của nấm men được tách chiết theo phương pháp (Souza
Liberal et al., 2005). Gen mã hóa 16S rDNA của VK được khuếch đại bằng
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’)
và 1429R (5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’). DNA tổng số của nấm men
tuyển chọn được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen mã hóa cho vùng ITS bằng
cặp mồi ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). Phản ứng PCR được thực hiện trong tổng
thể tích 50 µL có chứa 1 µL mẫu DNA của bộ gen (10 ng/µL), 5 µL của 10 x
Taq buffer, 1 µL dNTP (200 µM), 1 µL mồi xuôi và mồi ngược (0,5 µM) và Taq
DNA polymerase (0,05 U/µL) (MBI, Fermentas, Lithuania).

22
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích
thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang
DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit
PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình
tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và công
nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rDNA và vùng ITS và 28S rDNA được so
sánh với các trình tự gen tương ứng của các chủng vi khuẩn và nấm men trên
ngân hàng gen NCBI bằng công cụ BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
2.2.3. Lên men vi sinh vật tạo chế phẩm và phối trộn thức ăn thô
xanh lên men
1) Lên men, thu hồi sinh khối
a) Nhân giống vi sinh vật
Từ ống giống các chủng B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, L.
plantarum LTX28 và S. cerevisiae MTX14 được giữ trong glycerin -80ºC, giống
được lấy ra cho vào hộp đá (30 phút) để cho ống giống rã đông từ từ. Dùng que
cấy chuyển một vài mẫu giống sang ống nghiệm môi trường MPA lỏng (B.
subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18), MRS lỏng (L. plantarum LTX28) và
môi trường Hansen lỏng (S. cerevisiae MTX14). Các ống môi trường được cấy
giống được nuôi ở lắc 200 vòng/phút ở 30°C (vi khuẩn, nấm men) và 37o
C (VK
lactic) trong 18-20 giờ (vi khuẩn, VK lactic) và 48 giờ (nấm men). Các ống
giống cho thấy sự phát triển mạnh, thuần khiết (kiểm tra bằng phương pháp soi
kính hiển vi) được lựa chọn để cấy chuyển giống. Giống được chuyển với tỷ lệ
là 5% sang bình tam giác 500 ml chứa 150 ml môi trường lỏng đã chuẩn bị trước
đó. Các bình đã cấy chuyển giống được nuôi trên máy lắc: 200 vòng/phút, ở
nhiệt độ 30o
C/37o
C trong 18-20 giờ/48 giờ. Theo dõi, quan sát quá trình nhân
giống. Kiểm tra khả năng sinh trưởng và độ thuần khiết (soi kính hiển vi). Loại
bỏ những bình bị nhiễm, chết và thoái hóa, những bình giống thể hiện sự phát
triển chậm hay dịch môi trường đục bất thường. Giống sinh trưởng tốt và không
nhiễm được sử dụng để tiếp giống cho bình lên men.
b) Lên men các chủng tuyển chọn
Các chủng B. subtilis VTX16 và B. licheniformis VTX18 lên men trên
môi trường MTB3. Chủng L. plantarum LTX28 lên men trên môi trường MRS.

