Download luận văn thạc sĩ ngành dược học với đề tài: Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ LIÊN
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN
TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ
SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI 2018

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ LIÊN
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN
TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ
SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Nguyên Hà
PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo
HÀ NỘI 2018

3. LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận được sự
giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu viên, các anh chị
kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và bạn bè đã dành cho tôi.
Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần
Nguyên Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã giao đề tài, luôn tâm huyết và tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Trần Cao Sơn đã
cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều kiện tối đa giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Cao Công Khánh cùng các anh chị, các
bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm, khoa Độc học & dị nguyên, khoa Chất lượng, phụ
gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện
luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ
môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy
và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng
hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tôi
những ngày qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2018
Học viên
Lê Thị Liên

4. MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
PHẦN 1. TỔNG QUAN............................................................................................3
1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung.........................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật.........................................................................................3
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng .....................................................4
1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.......................................4
1.1.4. Tác dụng sinh học.........................................................................................5
1.2. Tổng quan về crinamidin................................................................................5
1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin........................................................7
PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................15
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................................15
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ................................................................................15
2.2.1. Chất chuẩn..................................................................................................15
2.2.2. Hóa chất, dung môi.....................................................................................16
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .........................................................................................16
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..............................................................................17
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc và TPBVSK..17
2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng crinamidin bằng kỹ thuật GC-MS/MS....19
2.4. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trong thuốc
và TPBVSK ...........................................................................................................21
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu.............................................................................21
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.....................................................................22
3.1. Xây dựng phƣơng pháp phân tích ...............................................................22
3.1.1. Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho phương pháp định lượng
crinamidin bằng GC-MS/MS ................................................................................22

5. 3.1.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý mẫu cho phương pháp định lượng
crinamidin bằng GC-MS/MS ................................................................................29
3.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích.............................................................39
3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống .......................................................................39
3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc...............................................................................40
3.2.3. Khoảng tuyến tính.......................................................................................44
3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ....................................................45
3.2.5. Độ lặp lại ....................................................................................................46
3.2.6. Độ thu hồi ...................................................................................................48
3.3. So sánh phƣơng pháp xây dựng với phƣơng pháp tiêu chuẩn Dƣợc điển
Việt Nam IV ..........................................................................................................52
3.3.2. So sánh về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của hai
phương pháp .........................................................................................................54
3.3.3. So sánh về hiệu suất của quy trình chiết trên nền mẫu lá TNHC của hai
phương pháp .........................................................................................................55
3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng crinamidin trên một số mẫu thuốc và TPBVSK..57
PHẦN 4. BÀN LUẬN..............................................................................................61
4.1. Về phƣơng pháp chiết xuất crinamidin từ các chế phẩm chứa TNHC....61
4.2. Về xác định hàm lƣợng crinamidin bằng GC-MS/MS ..............................61
4.3. Ứng dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng crinamidin trên mẫu thực ...62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................64
Kết luận .................................................................................................................64
Kiến nghị ...............................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO

6. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh)
ACN Acetonitril
AOAC Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức
(Association of Official Analytical Communities)
CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis)
CHCl3 Cloroform
DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV
EI Bắn phá electron (Electron ionization)
GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)
HCl Acid hydrocloric
H3PO4 Acid phosphoric
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)
LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)
LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantification)
MEKC Sắc ký điện động micell (Micellar electrokinetic chromatography)
MeOH Methanol
m/z Tỷ số khối lượng và điện tích của ion (Mass-to-charge ratio)
MRM Giám sát đa phản ứng (Multiple reaction monitoring)
MS Khối phổ (Mass Spectrometry)
NH3 Amoniac
NXB Nhà xuất bản
PDA Dãy diod quang (Photodiode array)
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)
SFE Chiết lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction)
tR Thời gian lưu
TNHC Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe
UV-VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visible)

7. DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin ..............................6
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét .................................7
Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của crinamidin sau khi bắn phá ................23
Bảng 3.2: Các mảnh ion mẹ và ion con của cafein sau khi bắn phá........................23
Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS .............................................................28
Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu ...................................................................29
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu.......................................................30
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu............................................................33
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu.......................................................35
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết ......................................................37
Bảng 3.9: Thời gian lưu và diện tích pic qua 6 lần tiêm mẫu ..................................40
Bảng 3.10: Tỷ lệ các ion crinamidin của dung dịch thêm chuẩn crinamidin...........43
Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn crinamidin và hệ số tương quan tuyến tính ......44
Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin.....................................................45
Bảng 3.13: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền viên nang cứng......46
Bảng 3.14: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền trà túi lọc........47
Bảng 3.15: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên nền cao lỏng..........47
Bảng 3.16: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền viên nang cứng.................49
Bảng 3.17: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền trà túi lọc..........................50
Bảng 3.18: Kết quả độ thu hồi của crinamidin trên nền cao lỏng............................51
Bảng 3.19: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký của phương pháp tiêu chuẩn và
phương pháp xây dựng..............................................................................................52
Bảng 3.20: Giá trị LOD và LOQ của crinamidin.....................................................54
Bảng 3.21: Kết quả phân tích hàm lượng crinamidin trong mẫu chuẩn và thử bằng
phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng.................................................56
Bảng 3.22: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu thuốc và TPBVSK......58
Bảng 3.23: Kết quả xác định hàm lượng crinamidin từ các mẫu cao và trà túi lọc.59

8. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) .......................................3
Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin ....................................................................6
Hình 2.1: Hệ thống sắc ký khí khổi phổ 2 lần (GC-MS/MS) ....................................18
Hình 3.1: Phổ khối của crinamidin sau khi bắn phá ion..........................................23
Hình 3.2: Phổ khối của cafein sau khi bắn phá ion..................................................23
Hình 3.3: Sắc ký đồ tổng (TIC) của crinamidin và chuẩn nội cafein .......................24
Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi MeOH.....25
Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi ACN..25
Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn crinamidin 20 µg/mL chế độ tiêm không chia dòng......26
Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chương trình nhiệt độ (*).27
Hình 3.8: Sắc đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL trong dung môi CHCl3,
chế độ tiêm chia dòng 10 : 1, chương trình nhiệt độ (**) ........................................27
Hình 3.9: Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu trên ba nền mẫu ...............31
Hình 3.10: Sơ đồ quy trình chiết xuất crinamidin từ chế phẩm TNHC ....................32
Hình 3.11: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và số lần chiết mẫu ...........34
Hình 3.12: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và thời gian chiết mẫu.......36
Hình 3.13: Biểu đồ tương quan hàm lượng crinamidin và tỷ lệ dung môi chiết ......38
Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu......................................................................39
Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl3 .....................................................................41
Hình 3.16: Sắc ký đồ placebo viên nang thêm chuẩn nội cafein ..............................41
Hình 3.17: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn crinamidin 20 µg/mL, chuẩn nội cafein......42
Hình 3.18: Sắc ký đồ của dung dịch thêm chuẩn crinamidin ...................................42
Hình 3.19: Sắc ký đồ tỷ lệ ion của crinamidin và cafein của dung dịch chuẩn 20 µg/mL .43
Hình 3.20: Đồ thị đường chuẩn crinamidin, chuẩn nội cafein.................................44
Hình 3.21: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL..........................................45
Hình 3.22: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền viên nang cứng.........................................48
Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền trà túi lọc..................................................48
Hình 3.24: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền cao lỏng....................................................48
Hình 3.25: Sắc ký đồ mẫu thực viên nang cứng .......................................................49

9. Hình 3.26: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 160 µg chuẩn crinamidin.............49
Hình 3.27: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 200 µg chuẩn crinamidin.............50
Hình 3.28: Sắc ký đồ mẫu viên nang cứng thêm 240 µg chuẩn crinamidin.............50
Hình 3.29: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 2 µg/mL (HPLC)...............................55
Hình 3.30: Sắc ký đồ của crinamidin ở LOD 0,3 µg/mL (GC-MS/MS)....................55
Hình 3.31: Đường chuẩn crinamidin từ 10 đến 100 µg/mL (HPLC) .......................57
Hình 3.32: Đường chuẩn crinamidin từ 5 đến 50 µg/mL, chuẩn nội cafein (GC-MS/MS) ..57

