Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Khả năng sử dụng một số vi khuẩn lab phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của lactobacillus fermentum
1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢ NĂNG SỬ DỤNG MỘT SỐ VI KHUẨN LAB PHÂN
LẬP TRONG KHOANG MIỆNG ỨC CHẾ SỰ TẠO
THÀNH MÀNG SINH HỌC CỦA Lactobacillus fermentum
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đặng Vân Anh
MSSV: 1311100138 Lớp: 13DSH02
TP.Hồ Chí Minh, 2017
2. Đồ án tốt nghiệp
i
LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS.
Nguyễn Hoài Hương Giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi
trường của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác
dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn trung
thực. Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình.
Tp.HCM, ngày tháng năm 2017
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Đặng Vân Anh
3. Đồ án tốt nghiệp
ii
LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành được đồ án “Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân
lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus
fermentum” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp
phải không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình
của TS. Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm -
Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những kiến thức và kỹ năng cần
thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của ngày hôm nay. Em xin chân
thành cảm ơn cô.
Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy Cô giảng viên và
Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học
Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện giúp em tiếp cận được nhiều nguồn tài liệu để
hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định.
Dù đồ án đã hoàn thành nhưng không tránh khỏi những sai sót nhất định do khả
năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để phục vụ quá trình
thực hiện đồ án. Kính mong nhận được sự góp ý và chỉ dạy của các Thầy Cô để em học
hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành
trang bước sang một môi trường làm việc mới sau này.
Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã
bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt
nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn!
TP.HCM, ngày tháng năm 2017
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Đặng Vân Anh
4. Đồ án tốt nghiệp
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CÁM ƠN ..................................................................................................................ii
MỤC LỤC...................................................................................................................... iii
PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ...................................................................v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..............................................................................................iv
MỞ ĐẦU..........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu ...........................................................................................2
3. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................3
4. Nhiệm vụ nghiên cứu...........................................................................................4
5. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................4
6. Các kết quả đạt được............................................................................................5
7. Kết cấu đồ án........................................................................................................5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................................6
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) ..............................................................6
1.2. Tổng quan về Probiotic..................................................................................19
1.3. Màng sinh học................................................................................................31
1.4. Sâu răng..........................................................................................................37
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................44
2.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................44
2.2. Thời gian thực hiện ........................................................................................44
2.3. Vật liệu và thiết bị..........................................................................................44
2.4. Phương pháp luận...........................................................................................45
2.5. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................47
5. Đồ án tốt nghiệp
iv
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.................................................................64
3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý............................................................................64
3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa .........................................................................67
3.3. Kết quả khả năng sinh enzyme ......................................................................71
3.4. Kết quả khả năng kháng khuẩn......................................................................75
3.5. Kết quả khả năng kháng kháng sinh ..............................................................77
3.6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau
khi qua xử lý nhiệt...................................................................................................81
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................84
1. Kết luận ..............................................................................................................84
2. Kiến nghị............................................................................................................84
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................85
PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU .........................................................................................94
6. Đồ án tốt nghiệp
v
PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG
Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe agar (MRS agar):
Tween 80 1ml
Cao thịt 10g
Pepton 5g
Yest Extract 5g
D-glucose 10g
Diamonium Citrate 2g
MgSO4.7H2O 0.2g
MgSO4.4H2O 0.2g
K2PO4 2g
Nước cất 1000ml
Agar 2%
Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25o
C.
Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth):
Tween 80 1ml
Cao thịt 10g
Pepton 5g
Yest Extract 5g
D-glucose 10g
Diamonium Citrate 2g
MgSO4.7H2O 0.2g
MgSO4.4H2O 0.2g
K2PO4 2g
Nước cất 1000ml
Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25o
C.
Thành phần nước muối sinh lí:
NaCl 9g
Nước cất 1000ml
Thành phần môi trường Glucose Phosphate broth (MR – VP broth):
Peptone 7g
Dextrose 5g
K2HPO4 5g
Nước cất 1000ml
7. Đồ án tốt nghiệp
ii
Thành phần môi trường Simmon citrate agar (SCA)
MgSO4.7H2O 0,2g
NH4H2PO4 1g
K2HPO4 1g
Na3C6H5O7 2g
NaCl 5g
Bromothymol blue 0,08g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0.2 tại 25o
C.
Thành phần môi trường canh tryptone:
Tryptone 10g
NaCl 5g
Nước cất 1000ml
Điều chỉnh pH = 7.5 ± 0.2 tại 25o
C
Thành phần môi trường Triple sugar iron agar (TSI):
Cao thịt 3g
Peptone 20g
Yeast extract 3g
Lactose 10g
Sucrose 10g
Dextrose 1g
FeSO4 0,2g
NaCl 5g
Na2S2O3 0,3g
Phenol red 0,024g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại
25o
C.
8. Đồ án tốt nghiệp
ii
Thành phần môi trường Blood agar:
Beef heart infusion 500g
Tryptose 10g
NaCl 5g
Agar 15g
Máu cừu 50ml
Nước cất 950ml
Điều chỉnh pH = 7.3 ± 0.2 tại 25o
C.
Thành phần môi trường Skim milk agar:
Bột sữa gầy 28g
Casein enzymic hydrolysate 5g
Cao nấm men 2,5g
Dextrose 1g
Agar 15g
Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25o
C.
Thành phần môi trường Lactobacillus biofilm medium (LBM):
Peptone 5g
Cao nấm men 2,5g
K2HPO4 3g
(NH4)3C6H5O7 1g
Dextrose 10g
Cao thịt 5g
Tween 80 0,5g
CH3COONa.H2O 2,5g
MgSO4 0,05g
MnSO4 0,025g
CaCl2 0,1g
Nước cất 1000ml
Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25o
C.
9. Đồ án tốt nghiệp
ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
LAB Lactic acid bacteria /Lactobacillales
MRS de Man, Rogosa and Sharpe
SCA Simmon citrate agar
SAS Statistical Analysis Systems
TSI Triple sugar iron
TN Thí nghiệm
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
10. Đồ án tốt nghiệp
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ
răng miệng .......................................................................................................................3
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic .....................................11
Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB .......19
Bảng 2.1. Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vòng kháng .....62
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý ..........................................................................64
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa ........................................................................67
Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate ..................................................69
Bảng 3.4. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng lactic ...................................71
Bảng 3.5. Tỉ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic (%) ................................................76
Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic ...........................................77
Bảng 3.7. Kết quả ức chế khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn lactic sau khi xử lý
nhiệt ...............................................................................................................................82
11. Đồ án tốt nghiệp
iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Một số vi khuẩn lactic điển hình ....................................................................8
Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic ...........................13
Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang
miệng .............................................................................................................................28
Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic ...............................................29
Hình 1.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học ......................................................32
Hình 1.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới
đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử ........................................32
Hình 1.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng
sinh học .........................................................................................................................35
Hình 1.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ
nước nóng Mickey, Oregon ..........................................................................................36
Hình 1.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng....................39
Hình 1.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng.......................39
Hình 1.11. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng ....................................40
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ..........................................................................................46
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn
lactic bị xử lý nhiệt ........................................................................................................63
Hình 3.1. Kết quả nhuộm bào tử bằng Malachite green của các chủng lactic .............66
Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh dưỡng kỵ khí. Dưới đáy ống nghiệm có xuất hiện
sinh khối, chứng tỏ các chủng đều tăng trưởng bình thường khi không có khí O2 .......67
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm Citrate (+: Salmonella typhimurium) ...........................68
Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm H2S ...............................................................................68
Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm Indole (+:Escherichia coli) ..........................................69
Hình 3.6. Kết quả lên men carbohydrate của các chủng lactic ....................................70
Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm tan huyết của các chủng lactic .....................................72
12. Đồ án tốt nghiệp
v
Hình 3.8. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Casein ........................................73
Hình 3.9. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Gelatin .......................................73
Hình 3.10. Tất cả các chủng đều chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính với
thử nghiệm β- galactosidase...........................................................................................74
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic ...........................75
Hình 3.12. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic .........................................80
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn
lactic sau khi xử lý nhiệt ...............................................................................................81
13. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì các nghiên cứu khoa
học thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng ngày càng phát triển. Ngày nay con người
đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, từ công nghiệp,
nông nghiệp, an ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v...