23
Chủng S. cerevisiae MTX14 lên men trên môi trường Hansen. Điều kiện lên
men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New Brunswick Scientific-Mỹ)
của các chủng B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, độ pH ban đầu 6,5 –
7,0; nhiệt độ 37ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít
môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48
giờ.
Điều kiện lên men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New
Brunswick Scientific-Mỹ) của chủng L. plantarum LTX28, độ pH ban đầu 6,0 –
6,5; nhiệt độ 37ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1 lít
môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48
giờ.
Điều kiện lên men trên hệ thống Bioflo 110 dung tích 10 lít (New
Brunswick Scientific-Mỹ) của chủng S. Cerevisiae MTX14, độ pH ban đầu 6,0
– 6,5; nhiệt độ 25ºC; Tốc độ khuấy 200 vòng/phút; tốc độ thổi khí 0,5 lít khí/ 1
lít môi trường/ 1phút; Dầu phá bọt: bổ sung nếu cần thiết; Thời gian lên men: 48
giờ.
c) Thu hồi sinh khối vi sinh vật
Từ 4 bình lên men của 4 chủng sẽ thu được sinh khối riêng rẽ của 4
chủng: B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, L. plantarum LTX28, và S.
cerevisiae MTX14. Sau quá trình lên men, thu toàn bộ dịch lên men và ly tâm
với tốc độ 7000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch trong, thu sinh khối, sinh
khối được rửa loại bỏ các thành phần môi trường với dung dịch NaCl 0,85%, sau
đó ly tâm với tốc độ 7000 vòng/phút, loại bỏ dịch trong, thu sinh khối. Sinh khối
của 4 chủng được trộn với glycerol 15% để bảo quản các mô sinh học bị đông.
Sinh khối của từng chủng dược cho vào từng khay được cho vào máy sấy đông
khô. Phương pháp giữu giống lạnh đông dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển
của vi sinh bằng cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu ở -25°C đến - 70°C.
2) Phối trộn, lên men thức ăn thô xanh và đánh giá thành phần dinh
dưỡng
a) Phối trộn khẩu phần
+ Phương pháp phối hợp khẩu phần: Đề tài lựa chọn tiêu chuẩn ăn của
Việt Nam (Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1547:1994 về thức ăn hỗn hợp cho lợn)

24
cho đối tượng lợn lai để phối hợp khẩu phần ăn. Chúng tôi sử dụng phần mềm
Pig diet Formulation để tiến hành phối hợp khẩu phần ăn cho lợn.
Thành phần dinh dưỡng của các nguyên liệu thức ăn được sử dụng để
phối hợp khẩu phần được trình bày tại (Bảng 2.1, Bảng 2.2).
Bảng 2.1. Thành phần hóa hóa học của các nguyên liệu thức ăn
Nguyên liệu DM ME Thành phần hóa học (%DM)
thức ăn (%) kcal/kg DM CP EE CF NDF ADF Ash
Bột ngô 89,15 3213 8,41 2,72 4,93 35,99 10,88 1,54
Bã bia 23,21 3116 28,06 8,03 14,45 51,36 18,40 4,35
Khô đỗ tương 89,23 3229 33,12 7,54 0,59 2,13 0,82 8,64
Bột cá 90,22 2621 42,28 6,32 2,37 7,66 3,01 26,66
NaCl 92,00 90,10
Premix 92,00 89,00
Cỏ voi 30 ngày 17,91 2077 13,29 2,37 34,72 65,82 36,38 12,87
Rau muống 13,82 2445 26,79 1,32 20,42 30,07 19,72 11,95
Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu thí nghiệm lên men thức ăn thô xanh kết hợp
với một số nguồn dinh dưỡng khác
Nguyên liệu Tỷ lệ (%)
Bột ngô 53,5
Bã bia 3,5
Khô đỗ tương 0,1
Bột cá 1,0
NaCl 0,5
Premix 0,3
Chế phẩm vi sinh 0,5-1,5
Cỏ voi 30 ngày 35,0
Rau muống 5,1
Đơn vị: kg (tính theo CK)
b) Sử dụng vi sinh lên men thức ăn thô xanh
Thức ăn xanh (rau muống, cỏ voi 30 ngày) được lấy về, rửa sạch và
nghiền nát bằng máy nghiền thức ăn 3A. Trong quá trình nghiền đồng thời thêm
bột ngô, cám gạo, khô đậu tương, bột cá, NaCl, premix, chế phẩm vi sinh bao
gồm các chủng B. subtilis VTX16, B. licheniformis VTX18, L. plantarum
LTX28, S. cerevisiae MTX14 và nước. Các nguyên liệu đều được nghiền nát và