10. 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ngày càng trở nên phức
tạp. Bệnh tật không chỉ làm rút ngắn tuổi thọ mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến chất
lượng cuộc sống con người. Khoa học và y – dược học ngày nay đã có những bước
tiến vượt bậc và đạt được nhiều thành tựu to lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị
bệnh. Sự phát triển này đã góp phần phong phú hóa số lượng và đa dạng hóa chủng
loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) trên thị trường, trong đó thuốc
và sản phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày càng tỏ ra ưu thế và chiếm được niềm tin
của người sử dụng vì sự an toàn của các hợp chất thiên nhiên.
Tại Việt Nam, với mục tiêu bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân
dân, nhiều chính sách, chiến lược quốc gia trong lĩnh vực y – dược học được đưa ra,
trong đó bảo tồn và phát triển ngành dược liệu Việt Nam là một định hướng quan
trọng trong thời gian tới [6], [15]. Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), họ
Thủy tiên (Amaryllidaceae) là loại dược liệu quý được biết đến với tác dụng hỗ trợ
điều trị u xơ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tiền liệt [10]. Lá trinh
nữ hoàng cung (TNHC) chứa nhiều thành phần, trong đó đáng quan tâm nhất là
nhóm alkaloid vì có tác dụng sinh học, điển hình như crinamidin, ambellin,
lycorin,...Sự hiện diện của TNHC được biểu thị qua hoạt chất đặc trưng điển hình,
đồng thời là hoạt chất chính trong cây cho tác dụng sinh học là crinamidin. Chế
phẩm chứa TNHC được bán tại các nhà thuốc, quầy thuốc, cửa hàng đông y, thậm
chí cửa hàng tạp hóa và các kênh bán hàng online. Mỗi chế phẩm lại có một công
thức bào chế khác nhau, từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, hệ quả là hàm
lượng crinamidin trong từng chế phẩm cũng không như nhau. Trong khi tiêu chuẩn
cho các chế phẩm này chưa được hoàn thiện, nhà sản xuất đã lợi dụng kẽ hở để trục
lợi, sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu không rõ nguồn gốc đưa vào sản xuất, sử
dụng các nguyên liệu khác thay thế mà không có tác dụng sinh học theo công bố
trên nhãn. Đây cũng chính là mấu chốt của vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả
hiện đang là chủ đề mang tính thời sự, nhận được nhiều sự quan tâm của báo chí và
dư luận thời gian qua. Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng chế phẩm chứa TNHC
là vô cùng quan trọng và cấp thiết.

11. 2
Hiện nay, Dược điển Việt Nam IV bản bổ sung năm 2015 quy định hàm
lượng crinamidin (C17H19NO5) trong nguyên liệu lá TNHC không thấp hơn 0,08%
tính theo khối lượng khô kiệt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
[3], mà chưa đưa ra quy định đối với các chế phẩm chứa thành phần TNHC. Để xác
định chất lượng sản phẩm TNHC, hàm lượng crinamidin là đại lượng quy chiếu
được lựa chọn. Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-
MS/MS) là phương pháp ưu việt, có khả năng xác định các hợp chất hữu cơ trong
hỗn hợp với độ phân giải cao, chọn lọc và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp
HPLC. GC-MS/MS là phương pháp rất thích hợp cho việc định lượng hoạt chất
trong các chế phẩm thuốc và TPBVSK với nền mẫu phức tạp đồng thời hàm lượng
crinamidin giảm nhiều lần so với hàm lượng trong nguyên liệu lá TNHC.
Để góp phần kiểm soát chất lượng của các chế phẩm trên thị trường, đảm bảo
quyền lợi của người sử dụng và sự chặt chẽ trong quản lý, chúng tôi thực hiện đề tài
nghiên cứu: “Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ
sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ”, với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc
và TPBVSK bằng sắc ký khí khối phổ.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin trong
thuốc và TPBVSK.

12. 3
Phần 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC), còn gọi là hoàng cung trinh nữ, tây nam
văn châu lan, thập bát học sĩ (Trung Quốc), tỏi Thái Lan, tỏi lơi lá rộng, có tên khoa
học là Crinum latifolium L., thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) [7], [10].
TNHC là một loại cây cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 –
15cm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài 10 – 15cm, có nhiều lá mỏng kéo
dài từ 80 – 100cm, rộng 3 – 8cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song, mặt
trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có
màu đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm 6 – 18 hoa, trên một cán hoa dài 30 – 60cm.
Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể
tách ra trồng riêng dễ dàng [10], [14], [39].
Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

13. 4
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng
TNHC là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và
phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới. Cây TNHC
hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia,
Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc
hoang ven suối trong rừng một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa-Vũng Tàu, tự
mọc và được trồng chủ yếu ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số tỉnh phía Nam,
sau được trồng ở các tỉnh phía Bắc [7], [18].
TNHC được xếp vào nhóm Thanh nhiệt giải độc [5]. Bộ phận sử dụng là lá
(Folium Crinii latifolii) dùng tươi hay phơi hoặc thái nhỏ sao vàng dùng dần. [10],
[13], [18].
1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần
hóa học của cây Crinum latifolium L. như sau:
+ Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambellin, 11-O-Acetyl-1,2-β-
epoxyambellin, Ambelin, Crinafolidin, Crinafolin, (-) 2-Epilycorin, 2-
Epipancrassidin, 1,2-β-epoxyambellin, Hippadin (Pratorin, Alkalois N3), Latindin,
Latisodin, Latisolin (Latisodin-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorin, (-) Lycorin-1-
0-β-glucosid, Pratorimin, Pratorinin, Pratosin, Pseudolycorin-1-0-β-D-glucosid [27].
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayn, (-) Acetyllycorin,
Cheryllin (S), (+) Crinamin, (-) Crinin (Vittatin, Crinidin), Hamayn (Bulbispermin,
Demethylcrinamin), Hipeastrin, Latifin (S), Powellin, Undulatin [35].
+ Crinum latifolium L. Việt Nam: 9-Octadecenamid, Dihydro-oxo-
demethoxyhaemanthamin, Augustamin, Oxoassoanin, Crinan-3-α-ol, Buphannidrin,
Powellin, Undulatin, Ambellin, 6-hydroxybuphannidrin,
1β,2β-epoxyambellin, 6-hydroxycrinamidin, Epoxy-3,7-dimethoxycrinan-11-one,
Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan,
4’7-dihydroxyflavan, kaemperol-3-O-β-glucopyranosid [8], [14], [39].
Từ lá cây TNHC, Võ Thị Bạch Huệ cũng đã tách được 18 vết bằng kỹ thuật
sắc ký ghép khối phổ, trong đó xác định được cấu trúc của 3 vết là ambellin,

14. 5
crinamidin và 6 – OH – crinamidin sau khi so sánh thời gian lưu, khối phổ với 3
alkaloid đơn chất [8].
Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b.
+ Crinum latifolium L. Việt Nam có 32 chất bay hơi và saponin, acid hữu cơ,
amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-
3-4-di-O-β-D-glucopyranosit.
1.1.4. Tác dụng sinh học
Ở Ấn Độ, người ta dùng bẹ của cây xào nóng giã đắp làm thuốc trị bệnh thấp
khớp; cũng dùng đắp mụn nhọt và áp xe để gây mưng mủ. Còn dịch lá dùng làm
thuốc nhỏ tai chữa đau tai [18].
Từ những năm 1989 – 1990, người dân Việt Nam đã biết cách sử dụng
TNHC để chữa những trường hợp u xơ và ung thư cổ tử cung (ở phụ nữ) và ung thư
tuyến tiền liệt (ở nam giới) [10], [31].
TNHC còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh u xơ tử cung, ung thư vú, tử
cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt, viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa. Hoạt tính
chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế
bào và sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống ngưng kết tiểu
cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình thành mạch máu của các tế bào nội mô
tĩnh mạch rốn của người (HUVECs) và điều hòa hệ miễn dịch của cơ thể [33], [40].
Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E. Zvetkova và cộng sự cũng đã chứng
minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự
sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế
bào TCD3, TCD4 invitro [20].
Lá tươi và thân hành dùng ngoài, hơ nóng xoa bóp vào chỗ sưng đau do thấp
khớp, sang chấn [3].
1.2. Tổng quan về crinamidin
Crinamidin là alkaloid trong cây TNHC (Crinum latifolium L.), có công thức
cấu tạo như hình 1.2.

15. 6
Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin
Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin
Crinamidin
Công thức phân tử
(Khối lượng phân
tử)
C17H19NO5
(M = 317,34 g/mol)
Tên IUPAC (1β,2β,3α)-7-Methoxy-1,2-epoxycrinan-3-ol
Phổ hấp thụ
Phổ IR có các băng hấp thụ cực đại (cm-1
) ở 3200 – 3400 (-
OH), 1499, 1278 (epoxy), 1035, 918 (-OCH2O-), 802 (epoxy).
Phổ UV – VIS có bước sóng hấp thụ cực đại ở 220 và 285 nm.
Phổ HR – MS cho mảnh có số khối 318,1369 m/z tương ứng
với mảnh ion phân tử giả [M+H]+
[19], [26].
Tính chất vật lý, hóa
học
Crinamidin là chất bột kết tinh màu trắng, điểm chảy 215 –
217o
C, – 10o
(CHCl3; 0,1 g/ml) [19], [26].

16. 7
1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin
Các nghiên cứu xác định crinamidin bao gồm khảo sát, định tính, định lượng
và tinh chế, trong đó có tiêu chuẩn DĐVN IV đưa ra quy định về hàm lượng
crinamidin trong lá TNHC. Kỹ thuật chính được sử dụng để định lượng là HPLC.
Kỹ thuật GC-MS được sử dụng để khảo sát thành phần trong cây và định tính. Chưa
có nghiên cứu về định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS. Các nghiên cứu xác
định crinamidin được tổng hợp trong bảng 1.2.
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét
Tài
liệu
Phương pháp nghiên cứu Kết quả Nhận xét
[2]  Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C18. Pha động: ACN – đệm
phosphat 100 mM, pH 3,0.
Gradient thành phần pha động
(0 – 65 phút). Detector UV 285
nm. Tốc độ dòng: 1 – 1,5
mL/phút. Thể tích tiêm: 50 µL.
Thời gian lưu của
crinamidin khoảng
33 phút.
Khoảng tuyến tính
của crinamidin từ
30 µg/mL đến 300
µg/mL.
Thời gian sắc ký
dài, quy trình chiết
chưa thực sự tối
ưu, cụ thể:
- Quy trình áp
dụng cho lá: phải
siêu âm và lọc
Tác dụng sinh học
Crinamidin là một alkaloid trong cây TNHC, cùng với các
alkaloid khác cho tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tử cung, ung
thư tuyến tiền liệt, kháng khối u, kháng viêm, chống oxi hóa
và kích thích miễn dịch [20], [32].
Các nhà khoa học đã chứng minh tác dụng đối một số bệnh
ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và các bệnh
viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa, chống oxi hóa, giảm đau,
chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và
sự phát triển của khối u [32]. Ngoài ra còn có khả năng chống
ngưng kết tiểu cầu, chống độc tế bào [29], ức chế sự hình
thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của
người [33], [40].

17. 8
 Phương pháp xử lý mẫu:
- Lá: Làm ẩm bột dược liệu bằng
NH3, sau 1 giờ, thêm 50 mL
CHCl3 – MeOH (3:1), siêu âm 30
phút, lọc. Bã chiết thêm 4 lần. Cô
dịch chiết. Hòa cắn bằng 20 mL
HCl 0,1N.
- Viên nang: Làm ẩm bột bằng
NH3, sau 1 giờ, chiết Soxhlet,
ngâm qua đêm. Đun hồi lưu 5
giờ. Cô dịch chiết. Hòa cắn bằng
HCl nhiều lần. Kiềm hóa đến pH
10 – 11, lắc với CHCl3 5 lần. Cô
dịch CHCl3. Hòa cắn bằng 20 mL
HCl 0,1N.
LOQ trong lá
TNHC là 4,2
µg/mL, trong viên
nang là 4,9 µg/mL.
nhiều lần, phương
pháp chưa có bước
loại tạp.
- Quy trình áp
dụng cho viên
nang: quy trình
chiết xuất mất
nhiều thời gian do
thời gian ngấm kiệt
kéo dài và một số
giai đoạn tiến hành
làm lặp nhiều lần
[3]  Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C18. Pha động: ACN – đệm
phosphat 100 mM, pH 3,0.
Gradient thành phần pha động
(0 – 65 phút). Detector UV, bước
sóng phát hiện 285 nm.
Tốc độ dòng: 1 – 1,5 mL/phút.
Thể tích tiêm: 50 µL.
 Phương pháp xử lý mẫu:
Làm ẩm bột lá bằng NH3, sau 1
giờ, thêm 50 mL CHCl3 – MeOH
(3:1), siêu âm 30 phút, lọc. Bã
được chiết thêm 4 lần. Cô dịch
chiết. Hòa cắn bằng HCl 0,1N.
Yêu cầu hàm
lượng crinamidin
không nhỏ hơn
0,08% (theo khối
lượng) crinamidin
(C17H19NO5) tính
theo dược liệu khô
kiệt.
Thời gian sắc ký
dài, quy trình chiết
chưa thực sự tối
ưu, phải siêu âm và
lọc nhiều lần,
phương pháp chưa
có bước loại tạp.

18. 9
[17]  Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C8. Pha động: MeOH –
H3PO4 pH 2,3 (15 : 85). Nhiệt độ
cột 40o
C. Thể tích tiêm 10 µL.
Detector PDA 214 nm.
 Phương pháp xử lý mẫu:
Bột lá TNHC được chiết với CO2
lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết cao
toàn phần bằng cách ngấm kiệt.
GĐ1: Làm ẩm bột lá TNHC bằng
cồn 96% trong 12 giờ. Nạp vào
bình chiết, thu hồi dung môi được
cao SFE.
GD2: Chiết cao alkaloid toàn
phần bằng phương pháp ngấm
kiệt.
Xây dựng được bộ
dữ liệu chuẩn
crinamidin và thiết
lập được 500 mg
chất chuẩn với độ
tinh khiết 98,74%.
Cao alkaloid toàn
phần có thể chất
sạch, ít tạp nhày,
nhựa, tuy nhiên hệ
thống chiết SFE
không phổ biến tại
các phòng thí
nghiệm, vận hành
phức tạp, tốn kém.
Thời gian chiết
xuất kéo dài.
[19]  Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C8. Pha động:
MeOH – H3PO4 0,1% (35 : 65).
Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Nhiệt
độ cột: 30o
C. Thể tích tiêm: 20
µL.
 Phương pháp xử lý mẫu:
Bột lá TNHC (100kg) được chiết
ngấm kiệt với ethanol 96%, cô
thu hồi dung môi được cao
ethanol.
Tiếp tục chiết xuất thu được cao
chiết pH = 4 (2,5kg), cao chiết
Crinamidin cho
thời gian lưu ~ 6,8
phút.
Thu được 1,5 g
crinamidin đạt tiêu
chuẩn chuẩn gốc
với hàm lượng
99,85%.
Quy trình được xây
dựng để thiết lập
chuẩn crinamidin
và phương pháp
này chưa thật sự
phù hợp để cải tiến
thành phương pháp
định lượng
crinamidin trong
TNHC do thời gian
chiết xuất kéo dài.

19. 10
pH = 9 (210g).
Cao pH 9 (130g) được sắc ký cột
nhanh (VLC) trên silicagel với hệ
dung môi: dicloromethan –
MeOH.
[16]  Điều kiện phân tích HPLC:
Cột: C8. Pha động: MeOH –
H3PO4 pH 3,0 và 0,2%
Triethanolamin.
Gradient thành phần pha động (0-
30 phút). Detector PDA ở 214
nm.
Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Thể tích
tiêm: 10 µL. Nhiệt độ cột: 40o
C.
 Phương pháp xử lý mẫu
(HPLC)
Chiết cao cồn: làm ẩm dược liệu
bằng dung môi chiết 12 giờ,
ngâm dược liệu 24 giờ. Gộp dịch
chiết, cô cách thủy được cao cồn.
Hòa tan cao cồn trong HCl. Lắc
dịch acid với ethyl acetat. Kiềm
hóa dịch acid, lắc với CHCl3. Cô
thu hồi dung môi CHCl3 được
phân đoạn alkaloid.
 Phương pháp xử lý mẫu (CE):
Chiết SFE bột lá thu được cao
SFE và dược liệu sau SFE. Hòa
tan cao trong acid, kiềm hóa, lắc
Xây dựng được
quy trình định
lượng đồng thời 6
alkaloid bằng
phương pháp
HPLC.
Chiết SFE thu
được alkaloid
0,24%, ngấm kiệt
được 0,60%.
Không có sự khác
biệt kết quả định
lượng alkaloid và
flavonoid trong lá
TNHC bằng
phương pháp
HPLC hoặc CE.
Kết hợp chiết
alkaloid và
flavonoid, định
lượng đồng thời
được nhiều
alkaloid và
flavonoid. Tuy
nhiên trang thiết bị
SFE tốn kém, vận
hành phức tạp, cần
phải thực hiện
nhiều khảo sát để
tìm các thông số
tối ưu áp suất, thời
gian, nhiệt độ, khối
lượng mẫu, dung
môi hỗ trợ và tỷ lệ
dung môi hỗ trợ.
Phương pháp này
tốn nhiều thời gian
và chi phí cao, khó
phổ biến trên thực
tế.
Alkaloid trong cây

20. 11
với CHCl3 được phân đoạn
alkaloid.
Dược liệu sau SFE được chiết
ngấm kiệt với cồn. Lấy phần dịch
chiết đã loại cồn, acid hóa, lắc
với ethyl acetat. Dịch chiết được
kiềm hóa, thêm CHCl3 được phân
đoạn alkaloid.
tồn tại chủ yếu ở
dạng muối cũng là
trở ngại lớn trong
chiết SFE.
[8]  Điều kiện sắc ký:
Cột DB 15m silica tan chảy, khí
mang heli. Chương trình nhiệt
60o
C/phút, tăng đến 120o
C
(30o
C/phút) rồi tăng đến 320o
C
(10o
C/phút), 1µL không chia
dòng (1 phút).
GC – EIMS, cột silica tan chảy
30m x 0,25 mm x 0,25 µm. Tiêm
mẫu chia dòng 1/30, 1 µL, nhiệt
độ interface 280o
C. Chương trình
nhiệt 60o
C/phút, tăng dần đến
120o
C (30o
C/phút) rồi tăng đến
320o
C (10o
C/phút). Thế năng 70
eV. EIMS với nhiệt độ nguồn
200o
C, thế năng 70 eV, dòng bẫy
200 µA. Chương trình nhiệt 300
C
tăng lên đến 520o
C (1o
C/giây).
 Phương pháp xử lý mẫu:
Lá TNHC ngấm kiệt bằng cồn
50o
chứa HCl (pH = 6). Dịch
Kết quả (A) tách
được 17 vết có
thời gian lưu từ 15
đến 35 phút. Còn
(B) tách không tốt
nên được tạo thành
dẫn chất dễ bay
hơi để tách bằng
sắc ký khí. Kết quả
(B) tách được 18
vết có thời gian
lưu từ 3 đến 15
phút, trong đó xác
định được cấu trúc
của 3 vết ambellin,
crinamidin và 6-
hydroxo-
crinamidin sau khi
so sánh thời gian
lưu, khối phổ với 3
alkaloid đơn chất.
Nghiên cứu này
nêu phương thức
chuyển đổi
alkaloid chiết xuất
từ lá TNHC thành
những chất dễ bay
hơi để có thể dễ
dàng tách bằng sắc
ký khí.
Nghiên cứu này
mới chỉ dừng ở
việc khảo sát sơ bộ
các alkaloid chiết
từ cây TNHC, xác
định sự hiện diện
của một số chất
phân lập từ cắn
alkaloid toàn phần
(phải qua giai
đoạn tinh chế) mà
chưa đưa ra

21. DOWNLOAD ĐỂ XEM ĐẦY ĐỦ NỘI DUNG
MÃ TÀI LIỆU: 50444
DOWNLOAD: + Link tải: Xem bình luận
Hoặc : + ZALO: 0932091562