Đề tài “ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang”.doc

Tải tài liệu tại sividoc.com
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thanh Loan
ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY
TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA
SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA
BÀN TỈNH BẮC GIANG”
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thanh Loan
ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA
(CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN
TỈNH BẮC GIANG”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
Hướng dẫn 1: TS. Đồng Thị Kim Cúc
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Hương
Hà Nội - 2019

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn
này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các
nghiên cứu khác. Các số liệu chưa từng được công bố trong luận án, luận văn
nào trước đây.
Mọi dữ liệu trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử
dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!
Tác giả
Nguyễn Thanh Loan
i

Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô và các cán bộ công tác tại
Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình học tập tại Học viện.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Thị
Kim Cúc và TS. Nguyễn Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cho
tôi trong quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và
thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các cán bộ, anh chị em,
bạn bè, đồng nghiệp trong Trung Tâm thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp Công
nghệ cao thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và đóng góp những ý
kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Luận văn này được thực hiện bởi sự cho phép của Viện Di truyền Nông
nghiệp, Trung tâm Thực nghiệm sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao và được
thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây
Sâm Núi Dành phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang”
Luận văn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 9 tháng 10 năm 2019
Tác giả
Nguyễn Thanh Loan
ii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Viết tắt Viết đầy đủ
DNA Deoxyribonucleic acid
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi
polymerase)
Cs Cộng sự
BA Benzyladenine (6-Benzyladenine)
CT Công thức
ĐC Đối chứng
Ki Kinetin
IBA Indole-3-butyric acid
MS Murashige và Skoog (1962)
NAA Naphthaleneacetic acid
TB Trung bình
TN Thí nghiệm
CV% Hệ số biến động (Correlation ò Variance)
LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0,05
(Leant Significant Difference)
MTN Môi trường nền
L lít
Mg miligram
iii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...............................................................................................................1
1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................1
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI .................................................................................2
3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI....................................................................................2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................3
1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH ..............................3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA....5
1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT
DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ .........................................................................6
1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật ................... 6
1.3.2. Bộ gene lục lạp ..................................................................................... 7
1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân ........................................... 7
1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm. .. 9
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM
NGỌC LINH....................................................................................................... 10
1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP... 11
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 11
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................... 12
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14
2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU . 14
2.1.1.Đối tượng............................................................................................. 14
2.1.2.Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 14
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu....................................................... 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 14
2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài Sâm Núi
Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn
tỉnh Bắc Giang..................................................................................................... 14
2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi
Dành 15
2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho
loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương pháp nuôi cấy in-
vitro 15
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................. 15
2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa ............................... 15
2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các
marker đặc trưng-Barcode................................................................................... 16
iv

2.3.3. Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính
trong loài Sâm Núi Dành..................................................................................... 19
2.3.4. Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành ................. 20
2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................... 25
2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 26
3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI
DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU
THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG....................................... 26
3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang....... 26
3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của
gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành. ....................... 28
3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI
DÀNH ................................................................................................................. 32
3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO..36
3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các
phương pháp giâm hom....................................................................................... 36
3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng
phương pháp nuôi cấy in-vitro............................................................................ 40
3.3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây
Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm ............................................................ 51
CHƯƠNG 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................. 54
4.1. KẾT LUẬN.................................................................................................. 54
4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 55
v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS...................................................................... 14
Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm............................................................. 28
Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu.......... 30
Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu ............................. 31
Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi .... 32
Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi...... 33
Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi ...... 33
Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất............... 34
Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm .............. 36
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành........... 37
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng
tạo mẫu sạch bệnh ............................................................................................... 40
Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi................................. 42
Bảng 3. 12. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Núi
Dành .................................................................................................................... 45
Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ............ 46
Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của ½MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ......... 46
Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của môi trường MS và IBA đến sự hình thành rễ ........ 47
Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của môi trường ½MS và IBA đến sự hình thành rễ ..... 48
Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ......................... 50
Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây Sâm Núi Dành in-vitro... 51
Bảng 3.19. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S1 trong
NCBI ................................................................................................................... 64
NCBI ................................................................................................................... 65
NCBI ................................................................................................................... 66
NCBI .......................................................................................................................................................... 67
vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng.......................................... 26
Hình 3.2. Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam)................................. 27
Hình 3.3. Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang ............................................. 27
Hình 3.4. a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng.......................................... 27
Hình 3. 5. Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm ........ 37
Hình 3.6. Động thái tăng trưởng số chồi/hom..................................................... 38
Hình 3.7. Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm.......................... 39
Hình 3.8. Động thái tăng trưởng số lá/chồi......................................................... 39
Hình 3. 9. Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh ................... 42
Hình 3. 10. Chồi Sâm Núi Dành trên các CT môi trường nhân nhanh............... 44
Hình 3. 11. Ảnh hưởng của môi trường và nồng độ các hoocmon tăng trưởng đến
khả năng hình thành rễ ........................................................................................ 49
Hình 3. 12. Chồi Sâm ra rễ trên môi trường có bổ sung 1 mg/l IBA + 0,4 mg/l
THT ..................................................................................................................... 50
Hình 3. 13. Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh........................................... 51
Hình 3.14. Cây Sâm Núi Dành in-vitro ra cây trên các công thức giá thể ......... 52
vii

MỞ ĐẦU
1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Ở Việt Nam, trong tổng số 3.948 loài cây thuốc có khoảng 87,1% là các
loài mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu ở các quần xã rừng, số còn lại là cây
trồng. Mỗi năm ngành Y dược tiêu thụ 30-50 tấn dược liệu các loại phục vụ
chữa bệnh hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong
số đó, trên 2/3 lượng dược liệu được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự
nhiên hoặc trồng trong nước, vì thế nhu cầu cây thuốc trong nước là rất lớn.
Năm 2016, Viện Dược liệu đã công bố tổng số 5117 loài cây thuốc đã được
phát hiện [1].
Sâm Núi Dành là một loài cây thuốc phân bố ở chân Núi dành thuộc
huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Hiện nay cho thấy do nhu cầu sử dụng dược
liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên Sâm Núi Dành bị khai thác ồ ạt,
dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt. Theo Sách đỏ Việt Nam
(2007), loài này được xếp ở mức độ sẽ bị nguy cấp bởi nơi cư trú của chúng
bị thu hẹp do rừng thường xuyên bị chặt phá; loài bị khai thác nhiều để làm
thuốc có thể dẫn đến cạn kiệt [2]. Một nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt
nguồn gen quý này là do cây Sâm Núi Dành rất khó nhân giống. Hạt nảy
mầm rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vùng phân bố của Sâm không
đa dạng. Việc bảo tồn loài sâm quý này đang ở mức báo động, cần sự chung
tay góp sức của các cấp, ngành và người dân địa phương.
Một trong những mục tiêu quan trọng của đề tài là nhân giống vô tính được
loài Sâm Núi Dành nhằm lưu giữ, bảo tồn nguồn gen quý của loài Sâm này do
nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác ồ ạt. Việc đáp ứng nhanh và bền vững
nguồn giống Sâm Núi Dành có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách.
Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp nhân giống
truyền thống: giâm cành, gieo hạt nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, hạt
gần như không nảy mầm ngoài tự nhiên. Để cải thiện hệ số nhân giống cây
Sâm này, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài
Sâm Núi Dành. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết lập quy trình nhân
giống vô tính loài Sâm Núi Dành có nguồn gốc từ tỉnh Bắc Giang. Nuôi cấy
1

mô tế bào thực vật là một trong những công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống
và bảo tồn này. Nó cho phép trong thời gian ngắn nhất, nhân nhanh với quy
mô lớn và cây có độ đồng đều cao, sạch bệnh và giữ được đặc tính di truyền
của bố mẹ.
Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu, đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành
(Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot) phân bố trên địa bàn tỉnh
Bắc Giang”.
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu, điều tra, thu thập các mẫu Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc
Giang. Xác định chính xác tên loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp sinh
học phân tử và xác định thành phần một số hoạt chất trong củ Sâm Núi Dành
ở các độ tuổi khác nhau.
- Xây dựng được quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng
phương pháp giâm hom và công nghệ in-vitro.
3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
- Đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học bước đầu về nghiên cứu xây
dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành.
- Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo trong việc
nghiên cứu, giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và nhân
giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH
Sâm Núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt
Nam và trên thế giới. Vì vậy, việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu còn hạn
chế, việc định hướng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước cũng khó
khăn.
Sâm Núi dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình
Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh
Bắc Giang. Theo bài viết của tác giả, trong sách “Đại Nam nhất thống chí”,
có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế. Sâm Nam sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn.
Cỏ thi cũng có ở Chung Sơn”. Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là Núi Dành,
nay phần lớn thuộc xã Liên Chung và phần còn lại thuộc địa phận xã Việt
Lập, huyện Tân Yên. Những câu chuyện quanh loài Sâm quý này được người
dân sinh sống dưới chân Núi dành kể lại. Theo ông Nguyễn Văn Được, 72
tuổi ở thôn Hậu, nhà ngay dưới chân Núi dành cho biết: “Núi dành xưa kia
toàn cây de với giàng giàng, mỗi lần Lý trưởng kiếm được củ sâm thì mừng
lắm, hiện ở góc vườn nhà tôi còn một khóm sâm, mỗi năm nó chỉ ra một đốt
từ đó mọc rễ và ra củ nên củ không lớn, tôi cũng đã từng nhân thử giống Sâm
Núi dành nhưng không thành công, và cũng đã nhiều lần thử du nhập những
giống sâm khác về trồng nhưng không sống được có lẽ do thời tiết và thổ
nhưỡng không hợp”. Ông Nguyên Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên
Chung tâm sự, gần hai chục năm trước ông nhận đất trồng rừng ở chân Núi
dành. Trong một lần cuốc đất thấy bật lên những củ nhỏ, mùi thơm, nếm thử
thấy ngọt mát, vốn gia đình có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết mình
gặp may khi tìm thấy gốc Sâm Núi dành và ông giữ gìn từ đó cho tới bây giờ.
Theo ông Lư, loại sâm này phải trên 10 năm tuổi dùng mới hữu dụng. Những
căn bệnh thông thường như ho cảm sốt, đau đầu, nhất là đối với trẻ nhỏ dùng
chút ít là khỏi [3].
Bằng phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, các tác giả Đồng Thị Kim
Cúc và cộng sự, đã xác định được Sâm Núi Dành thuộc họ đậu (Fabaceae),
chi Callerya có tên khoa học Callerya speciosa (Champ.) Schot., [4].
3