25
trộn đều. Mỗi công thức thức ăn được thử ở ba mức bổ sung khác nhau (0,5%;
1,0% và 1,5%) chế phẩm tính theo vật chất khô. Thức ăn lên men được chứa
trong thùng có nắp đậy kín xung quanh để đảm bảo cho quá trình lên men yếm
khí.
Thức ăn lên men được chứa trong bình 5 kg có nắp đậy kín xung quanh để
đảm bảo cho quá trình lên men yếm khí. Mỗi công thức thức ăn sẽ được ủ với số
lượng như sau: 1 công thức x 3 lần lặp x 2 mốc thời gian (0h, 120h) = 6 bình.
Sau các khoảng thời gian 0h, 120h, các thức ăn ủ được lấy mẫu để phân tích
thành phấn hóa học đánh giá chất lượng thức ăn và xác định tỷ lệ men bổ sung
thích hợp.
c) Lấy mẫu và phân tích chất khô
Phương pháp lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam năm 2007 (TCVN 4325 –
2007). Lấy mẫu tại thời điểm 0 và 72, 120 giờ sau khi lên men (6 mẫu/thời
điểm: 3 mẫu để xác định thành phần dinh dưỡng, 3 mẫu để xác định tỷ lệ tiêu
hóa in vitro). Thức ăn được khuấy đều trong các thùng lên men, sau đó lấy mẫu
đại diện và tiến hành phân tích chất khô theo TCVN-4326-2001. Thức ăn đã sấy
khô được bảo quản trong bao bóng buộc kín, sau đó mang mẫu tới phòng thí
nghiệm để tiến hành xác định và thành phần và giá trị dinh dưỡng của mẫu thức
ăn. Thức ăn đã sấy khô được bảo quản trong bao bóng buộc kín và gửi phân tích
tại Phòng thí nghiệm VILAS 929 – VIMCERTS 171 và Phòng thí nghiệm Trung
tâm Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
d) Đánh giá các chỉ tiêu dinh dưỡng của thức ăn
Mẫu thức ăn cho ăn, mẫu thức ăn thừa được phân tích chất khô (DM),
chất hữu cơ (OM), protein thô (CP), xơ thô (CF), mỡ thô (EE) và tro (Ash) được
phân tích theo các tiêu chuẩn tương ứng TCVN-4326-2001, TCVN-4328-2007,
TCVN-4329-2007, TCVN-4331-2001 và TCVN-4327-2007. Các thành phần xơ
xơ trung tính NDF và xơ axit ADF được xác định theo phương pháp của (Van
Soest et al., 1991). Giá trị GE, DE và ME được ước tính theo NRC (1998)(GE =
4,143 + (56*%EE) + (15*%CP) - (44*%Ash), R2 = 0,98; DE =
949+(0,789*GE)-(43*%Ash)-(41*%NDF), R2 = 0,91; ME = DE*(1,012-
(0,0019*%CP), R2 = 0,91).
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên
phần mềm excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những công
thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức:
Giá trị trung bình(X): X = 1 ∑ =1 XI;
Độ lệch chuẩn (δ): δ = √
∑ ( − )2
; Sai số (m): = ±
δ
=1
−1

26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. SINH
CELLLASE VÀ CÁC ENZYM NGOẠI BÀO CAO
3.1.1 Sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi
khuẩn Bacillus spp.
Sàng lọc khả năng sinh cellulase, protease và xylanase cho thấy 38/47 vi
khuẩn sinh ít nhất một trong ba loại enzyme nói trên (Bảng 3.1); (Hình 3.1).
Bảng 3.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 38 chủng vi
khuẩn thuộc chi Bacillus
Kí Hoạt tính enzyme ngoại bào (D-d)
Kí hiệu
Hoạt tính enzyme ngoại bào (D-d)
STT hiệu (mm) STT (mm)
chủng
chủng Cellulase Protease Xylanase Cellulase Protease Xylanase
1 VTX2 - 2 - 20 VTX27 19 ± 0,02 - 34 ± 0,04
2 VTX4 12 ± 0,01 17 ± 0,02 22 ± 0,03 21 VTX31 3 ± 0,01 5 ± 0,01 -
3 VTX5 - 14 ± 0,01 - 22 VTX36 13 ± 0,01 4 ± 0,01 6 ± 0,01
4 VTX6 55 ± 0,04 22 ± 0,03 - 23 VTX37 - 11 ± 0,01 -
5 VTX9 25 ± 0,03 - 40 ± 0,04 24 VTX38 - 8 ± 0,01 -
6 VTX10 18 ± 0,02 7 ± 0,01 - 25 VTX39 9 ± 0,01 1 5 ± 0,01
7 VTX11 - 15 ± 0,02 - 26 VTX40 7 ± 0,01 2 7 ± 0,01
8 VTX12 22 ± 0,03 19 ± 0,02 40 ± 0,04 27 VTX42 - 8 ± 0,01 -
9 VTX14 23 ± 0,03 - 42 ± 0,04 28 VTX43 8,5 ± 0,01 1 10 ± 0,01
10 VTX15 22 ± 0,03 6 ± 0,01 25 ± 0,03 29 VTX47 9 ± 0,01 4 ± 0,01 10 ± 0,01
11 VTX16 28 ± 0,04 20 ± 0,03 45 ± 0,04 30 VTX49 9 ± 0,01 1 8 ± 0,01
12 VTX17 17 ± 0,02 11 ± 0,01 22 ± 0,03 31 VTX50 10 ± 0,01 2 9 ± 0,01
13 VTX18 14 ± 0,01 14 ± 0,01 44 ± 0,04 32 VTX62 - 8 ± 0,01 -
14 VTX20 26 ± 0,04 22 ± 0,03 38 ± 0,04 33 VTX63 - 7 ± 0,01 -
15 VTX21 22 ± 0,03 16 ± 0,02 39 ± 0,04 34 VTX64 - 10 ± 0,01 -
16 VTX22 26 ± 0,04 - - 35 VTX65 - 6 ± 0,01 -
17 VTX23 32 ± 0,04 16 ± 0,02 - 36 VTX66 - 8 ± 0,01 -
18 VTX25 8 ± 0,01 3 17 ± 0,02 37 VTX67 - 10 ± 0,01 -
19 VTX26 23 ± 0,03 - - 38 VTX68 7 ± 0,01 6 ± 0,01 5,5 ± 0,01
Ghi chú: (-) không có hoạt tính; D: Đường kính vòng phân giải; d: Kích
thước khuẩn lạc