Các nhà khoa học cùng với các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kiến thức từ
các tài liệu trên toàn thế giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật mới để cho ra đời các
giống cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các giống hiện có. Bên
cạnh đó người ta còn tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, các
bộ kit xác định bệnh, những nhân tố mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế
- xã hội và bảo vệ môi trường.
Ngoài ra, đã có nhiều kết quả nghiên cứu khoa học áp dụng cho lĩnh vực công
nghệ thực phẩm. Từ những nghiên cứu đó chúng ta cho ra đời các loại vi sinh vật dùng
trong chế biến nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng, cảm quan và bảo quản thực phẩm,
làm cho thực phẩm không đơn giản chỉ là bổ sung năng lượng mà còn có thể giúp con
người phòng chống một số bệnh, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể.
Đi đôi với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu sử dụng các chế phẩm,
thực phẩm cũng như việc sinh hoạt lành mạnh để có được sức khỏe tốt luôn là mục tiêu
của rất nhiều người đang hướng tới. Thời gian gần đây, chúng ta thường nghe nhiều về
khái niệm “Probiotics” mà không phải ai cũng hiểu Probiotics là gì. Probiotics trên
thực tế chính là các vi khuẩn sống có lợi đường ruột, khi ăn vào đem lại các lợi ích sức
khoẻ con người nhờ cải thiện hệ vi sinh đường ruột và chức năng của ruột. Hai loài vi
khuẩn probiotics thông dụng hiện này Bifidobacteria và Lactobacillus. Vi khuẩn
probiotic giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư... Ngoài ra, việc có thể phát
hiện được một loài vi khuẩn có khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của các vi
khuẩn có hại trong khoang miệng để hạn chế khả năng gây sâu răng đồng thời mang
14. Đồ án tốt nghiệp
2
tính an toàn như một chủng vi khuẩn Probiotic cũng được khá nhiều nhà khoa học quan
tâm và đó là lý em em chọn thực hiện đề tài này. Em muốn mình có thể tìm hiểu cụ thể
hơn về loại vi khuẩn này cũng như hy vọng rằng có thể vận dụng những điều mình biết
được vào thực tế, cụ thể là khi làm việc sau này.
2. Tình hình nghiên cứu
Trong nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác
động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi
vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian
nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng
probiotic có khả năng này [43], khiến cho việc sử dụng vi khuẩn lactic nói chung và
probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn.
Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong sữa
chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong
nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng
[48]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho mát,
LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho mát có thể làm giảm tỷ lệ sâu
răng ở trẻ nhỏ [49].
Hallstrom và cộng sự cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic
L. reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 không góp phần hình thành mảng bám
trong khoang miệng [44].
Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều
thông qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang
miệng. Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1.
15. Đồ án tốt nghiệp
3
Bảng 0. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ
răng miệng [50].
Tác giả Chủng probiotic
Thời
gian
nghiên
cứu
Độ tuổi –
số đối
tượng
nghiên
cứu
Tổng MS
trong
khoang
miệng
Tình
trạng
sâu
răng
Nase và cs, 2001 L. rhamnosus GG 7 m 1–6, 594
Ahola và cs, 2002 Lactobacillus spp. 3 w 18–35, 74 -
Nikawa và cs, 2004 L. reuteri ATCC 55730 2 w 20, 40 -
Montalto và cs, 2004 Lactobacillus spp. 45 d 23–37, 35 -
Caglar và cs, 2005 Bifidobacterium animalis ssp.
lactis DN-173010
2 w 21–24, 21 -
Caglar và cs, 2006 L. reuteri ATCC 55730 2 w 21–25, 120 -
Caglar và cs, 2007 L. reuteri ATCC 55730 3 w 21–24, 80 -
Caglar và cs, 2008 Bifidobacterium lactis BB-12 10 d 20–24, 40 -
Caglar và cs, 2009 L. reuteri ATCC 55730, L. reuteri
ATCC PTA 5289
10 d 20, 20 -
Cildir và cs, 2009 Bifidobacterium animalis ssp.
lactis DN-173010
2 w 12–16, 24 -
Stecksen-Blicks và cs,
2009
L. rhamnosus LB21
21 m 1–5, 174
Lexner và cs, 2010 L. rhamnosus LB21 2 w 12–15, 20 -
Singh và cs, 2011 L. acidophilus La5
Bifidobacterium lactis Bb-12
10 d 12–14, 40 -
Jindal và cs, 2011 L. rhamnosus, Bifidobacterium
longum, Saccharomyces cerevisae
14 d 7–14, 150 -
Marttinen và cs, 2012 L. rhamnosus GG, L. reuteri
SD2112, L. reuteri PTA 5289
2 w 20–30, 13 -
Chuang và cs, 2011 L. paracasei GMNL- 33 2 w 20–26, 70 -
Cildir và cs, 2012 L. reuteri ATCC PTA 5289, L.
reuteri DSM 17938
25 d 4–12, 19 -
Petersson và cs, 2011 L. rhamnosus LB21 15 m 58–84, 160
Taipale và cs, 2012 Bifidobacterium animalis BB-12
15 m
2 tháng
tuổi đến 2
tuổi, 106
Juneja và Kakade, 2012 L. rhamnosus hct 70 9 w 12-15, 40 -
Sudhir và cs, 2012 L. acidophilus 3 w 10-12, 40 -
(d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm; , không thay đổi; -, âm tính)
3. Mục tiêu nghiên cứu
Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ khoang miệng. Mục tiêu
cuối cùng sau khi thực hiện các thử nghiệm khảo sát là xác định xem chúng có khả
16. Đồ án tốt nghiệp
4
năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum không và có đủ
an toàn để bổ sung vào các sản phẩm sử dụng cho con người và động vật không.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa.
_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn.
_ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh.
_ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum.
5. Phương pháp nghiên cứu
a) Phương pháp luận
_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý: khả năng chịu nhiệt ở 10o
C, 45o
C, 60o
C; khả năng
chịu mặn: 3,5% NaCl và 6,5% NaCl; khả năng sinh bào tử; khả năng sinh dưỡng trong
điều kiện kỵ khí.
_ Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa: khả năng lên men carbohydrate; thử nghiệm MR
– VP; thử nghiệm Citrate; Thử nghiệm Indole; khả năng sinh H2S.
_ Khảo sát khả năng sinh enzyme: enzyme thủy phân Gelatin; enzyme thủy phân
Casein; thử nghiệm tan huyết; thử nghiệm 𝛽 – Galactosesidase.