Đặc điểm nông sinh học:
Thân: Sâm Núi Dành thuộc dạng cây dây leo hoặc trườn, thường dài 4 -
5 m hoặc hơn, cành non có lông màu bạc;
Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt,
mùi thơm dịu và vị ngọt mát.
Lá kép lông chim lẻ, trục chính của lá dài 6-15 cm, mang 3-7 lá chét; lá
chét hình bầu dục dài hay trái xoan, cỡ 3-8 x 1-3 cm, 2 mặt có lông tơ màu
trắng, gân bên có 5-6, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới lá xanh nhạt.
Hoa: Cụm hoa chùm, mọc ở đầu cành hay nách lá, dài đến 30 cm,
cuống hoa và đài đều có lông nhung trắng. Hoa to, mọc đơn độc trên đốt trục
cụm hoa, dài 2,5-3 cm. Đài hình chuông, 5 mảnh dính với nhau, cỡ 9 x 12
cm, mặt ngoài có lông, mép có 4 răng; tràng 5 cánh không đều nhau, tiền khai
hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh
bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với nhau ở đáy tạo thành cấu
trúc tương tự như cái thuyền con mang kèm nhị và nhụy.
Cánh hoa màu trắng ngà, cánh cờ không có lông, 2 bên gốc có cục chai.
Nhị 10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1
chiếc rời. Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra
quả. Bầu hình thuôn, dài bằng nhị.
Quả đậu, dẹp, cỡ 9-18 x 1,2-1,6 x 0,7-0,8 cm, có lông nâu phủ dầy. Hạt
2-3, hình trứng, cỡ 1 cm.
Củ sâm có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt,
mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt.
Sinh học, sinh thái: Mùa ra hoa tháng 6-8, quả tháng 9-12 [4].
Giá trị sử dụng: Rễ củ được đào ở những cây trên 1 năm tuổi, phơi khô,
thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc mật ong, sao vàng dùng làm thuốc; có tác
dụng trị đau vùng lưng, khớp, thông kinh hoạt lạc, bổ nhuận phế, chữa cơ thể
suy nhược, kém ăn, ho nhiều đờm, nhức đầu, bí tiểu tiện [5].
4

1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA
Ting Yin và cộng sự đã phân lập được flavonoid millettiaspecoside A,
millettiaspecoside B, millettiaspecoside C, millettiaspecoside D,
khaephuoside B, seguinoside K, ablbrissinoside B từ phân đoạn n-butanol của
dịch chiết cồn củ Callerya speciosa (Champ.) [6], [7].
Zong XK và cộng sự đã phân lập được thêm 5 chất từ dịch chiết cồn
95
o
củ Callerya speciosa: Isoliquitigenin, maackiain, pterocarpin,
medicarpin, homopterocapain [8].
Ping Ding và cộng sự đã phân lập được thêm 13 chất từ phân đoạn
ether và ethyl acetat dịch chiết củ M. speciosa: docosanoic acid, tetracosane,
octadecane, hexacosanoic acid, β-sitosterol acetate, β-sitosterol, syringin,
maackiain, ormononetin, ψ-baptigenin, rotundic acid, pedunculoside và
daucosterol. Trong đó có β-sitosterol acetate, syringin, ψ-baptigenin,
rotundic acid và pedunculoside là những chất lần đầu tiên được công bố có
mặt trong cây [9].
Wang Cheng – wen đã định lượng được hàm lượng flavonoid tổng
trong dịch chiết chloroform rễ củ Millettia speciosa lên đến 5,52 mg/g dược
liệu [10].
Jun Cheno và cộng sự đã phân lập được 3 isoflavon glycosid từ thân
loài Callerya nitida (Millettia nitida var. hirsutissima) gồm: formononetin 7-
O-b-D-(6-ethylmalonyl)- glucopyranoside (hirsutissimiside A); 5-
Omethylgenistein 7-O-a-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-b-D-glucopyranoside
(hirsutissimiside B); retusin 7,8-di- O-b-Dglucopyranoside (hirsutissimiside
C) [11].
Ito Chihiro và cộng sự đã phân lập được các isoflavonoid từ dịch
chiết aceton của thân và hạt loài Callerya atropurpurea (Millettia
atropurpurea) gồm: isoformonotein, sayanedine, prunetin, formonotein,
auriculasin, millepurone, vestitol và millepurpan [12].
Fang Song-Chwan và cộng sự đã phân lập được 6 flavonoid từ thân
loài Callerya reticulata var. reticulata (Millettia reticulata Benth.) gồm: (-)
epicatechin; narigenin; 5,7,3’,5’- tetrahydroxy flavone; formononetin;
5

isoliquirtigenin và genistein [13].
Theo Đỗ Tất Lợi, loài M. speciosa có chứa tinh bột và alkaloid [14]
1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC
VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ
1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật
Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của
thế giới sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại
mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát
triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa –
PCR [15] đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải
trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA. Nhiều
dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng
dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật.
Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene
ty thể và bộ gene lạp thể. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy
ra không đồng đều. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở mỗi bộ gene đã được đánh
giá thông qua việc quan sát các thay thế nucleotide ở hàng loạt thực vật một
và hai lá mầm [16]. Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất,
trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9
thay thế cho một vị trí trong một năm. Bộ
gene lạp thể có mức độ thay thế nhanh hợn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9
thay thế cho một vị trí trong một năm. Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ
thay thế nucleotide nhanh hơn gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 ×
10-9
thay thế cho một vị trí trong một năm. Nghiên cứu đánh giá về tỷ lệ thay
thế nucleotide dựa trên các dữ liệu trình tự từ lúa và ngô cũng cho kết quả
tương tự như Wolfe và cộng sự. Tỷ lệ thay thế nucleotide ở những cây này
khác về căn bản so với sự tiến hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động
vật. Trong lịch sử tương đối ngắn của hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà
nghiên cứu tập trung tương đối nhiều vào bộ gene lục lạp, tuy nhiên điều đó
6

đã thay đổi khi các khảo sát về sau đã chuyển hướng sang các trình tự gene
trong nhân [17].
1.3.2. Bộ gene lục lạp
Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc
trưng bởi phân tử dạng vòng. Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ gene,
khoảng 135-160kb [18] với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR)
segments] chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy
region) và một vùng SSC (small single-copy region). Thành phần, kích thước,
cấu trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo tồn
cao trong các nghiên cứu về tiến hóa [19]. Tính bảo tồn cao này chỉ ra rằng
bất kỳ thay đổi nào về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan
mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh. Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa
theo các tỷ lệ khác nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide.
Những vùng không mã hóa của bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những
vùng mã hóa [16]. Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế
nucleotide hay sự sắp xếp lại. Các đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy
trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide
và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đa dạng của các vùng không
mang mã. Phần lớn các gene lục lạp là loại gene đơn bản trong khi các gene
trong nhân là thành viên của những họ đa gene. Tính bảo tồn cao của DNA
lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh
và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật
[20],[17].
Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lục lạp thường
được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau:
1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân
Bộ gene trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực
vật (1.1 × 106
đến 110 × 106
kbp) và bao gồm rất nhiều gene. Phần lớn các nổ
7

lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự
DNA ribosome trong nhân. Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn
vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene.
Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống
bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị
nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene
nhỏ hơn là 5,8S. Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách
rời những gene vừa đề cập. Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở
các thực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S
là khoảng 160bp. Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene
biến động từ 1 đến 8kb. Họ gene rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S,
26S có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại
cao. Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong
so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể.
Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự
26S. Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưng
kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt
là trong việc giải trình tự toàn bộ gene. Trái lại, kích thước của 18S rDNA
khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng
PCR và giải trình tự. Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng
trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự
rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín. Cho dù rất có tiềm năng
trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫn
chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín [17].
Gene 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gene
18S rDNA. Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gene 26S rDNA tiến hóa
nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tin
nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA.
8

Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng
các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA. Gene 5,8S rDNA hiếm khi
được sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo tồn cao và kích
thước bé (164-165bp). Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích
quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA.
Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA với gene 5,8S rDNA còn
ITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA với gene 26S rDNA. Vùng ITS hiện hữu
một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa [21]. Vùng ITS chứa các
trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch
đại và giải trình tự đã được mô tả. Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC làm
cho việc giải trình tự trở nên khó khăn. Khó khăn trong việc giải trình tự biến
động theo các nhóm thực vật và việc cho thêm DMSO hay BSA vào PCR hay
phản ứng giải trình tự là việc bổ sung mang lại hiệu quả cao [22]. Việc căn
trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tự ITS1 và ITS2
đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA. Các trình tự ITS biến động một cách
hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh ở những
taxon có quan hệ họ hàng gần. Theo đó, rất nhiều các bài báo thể hiện sự
thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử dụng các trình tự ITS
[23],[24]. Hơn nữa, vùng ITS được di truyền theo kiểu từ cả cha và mẹ khiến
cho nó cũng có thể được sử dụng để thăm dò sự lai chéo [25].
1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống
nhân sâm.
Tại Hàn Quốc, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại chi
Panax đã được triển khai nhiều và đạt được nhiều kết quả mang tính ứng dụng
cao. Trường đại học tổng hợp Hàn Quốc. Thư viện BAC (bacterial artificial
chromosome) gồm 106.368 dòng với chiều dài trung bình khoảng
98,61kb[26]. Từ thư viện BAC các nhà khoa học đã thiết kế các chỉ thị phân
tử SSR và thành công trong việc xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu trong phân
biệt các giống sâm của Hàn Quốc và trên thế giới. Trường đại học Chung Ang
Hàn Quốc đã nghiên cứu sự khác nhau giữa các loài nhân sâm bằng chỉ thị
phân tử RAPD. Kết quả mồi OP-5A cho băng đơn ADN với các mẫu nhân.
9

Mồi chỉ thị RAPD13B chỉ sự khác nhau giữa các loài sâm [27]. Trường đại
học William & Mary của Mỹ đã nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Mỹ và
nghiên cứu chọn giống Sâm bằng chỉ thị phân tử [28].
Năm 2011, Lee và cộng sự đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất từ
ISSR để nhận dạng các chủng sâm P.ginseng có đặc tính tốt phục vụ cho chọn
giống. 34 trong số 85 mồi ISR hình thành locus đa hình. Các mồi UBC-821,
UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các băng đa hình giữa các chủng
P.ginseng và cho phép phân biệt chúng với các mẫu P.quinquefolius và
P.notoginseng [29].
Tác giả Hongtao Wang – Trung tâm nghiên cứu và sản xuất Sâm của
Hàn Quốc đã nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu phân biệt giống
sâm Chunpoong với các giống Sâm khác. Giống sâm Chunpoong là một
giống nhập nội chất lượng cao và chất lượng cao trong số chín giống nhân
sâm Hàn Quốc. Trung tâm đã nghiên cứu quy trình kiểm định giống
Chunpoong bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự ADN của ty lạp thể
(COX2) trên vị trí intron I và intron II. Chỉ thị phân tử SNP đặc hiệu đã được
nghiên cứu dùng phân biệt giống nhân sâm Chunpoong với các giống nhân
sâm khác một cách đơn giản và chính xác [30].
Từ năm 2012 đến nay Trung tâm Ươm tạo và Hỗ trợ doanh nghiệp
Khoa học công nghệ đã hợp tác nghiên cứu giải trình tự hệ gen lục lạp của
Sâm Ngọc Linh với Trường đại học Quốc gia Seuol Hàn Quốc. Cuối năm
2015 tác giả Nguyễn Văn Binh, cán bộ của Trung tâm đã nghiên cứu giải trình
tự hoàn thiện genome lục lạp trên Sâm Ngọc Linh [31]. Kết quả này đóng vai
trò rất quan trọng trong việc nghiên cứu mối quan hệ di truyền của Sâm Ngọc
Linh với các loài khác trong họ Araliaceae và là cơ sở dữ liệu cho việc thiết
kế các chỉ thị phân tử đặc trưng cho loài.
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM
NGỌC LINH
Nguyễn Ngọc Dung là một trong những tác giả đầu tiên nghiên cứu
nhân giống vô tính Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học thông qua tái
sinh từ mô sẹo [32]. Năm 2010, Dương Tấn Nhật và cộng sự cũng tiến hành
10

nhân giống vô tính cây Sâm Ngọc Linh thông qua con đường phát sinh cơ
quan [33]. Mô sẹo được cảm ứng ở các mẫu củ Sâm Ngọc Linh cắt mỏng trên
môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ trong điều kiện chiếu
sáng 16h/ngày. Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo là môi
trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ. Số chồi tái sinh từ mô sẹo
đạt cao nhất trên môi trường Sh bổ sung1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 2,0 g/l
thanh hoạt tính. Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½MS đực bổ
sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose và 2 g/l thanh hoạt tính.
Nguyễn Bảo Triệu và công sự cũng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro
Sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l 2,4D, 0,2 mg/l TDZ và
trên môi trường SH bổ sung 1.0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA. Mai Trường và
cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tạo và nhân giống phôi sôma Sâm Ngọc
Linh trong môi trường lỏng [34]. Hoàng Xuân Chiến và cộng sự đã thử
nghiệm khả năng tạo củ in vitro và xác định hàm lượng saponin ở các cây
trồng thử nghiệm 17 tháng tuổi [35]. Các hệ phức hợp của GA/ABA và
auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng được tác giả khảo sát.
Nồng độ ABA thích hợp nhất cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l. GA3 ức chế
khả năng tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Các chồi cây Sâm Ngọc Linh
được cảm ứng để tạo củ thành công trên môt trường SH có bổ sung 1,0 mg/l
NAA và 2,0 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày. Nồng độ đường
sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l. Hàm lượng saponin trong củ
của những cây 17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng đã được xác định
là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%) MR2 (0,77%) [35].
1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2008, Huang và cs đã nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô
Millettia speciosa Champ. (tên gọi khác của Cellerya speciosa Champ.): Họ
đã tìm được môi trường nền là MS + 1,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA kết quả
cho tỷ lệ cảm ứng tạo chồi có thể đạt 100%. Sau khi cấy 20 ngày, các chồi
nách bắt đầu nảy mầm và phát triển bình thường. Với môi trường nhân nhanh
là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA, sau nuôi cấy 30 ngày cho hệ số nhân
đạt 7,0, sự sinh trưởng và phát triển của chồi là bình thường. Môi trường tạo
11

cây hoàn chỉnh tốt nhất là 1/2MS + 0,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l IAA cho tỷ lệ ra
rễ đạt 80%, chất lượng rễ tốt nhất [36].
Năm 2010, Pan và cs đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cây
thuốc Millettia speciosa Champ. Kết quả của nghiên cứu: sử dụng các đoạn
thân cây của Millettia speciosa Champ. để làm mẫu cấy để khử trùng và kết
luận là mẫu cấy khử trùng trong 5 phút với 0,1% HgCl2 là thích hợp nhất.
Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất là môi trường MS có bổ sung 1,0
mg/l αNAA [Error! Reference source not found.]. Các chồi nách ở thân có
thể tái sinh tạo chồi trong môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm với 2,0 và 2,5
mg/l 6-BA, nhưng tỷ lệ tái sinh tạo chồi cao nhất chỉ đạt 78,6%. Môi trường
tốt nhất cho tái sinh chồi nách là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,05 mg/l αNAA, hệ
số nhân là 4,0 - 5,0 sau khi nuôi cấy trong 30 ngày. Tỷ lệ ra rễ của chồi đạt
66,7% trên môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l αNAA + 2,5 mg/l IBA và tỷ lệ sống
của cây đạt 85% sau 30 ngày ở giai đoạn vườn ươm khi cây giống cấy mô
được trồng trên giá thể là hỗn hợp chất đất và cát ở tỷ lệ (3:1) [37].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2015, Nguyễn Thị Minh Hiền đã nghiên cứu nhân giống in-
vitro cây Sâm Nam Núi dành bằng phương pháp tạo callus. Nghiên cứu đã
thu được các kết quả: Các chất điều tiết sinh trưởng 2,4-D, αNAA, BA có
cảm ứng kích thích lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi dành tạo callus, tạo rễ
nhưng không tạo chồi. Bổ sung 3,0 mg/l αNAA là thích hợp nhất cho sự tái
sinh tạo callus cũng như tạo củ in vitro từ lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi
dành. Nguồn gốc callus tái sinh từ các môi trường khác nhau có ảnh hưởng
rõ rệt đến sự sinh trưởng của callus khi được cấy chuyển lên các môi
trường tái sinh mới. Trong đó, các khối callus trước đó được tái sinh từ lớp
mỏng tế bào mô lá Sâm Nam Núi dành trên môi trường (DCR + 3,0 mg/l
αNAA) có khả năng sinh trưởng tốt nhất. Nồng độ đường sucrose 30 g/l là
thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của callus.
Theo nghiên cứu của Hoàng Vũ Thơ đăng trên tạp chí Công nghệ
sinh học và Giống cây trồng với nội dung: “Nghiên cứu khả năng ra rễ của
Sâm Nam Núi dành (callerya spp.) bằng phương pháp giâm hom”. Thời
12