27
VTX16
VTX16 VTX18
VTX18
(A) (B)
Hình 3.1. Hoạt tính xylanase (A) và cellulase (B) trên môi trường có cơ chất của
hai chủng đại diện VTX16 và VTX18
Kết quả cho thấy có 38/47 chủng (chiếm 80,85%) sinh ít nhất một loại
enzyme; có 17 chủng (chiếm 36,17%) sinh cả 3 loại enzyme là VTX4, VTX12,
VTX15, VTX16, VTX17, VTX18, VTX20, VTX21, VTX25, VTX36, VTX39,
VTX40, VTX43, VTX47, VTX49, VTX50, VTX68 với đường kính vòng phân
giải dao động lớn từ 1 – 45 mm. Trong số đó chủng VTX12, VTX16, VTX18,
VTX20, VTX21 cho hoạt tính 3 loại enzyme cao (Bảng 3.1; Hình 3.1). Số chủng
sinh cellulase, protease và xylanase lần lượt là 26 chủng (chiếm 55,32%), 33
chủng (chiếm 70,21%) và 20 chủng (chiếm 42,55%). Hoạt tính enzyme thủy
phân của các chủng Bacillus spp. cũng tương đồng với một số nghiên cứu đánh
giá về hoạt tính enzyme thủy phân trên các nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus
(Saarela et al., 2000). Để tăng cường quá trình phân giải cellulose trong thành
phần thức ăn thô xanh, 26 chủng vi khuẩn sinh cellulase được lựa chọn cho các
nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Xác định hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn tuyển
chọn
Kết quả phân tích hoạt độ cellulase của 26 chủng vi khuẩn khi nuôi cấy
trên môi trường lỏng được thể hiện trên Hình 3.2.
Hoạt độ cellulase của các chủng dao động khá lớn, từ 17,21 – 630,67
U/mL. Trong một số nghiên cứu lên men phân giải các chất giàu xơ làm thức ăn
chăn nuôi, phần lớn các vi khuẩn được sử dụng thuộc chi Bacillus có hoạt tính
phân giải cellulose (CMCase, beta-glucanase) thành các sợi cellulose mạch ngắn
hoặc giải phóng đường glucose (Missotten et al., 2015). Vì vậy, trong nghiên
cứu này các chủng có hoạt độ cellulase cao: VTX22 (500,78 U/mL), VTX9
(508,61 U/mL), VTX23 (530,52 U/mL), VTX16 (577,31 U/mL), VTX18
(592,64 U/mL), VTX25 (593,11 U/mL), VTX26 (630,67 U/mL) được lựa chọn
cho các nghiên cứu tiếp theo.

28
700
(U/m
L)
600
500
cellul
ase 400
300
200
độ
100
Hoạ
t
0
Chủng vi khuẩn
Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của 26 chủng vi khuẩn được tuyển chọn
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT
LACTIC CAO
3.2.1. Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit tổng số cao
Khả năng sinh axit tổng số của 24 chủng LAB sau 48 giờ nuôi cấy trên
môi trường MRS được thể hiện trong Bảng 3.2 và Hình 3.3. Trong số 24 chủng
có 15 chủng tạo vòng phân giải với CaCO3 , chủng LTX31 thể hiện đường kính
vòng phân giải lớn nhất (14 mm).
Hình 3.3. Đặc tính phân giải CaCO3 trên môi trường MRS của một số chủng vi
khuẩn lactic đại diện trong nghiên cứu

29
Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS (bổ sung
1% CaCO3) của 24 chủng vi khuẩn lactic
STT Kí hiệu Đường kính STT Kí hiệu Đường kính
chủng vòng phân giải chủng vòng phân giải
CaCO3 (mm) CaCO3 (mm)
1 LTX2 0 13 LTX 21 0
2 LTX3 0 14 LTX 22 11± 0,17
3 LTX6 13 ± 0,2 15 LTX 23 9± 0,2
4 LTX7 0 16 LTX 24 2± 0,1
5 LTX9 10 ± 0,25 17 LTX 25 11± 0,15
6 LTX10 0 18 LTX 26 8 ± 0,28
7 LTX11 0 19 LTX 27 12 ± 0,3
8 LTX12 0 20 LTX 28 8 ± 0,22
9 LTX13 9 ± 0,18 21 LTX 29 0
10 LTX16 0 22 LTX 30 10± 0,27
11 LTX18 9±0,3 23 LTX 31 14± 0,16
12 LTX19 8±0,2 24 LTX 32 10± 0,27
3.2.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh axit lactic cao
Các chủng có khả năng sinh axit tổng số được định tính axit lactic nhờ
khả năng làm đổi màu thuốc thử Uphenmen Hình 3.4. Kết quả phân tích cho
thấy cả 15 chủng đều làm đổi màu thuốc thử Uphenmen.
Hình 3.4. Phản ứng với thuốc thử Uphenmen của một số chủng vi khuẩn lactic
đại diện
Xác định hàm lượng axit lactic của các chủng VK cho thấy toàn bộ 15
chủng vi khuẩn sinh axit lactic với hàm lượng từ 0,48 – 24,74 mg/ml; 12/15
chủng (tương ứng 80%) sinh axit lactic với hàm lượng trên 10 mg/ml và 3/15
chủng (tương ứng 20%) sinh axit lactic với hàm lượng dưới 10 mg/ml. Trong

30
đó, chủng LTX31 sinh axit lactic với hàm lượng cao nhất (24,74 mg/ml) và
chủng LTX19 sinh axit lactic với hàm lượng thấp nhất (0,48 mg/ml) (Hình 3.5).
30
(g/l
)
25
20
lac
tic
15
độ
aci
d
10
5
Nồ
ng
0
Chủng vi khuẩn lactic
Hình 3.5. Hàm lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic
So sánh khả năng sinh axit lactic của các chủng LAB trong nghiên cứu
với các nghiên cứu cho thấy hàm lượng axit lactic đạt được cao hơn so với số
liệu từ một số công bố trước đây tại Việt Nam. Trên thế giới nhiều nghiên cứu
công bố về khả năng sinh axit của các chủng LAB. (Kostov et al., 2011) báo cáo
hàm lượng axit lactic đạt được 45 g/l khi nuôi cấy chủng L. casei subsp.
rhamnosus trên môi trường MRS lỏng (Kostov et al., 2011). Các kết quả nghiên
cứu trên cho thấy các chủng LAB trong nghiên cứu sinh axit lactic với hàm
lượng cao, có thể giúp làm giảm pH môi trường, ức chế sự sinh trưởng của VSV
gây bệnh khi lên men.
3.2.3. Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic
Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của 15 chủng vi khuẩn lactic đã
tuyển chọn, cho thấy phần lớn các chủng có độ nhạy cảm cao với
chloramphenicol (66,67%), tiếp theo là gentamycin (60%), colistin (40%),
kanamycin (6,6%). Tất cả 15 chủng đều kháng nalidixic acid (100%), trong khi
mức độ kháng với kanamycin (66,6%), chloramphenicol (53,33%), gentamycin
và colistin (33,3%). Có 7/15 (46,67%) chủng kháng được 3/5 loại kháng sinh.
Kết quả được trình bày trong Bảng 3.3

31
Bảng 3.3. Khả năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn
Khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lactic
STT Kí hiệu chủng
1 2 3 4 5
1 LTX6 R S R R R
2 LTX9 R S S S R
3 LTX13 I S R S R
4 LTX18 R R S R R
5 LTX19 S S S S R
6 LTX22 R R R R R
7 LTX23 R I S S R
8 LTX24 R R R R R
9 LTX25 R R S R R
10 LTX26 R S S I R
11 LTX27 R S R R R
12 LTX28 I S S R R
13 LTX30 I S S S R
14 LTX31 I R S R R
15 LTX32 R S S S R
Ghi chú: (1) Kanamycin 30µg; (2) Ge8ntamycin 10µg; (3) Chloramphenicol
30µg; (4) Colistin 30µg; (5) Nalidixic a9cid 30µg; (S) nhạy cảm với kháng sinh,
(I) trung gian, (R) 10kháng kháng sinh.
Việc sử dụng kháng sinh phổ biến trong chăn nuôi có một số hiệu quả
nhưng làm thay đổi hệ VSV có lợi trong ruột, làm mất cân bằng hệ VSV sẵn có.
VK lactic được phân lập từ phân gà tại Malaysia có mức ức chế cao với
chloramphenicol so với nalidixic acid, gentamycin, kanamycin (Shazali et al.,
2014, Shazali et al., 2014). Ngoài khả năng kháng kháng sinh, khả năng đối
kháng với VSV kiểm định cũng được nghiên cứu rộng rãi. Năm 2011, Trần Thị

32
Ái Liên đã kiểm tra khả năng kháng B. subtilis và E. coli của 10 chủng VK lactic
(Trần Thị Ái Liên 2011); kết quả cho thấy 100% các chủng đều có khả năng
kháng 2 chủng VK gây bệnh trên. Nghiên cứu của Idoui (2014) đã cho thấy khả
năng kháng Salmonella spp. và E. coli của chủng L. fermentum khá cao với
đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn 12 mm (Idoui 2014).
3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH CỦA
CÁC CHỦNG TUYỂN CHỌN
Khả năng kháng VSV kiểm định được thực hiện đối với 31 chủng
Bacillus và 15 chủng LAB (Bảng 3.4) cho thấy: tất cả các chủng LAB kháng ít
nhất 1 chủng VSV kiểm định. Tuy nhiên, LAB nhìn chung thể hiện đường kính
vòng kháng khuẩn nhỏ hơn so với các chủng Bacillus spp. Hai chủng vi khuẩn
VTX16, VTX18 vừa có khả năng sinh cellulase và các enzyme ngoại bào cao,
vừa có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh nên được tuyển chọn cho nghiên cứu
tiếp theo.
Bảng 3.4. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng tuyển chọn
STT Kí hiệu Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm)
chủng S. Typhimurium E. coli ATCC Staphylococcus
ATCC 14028 11105 epidermidis
ATCC 12228
Vi khuẩn
1 VTX4 22 ± 0,5 22 ± 1,05 12 ± 1,2
2 VTX6 22 ± 0,71 - 35,3 ± 0,5
3 VTX9 12 ± 0,92 28 ± 0,5 25 ± 1,06
4 VTX12 21 ± 0,71 33 ± 1,05 22 ± 0,5
5 VTX14 23 ± 1,05 19 ± 1,2 23 ± 1,06
6 VTX15 13 ± 0,92 25 ± 0,71 22 ± 1,05
7 VTX16 22 ± 1,05 32 ± 1,06 28 ± 0,5
8 VTX17 19 ± 1,2 22 ± 1,05 17 ± 1,2
9 VTX18 18 ± 1,2 31 ± 0,71 14 ± 0,92
10 VTX20 26 ± 1,05 31 ± 1,06 26 ± 1,06
11 VTX21 22 ± 0,96 33 ± 0,96 22 ± 1,05
12 VTX22 15 ± 0,92 0 32 ± 1,05
13 VTX27 12 ± 1,04 34 ± 0,96 19 ± 1,2
14 VTX31 1± 1,09 1± 1,14 0
15 VTX36 1± 1,13 7 ± 1,18 1± 1,22
16 VTX37 0 1.5 0
17 VTX38 1± 1,07 0 0
18 VTX39 0 2 ± 0,81 0
19 VTX40 3 ± 1,24 7 ± 1,15 3 ± 1,02

33
20 VTX42 15 ± 0,92 20 ± 1,05 13 ± 0,92
21 VTX43 10 ± 1,09 4 ± 1,14 10 ± 1,04
22 VTX47 10 ± 1,18 2 ± 1,01 10 ± 1,10
23 VTX49 0 0 0
24 VTX50 0 0 0
25 VTX62 4 ± 0,81 0 1± 1,34
26 VTX63 2 ± 1,25 0 1± 1,28
27 VTX64 1± 1,08 0 4 ± 1,09
28 VTX65 0 0 0
29 VTX66 0 0 1± 1,12
30 VTX67 0 0 1± 1,08
31 VTX68 11 ± 1,09 8 ± 1,15 12 ± 1,04
Vi khuẩn lactic
32 LTX 6 10,5 ± 0,2 8,3 ± 0,3 7,8 ± 0,5
33 LTX 9 13,9 ± 0,85 15 ± 1,41 12 ± 0,8
34 LTX 13 15,3 ± 1,06 13,1 ± 0,14 16 ± 1,2
35 LTX 18 10,7 ± 0,91 7,5 ± 2,43 8,4 ± 0,9
36 LTX 19 3,9 ± 0,81 8±0,2 3±0,6
37 LTX 22 6,5 ± 1,36 4,9 ± 1,53 9,2 ± 0,4
38 LTX 23 1,8 ± 1,89 2,3 ± 0,95 2,5 ± 0,7
39 LTX 24 5,7 ± 0,58 3,5 ± 0,42 2,2 ± 0,55
32 LTX 25 9,8 ± 0,58 8,6 ± 0,67 3 ± 0,47
33 LTX 26 11,7 ± 0,42 11,5 ± 0,71 13 ± 1,3
34 LTX 27 5,6 ± 2,11 2,3 ± 1,10 3,5 ± 0,64
35 LTX 28 17,4 ± 2,50 14,2 ± 0,92 14 ± 0,5
36 LTX 30 3,2 ± 1,86 3,9 ± 0,96 3 ± 0,47
37 LTX 31 7,8 ± 2,43 8,1 ± 2,76 8 ± 0,87
38 LTX 32 4,8 ± 1,37 3,5 ± 2,25 6,2 ± 1,05
Ghi chú: ± sai số có nghĩa
Các chủng vi khuẩn lactic LTX9, LTX13, LTX26, LTX28 có khả năng
kháng cả 3 chủng VSV kiểm định với đường kính vòng kháng khuẩn cao, đồng
thời khả năng axit lactic cao nên được tuyển chọn. Cho đến nay, đã có rất nhiều
nghiên cứu chứng minh khả năng kháng khuẩn của các chủng VK.
3.4. TUYỂN CHỌN NẤM MEN TÍCH LŨY PROTEIN ĐƠN BÀO
3.4.1. Đặc điểm hình thái, tế bào của các chủng nấm men
Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của 14 chủng nấm men cho
kết quả trong Bảng 3.5 và Hình 3.6.

Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn Thô Xanh Dạng Lỏng Phục Vụ Chăn Nuôi Lợn.doc

Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn Thô Xanh Dạng Lỏng Phục Vụ Chăn Nuôi Lợn.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn Thô Xanh Dạng Lỏng Phục Vụ Chăn Nuôi Lợn.doc

Similar to Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn Thô Xanh Dạng Lỏng Phục Vụ Chăn Nuôi Lợn.doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (11)

Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Của Các Vi Sinh Vật Phù Hợp Cho Lên Men Thức Ăn Thô Xanh Dạng Lỏng Phục Vụ Chăn Nuôi Lợn.doc