_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục.
_ Khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar Diffusion
Test).
_ Khả năng ức chế tạo màng sinh học của Lactobacillus fermentum sử dụng các vi
khuẩn lactic sau xử lý nhiệt.
b) Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị.
- Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu.
17. Đồ án tốt nghiệp
5
6. Các kết quả đạt được
_ Chọn được chủng vi khuẩn lactic an toàn và có thể ứng dụng để ức chế sự hình thành
màng sinh học của Lactocbacillus fermentum.
7. Kết cấu đồ án
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề
tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề
tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.
18. Đồ án tốt nghiệp
6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB)
1.1.1. Giới thiệu chung
Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta.
Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu
thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích
chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến nay,
những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính
khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người.
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại
thực phẩm lên men (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc
để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà
hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua.
Năm 1875, L. Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động
của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister
đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là
Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic
đã được hình thành.
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, hiện nay chúng được công nhận là
an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên
trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người.
Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra
bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin,
plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển
của các nguồn bệnh trong thực phẩm [2] [3].
19. Đồ án tốt nghiệp
7
Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra
các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có khối
lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và
vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc
biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đối với hydroxy peroxide
thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên
tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Đối với bacteriocin, cơ chế
kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin,
bacteriocin gram (+) [4].
1.1.2. Đặc điểm hình thá i của vi khuẩn lactic.
Các tế bào có hình dáng đa dạng: từ hình que dài, mảnh đến hình que ngắn uốn
cong, thường tạo thành chuỗi. Không có khả năng di động (ngoại trừ một số chủng có
tiên mao hoặc lông roi trên bề mặt cơ thể), không sinh bào tử, gram dương. Một số
chủng thể hiện tính lưỡng cực, xuất hiện các chấm nhỏ hoặc các đường kẻ dọc (quan
sát qua kính hiển vi) khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm gram hoặc methylene blue.
[51]
Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bề mă ̣t bóng, màu trắng đục hoặc
màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn
lạc tỏa ra mùi chua của acid.
Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm. Các tế
bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Còn với trực
khuẩn thì từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.
Đặc điểm hình thái giống vi khuẩn lactic điển hình:
Trong số các vi khuẩn lactic, giống Lactobacillus được xem là đa ̣i diê ̣n cho chủng
vi khuẩn này.
20. Đồ án tốt nghiệp
8
Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng :
hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng loài.
_Giống Lactobacillus
Giới : Vi khuẩn
Ngành : Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Lactobacillacea
Giống: Lactobacillus
Hình 1.1. Một số vi khuẩn lactic điển hình
a) Lactobacillus casei b) Latobacillus brevis
c) Lactobacillus bulgaricus d) Lactobacillus plantarum
a)
b)
c)
d)
21. Đồ án tốt nghiệp
9
Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L.
casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus …
Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều
kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng
riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động,
không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi
trường có pH thấp. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng,
và chịu được nhiệt độ cao. Ngoại trừ loài L. plantarum thì những loài khác không có
khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định.
Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật
và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh
dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có
chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus
plantarum.
Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi
chất của chúng. Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau:
- Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium,
có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có
phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không
lên men được pentose, thường phát triển ở 45o
C.
- Nhóm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (có
FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men
đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid
acetic.
22. Đồ án tốt nghiệp
10
- Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có
phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả
hexose và pentose lên men dị hình.
Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích
trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng
ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn
Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ
do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp.
1.1.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
1.1.3.1. Đặc điểm sinh lý, sinh trưởng
Sinh dưỡng ở điểu kiện kỵ khí tùy nghi, thường tăng trưởng trên bề mặt môi
trường rắn kèm theo các điều kiện: kỵ khí, giảm áp suất oxy, 5-10% CO2. Có thể bị ức
chế tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí, một số loài thuộc nhóm sinh vật kỵ khí bắt
buộc.
Có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, dẫn xuất acid
nucleic, vitamin, khoáng, acid béo, ester acid béo và carbohydrate. Các yêu cầu dinh
dưỡng đặc trưng cho từng loài, thường là các chủng đặc biệt. Nhiệt độ tăng trưởng từ
2 – 53o
C, nhiệt độ tối ưu khoảng 30 – 40o
C.
Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2,
thường tăng trưởng ở mức pH 5.0 hoặc thấp hơn, tốc độ tăng trưởng giảm trong điều
kiện pH môi trường trung tính hoặc kiềm.
23. Đồ án tốt nghiệp
11
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic
Chi
Hình
thái tế
bào
Lên
men
lactic
Nhiệt
độ tăng
trưởng,
o
C
Khả năng
chịu
muối,%
pH tăng
trưởng
Lactic aicd
isomer
10 45 6,5 18 4,4 9,6
Lactobacillus que đh/dh ± ± ± - ± - D,L,DL
Lactococcus Cầu đh + - - - ± - L
Leuconostoc Cầu dh + - ± - ± - D
Oenococcus Cầu dh + + ± - ± - D
Pediococcus Tứ cầu đh ± ± ± - + - D,L,DL
Streptococcus Cầu đh - + - - - - L
Tetragenococcu
s
Tứ cầu đh + - + + - + L
Aerococcus Tứ cầu đh + - + - - + L
Carnobacterium Que dh + - - - - - L
Enterococcus Cầu đh + + + - + + L
Vagococcus Cầu đh + - - - ± - L
Weissella Cầu dh + - ± - ± - D,L,DL
(đh: đồng hình ; dh: dị hình)
1.1.3.2. Đặc điểm sinh hoá
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram (+), oxidase âm tính, không có khả năng di động
đồng thời không sinh bào tử , có khả năng lên men carbonhydrate.
Hiếm khi khử nitrate, chỉ khi pH cuối cùng từ 6.0 trở lên hoặc có bổ sung vào môi
trường tăng trưởng. Không thủy phân gelatine (làm gelatine hóa lỏng), không phân giải
24. Đồ án tốt nghiệp
12
casein nhưng một lượng nhỏ nitơ hòa tan được sản xuất ra bởi hầu hết các chủng. Thử
nghiệm Indole âm tính và không sản xuất H2S.
Catalase và cytochrome âm tính (không có prophyrin), tuy nhiên, một vài chủng
của một số loài phân hủy H2O2 bằng pseudocatalase hoặc bằng chính catalase của
heme có mặt trong môi trường. Phản ứng Benzidine âm tính. Hiếm có trường hợp hình
thành sắc tố, nếu có sẽ xuất hiện màu cam, vàng, đỏ gạch. [51]
1.1.3.3. Quá trình trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua
việc lên men lactic. LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose,
mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose
(arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các
loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện
khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo
ra cũng khác nhau.
Quá trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình. Lên men đồng hình gồm
con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành
lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic. Trong khi đó ở lên men
lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, còn lại là CO2,
acetaldehyde, ethanol.
25. Đồ án tốt nghiệp
13
Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic
A) Lên men đồng hình . B) Lên men dị hình
26. Đồ án tốt nghiệp
14
Lên men lactic đồng hình
Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic
tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol,
diacetyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:
C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J
Con đường Glycolysis hay con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)
được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli,
Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase
để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-
phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo
thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử
thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+
, do đó NADH đã được
oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra
chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. (Hình
1.2A)
Lên men lactic dị hình
Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo
6-phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục
chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được
tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic.
Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị
khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản
phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol,
acid acetic, acid succinic... thì nó được gọi là lên men lactic dị hình.
Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:
C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2
27. Đồ án tốt nghiệp
15
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic
và acid acetic 10% các loại khí 20%.... đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự
tích luỹ một lượng ít acid foocmic.
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn lactic
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần
đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là
lớn nhất và giá thành rẻ [79]. Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng
đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ
đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.
Thành phần môi trường nuôi cấy
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho
hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi
trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa
nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi
khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế
bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn
carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối
khoáng và các yếu tố vi lượng.
Yếu tố môi trường
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh hưởng đến enzyme của tế
bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các
enzyme, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt
độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở
28. Đồ án tốt nghiệp
16
nhiệt độ 30 – 40o
C. Một số có thể sinh trưởng dưới 15o
C và thậm chí một số dòng có
thể sinh trưởng dưới 5o
C [5].
Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm và khi
nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ảnh hưởng lên sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đó,
cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi,
pH tối ưu phải giữa 5.5 và 6.0.
Ảnh hưởng của nồng độ acid
Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi
khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích
lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát
triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta
cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid
sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3.
Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men
Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những
mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao
đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính
kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều
trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau như:
_ Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như
cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực
phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính cảm quan và
29. Đồ án tốt nghiệp
17
dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi
ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có
tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối đồng thời kéo
dài được thời gian bảo quản của các sản phẩm thực phẩm như bánh mì.
_ Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic,
đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh
vực khác nhau.
_ Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…
_ Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm
Fusarium, Aspergillus, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm,
ứ c chế một số vk gây bê ̣nh trên các loài thuỷ hải sản. Ngoài ra còn được ứ ng dụng
trong bảo quản ha ̣t giống do sự phát triển của nấm mốc như: bắp, đâ ̣u phộng,….
1.1.6. Hoạt tính sinh học
Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic
và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và
các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò
quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe
của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con
người [6] [7].
1.1.6.1. Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic
LAB cũng ứ c chế sự phát triển của vi sinh vâ ̣t có ha ̣i gây thối rữa thông qua các
sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đă ̣c biê ̣t là
bacteriocin.
Bacteriocin: Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể
tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với
30. Đồ án tốt nghiệp
18
chúng [8]. Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi
khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng,
đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc [9].
Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ
rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác
với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh
hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có
ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng
công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic.
Bacteriocin còn có một số ha ̣n chế như: ít được biết đến hơn chất bảo quản hoá
học. Bi ̣thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein.
Bacteriocin được ứ ng dụng: Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là
các chất bảo quản thực phẩm, dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng
gói thực phẩm.
Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử dụng để chống la ̣i các vi sinh vâ ̣t gây thối rữa
và chứ c năng hoá có thể ứ c chế vi sinh vâ ̣t của chúng được tóm tắt như sau:
31. Đồ án tốt nghiệp
19
Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB [5].
Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng
Acid lactic Vi khuẩn gram âm, một vài loài nấm
Acid acetic Nấm, nấm men, vi khuẩn gây thối rửa
H2O2 Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein
Hệ thống lactoperoxidase với
H2O2
Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa)
Lysozyme Vi khuẩn gram dương
Reuterin (3-OH-
propoonaldehyde)
Nấm mốc, nấm men
Diacetyl Vi khuẩn gram âm
Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau
1.2. Tổng quan về Probiotic
1.2.1. Lược sử nghiên cứu
Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà
vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người
bệnh và người khỏe mạnh. Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi
là probiotic.
Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe
tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có
nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ những vi sinh vật đã
được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người và động vật. [83]
Khái niệm này sau đó được làm rõ hơn bởi định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới
và Tổ chức Lương nông thế giới (WHO/FAO, 2001): “Probiotic là những vi sinh vật
còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của người sử
dụng.” [90]
32. Đồ án tốt nghiệp
20
Đây là những nhóm vi khuẩn (VK) sống trong đường tiêu hóa của người, chúng
tạo thành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của một số VSV gây bệnh, cung cấp
cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch. Con
người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc, sử dụng chúng
như một phương tiện để vận chuyển vi khuẩn probiotic vào trong cơ thể, từ đó giúp
phòng và chữa bệnh.
1.2.2. Các vi sinh vật probiotic thường gặp
Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn,
xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic
(LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành
phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB.
Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp:
Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen và Gorbach (1999), một
số loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó chủ
yếu là những loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus như L. acidophilus, L.
casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes,
Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,…
Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá
trình sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sung thêm trong chế phẩm
như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt là fructoligosaccharide, là một tá
dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chế phẩm propiotic.
Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (như L. acidophilus
hay L. sprorogenes,…) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L. acidophilus, L.
sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…). Sử dụng chế phẩm probiotic - lactic
là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu hóa, giúp duy trì hệ VSV có
33. Đồ án tốt nghiệp
21
lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ
những tác dụng trong cơ thể người. [71] [75]
Bacillus subtilis
B. subtilis là VK ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng được sử dụng qua
đường uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi dùng kháng
sinh. B. subtilis có tác dụng hồi phục hệ VSV tự nhiên trong đường tiêu hóa của người
sau khi dùng kháng sinh kéo dài. Các chế phẩm B. subtilis được bán ở hầu hết các nước
Châu Âu, mặc dù người ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử
của B. subtilis có thể vượt qua rào chắn đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm
trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis
đã được biết như làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [83].
Bacillus clausii
Thuộc giống Bacillus, GP+P, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi
trường dinh dưỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp VK tồn tại trong điều
kiện khắc nghiệt. Bào tử của B. clausii có thể qua dạ dày với tỉ lệ sống sót cao, có thể
sống được trong môi trường dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ. Chúng đề kháng rất tốt
với nhiều loại kháng sinh. Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian điều trị kháng
sinh.
Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trưởng và tiếp tục
sinh sôi nảy nở trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại được khoảng trống rối loạn hệ VK trong
đường ruột. Đồng thời sự sinh trưởng của B. claussi sẽ tái lập được điều kiện kỵ khí,
tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đường ruột (như
Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác
nhau.
B. clausii thường được dùng tạo chế phẩm probiotic cho người như chế phẩm
Enterogermina ở dạng lỏng. Bào tử được bào chế dưới dạng hỗn dịch không màu,
34. Đồ án tốt nghiệp
22
không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho
trẻ em.
Nấm men
Được sử dụng làm probiotic như Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii. Trong
các chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các vitamin nhóm B, hấp thu
độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic là cơ chất
cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản. Ngoài ra, chúng còn tiết enzyme tiêu hóa
như amylase, protease,…. [78]
S. boulardii: được dùng như probiotic từ năm 1950. Là thành phần chính của một
số chế phẩm probiotic như ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp). Tác động hiệu
quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu chảy do KS và trị liệu phối hợp
trong nhiễm trùng H. pylori. S. boulardii tác động thông qua cơ chế:
Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh
phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra.
Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và N-
aminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn
cần thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải.
Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào
T.
1.2.3. Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic
Vi sinh vật được sử dụng trong hầu hết các sản phẩm probiotic hiện nay chủ yếu
là LAB, do chúng mang những đặc điểm ưu việt vốn có thích hợp cho việc tạo chế
phẩm probiotic. Tuy nhiên, không phải bất kì LAB nào cũng được ứng dụng làm
probiotic. Những chủng LAB được chọn phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau:
Là VK hiện diện bình thường ở ruột của người, sinh trưởng và phát triển nhanh.