gian giâm hom vào vụ Xuân, với hom thu từ cây mẹ tuổi 4 cho thấy: 1) Sử
dụng IBA nồng độ 750ppm cho tỷ lệ ra rễ đạt 11,11%, số rễ trung bình trên
hom là 0,24 rễ, chiều dài rễ trung bình là 3,0cm và chỉ số ra rễ đạt trị số
0,72; 2) Khi sử dụng NAA nồng độ 500ppm cho tỷ lệ ra rễ hom đạt
11,11%, số rễ trung bình trên hom là 0,2 rễ, chiều dài trung bình của rễ là
1,33cm và chỉ số ra rễ là 0,27; 3) Sử dụng TTG giâm hom cho tỷ lệ ra rễ
đạt 2,22%, số rễ trung bình trên hom là 0,02, chiều dài trung bình của rễ là
1,5cm và chỉ số ra rễ là 0,03. Khả năng ra rễ của hom chịu ảnh hưởng rõ rệt
của nồng độ hoocmone.
13

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1.Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là loài Sâm Núi Dành, một loại cây
dược liệu phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang.
2.1.2.Vật liệu nghiên cứu
- Các mẫu Sâm thu thập trên địa bàn tỉnh Bắc Giang
- Danh sách các đoạn mồi ITS [38](Bảng 2.1)
Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS
TT Mồi Trình tự Nucelotid
ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
- Mẫu rễ cây Sâm Núi Dành ở các tuổi khác nhau: mẫu dưới 2 năm, 3 năm, 4
năm, > 5 tuổi và đoạn thân bánh tẻ chứa chồi ngủ cây Sâm Núi Dành có độ
tuổi từ 1-1,5 tuổi.
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thí nghiệm giâm hom được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp
và xã Việt Lập – huyện Tân Yên – Bắc Giang.
- Nghiên cứu quy trình nhân giống in-vitro, nghiên cứu các marker đặc
trưng để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành được thực hiện tại Viện Di
truyền Nông nghiệp.
- Phân tích định tính các thành phần hóa học thực hiện tại Viện Hóa
học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Thời gian nghiên cứu : 2017 – 8/2019
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài
14

Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập
được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang.
- Công việc 1 : Điều tra, thu thập thông tin và lấy mẫu một số loài Sâm phân
bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang.
- Công việc 2: Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự
ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành.
2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ
Sâm Núi Dành
- Công việc : Phân tích định tính một số nhóm chất trong loài Sâm Núi Dành
2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô
tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương
pháp nuôi cấy in-vitro
- Công việc 1: Nghiên cứu phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại
vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom.
- Công việc 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi
Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro.
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa
Sử dụng phương pháp thu mẫu thực địa theo Nguyễn Nghĩa Thìn
(1997, 2007).
- Phương pháp thu mẫu: Mẫu vật được thu hái theo danh lục đã phỏng vấn và
theo sự chỉ dẫn của các thầy thuốc bản địa. Các mẫu thu được có bộ phận dinh
dưỡng và bộ phận sinh sản; trường hợp mẫu thu được không đủ đặc điểm
phân loại (do không vào mùa hoa, quả) thì tiến hành thu và thay thế mẫu trong
các đợt thu mẫu tiếp theo. Mỗi mẫu đều được gắn nhãn (etyket) ghi số hiệu
mẫu, địa điểm và nơi lấy, các đặc điểm quan trọng: cây gỗ hay dây leo; màu
sắc lá, hoa, quả; mùi vị đặc trưng (nếu có); có nhựa mủ hay không; môi
trường sống...
15

- Cách xử lý mẫu: Mẫu vật được xử lý ngay sau mỗi đợt thu mẫu, ép tạm thời
bằng giấy báo, buộc chặt, cho vào túi nilon và tẩm cồn 70%.
- Chụp ảnh: sử dụng máy ảnh để ghi lại hình ảnh của các loài cây thuốc, cách
sơ chế, sử dụng và những hoạt động của tập thể trong quá trình nghiên cứu.
2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài
bằng các marker đặc trưng-Barcode
2.3.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Phương pháp sử dụng CTAB có cải tiến.
Quy trình:
- Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C.
- Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi
thành dạng bột mịn (mẫu sâm, chày, cối được giữ trước ở - 80C).
- Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10%.
Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl
1,4 M, CTAB 2%.
- Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
- Bổ sung Chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm
11000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C. Hút dung dịch phía trên
chuyển sang ống mới.
- Tiếp tục chiết lần 2 bằng Chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN.
- Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -20C trong 1 giờ.
- Ly tâm thu tủa 10500 vòng/phút trong 15 phút ở 4C.
- Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE.
- Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 37C trong 1 giờ.
Các bước tiếp theo tương tự các bước 5-9.
2.3.2.2. Thành phần của một phản ứng PCR
16

- Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần:
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước cất hai lần khử ion 9
2 Buffer Mg+
25 Mm 1,5
3 dNTPs 10 Mm 0,3
4 Taq ADN polymerase 5 U/µl 0,2
5 Mồi ITS1 10 µM 1,5
6 Mồi ITS4 10 µM 1,5
7 DNA 1
Tổng thể tích của một phản ứng 15,0
2.3.2.3. Chương trình chạy PCR
Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và thực hiện
trên máy Mastercycler epgradient S theo chu trình sau:
Các bước Nhiệt độ(C) Thời gian
1 94 5 phút
2 94 1 phút
3 52 45 giây
3 72 50 giây
5 Lặp lại từ bước 2, 35 lần
6 72 7 phút
7 4 ∞
Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ
sung 4 µl loading dye rồi tiến hành điện di.
2.3.2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
Cân 0,4 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan
hoàn toàn. Để nguội 45-50C bổ sung 2,5l Ethidium Bromide, đổ vào
khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn. Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông
cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE
1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm.
Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4l loading dye và tra vào các
giếng trên gel.
17

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với
bộ nguồn. Đặt 130V.
Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ
liên kết với EtBr.
2.3.2.5. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen
1. Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt
vào ống eppendorf 2ml.
2. Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG: 1 thể tích gel (100mg
~100μl).
3. Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn.
4. Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu
vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung
10μl sodium acetate 3M, pH 5.
5. Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc
độ 13 000 rpm trong 1 phút.
6. Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000
rpm trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa.
7. Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5
phút sau đó ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút.
8. Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch.
9. Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8.5) vào giữa màng
của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút, thu lượng ADN
tinh sạch.
2.3.2.6. Giải trình tự
Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công
ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được được so sánh với các
trình tự tương đồng trên NCBI. Sau đó, các trình tự được tập hợp lại và phân
tích bằng chương trình MEGA v5.1 để tạo cây phát sinh loài.
18

2.3.3. Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có
dược tính trong loài Sâm Núi Dành
2.3.3.1. Phương pháp chiết mẫu
Mẫu rễ Sâm Núi Dành được sấy khô, xay nhỏ và ngâm chiết với EtOH ở
nhiệt độ phòng, 3 lần, mỗi lần 8 h. Gộp dịch chiết của 3 lần chiết để tiến hành
phân tích định tính.
2.3.3.2.Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học
a. Định tính saponin:
Bằng hiện tượng tạo bọt [39].
Cách tiến hành: cân 1g bột củ Sâm Núi Dành (qua rây số 32), cho vào
bình tam giác có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ
trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml. Lấy 1 ống nghiệm
có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào ống nghiệm 10ml nước
sắc. Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây
2 lần lắc. Ðể yên 15 phút nếu có bọt xuất hiện thì kết luận trong mẫu có chứa
saponin.
b. Định tính flavonoid :
- Phản ứng với kiềm: Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% vào dịch chiết sẽ
thấy xuất hiện tủa vàng. Sau đó, thêm nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của
dung dịch sẽ được tăng thêm[40].
- Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda): Ðây là phản ứng khử cũng được sử
dụng để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3
- Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
c. Định tính coumarin:
- Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm.
- Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác
dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân
trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
19

Dựa vào huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm khi soi dưới ánh đèn
tử ngoại. Nguyên nhân sau khi mở vòng lacton bằng kiềm thì coumarin tạo
thành dẫn chất hydroxycinnamic ở dạng cis (acid coumarinic). Chất này dưới
tác dụng của tia tử ngoại thì chuyển thành dạng trans (acid coumaric) có
huỳnh quang sáng hơn [41].
d. Định tính acid hữu cơ:
- Phản ứng với Na2CO3:
Chất hữu cơ nào tác dụng được với muối cacbonat tạo khí CO2 thoát
ra thì phân tử chất hữu cơ phải có chứa nhóm chức axit hữu cơ (−COOH).
R-COOH + Na2CO3 → R-COONa + CO2
↑
+ H2O
e. Định tính acid amin:
- Phản ứng với ninhydrin: Dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh-tím sẫm [39].
f. Định tính alkaloid:
Sử dụng thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tetraiodobismutat).
Thuốc thử Dragendorff được chuẩn bị từ hai dung dịch sau:
Dung dịch 1: Lấy 0,85 g NaHSO3 hòa tan trong 40 ml nước cất và
10 ml acid acetic.
Dung dịch 2: Lấy 8 g KI hòa tan trong 20 ml nước cất.
Lấy 2 ml dung dịch 1 trộn với 5 ml dung dịch 2 và thêm 20 ml acid
acetic sau đó thêm nước cất đến 100 ml là được thuốc thử Dragendorff.
Nếu có mặt alkaloid thì thấy xuất hiện màu da cam sáng.
2.3.4. Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành
2.3.4.1. Nghiên cứu phương pháp nhân giống vô tính bằng giâm hom

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hoocmone sinh
trưởng đến khả năng ra rễ và nảy chồi của hom Sâm Núi Dành.