Là VK chịu được pH thấp nên có thể sống được khi qua dạ dày.
35. Đồ án tốt nghiệp
23
Lên men lactic làm giảm pH môi trường sống, ức chế sự phát triển của VSV
gây bệnh khác.
Có khả năng làm mất sự liên kết của các acid mật nên chịu acid mật tốt.
Đề kháng được kháng sinh.
Tạo enzyme lactase giúp đồng hóa được đường lactose trong sữa.
Làm tăng quá trình tiêu hoá thức ăn, tăng hấp thu chất dinh dưỡng.
Sản sinh một số chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh.
Điều hoà khả năng miễn dịch.
Làm giảm lượng cholestrol trong huyết thanh.
Hoạt tính chống đột biến và chống ung thư.
1.2.4. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic
Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác
động thông qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa
vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong
đường tiêu hóa. Điển hình là các điều kiện như pH thấp, acid mật, kháng sinh,…
Chịu pH thấp
Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu. Các nhà khoa học đã chứng
minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước
khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian
xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều kiện áp lực của dạ dày
với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được chọn lọc để sử dụng như trong chế
phẩm probiotic cần phải chịu được môi trường pH thấp ít nhất 90 phút. Sống sót ở pH
3.0 trong 2 giờ và nồng độ acid 1000 mg/l được xem như là khả năng chống đỡ đối với
acid tối ưu đối với các chủng probiotic [70].
36. Đồ án tốt nghiệp
24
Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzyme trong đường miệng như
lysozyme. Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để sàng lọc
khi muốn tuyển chọn các dòng probiotic [69].
Chịu acid mật
Acid mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi
sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm người), quá trình
tổng hợp acid mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol. Cơ thể tổng hợp khoảng
8mg cholesterol một ngày và dùng 4mg cholesterol để tổng hợp acid mật. Tổng cộng
có khoảng 20 – 30 g acid mật tiết vào ruột mỗi ngày [85].
Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột. Tại đây,
chúng chịu sự tác động của acid mật. Khi acid mật đi vào khu vực tá tràng thì số lượng
VSV sẽ giảm. Khả năng chịu đựng acid mật là một trong những đặc tính cần thiết của
VSV có hoạt tính probiotic [1].
Chịu kháng sinh
Kháng sinh được ứng dụng phổ biến trong điều trị một số bệnh cho người cũng
như vật nuôi. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phương
pháp trị liệu kháng sinh có một số hạn chế nhất định như là tác động loại bỏ không
phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ VSV có lợi trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị
liệu này đã dẫn đến thay đổi sự cân bằng hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng
xấu có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này.
Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được chỉ định uống trong thời gian
điều trị bệnh bằng kháng sinh, để phòng mất cân bằng hệ VSV trong đường ruột. Do
đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu đựng được kháng sinh
[77].
Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột
Các chủng VSV probiotic khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau lên đường
tiêu hóa. Chúng chỉ có thể tác động được khi chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt
37. Đồ án tốt nghiệp
25
trong đường tiêu hóa. Do vậy, bên cạnh khả năng sống sót thì chúng phải có khả năng
bám vào thành biểu mô ruột, nhờ đó chúng mới không bị rửa trôi ra ngoài cùng với
phân [67].
Sự kết bám với tế bào biểu mô ruột là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư
lâu dài của VK probiotic trong đường ruột, chống lại sự loại bỏ do nhu động ruột và tạo
được một ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột (Pedersen và Tannock 1989;
Freter 1992; Alander và cộng sự 1997) [66] [68].
Bên cạnh đó vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt
tính kháng khuẩn như các acid hữu cơ, ethanol, bacteriocin, H2O2,… Những chất này
được sản sinh cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng trong đường tiêu
hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ sinh thái
đường ruột.
Ngoài ra, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng
hóa cholesterol, lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng nhiều enzyme có lợi giúp cho
việc tiêu hóa thức ăn diễn ra dễ dàng. Bên cạnh đó, chúng còn giúp hấp thu các chất
dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư, các hợp chất độc hại, kích
thích điều hòa hệ miễn dịch cơ thể chủ, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,…
[71] [75].
1.2.5. Cơ chế tác động chung của probiotic
Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên
đường tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các VK
gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của
cơ thể vật chủ,…
Cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh
Hệ vi sinh vật ở đường tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác nhau,
một trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng kháng sinh dài ngày dẫn đến
38. Đồ án tốt nghiệp
26
việc tiêu diệt các VSV có lợi trong ruột. Để khắc phục điều này, người ta thường bổ
sung các VSV có lợi thông qua sử dụng probiotic. Các VSV probiotic sẽ phát triển,
chiếm ưu thế trong đường ruột bằng cách cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất
dinh dưỡng và khối lượng các chất được sản sinh. Từ đó, ức chế và tiêu diệt được VSV
gây hại, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột.
Trong một nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp thường xuyên các VSV có lợi dưới
dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật nuôi với liều lượng thích
hợp (1,2 tỷ CFU/ kg thức ăn/ ngày), sự cân bằng của hệ VSV đường ruột được duy trì
[57] [64] [74] [76] .
Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn
Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lượng cạnh
tranh vị trí bám với VK gây bệnh, chúng còn tác động nhờ vào khả năng sản sinh các
chất có hoạt tính kháng khuẩn như kháng sinh, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid
acetic, acid formic, acid béo, …), diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol,… Đặc biệt,
nhiều chủng VSV còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn
[58]. Những chất này có tác dụng ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh ở đường ruột.
Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột.
Một số chủng VSV probiotic khi được bổ sung vào đường tiêu hóa có vai trò
tăng cường hoạt động chuyển hóa của một số chủng VK đường ruột khác. Chẳng hạn
như khi sử dụng L. rhamnosus dưới dạng sữa lên men, chúng kích thích hoạt động
enzyme và khả năng biến dưỡng của VK đường ruột [57].
Điều hòa phản ứng miễn dịch
Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng điều hòa phản ứng miễn dịch thông qua
ảnh hưởng lên lympho bào B. Như khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917
và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hóa P3PH - thymidine trong tế
bào lách ở chuột. Ngoài ra, L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159 cũng
39. Đồ án tốt nghiệp
27
có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích
thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [57].
Ngoài ra, VSV probiotic còn tác động lên hệ tiêu hóa của người cũng như vật
nuôi bằng những cơ chế khác, như đồng hóa lactose trong sữa,... Sự không dung hòa
lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người thiếu khả năng sản xuất enzyme
lactase hay β-galactosidase. Lactase cần thiết để đồng hóa lactose trong sữa, phân giải
chúng thành các phân tử đường glucose và galactose đơn giản. Các cá thể thiếu lactase
sẽ không tiêu hóa được sữa và thường gây ra những khó khăn trong quá trình tiêu hóa,
đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Triệu chứng thường thấy là khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp
bẻ, đầy hơi, nôn và buồn nôn,… khi dùng sữa. Một vấn đề khác có liên quan đến việc
không dung hòa lactose là tình trạng thiếu canxi do không dùng sữa. Ngoài ra, VK khu
trú trong ruột kết không lên men tiêu hóa được lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây ra
các triệu chứng như đau bụng, sưng phù và tiêu chảy.
Các dòng probiotic đã được chứng minh là có thể giải quyết vấn đề không dung
hòa được lactose nhờ khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ β-galactosidase ở ruột
non. Do vậy, người ta cho các bệnh nhân không dung hòa được lactose sử dụng
probiotic. Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ được
đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [58].
Cơ chế bảo vệ răng miệng của vi khuẩn Probiotic nói chung và
Lactobacillus spp. nói riêng
Vi khuẩn probiotic có tác động trực tiếp lên các tế bào khác và môi trường xung
quanh chúng. Các cơ chế kháng này được chia như sau:
Tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn khác
Tăng khả năng miễn dịch của vật chủ
Ức chế vi khuẩn khác thông qua khả năng sinh hydrogen peroxide,
bacteriocins, và một số acid hữu cơ.
40. Đồ án tốt nghiệp
28
Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang
miệng [44].
41. Đồ án tốt nghiệp
29
1.2.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc probiotic
Các sản phẩm thực phẩm chứa probiotic từ sữa
Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic [91]
Ở Việt Nam hiện nay, các sản phẩm thực phẩm có chứa probiotic thường được
sản xuất ở dạng sữa chua (Vinamilk, Dutch Lady…) hoặc sữa chua uống (Yakult,
Probi). Ngoài ra, gần đây còn có các sản phẩm sữa bột cho trẻ nhỏ (Nestle Nan 1, 2)
hoặc sản phẩm kẹo có chứa vi khuẩn probiotic (Kẹo Huro).
42. Đồ án tốt nghiệp
30
Chế phẩm probiotic
Theo tổ chức lương thực và thực phẩm Quốc Tế (FAO) [82]. Một chủng VSV
được sử dụng tạo chế phẩm probiotic cần phải đảm bảo tiêu chuẩn sau đây:
Giống dùng cho probiotic phải mang tính đại diện và được công nhận
chung về tính an toàn cho người và vật nuôi (GRAS microorganism) [65] [72].
Có nguồn gốc từ người được chứng minh an toàn cho người.
Có khả năng sống sót trong điều kiện acid ở dạ dày, nồng độ acid mật và
kháng sinh trong ruột.
Có khả năng kết bám vào biểu mô ruột, định cư và tăng trưởng nhanh về
số lượng trong ruột người.
Góp phần điều chỉnh tích cực chức năng của ruột.
Khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol
và lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu
hóa thức ăn được diễn ra dễ dàng, hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết và khử
các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại [73] [75].
Tạo ra chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng mầm bệnh ở người như sản
sinh acid L - lactic và những chất ức chế VK gây hại.
Có khả năng tiết ra các chất có hoạt tính sinh học có thể kích thích đáp
ứng miễn dịch, làm gia tăng chức năng phòng thủ của mạng lưới tế bào chủ.
Có khả năng tồn tại trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản bằng đông
khô.
Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau. Một
trong những chế phẩm probiotic được biết đến phổ biến với tên thường gọi là “men vi
sinh”. Chúng tồn tại ở các dạng như cốm, bột, lỏng, viên nén,… chứa VSV có thể ở
dạng sống, chết đông khô, xác VK. Các sản phẩm probiotic có thể phối hợp nhiều
chủng VK (như L. acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…)
hoặc chỉ sử dụng một chủng VK ( như L. acidophilus hay L. sprorogenes,…). [71] [75]
43. Đồ án tốt nghiệp
31
Một số chế phẩm thông dụng ở dạng men tiêu hóa trên thị trường hiện nay như
Antibio (Hàn Quốc), Probio (Việt Nam), Acidophilus (Mỹ), Biolactyl (Việt Nam),
Lactéol (Pháp), Bio - acimin (Việt Nam), Biolactyl (liên doanh Pháp), L – bio - 3D
(Việt Nam), Bioflora (Pháp),… Các chế phẩm này được sử dụng nhằm khắc phục: các
chứng bệnh về đường tiêu hóa, một số hạn chế do điều trị bằng KS dài ngày mang lại,
điều trị tiêu chảy cấp, tăng cường khả năng miễn dịch,…
1.3. Màng sinh học
1.3.1. Sự hình thành
Các tế bào vi khuẩn sinh sống trôi nổi trong môi trường lỏng (dạng phù du) vô
tình bám vào một bề mặt nào đó, và nếu sau một thời gian chúng không chịu tác động
di chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu
khuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học. Kế
đến vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi
hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance
(EPS). Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng
các tế bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiên mao sẽ tăng thêm độ vững chắc
của màng sinh học. Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một
lần nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định
cư khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán [11].
44. Đồ án tốt nghiệp
32
Hình 0.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học
Hình 0.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới
đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử [12].
45. Đồ án tốt nghiệp
33
1.3.2. Mạng lưới polymer ngoại bào (EPS)
EPS là các polymer sinh học cao phân tử được vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường
sống xung quanh chúng. EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hóa lý của
màng sinh học [13]. EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của một màng
sinh học [14].
EPS chủ yếu là polysaccharide và một số protein. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ
các thành phần khác như: DNA, lipid, mùn đất. EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi
khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác.
Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia
thành hai dạng. Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ
yếu là dextran, glucan và levan. Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp
từ nucleotide. Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ loài lên men dị hình
như L. pontis, L. frumenti, L. sanfranciscensis, và L. reuteri. Heteropolysaccharides
được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình
như L. kefiranofaciens, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. paracasei, L. rhamnosus,
L. helveticus, và L. sakei [47].
1.3.3. Tính chất
Màng sinh học có thể là cả một quần thể vi khuẩn cùng nhau sinh trưởng và phát
triển, quan hệ hợp tác hay cạnh tranh đều có thể diễn ra trong màng, phụ thuộc vào
những loài có mặt trong đó [15].
Tính kỵ nước có một phần ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học của vi
khuẩn. Vì nếu tế bào có tính kỵ nước thì lực tác động của các phân tử ngoại bào hoặc
các tế bào khác lên chúng sẽ giảm đáng kể [16]. Một số vi khuẩn không có khả năng
bám trực tiếp lên một bề mặt nào đó, nhưng lại có khả năng liên kết với mạng lưới cơ
chất ngoại bào hoặc với tế bào vi khuẩn khác. Những vi khuẩn không có khả năng di
động sẽ kéo theo hạn chế về khả năng bám dính [16].
46. Đồ án tốt nghiệp
34
Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự
tổng hợp nên EPS. EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà
còn các thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu,
fibrin, protein và các acid nucleic [16]. Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh
nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào [17].
EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi
tín hiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khóa quan trọng
cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS còn có chức năng giữ cho
các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn
định hơn [18].
Dù cùng loài nhưng nếu sinh trưởng trong màng sinh học thì vi khuẩn sẽ có một
số đặc tính khác biệt rõ ràng hơn so với dạng phù du. Một nghiên cứu đã cho thấy
trong một số trường hợp khả năng kháng các chất diệt khuẩn, chất kháng sinh của vi
khuẩn trong màng sinh học cao hơn gấp 1000 lần so với dạng phù du [19].
Mức độ hình thành màng sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: mật độ vi
khuẩn, hàm lượng chất dinh dưỡng, độ bão hòa, pH, thành phần dinh dưỡng trong môi
trường, độ tĩnh và hệ gen của vi khuẩn [22].