- Bố trí thí nghiệm: 4 công thức thí nghiệm và 1 công thức đối chứng:
+ ĐC: Nhúng qua nước cất
+ CT 1: Dung dịch IBA nồng độ 500ppm, nhúng nhanh trong 5 giây
+ CT 2: Dung dịch IBA nồng độ 1.000 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây
20

Các công thức và đối chứng được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ,
3 lần lặp, số mẫu cho mỗi công thức và đối chứng là 90 hom.
-Vật liệu sử dụng: là các đoạn thân bánh tẻ có chứa mắt ngủ.
- Phương pháp: Cắt thành các hom có từ 2 – 3 mắt. Sau đó tiến hành nhúng
nhanh qua các công thức thí nghiệm. Và giâm hom vào trong khay cát sạch đã
được xử lý sạch với nước và đem phơi khô.
- Chăm sóc: Sau khi giâm hom được che nắng và giữ ẩm thường xuyên.

Thí nghiệm 2: Xác định giá thể ra cây phù hợp cho cây giâm hom

Các mẫu hom đã ra rễ thu được từ kết quả của thí nghiệm 1 được lấy
làm vật liệu cho thí nghiệm 2.
- Bố trí thí nghiệm: 4 công thức giá thể sau
+ GT 1: Đất tầng B
+ GT 2: 50% đất tầng B+ 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa
+ GT 3: 30% đất tầng B + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa
+ GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa
Chú ý: Đất tầng B- lớp đất thứ 2 từ trên mặt xuống, sau lớp tầng đất
mặt hay tầng đất canh tác (đất tầng A), tích tụ các chất rửa trôi từ tầng A
xuống, được lấy tại chân Núi Dành - thôn Đồng Sen - xã Việt Lập - huyện
Tân Yên.
Giá thể được xử lý thuốc chống nấm (Benkona) trước khi sử dụng cho
thí nghiệm. Giá thể được đóng trong túi bầu có kích thước 10x10. Mật độ
giâm 100 bầu/m2
. Bầu được đặt trong bóng dâm có che phủ 1 lớp lưới đen.
Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ
2. Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của hom Sâm ở các công thức
thí nghiệm. Các đặc điểm hình thái được theo dõi bằng phương pháp quan
sát, đo đếm trực tiếp số cây sống, cây chết.
21

2.3.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính bằng
phương pháp nuôi cấy in-vitro Sâm Núi Dành
Vật liệu: Đoạn thân bánh tẻ có chứa mắt ngủ lấy từ cây Sâm Núi Dành
1 -1,5 năm tuổi. Khử trùng sơ bộ dưới vòi nước chảy, rửa bằng chất tẩy nhẹ
(xà phòng hoặc nước rửa chén loãng) rồi tráng qua bằng nước cất vô trùng.
Sau đó mẫu được đưa vào trong box cấy, khử trùng nhanh bằng cồn 70%
trong 20 giây rồi rửa sạch 2 lần bằng nước cất vô trùng. Sau đó thực hiện thí
nghiệm khử trùng.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu xác định biện pháp khử trùng tạo mẫu sạch:
- Sử dụng chất khử trùng: HgCl2 0,1% và Javen 6%.
- Bố trí thí nghiệm: 8 công thức và 1 đối chứng
ĐC: Không sử dụng các chất khử trùng
CT1: Lắc khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút
CT5: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 10 phút
Mẫu cấy sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nền MS [42]
không chứa hoocmon sinh trưởng. Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch bệnh, tỷ lệ mẫu
nảy chồi và chất lượng chồi sau khử trùng sau 20 ngày vào mẫu.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi:
-Bố trí thí nghiệm: gồm 5 công thức và 1 đối chứng
ĐC: MS + 30 g/l Sucrose + 6,5 g/l Agar CT1: ĐC + 0,2 mg/l Ki
22

CT2: ĐC + 0,4 mg/l Ki
CT5: ĐC + 1 mg/l Ki
-Sử dụng các mẫu sạch thu được từ phương pháp khử trùng tốt nhất
của thí nghiệm 1 cấy trên các công thức môi trường tái sinh.
-Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, tái sinh chồi, chất lượng chồi sau
30 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và IBA đến hệ số nhân
chồi.
Chồi tái sinh được lấy từ môi trường tái sinh tốt nhất, chồi xanh mập đã
có lá được cắt thành từng đoạn dài 3-5 cm chứa 1-2 mắt ngủ được chuyển
sang môi trường nhân nhanh.
-Bố trí thí nghiệm: Sử dụng môi trường: MS + 30 mg/l sucrose + 6,5
mg/l aga có bổ sung BA ở các nồng độ: 2; 2,5; 3 và 3,5 mg/l và IBA ở các
nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4 mg/l.
Theo dõi hệ số nhân chồi, chiều cao trung bình của chồi và chất lượng
chồi sau 60 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường tạo rễ cho chồi Sâm Núi Dành in-
vitro:
+ Thí nghiệm 4.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền có bổ sung
NAA ở các nồng độ đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành.
-Bố trí thí nghiệm: gồm 10 công thức và 2 đối chứng
ĐC1: MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l ĐC2: ½ MS + 30 g/l sucrose + 6,5
agar g/l agar
CT1: ĐC1 + 0,5 mg/l NAA CT6: ĐC2 + 0,5 mg/l NAA
CT2: ĐC1 + 1 mg/l NAA CT7: ĐC2 + 1 mg/l NAA
CT3: ĐC1+ 1,5 mg/l NAA CT8: ĐC2+ 1,5 mg/l NAA
CT4: ĐC1+ 2 mg/l NAA CT9: ĐC2+ 2 mg/l NAA
CT5: ĐC1+ 2,5 mg/l NAA CT10: ĐC2+ 2,5 mg/l NAA
23

+ Thí nghiệm 4.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền có bổ sung IBA
ở các nồng đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành.
-Bố trí thí nghiệm: gồm 10 công thức sau:
CT1: ĐC1 + 0,5 mg/l IBA CT6: ĐC2 + 0,5 mg/l IBA
CT2: ĐC1 + 1 mg/l IBA CT7: ĐC2 + 1 mg/l IBA
CT3: ĐC1+ 1,5 mg/l IBA CT8: ĐC2+ 1,5 mg/l IBA
CT4: ĐC1+ 2 mg/l IBA CT9: ĐC2+ 2 mg/l IBA
CT5: ĐC1+ 2,5 mg/l IBA CT10: ĐC2+ 2,5 mg/l IBA
+ Thí nghiệm 4.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến chất lượng rễ.
Môi trường ra rễ tối ưu nhất từ kết quả của thí nghiệm 1 và thí nghiệm
2 được bổ sung thêm than hoạt tính với các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mg/l.
Các thí nghiệm được theo dõi tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình trên mỗi mẫu,
chiều dài trung bình của rễ và chỉ số ra rễ sau 90 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống
của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm.
Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh được đưa ra vườn trên các loại
giá thể khác nhau.
Cây in vitro hoàn chỉnh có 2-4 rễ, thân dài 10-15cm, có 3-4 nhánh thân
được huấn luyện và trồng trong bầu tại vườn ươm
- Bố trí thí nghiệm: gồm 4 công thức giá thể sau:
- GT 1: Đất tầng B
- GT 2: 50% đât tầng B + 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa
- GT 3: 30% đất tầng B+ 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa
- GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa
Giá thể được xử lý thuốc chống nấm (Benkona) trước khi sử dụng cho
thí nghiệm. Giá thể được đóng trong túi bầu có kích thước 10x10. Mật độ
giâm 80 bầu/m2
.
24

Bầu được đặt trong nhà lưới có che phủ bằng nylon và 1 lớp lưới đen.
Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ
2. Theo dõi tỷ lệ cây sống, cây chết, sinh trưởng và phát triển của cây.
2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn
(Complete Randomized Design -CRD) với 20 bình, mỗi bình 4 mẫu, lặp lại 3
lần.
Các chỉ tiêu theo dõi
Số mẫu sạch bệnh

Tỷ lệ mẫu sạch bệnh = x 100%
Tổng số mẫu
Số mẫu nảy chồi

Tỷ lệ mẫu nảy chồi = x 100%
Tổng số mẫu
Số mẫu ra chồi (rễ)

Tỷ lệ ra chồi (rễ) = x 100%
Tổng số mẫu (rễ)

Số lượng chồi trung bình, số rễ trung bình và chiều dài trung bình chồi
trên mỗi mẫu được tính theo công thức:
1 n
= ∑ Xi
X
n i-n
Tổng số chồi (rễ)

Hệ số nhân chồi (rễ) =
Tổng số mẫu

Chỉ số ra rễ = Số rễ TB/mẫu x Chiều dài rễ TB/mẫu


Điều kiện môi trường và phòng nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng

ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210
C trong 25 phút. Điều kiện nuôi cấy in vitro:
14h sáng, cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20
C.
2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel 2013 và IRRISTAT 5.0.
25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM
NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM
THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG.
3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc
Giang
+ Sâm Đắng ở chân núi Yên Tử, huyện Sơn Động
-Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông nâu. Lá kép lông chim lẻ,
11-15 lá chét, lá chét dài thon nhọn, mặt phủ lông tơ màu nâu. Hoa màu nâu,
có lông tơ màu nâu phủ bên ngoài. Quả đậu, có lông nâu phủ, có 2-3 hạt hình
trứng.
+ Sâm Ngọt (người dân còn gọi là Sâm Nam) thu tại huyện Lạng Giang
-Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc. Lá kép lông chim lẻ,
7-11 lá chét, lá chét dài thon nhọn. Hoa màu trắng ngà, có phủ lông nhung
trắng. Quả đậu, có phủ lông nâu, có 5-6 hạt hình trứng.
+ Sâm Núi Dành thu tại xã Việt Lập và xã Liên Chung huyện Tân Yên
-Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc. Lá kép lông chim lẻ,
3-7 lá chét, lá chét hình bầu dục, mặt phủ long tơ trắng. Hoa trắng ngà, có phủ
lông nhung trắng. Quả đậu, có lông nâu phủ dầy, có 2-3 hạt hình trứng.
a) b)
Hình 3.1. a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng
26

Hình 3.2. Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam)
Hình 3.3. Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang
a) b)
Hình 3.4. a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng
27

3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự
ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành.
Sử dụng 04 mẫu Sâm đã thu thập được làm nguồn vật liệu để tiến hành
nghiên cứu cho thí nghiệm này, từ đó xác định được chính xác loài Sâm Núi
Dành làm nguồn vật liệu chuẩn cho những nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm
STT
Ký hiệu
Tên giống Sâm Nơi thu mẫu
DNA
1 S1 Sâm Núi Dành
khu vực chân Núi Dành, xã Việt
Lập, Tân Yên, Bắc Giang
2 S2 Sâm Núi Dành
khu vực chân Núi Dành, xã Liên
Chung, Tân Yên, Bắc Giang
3 S3 Sâm Đắng
Thu thập tại địa bàn huyện Sơn
Động
4 S4 Sâm Ngọt
Thu thập tại địa bàn huyện Lạng
Giang
3.1.2.1. Phân tích các sản phẩm khuếch đại
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi
ITS1/ITS4 và được điện di trên gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích
thước khoảng 700 bp. Kết quả khuếch đại sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành
thôi gel, sử dụng cột Sigma GenElute TM Agarose Spin column (USA),
nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu.
3.1.2.2. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của các mẫu Sâm
- Kích thước đoạn trình tự của các mẫu Sâm nghiên cứu
Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 sau khi tinh sạch được phân
tích trực tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer
(Applied Biotech) của công ty Macrogen (Hàn Quốc) và phần mềm MEGA
v5.1, kết quả cho ra giản đồ có các đỉnh (peak) với bốn màu sắc khác nhau
tương ứng với bốn loại nucleotide và biểu thị dãy trình tự các nucleotide. Kết
28

quả đã thu được 04 đoạn trình tự ITS của 04 mẫu giống Sâm với số
nucleotide khác nhau trên từng mẫu giống:
Trình tự mẫu S1 (1-640)
ATCCCGACCTGAACTGAGGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGGACGCCCGTGGG
TCACGGAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTC
ACTCAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCA
GCCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCAC
AATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGTGAC
GCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTC
AAAGACTCGATGGTTCCCGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTT
CGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAGATATCTGTTGCCGAGAGTCA
TTCTGTATAGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGTCTCCGGGCCG
ACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGGGCATTTGGCGCCCGGG
TTTGTGTTTGGCTCGGCGGGGAACACACTGCGTGGCCCCCCTCCGAGCCCG
AGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCAACCCTACCGAGTGGTC
AGACAGATTGCCGGTGACTGCTGGCCAGGGC
CTCCGATCTGAGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGCACGCCCGTGGGTCACG
GAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTCACT
CAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCAG
CCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCA
CAATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGT
GACGCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTG
CGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTAT
CGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAAATATCCGTTGCC
GAAAGTCATTCCGTATCGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGT
CTCCGGGCCAACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGCGCAT
TCGGCGCCCGGGTTCGTGTTTGGCTCGGCGGGAAACACACTGCGTGGCC
CCCCTCCAAGCCCGAGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCA
ACCCTACCGAGTGGTCAAACAGATCGCCGGTGGACTGCTGCAGGCCG.
GGTGATCGAGCTTTCAGCAGTCCACCGGTCGATCTGTTTGACCACTCGG
TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG
AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG
CGCCAAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG
29

CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACGGAA
TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG
CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT
CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGTTGAGGGCACGTCTGCC
TGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGCT
CTAATTGGCGGGGGATGGGGCTTCCCGGAAGCCGGGCCTCCGGTTGGTG
AAA
GGTGATCGAGCTTTGCAGCAGTCCACCGGCGATCTGTTTGACCACTCGG
TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG
AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG
CGCCGAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG
CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACAGAA
TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG
CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT
CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTTAGGTTGAGGGCACGTCTGC
CTGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGC
TCTAATTGTGCAGGGTGGATGGTGGCTTCCCGTGAGCACCGGTGCCTCT
CGGTTGGTGAAAATCAATCCGCGGCGGGGTGCCCCCACAAAAGGGGTT
GATGACCTC.
Kết quả phân tích vùng ITS cho thấy trình tự các nucleotide giữa 4 mẫu
Sâm có sự khác biệt nhau. Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các mẫu nghiên cứu
có tỷ lệ Guanin và Cytosine cao hơn tỷ lệ Adenine và Thymine hay nói một
cách khác là đều có thành phần GC cao hơn thành phần AT. Tỉ lệ thành phần
GC trung bình của 4 mẫu Sâm nghiên cứu là 61,7% và tỉ lệ thành phần AT
trung bình 38,3%.
Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu
Mẫu Tỉ lệ (%)
giống T(U) C A G GC AT
S1 19,1 31,7 18,4 30,8 62,5 37,5
S2 19,7 28,9 19,2 32,2 61,2 38,8
S3 20,0 28,9 19,1 32,0 60,8 39,2
S4 18,5 32,9 19,1 29,5 62,4 37,6
Trung
19,4 30,6 18,9 31,1 61,7 38,3
bình
30

* Kết quả so sánh các mẫu nghiên cứu trên Blast
Theo kết quả Blast (Basic Local Alignmet Search Tool) trong NCBI
(National Center for Biotechnology Information), sự tương đồng của trình tự
các nucleotid vùng ITS ở mẫu S1 với các nghiên cứu khác trong cùng chi
Callerya vào khoảng 88-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa
là 99%, cao nhất trong chi Callerya (Bảng 3.3 – Phụ lục 2).
Khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS của mẫu S2
với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động
từ 87-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%, cao nhất
trong chi Callerya (Bảng 3.4 – Phụ lục 2).
Mẫu S3, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với
các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ
88-93%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.5- Phụ lục 2).
Mẫu S6, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với
các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ
88-91%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.6- Phụ lục 2).
* Kết quả so sánh trình tự gen ITS giữa các mẫu Sâm nghiên cứu
Kết quả so sánh sự sai khác giữa 04 mẫu sâm nghiên cứu được trình bày
ở bảng 3.7. Từ bảng kết quả cho thấy, mức tương đồng di truyền của 04 mẫu
Sâm dao động trong khoảng 43,4% đến 98,7%. Hai mẫu (S1-S3) có mức sai
khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền nhỏ nhất là 0.43). Hai
mẫu Sâm S1 và S2 có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất trong 4 mẫu
nghiên cứu (có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,975). Mẫu sâm S1 có
hệ số tương đồng với mẫu S3 và S4 là 0,434 và 0,43
Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu
S1 S2 S3 S4
S1
S2 0.975
S3 0.434 0.43
S4 0.43 0.432 0.857
31

Như vậy, Hai mẫu S1 và S2 có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất
trong 4 mẫu nghiên cứu (có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,975) và
đều tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%. Như vậy có thể khẳng
định chính xác tên loài Sâm Núi Dành là Callerya speciosa (Champ. ex
Benth) Schot.)
3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM
NÚI DÀNH
Sau khi đã xác định được mẫu Sâm Núi Dành chuẩn, thu các mẫu củ tiến
hành phân tích định tính một số nhóm chất quan trọng đặc trưng của Sâm. Từ
đó khẳng định được chất lượng và giá trị của Sâm Núi Dành.
Các mẫu Sâm được thu và được ký hiệu như sau:
STT Ký hiệu Lượng mẫu Chú thích
1 M2 1kg Sâm Núi Dành <3 năm tuổi
2 M3 1kg Sâm Núi Dành 3-4 năm tuổi
3 M4 0,4kg Sâm Núi Dành 4-5 năm tuổi
4 M5 1 kg Sâm Núi Dành >5 năm tuổi
Đối với phương pháp định tính do lượng mẫu Sâm M4 ít nên đã tiến
hành gộp vào mẫu M3. Kết quả được trình bày tại các bảng sau:
Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi
TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét
1 Saponin - Tạo bọt (++) Có saponin
- Phản ứng với kiềm (++)
- Phản ứng Cyanidin (+)
- Phản ứng với FeCl3 (++)
2 Flavonoid -Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (+) Có flavonoid
- Quan sát dưới đèn tử ngoại ở (-)
bước sóng 366nm
- Quan sát huỳnh quang của các
vết coumarin dưới ánh sáng tử (-)
3 Coumarin ngoại khi tác dụng với dung Không có
32

dịch kiềm coumarin
4 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 (+++) Có acid hữu cơ
5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (++) Có acid amin
6 Alkaloid - Hiện bằng thuốc thử (-) Không có
Dragendorff alkaloid
7 Saccharid -Sắc ký bản mỏng có so sánh (++) Có saccharid
với chất chuẩn
Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi
1 Saponin - Tạo bọt (+++) Có saponin
- Phản ứng với kiềm (++)
2 Flavonoid - Phản ứng Cyanidin (+)
- Phản ứng với FeCl3 (++) Có flavonoid
-Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (+)
bước sóng 366nm
3 Coumarin - Quan sát huỳnh quang của (-) Không có
các vết coumarin dưới ánh coumarin
sáng tử ngoại khi tác dụng với
dung dịch kiềm
5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (++) Có acid amin
7 Saccharid Sắc ký bản mỏng có so sánh (++) Có saccharid
Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi
1 Saponin - Tạo bọt (+++) Có saponin
- Phản ứng với kiềm (+++)
2 Flavonoid - Phản ứng Cyanidin (++) Có flavonoid
- Phản ứng với FeCl3 (+++)
-Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (++)
33

bước sóng 366nm Không có
3 Coumarin - Quan sát huỳnh quang của (-) coumarin
các vết coumarin dưới ánh
sáng tử ngoại khi tác dụng với
dung dịch kiềm
5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (+++) Có acid amin
7 Saccharid -Sắc ký bản mỏng có so sánh (++) Có saccharid
Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính; (+): Phản ứng dương tính; (++): Phản ứng rõ;
(+++): Phản ứng rất rõ
Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất
Các chất định Cá phản ứng Hình ảnh Chú thích
tính thực hiện
Định tính
Phản ứng tạo
bọt
saponin:
1: Dịch chiết
mẫu ban đầu
Phản ứng với
2: Dịch chiết
mẫu sau phản
NaOH 10% ứng
Định tính 1 2
flavonoid: 1: Dịch chiết
mẫu ban đầu
Phản ứng với
2: Dịch chiết
mẫu sau phản
dung dịch FeCl3
ứng
34

1 2
Định tính acid Phản ứng với 1: Dịch chiết
amin: dung dịch mẫu ban đầu
ninhydrin 2: Dịch chiết
mẫu sau phản
ứng
1 2
1: Chất chuẩn
(đường glucose)
Hệ dung môi: 2: Dịch chiết
mẫu
Định tính CH2Cl2 : MeOH
3: Hỗn hợp chất
saccharid: :H2O=3:2:
chuẩn và dịch
0.15
chiết mẫu
1 2 3
Định tính
Phản ứng với
thuốc thử
alkaloid:
Dragendorff
Từ các kết quả nghiên cứu đã thu được có thể thấy được Sâm Núi Dành
là một loài Sâm quý bởi củ của nó có chứa các nhóm chất đặc trưng của các
loại Sâm quý như: saponin, flavonoid, acid hữu cơ, acid amin, saccharid.
- Sau khi đã xác định được chính xác loài Sâm Núi Dành (Callerya
speciosa (Champ. Ex Benth) Schot.) và bước đầu đánh giá được chất lượng
thông qua việc định tính được một số thành phần hoạt chất quan trọng có
trong củ sâm, tiến hành thu mẫu để phục vụ cho nghiên cứu nhân giống vô
tính.
35

3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO
3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa
bằng các phương pháp giâm hom

Ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng hình thành rễ và nảy chồi
của các hom Sâm Núi Dành.

Kết quả giâm hom theo dõi sau 60 ngày thực hiện được trình bày tại
bảng sau:
Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm
TT Công Tỷ lệ hom ra Số rễ TB/hom Chiều dài rễ Chỉ số ra
thức rễ (%) (rễ) TB (cm) rễ
1 ĐC 0 0 0 0
2 CT1 0 0 0 0
3 CT2 9,3 1,8b 4,6a 8,3
4 CT3 29,0 2,8a 4,7a 13,2
5 CT4 15,6 1,5b 4,3a 6,5
CV(%) 8,8 6,4
LSD0,05 0,3 0,4
Chú thích : + ĐC: Nhúng qua nước cất
+ CT 1: Dung dịch IBA nồng độ 500ppm, nhúng nhanh trong 5 giây
+ CT 4: Dung dịch IBA nồng độ 2.000 ppm, nhứng nhanh trong 5 giây
Từ bảng số liệu trên ta thấy khi xử lý hom qua nước cất và dung dịch
IBA có nộng độ 500ppm thì hom không hình thành được rễ. Khi nồng độ
IBA tăng lên từ 1000ppm – 2000ppm thì hom có sự hình thành rễ. Công thức
CT3 với nồng độ IBA là 1.500ppm cho tỷ lệ cao nhất đạt 29,0% sai khác có ý
nghĩa với các công thức còn lại ở mức độ tin cậy 95%. Các công thức còn lại
là CT4 có nồng độ IBA cao hơn (2.000ppm) và CT2 có nồng độ IBA thấp
hơn (1.000ppm) đều thu được kết quả thấp hơn CT3 (15,6% và 9,3%).
36

Như vậy là IBA có ảnh hưởng đến sự ra rễ của hom, số rễ trung
bình/hom. Nồng độ TBA thấp hay cao sẽ thu được một tỷ lệ hom ra rễ nhất
định. Khi sử dụng ở nồng độ thích hợp sẽ kích thích hom Sâm Núi Dành có
phản ứng hình thành rễ tốt và chất lượng rễ cũng tốt hơn. (hình 3.7)
Kết quả giâm hom Sâm Núi Dành lựa chọn được công thức tốt nhất là
khi xử lý hom qua dung dịch có chứa IBA nồng độ 1.500ppm, cho tỷ lệ hom
ra rễ là 29%.
Hình 3. 5. Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm

Xác định giá thể ra cây phù hợp cho cây hom.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành
STT Công Số cây sống trung Tỷ lệ cây Số chồi Số lá
thức bình sống (%) TB/hom TB/hom
1 GT1 19,2c 32 1,4 2,6
2 GT2 30,6b 51 1,6 3,7
3 GT3 46,8a 78 1,8 4,1
4 GT4 35,4b 59 1,7 3,9
CV(%) 9,6 - - -
LSD0,05 2,6 - - -
Chú thích: + GT 1: Tầng đất B
+ GT 2: 50% đất tầng B+ 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa
+ GT 3: 30% đất tầng B + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa
+ GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa
37

Kết quả thí nghiệm cho cây hom Sâm Núi Dành tại thí nghiệm 2 trên
4 giá thể cho thấy: Số cây sống ở công thức GT3 sai khác có nghĩa so với
công thức giá thể GT1. Số cây sống trung bình tại các công thức giá thể dao
động từ 19,2 – 46,8 cây. Trong đó giá thể GT3: 30% đất + 20 % trấu hun +
50% bột xơ dừa có tỷ lệ cây sống đạt cao nhất đạt 78% tiếp theo là công thức
GT4 với 59%; GT2 là 51% và công thức giá thể GT1 có tỷ lệ ra cây sống thấp
nhất 32%.
Hình 3.6. Động thái tăng trưởng số chồi/hom
Chú thích:
SCTH.15: Số chồi hình thành sau 15 ngày SCTH.30: Số chồi hình thành sau 30 ngày
Khi hom giâm sau 90 ngày được hình thành rễ đã tiến hành đóng các
cành hom giâm vào các túi bầu chứa các giá thể khác nhau và cứ 15 ngày tiến
hành theo dõi động thái tăng trưởng. Hình 3.8 kết quả theo dõi số chồi hình
thành trên hom giâm. Ta thấy trước 60 ngày trồng vào giá thể ra cây thì tại
các hom giâm không có sự thay đổi về số chồi/hom. Sau 60 ngày thì các công
thức giá thể mới có sự thay đổi sau 90 ngày theo dõi giá thể GT3 cho số chồi
cao nhất tiếp theo là giá thể GT4.
Tương tự chỉ tiêu số chồi/hom thì chiều dài chồi cũng được theo dõi 15
ngày 1 lần, kết quả cho thấy các công thức không có sự chênh lệch nhiều về
sinh trưởng chiều dài chồi. Giá thể GT3 sau 90 ngày chuyển thì có chiều dài
38

chồi lớn nhất 38,2 cm, tiếp theo là giá thể GT4 với 34,6cm tại GT2 là 35,4 cm
và thấp nhất tại giá thể GT1 với 33,4 cm.
Hình 3.7. Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm
Chú thích: CDC: Chiều dài chồi
GT1: Giá thể 1 GT2: Giá thể 2 GT3: Giá thể 3 GT4: Giá thể 4
Hình 3.8. Động thái tăng trưởng số lá/chồi
Chú thích: SL.15 : Số lá sau 15 ngày SL.30: Số lá sau 30 ngày SL.45: Số lá sau 45 ngày
SL.60: Số lá sau 60 ngày SL.75: Số lá sau 75 ngày SL.90: Số lá sau 90 ngày
Qua hình 3.10 ta thấy các giá thể ra cây không ảnh hưởng nhiều tới khả
năng sinh trưởng phát triển lá mới trên chồi giâm. Sau 60 ngày chuyển vào giá
thể ra cây thì cành giâm mới bắt đầu ổn định và phát triển.
39

Tổng hợp các kết quả thu được từ các thí nghiệm nhân giống cho loài
Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom: Hom có tỷ lệ ra rễ tốt nhất khi
được xử lý qua dung dịch IBA nồng độ 1.500ppm đạt 29% và ra cây trên giá
thể có chứa: 30% đất tầng B + 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa cho tỷ lệ cây
sống cao nhất (78%).
3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi
Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro
3.3.2.1.Nghiên cứu xác định biện pháp khử trùng tạo mẫu sạch.
Thí nghiệm sử dụng Javen 6% trong các khoảng thời gian (10, 12, 14
và 16 phút) và HgCl2 0,1% khử trùng trong (3, 5, 7 và 9 phút). Mẫu sau khi
khử trùng được nuôi cấy trên trường MS.
Sau thời gian theo dõi 20 ngày, kết quả khử trùng tạo mẫu sạch được
thể hiện tại bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả
năng tạo mẫu sạch bệnh
Loại hóa Thời gian khử Tỷ lệ sạch Tỷ lệ mẫu Đặc điểm mẫu
chất trùng (phút) bệnh (%) sống (%)
ĐC 0 0 0 Mẫu bị nấm, khuẩn
10 23,3 56,7 Mẫu xanh
Javen 6%
12 34,2 48,3 Mẫu hơi ngả vàng
3 66,7 26,7 Mẫu xanh
HgCl2 0,1%
5 95,7 65,8 Mẫu xanh
9 99,2 8,3 Mẫu ngả vàng
Phân tích kết quả từ bảng 3.10 cho thấy:

Với chất khử trùng là Javen 6%: Khi khử trùng mẫu bằng Javen
6% có tác dụng diệt khuẩn nhưng nó cũng gây phá hủy thành tế bào cellulose

40

của tế bào thực vật nên khi thời gian khử trùng dài tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao
đồng thời tỷ lệ mẫu sống cũng giảm đi. Từ bảng số liệu trên ta thấy, thời gian
khử trùng với Javen 6% trong 10 phút cho kết quả mẫu sống cao nhất là
56,7% nhưng tỷ lệ mẫu sạch bệnh lại thấp 23.3%. Khi tăng thời gian khử
trùng lên 12 -14 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh tăng là 34,2% và 54,2% nhưng
tỷ lệ mẫu sống giảm 48,3% và 25,8%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên
16 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh tiếp tục tăng nhưng tỷ lệ mẫu sống giảm
xuống còn 10,7%.

Với chất khử trùng là HgCl2 0,1%: HgCl2 có khả năng diệt khuẩn diệt
nấm mạnh nhưng chúng cũng ngấm qua thành tế bào thực vật gây ngộ độc
cho tế bào nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm giảm nhưng tỷ

lệ sống cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy, thời gian lắc khử trùng với
HgCl2 0,1% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 65,8% và tỷ lệ mẫu
sạch bệnh là 95,7%. Khi tăng thời gian khử trùng lên 7 phút và 9 phút thì tỷ lệ
mẫu sạch bệnh cao hơn là 97,8% và 99,2% nhưng tỷ lệ mẫu sống cũng giảm
đi còn 21,6 % và 8,3 %.
Như vậy, thời gian khử trùng và chất khử trùng có ảnh hưởng tới tỷ lệ
mẫu sạch và tỷ lệ sống của mẫu cấy. Lựa chọn chất khử trùng là HgCl2 0,1%
, thời gian khử trùng là 5 phút làm phương pháp khử trùng tốt nhất, vừa có
khả năng tiêu diệt mầm bệnh và tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ
sống của mẫu cao.
3.3.2.2. Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi Sâm Núi Dành
Sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả đánh giá thí nghiệm được thể hiện tại
bảng 3.11.
41

Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi
Công thức Tỷ lệ nảy chồi Chiều dài TB chồi
Đặc điểm của chồi
thí nghiệm (%) (cm)
ĐC 68,5 7,83d Chồi sinh trưởng chậm
CT1 90,8 10,27b
Chồi sinh trưởng tốt, chồi
xanh, mập
CT2 97,5 10,53a
xanh, mập
CT3 100 10,7a
xanh, mập
CT4 96,7 10,2b
xanh, mập
CT5 90 9,63c
Chồi sinh trưởng chậm
hơn, xuất hiện callus ở gốc.
CV% 0,8
LSD0,05 0,14
Chú thích: ĐC: MS + 30 g/l Sucrose + 6,5 g/l Agar
CT1: ĐC + 0,2 mg/l Ki CT2: ĐC + 0,4 mg/l Ki
CT4: ĐC + 0,8 mg/l Ki CT5: ĐC + 1 mg/l Ki
Hình 3. 9. Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh
a) Môi trường có bổ sung 0,6mg/l Ki
b) Môi trường có bổ sung 1 mg/l Ki
Sau 1 tuần thì Sâm Núi Dành bắt đầu phản ứng tái sinh chồi trên môi
trường có bổ sung Ki. Ở môi trường đối chứng, sau 2 tuần Sâm Núi Dành mới
42

có phản ứng tái sinh chồi, chồi sinh trưởng chậm hơn so với các môi trường
có bổ sung Ki.
Từ bảng 3.11 cho thấy Ki có ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi của Sâm Núi
Dành. Số chồi tái sinh cao nhất (100%), chồi sinh trưởng tốt, chồi xanh và mập
ở công thức môi trường có bổ sung 0,6 mg/l Ki. Khi bổ sung nồng độ Ki cao
(1mg/l) chồi sinh trưởng chậm hơn và xuất hiện callus ở gốc.
Như vậy môi trường MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 0,6 mg/l Ki
được chọn là môi trường tái sinh chồi Sâm Núi Dành tốt nhất.
3.3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và IBA đến hệ số nhân chồi Sâm
Núi Dành
Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của BA và IBA đến hiệu quả nhân
nhanh chồi Sâm Núi Dành sau 60 ngày được thể hiện tại bảng 3.12.
Phân tích bảng kết quả (bảng 3.12) cho thấy sự kết hợp giữa BA và IBA
trong môi trường nhân nhanh có ảnh hưởng đến kết quả nhân nhanh chồi của
Sâm Núi Dành nhưng lại không ảnh hưởng nhiều đến chiều cao trung bình
của chồi. Khi sử dụng BA và IBA ở những nồng độ khác nhau thì cho kết quả
khác nhau. Môi trường có bổ sung: 3 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA cho kết quả tốt
nhất, hệ số nhân chồi đạt cao nhất (6,52 lần), chiều cao đạt 10,2cm và chất
lượng chồi cũng tốt nhất, chồi xanh và nhiều lá. Ở các công thức kết hợp khác
giữa nồng độ BA là (2; 2,5; 3,5; 4 mg/l) và IBA là (0,2; 0,6 và 0,8 mg/l) đều
thu được kết quả thấp hơn, giao động từ 3,25 – 6,37 lần. Hệ số nhân chồi giả
m, chồi ngắn, các chồi phát triển chậm, có ít hoặc không có lá và sùi ở gốc
hình thành callus (hình 3.10).
Như vậy, môi trường MS + 30 g/l đường sucrose + 6,5 g/l agar + 3 mg/l
BA + 0,4 mg/l IBA được lựa chọn là môi trường nhân nhanh chồi Sâm Núi
Dành tốt nhất.
43

a
c
b
d
Hình 3. 10. Chồi Sâm Núi Dành trên các CT môi trường nhân nhanh
a) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung: 4 mg/l BA+0,8 mg/l IBA
b) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung: 3 mg/l BA+0,4 mg/l IBA
c) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung 3 mg/l BA + 0,8 mg/l IBA
d) Chồi Sâm nhân nhanh trên môi trường có bổ sung 4 mg/l BA + 0,4 mg/l IBA
44

Đề tài “ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang”.doc

Đề tài “ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang”.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Đề tài “ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang”.doc

Similar to Đề tài “ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang”.doc (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Đề tài “ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang”.doc