1.3.4. Phân bố
1.3.4.1. Trong tự nhiên
Màng sinh học có ở khắp nơi trong mọi cơ thể sống. Ngoài ra màng sinh học còn
có thể hình thành trong cả những môi trường cực kỳ khắc nghiệt: dưới dòng chảy
mạnh, nhiệt độ cao trong suối nước nóng, môi trường độ kiềm/acid cao, các hồ đông
lạnh.
Ta có thể dễ dàng tìm thấy màng sinh học có thể trên các tảng đá, sỏi ở những con
sông. Màng sinh học cũng nằm trong chuỗi thức ăn của động vật dưới nước. Màng sinh
học hình thành trên hoặc trong thân cây thì lại góp phần gây bệnh cho cây, ngoại trừ
47. Đồ án tốt nghiệp
35
trường hợp màng sinh học của vi khuẩn Rhizobium (vi khuẩn nốt sần) ở rễ cây họ đậu.
Một số bệnh ở cây trồng do sự hình thành màng sinh học: Citrus Canker (bệnh thối quả
ở chi cam chanh); Pierce (nho héo lá); bệnh đốm trắng cà chua, ớt [20].
Màng sinh học còn được tìm thấy bên trong các đường ống nước, đặc biệt là ống
nước thải, gây tắc nghẽn và ăn mòn. Trường hợp xuất hiện trong đường ống dẫn nước
lạnh/nóng thì sẽ giảm khả năng truyền nhiệt đáng kể [21].
Màng sinh học xuất hiện trên vỏ của các con tàu sẽ hỗ trợ cho sự neo bám của các
sinh vật khác và bùn đất. Điều này kiến cho vận tốc di chuyển của tàu giảm đi một
phần đáng kể, bên cạnh đó còn phát sinh khoảng chi phí vệ sinh đáy tàu (cạo bỏ sinh
vật biển).
Hình 0.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng
sinh học
48. Đồ án tốt nghiệp
36
Hình 0.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ
nước nóng Mickey, Oregon [47].
1.3.4.2. Trong cơ thể sống
a) Đường ruột
Trong cơ thể người, màng sinh học được tìm thấy nhiều nhất trong đường ruột,
một trong những môi trường ẩm ướt nhưng ấm áp, cực kỳ thuận lợi cho sự phát triển
của vi khuẩn. Một nghiên cứu gần đây đã cho rằng hệ miễn dịch trong cơ thể chúng ta
đang hỗ trợ cho vi khuẩn trong ruột già tạo mảng bám. Từ phát hiện này người ta đã
đưa ra một số giả thuyết về chức năng của ruột thừa. Trong ruột thừa chứa một lượng
lớn mảng bám vi khuẩn, vì thế khi ruột già bị tổn thương, hệ vi sinh vật trong ruột đang
mất cân bằng thì vi khuẩn trong ruột thừa có thể giúp hồi phục lại hệ vi khuẩn trong
đường ruột [23].
b) Khoang miệng
Khi xuất hiện trong khoang miệng, màng sinh học được gọi là mảng bám răng.
Chúng hình thành ở mọi nơi trong khoang miệng kể cả trên răng giả. Phần nước chiếm
49. Đồ án tốt nghiệp
37
khoảng 80 – 90% trong mảng bám, trong khi 70% phần khô là vi khuẩn, còn lại là các
hợp chất polysaccharides và glycoproteins [24].
Các yếu tố sinh thái trong khoang miệng góp phần thúc đẩy sự hình thành của
mảng bám răng. Phổ pH bình thường trong miệng là 6 – 7, trong khi màng sinh học
được hình thành trong phổ pH 6.7 – 8.3 [25]. Và ngoài vai trò như là một chất đệm,
nước bọt còn chứa một số yếu tố dinh dưỡng như acid amin, protein và glycoprotein.
Chế độ ăn uống chỉ đóng một vai trò nhỏ trong việc cung cấp nơi cư trú cho vi khuẩn
[31]. Sự oxy hóa-khử của vi khuẩn hiếu khí đã góp phần cho lượng oxy trong khoang
miệng ở trạng thái bán ổn định, tạo điều kiện cho toàn quần thể vi khuẩn tồn tại.
1.4. Sâu răng
1.4.1. Bệnh học
1.4.1.1. Định nghĩa
Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn thương,
đặc trưng bởi sự khử khoáng ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và không hoàn
nguyên được. Có nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những nghiên cứu và
nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu răng có thể được
định nghĩa như sau:
- Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên
mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mô răng với chất dịch xung quanh và theo
thời gian, hậu quả là sự mất khoáng của mô răng [27].
- Là bệnh nhiễm trùng của mô răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái
khoáng xen kẽ nhau [28].
1.4.1.2. Lịch sử
Sâu răng là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính,
dân tộc. Bệnh đã có từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở
50. Đồ án tốt nghiệp
38
thành thứ không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường
gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [29]. Suốt một thể kỷ qua
người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật có trong miệng đều có thể gây sâu răng và
việc chữa trị duy nhất đó là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn.
Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ
quân sự nhiều nhất đó là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đoán: nếu một người sống đủ
lâu thì sau này chắc chắn sẽ không còn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt
trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đô la (năm 1990). Tới
những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng có thể kiểm soát và phòng ngừa. Gần 50%
trẻ nhỏ không bị sâu răng và tỷ lệ sún răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống còn
20% [30].
Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí
cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư).
1.4.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng
Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng,
đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [31]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn ra thì
lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu. Ở giai
đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+
có trong nước
bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng tái
khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [32].
51. Đồ án tốt nghiệp
39
Hình 0.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng.
Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy
bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu có thể
bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhói khi
nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt.
Hình 0.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng.
Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng. Trường hợp xấu
hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu). Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn
mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, … đe dọa đến tính mạng của người bệnh.
52. Đồ án tốt nghiệp
40
1.4.1.4. Nguyên nhân
Cần có bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng:
men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là
sucrose) và thời gian [33]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng,
thói quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, … Sự sâu răng có thể xảy ra ở bất
kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng
sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi có sự hiện diện của các
nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose.
Hình 0.11. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng.
a) Vi khuẩn
Khoang miệng của người chứa vô số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đó có
khả năng gây sâu răng, đáng nói đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus và một số loài trong chi Lactobacillus.
Đặc tính để quyết định vi khuẩn có khả năng gây sâu răng hay không bao gồm:
khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi
lên men đường, khả năng sinh trưởng trong môi trường pH thấp [34].
53. Đồ án tốt nghiệp
41
Những vi khuẩn này đa số đều có mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ với
mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khoáng men răng. Nhưng nếu không trực
tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao, thì sẽ
diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám. Lúc này mật độ của những
vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang miệng và
gây sâu răng. Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động của quá trình
nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng.
Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thông qua
việc bú sữa mẹ, hành động mớm ăn và hôn của người chăm sóc trẻ [35].
b) Nguồn carbohydrates
Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose (đường
ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra quá trình
khử khoáng, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men đường của
vi khuẩn có thể bị trung hòa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng.
Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu
răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose là
đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì vi
khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và
fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide
bởi enzyme dextransucranase.
n sucrose (glucose)n + n fructose
c) Thời gian
Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng.
Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH.
Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang
54. Đồ án tốt nghiệp
42
miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa. Vì thế sự khử khoáng gây
sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp.
d) Răng
Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khoáng bắt đầu xảy
ra khi pH môi trường đạt 5.5 [36]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì
chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [37].
Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng của
cá thể. Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [38]. Nguyên nhân có thể là do yếu
tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ
dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy
trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị,
bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng,… cũng ảnh hưởng đáng kể đến
mật độ khoáng của răng [39] [40]. Nhưng dù sao rối loạn do bệnh tật cũng không phải
là nguyên chính gây sâu răng.
Trường hợp thức ăn bị mắc lại trong các lỗ sâu, chân răng, kẽ răng cũng là
nguyên nhân dẫn đến gây sâu răng.
e) Yếu tố khác
Khả năng tiết nước bọt thấp sẽ tăng mức độ sâu răng, do tốc độ trung hòa pH
trong môi trường khoang miệng diễn ra chậm.
Một số hiệu thuốc lá không khói chứa hàm lượng đường cao, làm tăng khả năng
gây sâu răng [41]. Việc hút thuốc có thể dẫn đến bệnh nha chu, khiến nướu co lại, để
hở chân răng và tạo khoảng trống thuận lợi cho sự hình thành mảng bám.
55. Đồ án tốt nghiệp
43
1.4.2. Điều trị
Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt
để mảng bám vi khuẩn. Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đoán trạng thái của
răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khó nhận thấy. Hơn nữa chỉ có nha
sĩ mới có đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên môn để chẩn đoán, điều trị và đưa ra
những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn. Nếu đợi đến khi răng đau rồi mới đi
gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, có khi phải chữa tủy răng, mổ nướu
răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn.
Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến. Phương pháp này thường
dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề mặt nhai của
răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khoáng.
Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngoài việc Florua đóng vai trò ức chế sự
khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả
năng diệt khuẩn [42]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí vô
cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng.
Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn carbohydrates
có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những thực phẩm
được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngoài ra trái cây, rau quả còn
có nhiều chất xơ (fiber) tác động làm sạch răng. Bên cạnh đó có thể dùng đường xylitol
thay thế các loại đường ăn thông thường để tăng khẩu vị trong thực phẩm, vì vi khuẩn
không thể lên men được xylitol. Tránh những thức ăn dẻo, loại thức ăn này rất dễ bám
quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi khuẩn phát triển.
Từ bỏ thói quen ăn ngọt giữa các bữa ăn. Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời gian
men răng phơi nhiễm trong môi trường có pH thấp.
Nếu phải uống soda, cam, chanh thì nên dùng ống hút, tránh để chúng tiếp xúc
với răng (cam chanh có tính acid sẽ khử khoáng men răng). Nên súc miệng ngay sau
khi ăn ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống có tính acid.
56. Đồ án tốt nghiệp
44
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường
Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện trong 15 tuần, từ ngày 03/04/2017 đến ngày 16/07/2017.
2.3. Vật liệu và thiết bị
2.3.1. Thiết bị - Dụng cụ
- Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)
- Máy đo pH Horiba (Nhật Bản)
- Autoclave (Memmmert – Đức)
- Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản
- Cân phân tích, cân kỹ thuật
- Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức)
- Lò vi sóng (Microwave)
- Pipetteman 100 – 1000 µl
- Bếp điện
- Bông thấm nước, bông không thấm nước
- Giấy lọc, lame, lamell
- Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đèn cồn, bình định mức, ống
đong, pipette, …..
2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm, thuốc thử, chất chỉ thị màu:
57. Đồ án tốt nghiệp
45
_ Safranine
_ Ethanol 95%
_ Chất chỉ thị màu Bromoresol green, Bromocresol purple
_ Chất chỉ thị màu Methyl red, Phenol red
_ Malachite green
_ Phenolphthalein
_ NaOH, KOH
_ NaCl
_ H2O2
2.3.3. Giống vi khuẩn lactic
Sử dụng giống đã phân lập được từ đồ án “Phân lập vi khuẩn Lactic trong
khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus
spp.” của bạn Nguyễn Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02.
Năm chủng vi khuẩn gây bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium do bạn Nguyễn
Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02 cung cấp.
2.4. Phương pháp luận
Mục tiêu: Khảo sát các vi khuẩn lactic phân lập từ khoang miệng có khả năng
ức chế sự tạo thành màng sinh học Lactobacillus fermentum hay không.
Nội dung:
_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa.
_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn.
_ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh.
_ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum.
58. Đồ án tốt nghiệp
46
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
LAB có khả năng ức chế sự tạo màng
sinh học của L. fermentum
Lactobacillus spp.
Thử nghiệm
sinh lý
Sinh dưỡng
kị khí
Chịu mặn
3.5 - 6.5% NaCl
Sinh dưỡng
10o
C, 45o
C, 60o
C
Thử nghiệm
sinh hóa
VP - MR
Sinh H2S
Vòng indole
Citrate
Khả năng lên men
carbohydrates
Hệ enzyme
Thủy phân
hồng cầu
Gelatinase
Caseinase
β-galactosidase
Khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis
E.coli
Salmonella typhimurium Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Khả năng kháng kháng sinh
Streptomycin
Ampicilli
n
Penicillin
Chloramphenicol
0o
C
100o
C
80o
C
Khảo sát
Khả năng ức chế sự tạo màng
sinh học của L. fermentum sau
khi bị xử lý nhiệt
59. Đồ án tốt nghiệp
47
2.5. Phương pháp thí nghiệm
2.5.1. Thử nghiệm sinh lý
2.5.1.1. Khả năng sinh dưỡng ở 10o
C, 45o
C, 60o
C trong 48 giờ
_ Bước 1: Chuẩn bị 200ml môi trường MRS broth, phối môi trường vào các ống
nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng.
_ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt
trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ 10o
C, 45o
C, 60o
C trong 24 giờ và 48 giờ
_ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận
2.5.1.2. Khả năng chịu mặn: NaCl 3,5% và 6,5% trong 48 giờ
_ Bước 1: Chuẩn bị 100ml môi trường MRS broth, NaCl 3,5% và 100ml môi
trường MRS broth, NaCl 6,5%, phối môi trường vào các ống nghiệm mỗi ống
10ml, hấp tiệt trùng.
_ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt
trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ 37o
C trong 48 giờ.
_ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận.
60. Đồ án tốt nghiệp
48
2.5.1.3. Khả năng sinh bào tử
Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều
lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu
cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế
bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất
của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh
và tế bào có màu hồng.
Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già (khoảng 7 ngày) để nhuộm bào tử. Từ kết
quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không
sinh bào tử.
Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton
- Nuôi cấy vi khuẩn ở 37o
C, 5 – 7 ngày.
- Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram.
- Nhuộm bằng dung dịch Malachite green trong 10 phút, đặt trên 1 cốc nước đun
sôi, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 – 90 giây, rửa nước, thấm khô.
- Soi kính: dùng vật kính dầu 100x
Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào sinh dưỡng có màu đỏ.
2.5.1.4. Khả năng sinh dưỡng kỵ khí
_ Bước 1: Chuẩn bị 100ml môi trường MRS broth, phối môi trường vào các ống
nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng.
_ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt
trùng, bơm 1 lớp parafin có độ dày 1cm, sau đó ủ ở nhiệt độ 37o
C trong 24 giờ.
_ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận.