Chế tạo hạt nano vàng gắn kháng thể ứng dụng cho phát hiện nhanh viruts cúm A : Luận văn ThS. Vật liệu và Linh kiện Nanô

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
PHẠM VĂN ĐỒNG
CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG
DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hà Nội – 2010

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ
PHẠM VĂN ĐỒNG
CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG GẮN KHÁNG THỂ ỨNG
DỤNG CHO PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A
Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô
(Chuyên ngành đào tạo thí điểm)
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ
Hà Nội – 2010

3. MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU....................................................3
1.1. Tổng quan về hạt nano kim loại ...............................................................................3
1.2. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt của hạt nano kim loại.................................3
1.3. Các loại hạt nano ứng dụng trong y sinh học...........................................................5
1.3.1. Các hạt nano kim loại..............................................................................5
1.3.2. Các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ....................................................................6
1.3.3. Hạt nano từ tính.......................................................................................6
1.3.4. Chấm lượng tử.........................................................................................7
1.4. Hạt nano vàng...........................................................................................................7
1.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano vàng..................................................................9
1.5.1. Phương pháp Turkevich........................................................................10
1.5.2. Phương pháp Brust................................................................................11
1.5.3. Phương pháp Perrault............................................................................11
1.5.4. Phương pháp Martin..............................................................................11
1.5.5. Phương pháp rung siêu âm (sonolysis).................................................12
1.6. Các ứng dụng trong y sinh học của AuNPs............................................................12
1.6.1. Đánh dấu sinh học................................................................................. 13
1.6.2. Phân phát thuốc và chuyển gen............................................................. 13
1.6.3. Sensor sinh học......................................................................................14
1.7. Kit chẩn đoán bệnh bằng que thử nhanh ................................................................14
1.7.1. Giới thiệu...............................................................................................14
1.7.2. Sơ đồ nguyên lý của que thử nhanh......................................................15
1.8. Kháng thể................................................................................................................17
1.8.1. Giới thiệu chung....................................................................................17
1.8.2. Giới thiệu về vùng biến đổi của kháng thể (Single Chain Variable
Fragmet-scFv) .................................................................................................18
1.9. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ...................................................................................19

4. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...............................................................22
2.1. Vật liệu ...................................................................................................................22
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................22
2.2.1. Phương pháp chế tạo dung dịch nano vàng (AuNPs)...........................22
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu các nhân tố ảnh hướng đến chất lượng mẫu 25
2.2.2.1. Thời gian phản ứng ............................................................................25
2.2.2.2. Thay đổi lượng chất khử Na3C6H5Na3 ...............................................25
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu kích thước, hình thái và cấu trúc hóa học của
AuNPs. ............................................................................................................26
2.2.3.1. Phân tích bằng phổ hấp thụ UV .........................................................26
2.2.3.2. Phân tích bằng hiển vi điện tử quét (SEM)........................................27
2.2.3.3. Phân tích bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR ...................................28
2.2.4. Phương pháp gắn kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 lên bề mặt hạt
nano vàng ........................................................................................................30
2.2.4.1. Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng................30
2.2.4.2. Tạo phức hợp kháng thể gắn trên bề mặt hạt nano vàng (kháng
thể/nano vàng).................................................................................................31
2.2.5. Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1 sử dụng phức hợp kháng
thể/nano vàng. .................................................................................................32
2.2.5.1. Thiết kế que thử nhanh đơn giản........................................................32
2.2.5.2. Kiểm tra sự hoạt động của phức hợp kháng thể/nano vàng...............33
2.2.5.2.1. Kiểm tra bằng Dot blot....................................................................33
2.2.5.2.2. Phương pháp que thử nhanh............................................................34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................36
3.1. Kết quả chế tạo hạt nano vàng................................................................................36
3.1.1. Kích thước, hình thái.............................................................................36
3.1.2 Phân tích thành phần EDX.....................................................................38
3.1.3. Đặc trưng quang học của AuNPs..........................................................38
3.1.4. Cấu trúc hóa học của AuNPs. ...............................................................39
3.1.5. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng AuNPs...................40

5. 3.1.5.1. Thời gian phản ứng ............................................................................40
3.1.5.2. Thay đổi lượng chất khử natri citrate.................................................41
3.1.5.3. Thời gian và điều kiện bảo quản hạt AuNPs .....................................42
3. 2. Tạo phức hợp AuNPs gắn kháng thể cúm A.........................................................43
3. 2.1. pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể/nano vàng ..............................43
3. 2.2. Tìm lượng kháng thể thích hợp cho phản ứng gắn ..............................44
3.3. Kiểm tra phát hiện virus cúm A/H5N1 bằng phức hợp kháng thể/nano vàng.......48
3.3.1. Kết quả phát hiện kháng nguyên virus cúm A bằng Dot blot...............48
3.3.2. Kết quả kiểm tra thử nghiệm bằng que thử đơn giản............................49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................52
PHỤ LỤC ......................................................................................................................57

6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử
quét
FTIR Fourier Tranform Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại
UV Ultraviolet photospectroscopy Phổ UV
AuNPs Gold nanoparticles Hạt nano vàng
SPR Surface Plasmon Resonance Cộng hưởng Plasmon bề mặt.
BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò

7. DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1.
Những chiếc cốc Lycurgus (Roman ~ 400 AD, Myth of King Lycurgus) được
làm bằng thủy tinh có pha thêm các hạt nano vàng và bạc. Cốc xuất hiện màu
xanh khi phản xạ, màu đỏ khi ánh sáng truyền qua
3
Hình 1.2. Hiện tượng Plasmon bề mặt ở mặt phân cách giữa kim loại và điện môi. 4
Hình 1.3.
Đỉnh hấp thụh Plasmon bị dịch chuyển dưới sự thay đổi của tác nhân bọc xung
quanh hạt.
4
Hình 1.4.
A) Các dung dịch nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs) được chế tạo theo
phương pháp Turkevich. B) Phổ hấp thụ UV tương ứng của các dung dịch.
5
Hình 1.5.
Các hạt nano chấm lượng tử với kích thước khác nhau dưới tía cực tím (trên)
và dưới điều kiện ánh sáng thường (dưới).
8
Hình 1.6.
(A). Vàng khối nguyên chất dạng khối từ quặng. (B) Hạt nano vàng kích thước
15nm và (C) dung dịch nano vàng do Faraday chế tạo năm 1850
8
Hình 1.7. Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần (từ trái qua) [62] 8
Hình 1.8. Phản ứng tạo hạt nano vàng theo Turkevich 9
Hình 1.9.
AuNPs có rất nhiều ứng dụng trong sinh học, bao gồm phép nhuộm đặc hiệu,
phân phát thuốc và DNA vào tế bào
12
Hình 1.10. Mô hình que thử nhanh cơ bản [63] 15
Hình 1.11. Một mẫu que thử nhanh thương mại sử dụng hạt nano vàng 16
Hình 1.12. Cấu Trúc của kháng thể 17
Hình 1.13. Sơ đồ tạo scFv 19
Hình 2.1.
Sơ đồ phản ứng hóa học tạo hạt nano vàng theo phương pháp khử của
Turkevich
23
Hình 2.2.
Kích thước và hình dạng của hạt nano vàng theo thời gian phản ứng trong
khoảng thời gian t=10giây đến t=120giây
23
Hình 2.3. Sơ đồ máy đo phổ hấp thụ UV/vis hai chùm tia 27
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa cấu tạo của kính hiển vi điện tử quét 27
Hình 2.5. Mô hình một máy quang phổ FTIR cơ bản 29
Hình 2.6. Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng 31
Hình 2.7. Mô hình que thử nhanh với hai vạch kháng thể (test line và control line) 33

8. Hình 2.8.
Mô hình tiến hành thí nghiệm Dot Blot để kiểm tra sự hoạt động của phức hợp
kháng thể/nano vàng.
34
Hình 2.9.
Mô hình thí nghiệm que thử nhanh: Que thử gắn vạch kháng thể được nhúng
vào dung dịch chứa phức hợp kháng thể/nano vàng.
35
Hình 3.1. Ảnh SEM của AuNPs (A, B) và phân bố kích thước của hạt (C). 37
Hình 3.2. Phổ phân tích thành phần vật liệu EDX của mẫu nano vàng 38
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch AuNPs 39
Hình 3.4. Phổ hồng ngoại (FTIR) của AuNPs 39
Hình 3.5.
Phổ hấp thụ UV của các mẫu vàng trong các khoảng thời gian phản ứng khác
nhau.
40
Hình 3.6.
Phổ hấp thụ của các mẫu dung dịch AuNPs theo bảng với hàm lượng citrate
khác nhau.
42
Hình 3.7. Phổ hấp thụ của mẫu AuNPs ban đầu và sau thời gian 60 ngày 43
Hình 3.8.
Sự thay đổi màu dung dịch với lượng kháng thể gắn như nhau ở các pH khác
nhau từ trái sang lần lượt từ pH 5 - pH 11.
43
Hình 3.9.
Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng trước (đường a ) và sau khi gắn kháng
thể (đường b)
44
Hình 3.10.
Phổ hấp thụ FTIR của mẫu nano vàng không gắn kháng thể (A) và mẫu sau khi
gắn kháng thể lên bề mặt (B).
46
Hình 3.11. Các hạt AuNPs trước (A) và sau khi gắn kháng thể (B) 46
Hình 3.12.
(A) Từ trái sang với các mẫu gắn lượng protein thay đổi từ (1 -100 µl kháng
thể nồng độ 100µg/ml trên 1ml dung dịch AuNPs). (B) Phổ hấp thụ của các
mẫu sau khi bổ sung dung dịch NaCl để kích thích kết tủa của dung dịch.
48
Hình 3.13.
Kết quả kiểm tra bằng Dot Blot với các nồng độ kháng nguyên khác nhau cố
định trên màng
48
Hình 3.14.
Vạch kháng thể kháng virus cúm A được cố định trên màng nitrocellulose bắt
các hạt kháng thể/nano vàng và tập hợp thành vạch. Vạch có thể quan sát dễ
dàng bằng mắt thường sau thời gian kiểm tra từ 5-10 phút.
49

9. 1
MỞ ĐẦU
Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của mọi loài
chim, trong đó có gia cầm và thủy cầm, do các phân týp (subtype) của nhóm virus cúm
A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Chủng virus cúm A/H5N1
được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Cúm
A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm
gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao
(HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và
phát sinh nhiều dưới dòng (sublineage) và nhóm/phân nhóm (clade) có độc lực rất
cao. Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO), tính đến tháng 10 năm 2010,
tổng số ca mắc cúm A/H5N1trên thế giới lên tới 507, trong đó, 302 trường hợp đã
tử vong. Trong đó, Việt Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và
tử vong cao nhất do virus cúm A/H5N1 gây nên. Để ngăn chặn sự lây lan của bệnh
và có các biện pháp điều trị kịp thời thì việc chẩn đoán nhanh và chính xác cúm
A/H5N1 là rất cần thiết.
Chẩn đoán và phát hiện nhanh virus cúm tại hiện trường đồng thời tiến hành các
công tác dập dịch là công việc rất quan trọng. Hiện nay có một thiết bị chẩn đoán
nhanh các loại bệnh dịch với thời gian kiểm tra nhanh và cho kết quả rất đáng tin
cậy đó là que thử nhanh. Đây là một thiết bị chẩn đoán được thiết kế dựa trên
nguyên tắc sắc ký miễn dịch đặc hiệu (immunochromatographic assays), và được
sử dụng phổ biến cho các xét nghiệm nhanh từ cuối những năm 1980. Que thử
nhanh được phát triển bằng việc sử dụng các hạt nano vàng hoặc các loại hạt khác
kích thước nano ở dạng huyền phù gắn kháng thể đơn dòng. Trong thiết bị này, các
hạt kích thước nano được sử dụng cho việc đánh dấu quang học, đóng vai trò như
một sensor màu dùng để phát hiện sự tồn tại của các chất có trong mẫu thử. Que
thử nhanh cho phép phát hiện rất nhiều đối tượng bao gồm kháng nguyên, kháng
thể, thậm chí trong kiểm tra sự tồn tại của các loại hợp chất khác. Que thử nhanh
rất tiện dụng, thân thiện với người dùng, giá thành sản xuất thấp và cũng như tính
linh hoạt cao trong sử dụng, có thể được sử dụng ở phạm vi rộng, không chỉ trong bệnh
viện hoặc các trung tâm y tế hiện đại.
Công nghệ nano hiện nay đã và đang trở thành một lĩnh vực hứa hẹn cho rất
nhiều ứng dụng trong khoa học và đời sống. Công nghệ nano sinh học tạo ra các sản
phẩm khả năng ứng dụng to lớn trong các lĩnh vực dược phẩm, y sinh. Trong các
loại vật liệu nano hiện nay, hạt nano vàng (AuNPs) là một trong những loại vật liệu
nano được nghiên cứu rộng rãi nhất. Với kích thước trong khoảng 10- 100 nm, các
hạt nano vàng tạo ra hiệu ứng cộng hưởng plasmon đặc trưng dưới tác động của các
photon. Các hạt nano vàng có thể được gắn với các phân tử sinh học, đã và đang trở
thành một sản phẩm với rất nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học, trong chẩn
đoán và điều trị các tế bào ung thư [7, 48] và đặc biệt trong công nghệ chế tạo các
loại kit chẩn đoán nhanh các loại bệnh truyền nhiễm [14].

10. 2
Ở Việt Nam hiện nay, việc ứng dụng các loại vật liệu nano là một lĩnh vực
nghiên cứu mới được quan tâm, đặc biệt là trong công tác chẩn đoán và chữa trị
các loại bệnh nguy hiểm. Bệnh cúm A hiện nay đang là một bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm đã gây nên nhiều đợt dịch trên người và gia cầm thời gian vừa qua.
Chính vì thế, việc nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian chẩn đoán, qua đó góp
phần cho công tác phòng chống bệnh kịp thời sẽ là đóng góp quan trọng trong việc
dập tắt các đợi đại dịch.
Để có cơ sở lý thuyết và thực nghiệm cho việc chủ động chế tạo được kit
chẩn đoán dựa trên các ưu điểm của vật liệu nano, góp phần đóng góp cho công
tác phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan của virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Chế tạo hạt nano vàng (AuNPs) gắn kháng thể ứng
dụng cho phát hiện nhanh virus cúm A”.
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm việc chế tạo vật liệu nano vàng có gắn
kháng thể kháng virus cúm A và bước đầu tiến hành việc phát hiện nhanh virus cúm
A/H5N1.
Nội dung nghiên cứu
+ Chế tạo các hạt nano vàng (AuNPs)
+ Nghiên cứu các đặc tính vật lý và hóa học của hạt nano vàng chế tạo được
+ Nghiên cứu chế tạo phức hợp hạt nano vàng gắn kháng thể.
+ Ứng dụng các hạt nano vàng đã được gắn kháng thể để phát hiện sự có mặt của
virus cúm A/H5N1.

11. 3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về hạt nano kim loại
Các hạt nano kim loại có ít nhất kích thước một chiều dao động trong khoảng
1- 100 nm [45]. Ở kích thước nano mét, chúng có những tính chất đặc biệt và khác
biệt so với vật liệu khối cùng loại (tính chất điện, tính chất xúc tác, tính chất
quang, tính chất từ, cấu trúc và tính chất cơ). Việc tổng hợp các hạt nano không
chỉ được phát triển trong khoa học hiện đại ngày nay mà đã có từ rất lâu trong lịch
sử loài người. Các nhà giả kim học đã chế tạo được những hạt nano vàng và họ tin
rằng đó là thứ thuốc giúp con người trường thọ [9]. Các loại hạt nano kim loại khác
đã được dùng để trang trí các cánh cửa nhà thờ, cung điện cho các màu sắc rực rỡ của
chúng.
Hình 1.1. Những chiếc cốc Lycurgus (Roman ~ 400 AD, Myth of King Lycurgus)
được làm bằng thủy tinh có pha thêm các hạt nano vàng và bạc. Cốc xuất hiện màu
xanh khi phản xạ, màu đỏ khi ánh sáng truyền qua [60].
Ngày nay việc nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng của các hạt nano kim loại đã
góp phần tạo nên một bước tiến nhảy vọt trong khoa học cũng như đời sống do chúng
sở hữu những thuộc tính vật liệu khác biệt, nổi trội và quý giá so với các vật liệu khối
thông thường.
1.2. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt của hạt nano kim loại.
Các hạt nano kim loại với kích thước nhỏ hơn bước sóng trong vùng khả kiến
bộc lộ đặc tính tự nhiên liên quan đến cộng hưởng plasmon bề mặt phụ thuộc vào
đặc tính hình học của hạt nano khi chúng bị kích thích bởi trường điện từ [25].
Trên bề mặt của hạt kim loại, plasmon là dạng sóng được truyền dọc theo bề mặt
của vật dẫn ở phần chuyển tiếp giữa kim loại và vật liệu điện môi chứa hạt.

12. 4
Hình 1.2. Hiện tượng Plasmon bề mặt ở mặt phân cách giữa kim loại và điện môi.
Plasmon bề mặt (sóng điện từ) bị kích thích khi các photon của bước sóng
tới đập vào khu vực chuyển tiếp kim loại/điện môi và kích thích dao động cộng
hưởng ở bề mặt, tạo nên một dạng sóng truyền (plasmon bề mặt) [27, 50]. Đối với
các hạt nano kim loại, kích thước nhỏ tạo ra một sự hấp thụ cường độ mạnh trong
khu vực khả kiến/gần UV. Các điện tử dẫn tạo nên một dao động chọn lọc đặc
trưng, tạo nên dải Plasmon có thể quan sát trong khu vực gần 530 nm với các hạt
nano kích thước từ 5-20 nm. Đặc tính này được gọi là dao động cộng hưởng
Plasmon định xứ [31].
Tần số cộng hưởng Plasmon của các hạt nano phụ thuộc vào chỉ số khúc xạ
cục bộ. Một sự thay đổi nhỏ với chỉ số này sẽ dẫn đến việc dịch chuyển tần số dao
động và do đó sẽ tạo nên sự dao động tỉ số khúc xạ. Ví dụ, nếu bề mặt của hạt
nano được nhúng trong trong dung dịch đệm lỏng và sau đó được nhúng trong
dung dịch với tỉ số khúc xạ lớn hơn, điều này sẽ làm tăng tỉ số khúc xạ có thể được
phát hiện bởi sự dịch chuyển trong cộng hưởng plasmon (hay kích thích) của hạt
nano.
Absorbance
Wavelength
Absorbance at selected
wavelength
Increase in absorbance at
selected wavelength due to
shift in plasmon resonance
band
Extinction
Extinction at selected
wavelength
Increase in extinction at
selected wavelength due to
shift in plasmon resonance
band
Absorbance
Wavelength
Absorbance at selected
wavelength
Increase in absorbance at
selected wavelength due to
shift in plasmon resonance
band
Extinction
Extinction at selected
wavelength
Increase in extinction at
selected wavelength due to
shift in plasmon resonance
band
Hình 1.3. Đỉnh hấp thụh Plasmon bị dịch chuyển dưới sự thay đổi của tác nhân bọc
xung quanh hạt [31].

13. 5
Hiện tượng dịch chuyển đỉnh hấp thụ là do các tác nhân bọc xunh quanh hạt
nano, sự dịch chuyển này có thể phù hợp với các ứng dụng trong chế tạo các sensor
cảm biến sinh học bằng việc bọc chúng với kháng thể. Độ nhạy cảm của plasmon bề
mặt phụ thuộc vào đặc điểm hình thái (kích thước và hình dạng), môi trường điện môi
(tác nhân bọc, môi trường xung quanh, chất nền), tương tác giữa các hạt (trạng thái co
cụm).
Hình 1.4 minh họa thuộc tính quang học của các hạt nano vàng và nano bạc
được tổng hợp theo các quy trình khác nhau tạo ra các hình dạng và kích thước hạt
nano khác nhau. Do đó, màu sắc dung dịch chứa các hạt nano do cộng hưởng plasmon
cũng thay đổi, phổ hấp thụ UV thể hiện ở các đường hấp thụ với các đỉnh cực đại hấp
thụ ở các vị trí bước sóng khác nhau.
Hình 1.4. A) Các dung dịch nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs) được chế tạo
theo phương pháp Turkevich. B) Phổ hấp thụ UV tương ứng của các dung dịch [31].
1.3. Các loại hạt nano ứng dụng trong y sinh học
1.3.1. Các hạt nano kim loại
Hạt nano kim loại là dạng phân tán của các pha rắn trong một môi trường chất
lỏng, hầu hết các hạt nano kim loại với kích thước từ vài nm đến µm (Au [5], Ag
[40], Pt [57], Pa [58], Cu, Fe, và Hg [22]). Các loại hạt nano kim loại quan trọng nhất
được nghiên cứu và ứng dụng là nano vàng (AuNPs) và nano bạc (AgNPs). Các hạt
nano vàng được hình thành từ một nguyên tử khởi đầu, sau đó được bao bọc bởi số
lượng các nguyên tử vàng nhất định xung quanh, số lượng các hạt xung quanh được
tính bởi công thức [10n2
+2] [41], với n là số các lớp nguyên tử trong hạt. Như vậy
hạt nano vàng nhỏ nhất sẽ bao gồm 13 nguyên tử vàng (Au). Các hạt khác tương tự
có cấu trúc gần với khối 20 mặt (icosahedrons) và khối 12 mặt (dodecahedrons) xấp
xỉ dạng hình cầu cùng với đường kính tăng dần.

14. 6
1.3.2. Các hạt nano cấu trúc lõi/vỏ
Các hạt nano kim loại có cấu trúc lõi/vỏ (core/shell nanoparticles) có những
đặc tính quang học rất đặc trưng. Chúng có hai dao động cộng hưởng plasmon bề mặt
tương ứng với dải điện tử của các thành phần kim loại tinh khiết trong cấu tạo hạt kim
loại (của cả lõi và vỏ) [1]. Đặc tính quang học của các hạt nano kim loại được giải
thích bằng lý thuyết Mie cho các hạt bị bọc bởi một lớp khác [10, 41] . So với các thể
dị hướng, các hạt nano kim loại cấu trúc lõi vỏ được tổng hợp, ví dụ như dạng hợp
kim bởi quá trình phát xạ laser, chỉ thể hiện một đỉnh Plasmon, nằm giữa các vùng
hấp thụ của kim loại nguyên chất. Các hạt nano kim loại lõi- vỏ đóng vai trò rất quan
trọng việc chẩn đoán sinh học [8].
Hơn nữa, các hạt nano kim loại thuần nhất bộc lộ một số khuyết điểm liên quan
đến độ bền hóa học hoặc khi được sử dụng trong các dung môi khác nhau. Để ngăn
chặn hiện tượng kết đám, các hạt huyền phù có thể được bọc bởi một lớp vỏ cách
điện, ví dụ vỏ silica [34]. Sau khi bọc các hạt nano kim loại bằng lớp vỏ điện môi,
chúng có thể được sử dụng trong các môi trường dung môi khác nhau. Độ dày của lớp
vỏ silica trong suốt có thể được kiểm soát trong quá trình tổng hợp. Việc thay đổi độ
dày của lớp silica và chỉ số khúc xạ của dung môi cho phép kiểm soát thuộc tính
quang học thông qua độ phân tán. Với việc tăng độ dày của lớp vỏ silica lên tới một
kích thước nhất định, cường độ của dải plasmon tăng và đỉnh hấp thụ sẽ dịch chuyển
về phía bước sóng dài hơn (redshift) do chỉ số khúc xạ cục bộ tăng xunh quanh hạt.
Tuy nhiên, khi kích thước của cấu trúc vượt lên trên 80 nm, hiện tượng tán xạ trở nên
đáng kể, tạo nên một sự gia tăng mạnh trong phổ hấp thụ của các bước sóng ngắn hơn
(blue-shift) tương tự như đặc điểm của hạt nano vàng không có lớp vỏ silica. Kết quả
tương tự đối với các lớp phân tử sinh học, hoặc polymer được hấp thụ lên bề mặt của
các hạt nano kim loại. Lớp vỏ polymer cũng sẽ làm thay đổi các thông số hình học,
điện môi của hạt [23]. Một loại hạt nano composite khác có cấu trúc vỏ kim loại bọc
xung quanh một lõi điện môi . Thuộc tính quang học của những hạt nano silica đơn
phân tán (còn gọi là các hạt Stöber [55]) có thể bị ảnh hưởng bởi việc bọc xunh quanh
một lớp vỏ kim loại mỏng và đồng đều. Khi giữ nguyên kích thước của lõi điện môi, sự
dịch chuyển của hấp thụ quang tương đối nhạy với độ dày của lớp vỏ.
1.3.3. Hạt nano từ tính
Các hạt nano từ hầu hết là các hợp chất của oxit sắt (Fe3O4 /magnetite Fe2O3
/maghemite) do đó không phải là những hạt kim loại nguyên chất. Tuy nhiên chúng là
một trong những công cụ mạnh mẽ và hiệu quả nhất trong sinh học và y học. Có hai
loại hạt nano từ tính: (1) các đầu magnetic chứa các hạt nano oxit sắt được bọc bởi
mạng lưới polymer-silica và (2) các hạt oxit kim loại nguyên chất trong một dải nm.
Các hạt oxit sắt ferromagnetic phân tán đơn domain được gọi là chất lỏng từ và có thể
được sử dụng trong các ứng dụng sinh học nếu nó có tính hợp sinh cao. Việc biến tính
các đầu magnetic hoặc hạt nano, cho phép chúng có thể gắn với protein hoặc DNA và

15. 7
do đó, sử dụng trong các ứnh dụng phát hiện, chẩn đoán và là tiềm năng trong việc
ứng dụng chế tạo các công cụ chẩn đoán và chữa trị hiện đại, ví dụ như trong nhiệt trị
tế bào ung thư [58] mà chỉ có các hạt nano từ tính hợp sinh học mới có thể được sử
dụng. Hoặc việc sử dụng các hạt nano từ tính và các đầu từ (magnetic bead) làm tác
nhân làm mạnh ảnh chụp cộng hưởng từ (MRI) cũng như phát hiện các phân tử sinh
học bằng các sensor từ tính. Một ứng dụng khác có thể kể đến là việc tách chiết các
phân tử sinh học sử dụng hạt nano từ tính là một trong những kỹ thuật trong các
phòng thí nghiệm đang được chuẩn hóa trên toàn thế giới vì ưu điểm tiện lợi, nhanh
và rẻ tiền. Ho và các cộng sự (2010) sử dụng các hạt từ tính gắn kháng thể như một
đầu dò ái lực hiệu quả cho việc làm giàu có chọn lọc các vi khuẩn từ mẫu dung dịch
lỏng [16].
1.3.4. Chấm lượng tử
Chấm lượng tử là những cấu trúc nano tinh thể có thể phát xạ khi bị kích thích
trong một dải tần số ánh sáng nào đó. Các loại chấm lượng tử có cấu trúc nano như
CdSe, CdS, CdTe trong khoảng 200- 10,000 nguyên tử, đặc điểm nổi bật của chấm
lượng tử là thể hiện đặc tính quang học phụ thuộc mạnh vào kích thước và tính chất
điện tử [2].
Hình 1.5. Các hạt nano chấm lượng tử với kích thước khác nhau dưới tía cực tím
(trên) và dưới điều kiện ánh sáng thường (dưới) [61].
Các chấm có thể phát xạ với phổ ánh sáng năng lượng thấp trong một dải rộng,
phổ kích thích liên tục, và hơn nữa, chúng rất bền dưới phản ứng quang hóa. Do đặc
tính quang học phụ thuộc kích thước, tín hiệu phát quang có thể bao gồm toàn bộ phổ
bức xạ vùng nhìn thấy. Đặc điểm này tạo điều kiện cho việc kích thích các chấm
lượng tử với kích thước khác nhau ở cùng một thời điểm và làm cho chúng phù hợp
với vai trò là các đầu dò phát quang cho việc đánh dấu trong hệ thống sinh học [43].
1.4. Hạt nano vàng
Vàng khối (Au) đứng ở vị trí thứ 79th
trong bảng hệ thống tuần hoàn, nó là một
trong những vật liệu đầu tiên được con người khám phá, khai thác và sử dụng. Vàng
sở hữu bốn tính chất nổi bật: kim loại sáng màu vàng, khả năng chống oxi hóa và ăn

16. 8
mòn rất tốt, độ dẻo cao và khối lượng riêng lớn (19.32 g/cm3
). Cấu hình điện tử của
vàng (1s2
2s2
p6
3s2
p6
d10
4s2
p6
d10
f14
5s2
p6
d10
6s1
) quyết định thuộc tính quang học,
hoạt tính hóa học và cấu trúc tinh thể. Vàng khối có cấu trúc tinh thể lập phương tâm
diện (fcc). Mật độ nguyên tử lớn giúp vàng trở nên tương đối khó truyền qua khi bị
tác dụng bởi tia X và nó tương tác mạnh với các điện tử trong các kỹ thuật hiển vi
điện tử quét (SEM) và hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Vàng được sử dụng làm vật
dụng và đồ trang sức quý giá cho con người từ rất xa xưa cho đến ngày nay.
Khi vàng khối thông thường được chế tạo ở kích thước nhỏ mức nano mét,
chúng được gọi là các cấu trúc nano vàng. Hạt nano vàng (AuNPs) là các hạt nano tồn
tại ở dạng dung dịch huyền phù có độ bền cao của các cụm nguyên tử vàng với các
kích thước nằm trong khoảng 1- 100 nm.
Hình 1.6. (A). Vàng khối nguyên chất dạng khối từ quặng. (B) Hạt nano vàng kích
thước 15nm và (C) dung dịch nano vàng do Faraday chế tạo năm 1850[38].
Khi ở kích thước nano mét, AuNPs sở hữu nhiều tính chất lý hóa khác nhau so
với vật liệu vàng khối [2, 12]. Một ví dụ điển hình nhất đó là sự thay đổi màu sắc từ
màu vàng đến đỏ ruby khi vàng khối được chuyển thành các hạt vàng phân tán dạng
hạt có kích thước nano mét.
Hình 1.7. Dung dịch chứa các hạt nano vàng kích thước tăng dần (từ trái qua) [62]
A
B
C

17. 9
Theo thuyết Plasmon, khi trường điện từ của ánh sáng tới đập vào cụm các
nguyên tử vàng, các electron tự do bề mặt (6 electron trong trường hợp AuNPs) tồn
tại trong vùng dẫn của AuNPs dao động qua lại, do đó tạo nên vùng cộng hưởng
plasmon, tại đó có đỉnh hấp thụ trong vùng khả kiến 530-540 nm [26]. Vùng plasmon
bề mặt được sử dụng như một chất chỉ thị cho việc hình thành nên các hạt nano vàng
từ muối của chúng. Độ nhạy của hấp thụ plasmon bề mặt được làm cơ sở cho cơ chế
phát hiện liên quan đến các thiết bị cảm biến sử dụng AuNPs [42].
Các tính chất vật lý của AuNPs phụ thuộc vào kích thước, hình dạng, khoảng
cách giữa các hạt (mật độ) và bản chất của chất hoạt động bề mặt được sử dụng để
ngăn cản việc kết đám giữa các hạt [2]. Theo lý thuyết Mie, hiện tượng cộng hưởng
Plasmon bề mặt bị biến mất khi kích thước hạt nhỏ hơn 2 nm và lớn hơn 500 nm [12].
Các thanh nano vàng (nanorod) có hai dải cộng hưởng plasmon, một dải là cộng
hưởng theo chiều dọc của thanh ở 550-600 nm và một dải còn lại theo chiều vuông
góc với thanh ở 520 nm [33]. Dải bước sóng theo chiều dọc của thanh rất nhạy cảm và
sự thay đổi hệ số tỉ lệ của thanh sẽ thay đổi vùng hấp thụ từ vùng nhìn thấy tới vùng
gần hồng ngoại đỏ (near-infra red-NIR) [32]. Thuộc tính này quang học duy nhất này
của các thanh nano vàng được sử dụng trong chữa trị bằng tia hồng ngoại gần và tán
xạ Raman được kích thích của các phân tử sinh học được hấp thụ . Do đó, bằng việc
thay đổi kích thước và hình dạng của AuNPs, cộng hưởng plasmon có thể phù hợp và
đáp ứng với các ứng dụng trong hiện ảnh tế bào, phân phát thuốc và chữa trị.
Sáu điện tử tồn tại trong vùng dẫn của hạt nano vàng là đặc điểm khiến chúng
trở nên dễ dàng liên kết được với các nhóm thiol và amine [29]. Do đó, AuNPs có thể
dễ dàng được gắn bằng các loại protein hoặc các phân tử sinh học giàu axit amine,
dẫn đến các ứng dụng sinh học quan trọng bao gồm phân phát thuốc hướng đích [44,
52], hiện ảnh tế bào [4], và biosensor [47]. Hơn nữa, các điện tử tự do khiến cho
AuNPs trở nên hữu ích như một tác nhân làm tăng cường độ tương phản [3] . Các
nghiên cứu về hiện ảnh được dựa trên các so sánh về độ tương phản bằng việc thay
đổi mật độ điện tử trong các mô khác nhau. Với mật độ điện tử cao, AuNPs đóng vai
trò như một tác nhân làm tăng độ tương phản một cách tuyệt vời trong việc phát hiện
các khối u, vùng đích trong cơ thể.
1.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano vàng
Nhìn chung, các hạt nano vàng được tổng hợp trong pha lỏng (phương pháp
hóa ướt) bằng việc khử axit chloauric (HAuCl4) mặc dù có rất nhiều các phương
pháp tiên tiến và độ chính xác cao đã được phát triển. Sau khi hòa tan muối HAuCl4,
dung dịch được khuấy nhanh trong khi bổ sung thêm chất khử (natri citrate). Các ion
Au3+ được khử về các nguyên tử Au0. Khi ngày càng nhiều các nguyên tử được tạo
thành, dung dịch trở nên bão hòa, và các nguyên tử vàng bắt đầu kết hợp lại với nhau
để hình thành nên các hạt kích thước bán nano. Các nguyên tử còn lại sẽ tiếp tục bám

18. 10
vào hạt sẵn có, nếu dung dịch được khuấy ở tốc độ phù hợp, các hạt sẽ tồn tại ở dạng
đồng đều và bền trong môi trường lỏng và ở dạng huyền phù.
Để ngăn cản sự kết đám của các hạt nano vàng, các tác nhân làm bền cũng
được sử dụng để bọc lên bề mặt hạt. Các hạt cũng có thể được biến tính bằng với các
loại phân đoạn hữu cơ khác nhau để tạo nên dạng hạt lai hữu cơ -vô cơ với những
chức năng tiêu biểu [49]. Các hạt nano vàng cũng có thể được tổng hợp bằng phương
pháp bắn phá laser.
1.5.1. Phương pháp Turkevich
Phương pháp này được phát minh bởi J. Turkevich và các cộng sự vào vào
năm 1951 [18, 24] và sau đó được cải tiến bởi G. Frens vào những năm 1970 [13], và
là một phương pháp tổng hợp dung dịch nano vàng đơn giản nhất tính cho đến thời
điểm hiện tại. Nhìn chung, phương pháp này tạo ra các hạt nano vàng đơn phân tán
hình cầu tan trong nước với kích thước đặc trưng từ 10-20 nm. Các hạt lớn hơn cũng
có thể được tạo ra bằng phương pháp này nhưng sẽ mất nhiều quy trình công nghệ
hơn trong việc duy trì tính phân tán cũng như hình dạng hạt. Quy trình tạo hạt nano
vàng liên quan đến phản ứng giữa một lượng dung dịch nóng chloauric HAuCl4 với
dung dịch natri citrate. Hạt nano vàng sẽ hình thành bởi vì các ion citrate sẽ bao xung
quanh bề mặt lõi vàng, nó đóng cả hai vai trò làm tác nhân khử cũng như tác nhân
làm bền hạt nano.
Hình 1.8. Phản ứng tạo hạt nano vàng theo Turkevich
Để tạo ra các hạt nano vàng lớn hơn, yêu cầu một lượng citrate ít hơn (có thể
dưới 0.05% và tuy nhiên, một lượng citrate quá nhỏ sẽ không thể kích thích phản ứng
khử hết các ion Au3+).
Việc khử bởi một lượng natri citrate sẽ giảm lượng ion citrate
sẵn có cho việc bọc xunh quanh hạt nano vàng, điều này sẽ làm cho các hạt nhỏ kết
đám với nhau và tạo nên những hạt lớn hơn (cho đến khi tổng diện tích bề mặt của
các hạt trở nên đủ nhỏ để được bọc bởi tất cả các ion citrate tồn tại trong dung dịch).

19. 11
1.5.2. Phương pháp Brust
Phương pháp này được phát hiện bởi Brust và Schiffrin vào đầu những năm
1990 [37] và có thể được sử dụng để tổng hợp các hạt nano vàng trong dung môi hữu
cơ mà thông thường không thể trộn lẫn trong nước (như toluence). Phản ứng đặc của
phương pháp giữa axit chloauric và tetraoctylammonium bromide (TOAB) trong
toluence và natri borohydrate đóng vai trò lần lượt như chất chống kết tủa và chất
khử.
Các hạt nano vàng chế tạo theo phương pháp này có kích thước trung bình 5-6
nm. NaBH4 đóng vai trò tác nhân khử, trong khi TOAB đóng vai trò là chất xúc tác
chuyển pha và chất làm bền. Một điều quan trọng là TOAB không bọc xung quanh
hạt nano một cách vững chắc, nhưng dung dịch sẽ bị kết tủa sau khoảng thời gian 2
tuần. Để hạn chế hiện tượng này, một tác nhân làm bền mạnh có thể được sử dụng
như thiol (alkanethiol), có thể liên kết cộng hóa trị với hạt nano vàng, tạo ra một dung
dịch gần như vĩnh cửu. Alkanethiol bảo vệ hạt nano vàng có thể bị kết tủa nhưng sau
đó sẽ được hòa tan lại. Một số tác nhân chuyển pha có thể duy trì việc bọc với các hạt
nano sau khi đã làm sạch, việc này có thể gây ảnh hưởng đến thuộc tính vật lý của hạt
như tính tan.
1.5.3. Phương pháp Perrault
Phương pháp này được phát minh bởi Perrault và Chan trong năm 2009 [51], sử
dụng hydroquione để khử HAuCl4 trong dung dịch có chứa sẵn các hạt nano vàng.
Phương pháp này tương tự với phương pháp sử dụng trong việc phát triển film tạo
ảnh, trong đó các hạt bạc (Ag) bên trong film lớn dần lên trong khi có sự bổ sung của
các nguyên tử bạc được khử ngay trên bề mặt. Tương tự như thế, các hạt nano vàng
có thể đóng vai trò là chất cầu nối với hydroquinone để xúc tác việc khử các ion vàng
trên bề mặt. Sự tồn tai các chất ổn định như các ion citrate có thể tạo ra việc mọc các
hạt có kiểm soát. Phương pháp này có thể tạo ra các hạt nano với kích thước rất lớn trong
khoảng 30-250 nm.
1.5.4. Phương pháp Martin
Phương pháp này được phát minh bởi nhóm Eah vào năm 2010 [39], phương
pháp này tạo ra các hạt nano vàng dạng “trần” trong nước bằng việc khử HAuCl4 với
NaBH4 Mặc dù không sử dụng các chất hoạt động bề mặt như citrate, các hạt nano
vàng phân tán rất bền. Phân bố kích thước gần như đơn phân tán với đường kính có
thể chính xác và tái tổng hợp trong khoảng 3.2 đến 5.2 nm. Chìa khóa cho việc làm
bền HAuCl4 và NaBH4 trong dung dịch stock với HCl và NaOH lần lượt trong hơn 3
tháng và hơn 3 giờ. Hơn nữa, tỷ số của các ion NaBH4-NaOH với HAuCl4-HCl phải
được kiểm soát chính xác trong vùng gọi là “sweet zone”. Các hạt nano “trần” được
bọc với một đơn lớp 1-dodecanethiol và sau đó chuyển pha thành hexane bằng việc
lắc hỗn hợp của nước, acetone và hexane trong 30 giây. Do đó, tất các sản phẩm phản

20. 12
ứng kết hợp tồn tại ở pha nước-acetone. Lượng 1-dodecanethiol chỉ chiếm 10%
nguyên tử vàng trong tổng số. Tất cả các quy trình phản ứng này chỉ mất dưới 10
phút.
Những hạt nano vàng được bọc bởi lớp phân tử hữu cơ kỵ nước có tính chất
đặc biệt cho khả năng tự sắp xếp 2 chiều và tính điện trong dung môi không phân cực.
Chúng nổi lên ra ngoài phía bề mặt của hạt toluene trong không khí và hình thành
một lớp màng mỏng, và hình thành nên đơn lớp và có thể phủ lên bất kỳ loại đế nào
khi toluence bay hơi mà không cần bất kỳ thiết bị phức tạp nào. Loại màng đơn lớp
chứa các hạt nano vàng gần như đồng đều ở tất cả các kích thước nm, µm và mm,
phương pháp này không hạn chế về kích thước chế tạo, do đó nó có thể bao phủ bề
mặt của cả miếng silicon tới 3 inch.
Việc kiểm soát kích thước chính xác trong khoảng 3.2 – 5.2 nm rất quan trọng
cho cả việc chuyển pha của các hạt nano vàng từ nước sang toluence và sự sắp xếp
chiều của chúng trên giọt toluence.
1.5.5. Phương pháp rung siêu âm (sonolysis)
Một phương pháp khác được sử dụng để tạo ra các hạt nano vàng đó là phương
pháp rung siêu âm. Phương pháp này dựa trên việc sử dụng sóng siêu âm, nó kích
thích phản ứng giữa muối vàng chloauric và dung dịch glucose, các tác nhân khử là
các nhóm hydroxyl (hình thành giữa khư vực biên giới của giữa các lỗ trống hỗn loạn
và nước dạng khối). Dạng hình thái hạt nano vàng đạt được là các dây nano dạng
mảnh (nanoribbon) với chiều rộng khoảng 30-50 nm và chiều dài lên tới vài
micromets. Những dải dây nano này rất dẻo và linh hoạt và có thể uốn cong với góc
lớn hơn 900. Khi glucose được thay thế bởi cyclodextrin (một loại phân đoạn của
glucose) thì có các hạt nano hình cầu được hình thành, điều này chứng minh cho
viêcn glucose đóng vai trò rất quan trọng trong việc quyết định hình thái và kích
thước của cấu trúc nano vàng.
1.6. Các ứng dụng trong y sinh học của AuNPs
Hạt nano vàng là một vật liệu quý, ít nhất là ở kích thước nano mét, chúng thu
hút được chú ý rất lớn của các nhà khoa học cùng với vô số những ứng dụng đang gia
tăng hàng ngày.
Một trong những lĩnh vực đã được phát triển rất mạnh trong những thập kỷ qua
đó là việc sử dụng các hạt nano vàng trong lĩnh vực y sinh học hay khoa học sự sống.
Những ứng dụng y sinh này có thể chia thành bốn lĩnh vực: đánh dấu sinh học, phân
phát thuốc, đốt nhiệt và cảm ứng [54].

21. 13
Hình 1.9. AuNPs có rất nhiều ứng dụng trong sinh học, bao gồm phép nhuộm đặc
hiệu, phân phát thuốc và DNA vào tế bào [54].
1.6.1. Đánh dấu sinh học
Thuộc tính nổi bật và tiêu biểu nhất của AuNPs được khai thác đó là tạo ra độ
tương phản và làm mạnh tín hiệu màu. Ví dụ trong kính hiển vi điện tử truyền qua,
đặc tính hấp thụ mạnh điện tử của hạt nano vàng khiến chúng trở nên vật liệu phổ
biến và thích hợp nhất cho việc nhuộm để tăng cường tính tương phản của các vật
liệu hấp thụ kém điện tử. Kích thước nhỏ của chúng và khả năng chức năng hóa của
hạt, có thể ứng dụng trong việc gắn với các kháng thể (immunostaining), nghĩa là
chúng có thể cung cấp độ phân giải rất cao và đặc biệt trong rất nhiều ứng dụng đánh
dấu sinh học khác. Tương tự như thế, đặc tính quang học- khả năng hấp thụ mạnh, tán
xạ và đặc biệt là cộng hưởng Plasmon bề mặt giúp chúng trở nên công cụ hữu ích
trong các kỹ thuật ứng dụng hiệu ứng quang học bao gồm các sơ đồ kết hợp gồm hiện
ảnh nhiệt-quang (photo-thermal), hay quang-thanh (photo-acoustic imaging). Hơn
nữa, các hạt nano vàng có thể được đánh dấu phóng xạ bởi các kích thích neutron,
cho phép việc phát hiện ở mức độ cực nhạy và được sử dụng như một tác nhân làm
tăng độ tương phản của tia X.
1.6.2. Phân phát thuốc và chuyển gen
Các hạt nano vàng có thể đóng vai trò như thụ thể mang cho các ứng dụng
phân phát thuốc và chuyển gen. Các phân tử hoạt hóa sinh học được hấp thụ lên bề
mặt của hạt nano vàng có thể được dẫn đường vào các tế bào và được giải phóng. Vận
chuyển DNA, là một nguyên tắc cơ bản của liệu pháp gen. Khả năng hấp thụ mạnh
ánh sáng của hạt nano vàng cho phép chúng trở nên phù hợp với các đối tượng môi
trường kích thích nhiệt; năng lượng hấp thụ ánh sáng được tiêu tan vào các hạt xung
quanh, làm tăng nhiệt độ của môi trường xunh quanh. Hiệu ứng này có thể được sử
dụng để mở các viên nang polymer dạng bọc kích thước micro, ví dụ cho mục đích
phân phát thuốc. Những thuộc tính khác như các hạt được chức năng hóa như nhau, có

22. 14
thể gắn đặc hiệu với các tế nào cụ thể nào đó, ứng dụng này rất quan trọng trong các
ứng dụng điều trị như bệnh ung thư hay nhiệt điều trị bằng cách nung nóng các mô có
sẵn các hạt nano để phá hủy các tế bào ung thư ác tính. Tuy nhiên, đối với các ứng
dụng in vivo những yếu tố gây độc của các hạt nano lại đang trở thành vấn đề nổi
cộm cần quan tâm và cần được nghiên cứu kỹ lưỡng với sức khỏe. Mặt khác, người ta
chưa biết được khả năng ảnh hưởng của của các hạt nano này khi tồn tại trong môi
trường tới vi sinh vật và hệ thống sinh thái.
1.6.3. Sensor sinh học
Các thuộc tính quang học của chúng có thể thay đổi khi gắn với phân tử sinh
học cụ thể, cho phép phát hiện và định lượng phân tích. Phổ hấp thụ của hạt nano
vàng có thể thay đổi đột ngột khi các hạt trở nên co cụm với nhau. Sự co cụm của các
hạt ảnh hưởng đến chất lượng của các sản phẩm này đã thương mại hóa nhưng nó có
thể cực kỳ hữu dụng trong ứng dụng phát hiện DNA với độ nhạy cực cao, thậm chí
chỉ là vài cặp DNA liên kết bổ sung lỗi.
Một chiến lược khác cho việc sản xuất sensor là hiệu ứng dập tắt huỳnh quang.
Các phân tử huỳnh quang được kích thích và gần các hạt AuNPs có thể truyền năng
lượng của chúng vào kim loại tạo nên một sự hồi phục không phát xạ của các chất
huỳnh quang. Trong một số các sơ đồ phát hiện khác, chất phân tích thay thế các phân
tử huỳnh quang từ bề mặt của các hạt hoặc thay đổi sự hình thành của chúng, mục
đích để sự paths quang của những phân tử reporter bị thay đổi trong sự xuất hiện của
chất phân tích. Trong khi rất nhiều các thuộc tính quang học khác của hạt nano vàng
đã được khai thác trong những ứng dụng gần đây, vẫn còn vô số các ứng dụng tiềm
năng mà chúng ta chưa khai thác hết. Điều này sẽ cuối cùng dẫn đến các phép phân
tích được thiết lập kỹ lưỡng, quy trình hiện đại cho việc đa dạng các ứng dụng sinh
học trong tương lai gần.
1.7. Kit chẩn đoán bệnh bằng que thử nhanh
1.7.1. Giới thiệu
Một ứng dụng phổ biến sử dụng hạt nano vàng, đó là phép thử sắc ký đặc hiệu
(Immunochromatographic assays) hay còn được gọi là que thử nhanh (flow lateral
test trip) dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể và hiện tượng
mao dẫn trong các ống nhỏ của màng mỏng. Đây là công nghệ được mở rộng từ kỹ
thuật ngưng kết hạt latex lần đầu tiên được phát triển vào năm 1956 bởi Singer và
Plotz [56].
Que thử nhanh thực chất là một thiết bị dùng để kiểm tra thiết kế theo kiểu one-
step và dễ dàng sử dụng. Ưu điểm nổi bật của thiết bị này là thời gian kiểm tra nhanh,
giá thành rẻ và đặc biệt người sử dụng không đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao do đó nó
phù hợp cho những ứng dụng cách xa phòng thí nghiệm. Thiết bị que thử nhanh cho
kết quả của phép thử có hoặc không. Hơn nữa, que thử có thể được bảo quản trong

23. 15
thời gian dài mà không cần đến tủ lạnh, điều này mang lại hiệu quả đối với những khu
vực thiếu thốn thiết bị.
1.7.2. Sơ đồ nguyên lý của que thử nhanh
Que thử nhanh bao gồm có 6 bộ phận cơ bản (Hình 1.10):
Hình 1.10. Mô hình que thử nhanh cơ bản [63]
Nguyên lý chung của que thử nhanh hiện nay dựa trên sự chuyển động của mẫu
chất lỏng qua khu vực dùng để phát hiện, tại đó các phân tử phản ứng đặc hiệu với
chất phân tích và cho ra tín hiệu màu. Một que thử nhanh điển hình bao gồm có:
màng, sample pad, conjugate pad và adsorbent pad như mô tả trên hình 1.9. Màng có
thể được chế tạo từ nitrocellulose [35, 46], nylon [6], polyethersulfone [21], hoặc
polyethylene [22]. Dạng màng phổ biến nhất được sử dụng là nitrocellulose với kích
thước ống nhỏ trong màng là 0.05 đến 12 µm. Sample pad được gắn ở phần cuối của
màng và thường được làm từ cellulose hoặc cross-linked silica. Conjugate pad được
đặt ở vị trí tiếp xúc với sample pad và màng. Chất dùng để đánh dấu hoặc các thành
phần dùng cho việc nhận biết mẫu phân tích được làm khô trên khu vực này, sẽ tương
tác đặc hiệu với vật liệu có trong mẫu phân tích lỏng. Các chất đánh dấu cho việc phát
hiện có thể là các hạt nano vàng (Au), các hạt latex khô [15], selenium, carbon, hoặc
liposome [59]. Việc sử dụng các hạt nano được công bố lần đầu tiên bởi Leuvering và
cộng sự [30] vào năm 1980 và ngày nay chúng được sử dụng phổ biến cho việc đánh
dấu. Đối với việc phân tích một đối tượng cụ thể, hai vạch được cố định lên màng:
một vạch kiểm tra (test line) cho ra kết quả kiểm tra và vạch kiểm soát (control line)
dùng để xác nhận chất phân tích đã chảy qua màng phân tích. Đối với phép kiểm tra
cho nhiều đối tượng khác nhau, có thể sử dụng nhiều vạch kiểm tra khác nhau. Chất

24. 16
lỏng di chuyển ngược lên màng do lực mao dẫn của màng và dừng lại ở absorbent
pad ở đầu cuối của màng.
Hình 1.11. Một mẫu que thử nhanh thương mại sử dụng hạt nano vàng
Khi kháng thể được sử dụng cho việc phát hiện bệnh trong mẫu, phép thử được
gọi là “lateral flow immunoassays”. Chúng dùng để kiểm tra xem có hay không bệnh
trong mẫu. Những năm gần đây, que thử nhanh trở nên là một thiết bị phân tích hữu
hiệu có sẵn trên thị trường cho việc phát hiện các loại hormone, virus, hợp chất độc
hại, chất làm rối loạn trao đổi chất. Hai dạng thiết kế phổ biến được sử dụng. Kiểu
sandwich (possitive assay) được thiết kế cho các mẫu phân tích có nhiều hơn một
epitope được phát hiện bởi hệ thống miễn dịch, đặc biệt là kháng thể. Đối với kiểu
định dạng này, vạch kiểm tra sử dụng kháng thể đơn dòng và cường độ của chúng
tương ứng trực tiếp với lượng chất cần phân tích có trong mẫu. Thứ hai, kiểu cạnh
tranh (negative assay) được thiết kế với các chất cần phân tích có khối lượng phân tử
nhỏ hơn 1000 Da và có chỉ một epitope. Vạch kiểm tra trong phép phân tích này có
thể là kháng thể kháng lại chất cần phân tích (anti-analyte antibody) hoặc chất gắn kết
chất phân tích-protein (analyte-protein conjugates). Kết quả trên vạch kiểm tra sẽ đậm
màu nhất nếu như không có mặt có chất cần phân tích vì mối quan hệ nghịch đảo giữa
nồng độ của chất cần phân tích và sự hình thành chất mầu.
Chẩn đoán dùng que thử nhanh giúp giảm thiểu thời gian kiểm tra, mang lại sử
thuận tiện và hướng tới thị trường. Hơn nữa kiểu mô hình kiểm tra này cho tín hiệu
mạnh hơn, thời gian kiểm tra ngắn so với các phép kiểm tra khác dựa trên nguyên lý
miễn dịch như miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay), miễn dịch liên kết enzyme
(enzyme linked immunoassay).

25. 17
1.8. Kháng thể
1.8.1. Giới thiệu chung
Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (Ig) có trong huyết thanh của động
vật có vú, có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó.
Kháng thể có bản chất protein và bị biến tính bởi các tác nhân hóa học, hóa lý và sinh
học.
Hình 1.12. Cấu Trúc của kháng thể
Tất cả các dạng kháng thể đều có cấu tạo giống nhau do một hay nhiều đơn vị
monomer tạo thành, có dạng hình chữ Y. Đơn vị cơ bản của phân tử kháng thể gồm 4
chuỗi polyleptit hai chuỗi nặng có trọng lượng phân tử lớn (2H) và hai chuỗi nhẹ có
trọng lượng phân tử lượng thấp (2L) nối với nhau bằng liên kết cộng hóa trị (-S-S-)
và liên kết không cộng hóa trị.
Chuỗi nặng gồm vùng biến đổi VH, vùng đa dạng D, vùng liên kết JH và vùng
cố định CH trong khi đó chuỗi nhẹ có VL, JL và CL. Một cặp chuỗi nặng có vùng V-D-
J và chuỗi nhẹ là V-J tạo nên vị trí bám của kháng thể nơi nhận diện ra vị trí gắn kết
kháng nguyên.
Kháng thể có hai đặc tính hữu dụng: tính đặc hiệu và tính ghi nhớ. Tính đặc
hiệu thể hiện ở việc mỗi loại kháng thể chỉ liên kết và tấn công một loại kháng
nguyên nhất định. Loại kháng thể đó được gọi là kháng thế đơn dòng. Kháng thể đơn
dòng chủ yếu được ứng dụng trong việc chẩn đoán bệnh. Hai công trình tiêu biểu
trong số nhiều công trình mà sử dụng kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán là:
Gần đây, Jianfeng Chen (năm 2007) [20] và các đồng sự đã thành công trong
việc phát hiện nhanh cúm gia cầm H5N1 từ dịch niệu gà, miếng gạc khí quản và các
mô. Ở đây họ đã sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với glycoprotein HA của
H5N1 để gắn lên nhóm cacboxyl của hạt latex bằng các nhóm cacbondiimide tan

26. 18
trong nước để tạo nên các “hạt latex nhạy”. Phương pháp này có khả năng phát hiện
đặc hiệu sự có mặt của H5N1 trong dịch niệu mà không có mặt các tuýp khác như
H1N1, H3N2, H4N6, và H9N2.
1.8.2. Giới thiệu về vùng biến đổi của kháng thể (Single Chain Variable
Fragmet-scFv)
Kỹ thuật phage display ra đời vào năm 1985 bởi Smith và các cộng sự [53] và
đã trở thành một trong những kỹ thuật được nghiên cứu cũng như ứng dụng triển khai
mạnh mẽ. Đoạn ADN mã hóa cho mảnh scFv được tạo ra bằng kỹ thuật này và chứa
trong thư viện phage display. Kháng thể tái tổ hợp được tạo ra theo phương pháp này
có thể dễ dàng và nhanh chóng phát triển ở một tiêu chuẩn cao và được tạo ra mà
không cần phải có sự tham gia của hệ thống miễn dịch.
ScFv là sự kết hợp của những vùng khác nhau của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của
IgG thông qua một cầu nối ngắn, thường là serine hoặc glycine. Để tạo ra scFv trong
thư viện phage display về nguyên tắc thì cơ bản giống với phương pháp tạo ra các
kháng thể tái tổ hợp khác trong thư viện. Các gen mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ
sẽ được lấy ra từ tế bào lympho B thông qua quá trình sao chép ngược. Khuếch đại các
đoạn gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ bằng phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm
PCR bằng enzim giới hạn và tách dòng gen đó ra. Sau đó gắn vào một gen đơn sử dụng
một mảnh ADN nối. Mảnh ADN scFv lắp ráp này sẽ được cài vào trong một vector
phagemid và phagemid tái tổ hợp này sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli
thông qua phương pháp biến nạp bằng sốc nhiệt hay xung điện.
Hiện nay đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về scFv và phạm vi ứng dụng
của nó ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: sinh học, y học. Do mới ra đời nên
những nghiên cứu về ứng dụng của scFv vẫn chưa được nghiên cứu nhiều nhưng
những ứng dụng của scFv là khá quan trọng vì vậy nghiên cứu scFv giúp chúng ta tạo
ra được kháng thể đơn dòng cho phép sử dụng trực tiếp trong việc điều trị bệnh và chẩn
đoán bệnh.

27. 19
Hình 1.13. Sơ đồ tạo scFv
1.9. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1
Cúm (Influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tính thường xảy ra vào mùa đông, ở
vùng khí hậu ôn đới; tuy nhiên, bệnh cũng có thể xuất hiện hai lần trong một năm ở
vùng nhiệt đới. Bệnh cúm do virus thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Họ
Orthomyxoviridae được chia thành 4 nhóm: virus cúm A (Influenza A virus), virus
cúm B (Influenza B virus), virus cúm C (Influenza C virus) và Thogotovirus. Các
nhóm này được phân biệt bởi nucleoprotein NP và M. Ba nhóm đầu gây nên các kiểu
bệnh cúm tương ứng là: cúm A, cúm B và cúm C. Cúm B chỉ gây nhiễm trên người,
tạo ra những dịch nhẹ và rải rác. Virus cúm C gây bệnh trên người và cũng được tìm
thấy ở một số lợn tại Trung Quốc; không thấy biểu hiện nguy hiểm cho người. Trái
lại, virus cúm A, với nhiều phân tuýp khác nhau, gây nhiễm trên người, gia cầm và rất
nhiều loài động vật có vú, tạo nên những đại dịch kinh hoàng trong lịch sử.
Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các
vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1
thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003
cho đến nay và phát sinh nhiều dưới dòng (sublineage) và nhóm/phân nhóm
(clade) có độc lực rất cao. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên
gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Có thể gọi cúm A/H5N1 phân
lập năm 1959 tại Scotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck-
Scotland-(59)(H5N1) (số đăng ký: X07869). Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đến
nay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh),
Tế bào lympho B
Chuỗi H cADN
Chuỗi H mARN Chuỗi L mARN
Sao chép ngược
420
C, 15 phút
PCR, 30 chu kỳ
940
C, 1 phút
550
C, 2 phút
720
C, 2 phút
ADN nối
PCR, 7 chu kì
940
C, 1 phút
680
C, 4 phút
Mảnh ADN mã hóa scFv
Chuỗi L cADN

28. 20
loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có
nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 trước đây. Nhằm
ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế giới đã có hàng
trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và
kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1, mỗi năm một
cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức
Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp
mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243 trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt
Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do
virus cúm A/H5N1 trên thế giới. Tính gây bệnh của A/H5N1 thể độc lực cao
không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà
là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính
gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Hàng ngàn công trình
nghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5 năm
gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và (các loại) vaccine gây miễn dịch cho
gia cầm và chuẩn bị cho đại dịch có thể xảy ra ở người.
Trước tình hình lây lan của dịch cúm A/H5N1. Trên thế giới cũng như ở
Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu như:
Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm
A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng
đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp xác định
phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã
và công bố trên Ngân hàng gen. Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc
phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có
nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông
(Trung Quốc), đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông [28]. Như vậy, virus
cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc
thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc
với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông [53]. Các chủng phân lập
những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ
phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng
Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-
Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc
và Hồng Kông. Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại
Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên
và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các
chủng phân dòng Quảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch.

29. 21
Với khả năng lây nhiễm nhanh và tính chất nguy hiểm của virus cúm A/H5N1,
việc phòng chống cũng như dập tắt dịch đóng vai trò rất quan trọng. Để phát hiện cũng
như dập dịch ngay tại hiện trường, thì vai trò của các phương pháp chẩn đoán, phát
hiện bệnh trở nên vô cùng quan trọng, trong đó các loại kit chẩn đoán nhanh với ưu
điểm dễ sử dụng, thời gian kiểm tra nhanh, tính di động cao là rất cần thiết.
Trên cơ sở khoa học và thực tiễn của đề tài tại Việt Nam hiện nay, xu hướng
nghiên cứu và phát triển các thành tựu từ công nghệ nano đang trở nên hấp dẫn và có
những ứng dụng khả quan trong lĩnh vực y sinh học. Quy trình chế tạo hạt nano vàng
thuận tiện với các đặc tính quang học đặc trưng phù hợp trong đánh dấu sinh học, làm
tiền đề cho việc chế tạo các kit chẩn đoán nhanh các bệnh cấp tính lây lan nhanh được
coi là hướng nghiên cứu chính của các nhà khoa học. Việc chủ động tạo nguồn kháng
thể được phân lập tại các phòng thí nghiệm trọng điểm, từ đó làm cơ sở cho việc chế
tạo nên các kit chẩn đoán nhanh với chi phí rẻ, dễ sử dụng và có thể được sử dụng rộng
rãi tại tất cả các vùng miền trên cả nước. Do đó, việc thực hiện đề tài cũng là bước đầu
đặt cơ sở cho việc nghiên cứu, chế tạo và hoàn thiện kit chẩn đoán nhanh sử dụng hạt
nano vàng gắn kháng thể cúm, đặc biệt là công nghệ chế tạo que thử nhanh sử dụng
phức hợp kháng thể/nano vàng nhằm phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 có ý nghĩa
khoa học và thực tiễn cao.

30. 22
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Kháng thể scFv đã được sàng lọc trong thư viện bằng kỹ thuật phage display,
có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HA của virus cúm gia cầm A/H5N1
do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp. Mẫu kháng nguyên của virus cúm
A/H5N1 được cung cấp bởi phòng Vi sinh phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Khoa học công nghệ Việt Nam.
Hóa chất: muối vàng chloroauric (HAuCl4, 99,9%, Roth), natri citrate
(C6H5O7Na3, 99,9%, Roth), nước khử ion, và các hóa chất thông dụng trong sinh học
phân tử được cung cấp bởi các hãng.
Các thiết bị: Bếp khuấy từ, máy li tâm, thanh khuấy từ, bình tam giác, ống
nghiệm thủy tinh, màng nitrocellulose, máy ảnh, pipette, găng tay, máy đo độ pH.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chế tạo dung dịch nano vàng (AuNPs)
Phương pháp tổng hợp Turkevich [58] dựa trên nguyên tắc khử ion Au3+
bằng
natri citrate được ông và các cộng sự tiến hành năm 1951, đây là phương pháp khử
hóa học thuận tiện có thể tổng hợp dung dịch hạt nano vàng thể huyền phù với các hạt
đơn phân tán, có kích thước dao động ~ 20nm. Ưu điểm của phương pháp này là tạo
ra các hạt nano vàng hình cầu với độ phân tán cao, quá trình khử bằng citrate sẽ tạo ra
một lượng ion (–) citrate bám xung quanh hạt nano bằng lực hút tĩnh điện làm cho bề
mặt của chúng được tách rời nhau ngăn cản chúng liên kết với nhau để tạo thành
những hạt lớn hơn, các hạt AuNPs sau khi được tổng hợp sẽ có sẵn những nhóm chức
carboxyl (–COOH ) sẵn trên bề mặt. Về mặt sinh học, đây là một ưu điểm rất thuận
lợi để có thể gắn các hạt nano với các phân tử sinh học như DNA, RNA, các phân tử
kháng thể... mà không cần qua một quá trình biến tính hóa học phức tạp nào khác và
có thể được dùng trong các ứng dụng chế tạo kit chẩn đoán nhanh một số loại bệnh,
các ứng dụng khác có liên quan.
Phương trình phản ứng và cơ chế phản ứng cho việc khử ion Au3+
thành Au0
được minh họa như bên dưới:
2 HAuCl4 + 4 Na3C6H5O7  H2 + 2 Au0
+ 4 CO2 + 4NaC5H5O5 + 8NaCl
Tiến trình của phản ứng:
1. HAuCl4 + Na3C6H5O7 Na2C6H6O7 + AuCl3
2. HAuCl4 + Na2C6H6O7 NaC6H6O7 – AuCl2
3. NaC6H6O7 – AuCl2 + Na3C6H5O7 CO2 + Na2C6H6O7 + NaC5H5O5 + AuCl
– NaCl
– NaCl
– NaCl

31. 23
4. Na2C6H6O7 + AuCl NaC6H6O7 – Au
5. 2 NaC6H6O7 – Au H2 + 2Au0
+ 2CO2 + 2 NaC5H5O5
Sau đó các hạt nano vàng sẽ được hình thành thông qua các giai đoạn: hình
thành nhân, mọc thành hạt và sự ổn định hạt.
Quá trình chế tạo dung dịch AuNPs có thể được minh họa theo sơ đồ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng hóa học tạo hạt nano vàng theo phương pháp khử của
Turkevich [64].
Cơ chế của phản ứng:
Khi bắt đầu hình thành nhân (nucleation) của phản ứng, tất cả các hạt nano
vàng ở kích thước rất nhỏ và đồng đều nên dung dịch có màu tím sẫm. Tuy nhiên sự
cực tiểu hóa năng lượng bề mặt khiến các hạt này trở nên co cụm và tập trung vào
nhau. Tại cùng thời điểm đó các ion citrate tích điện âm được giải phóng trong suốt
quá trình khử gắn vào bề mặt của hạt nano vàng và ngăn cản các hạt tiếp tục co cụm
lại với nhau. Các ion citrate đóng vai trò chất hoạt động bề mặt và kìm hãm sự co
cụm của các hạt nano vàng, nếu dung dịch được khuấy liên tục và giả thiết rằng dung
dịch là đồng nhất thì các hạt nano sẽ tiếp tục co cụm với nhau và phát triển cho tới khi
tất cả diện tích bề mặt của hạt nano vàng được bọc hoàn toàn bởi các ion citrate, tại
thời điểm này kích thước các hạt sẽ không tăng thêm nữa. Do đó, nếu có càng nhiều
ion citrate thì chúng sẽ có thể che phủ bề mặt lớn hơn của các hạt nano vàng, điều này
đồng nghĩa với việc tạo ra các hạt nhỏ hơn. Do đó, việc thay đổi lượng citrate trong
phản ứng có khả năng được dùng để kiểm soát kích thước hạt nano vàng.
Hình 2.2. Kích thước và hình dạng của hạt nano vàng theo thời gian phản ứng trong
khoảng thời gian t=10giây đến t=120giây [19].
– NaCl

32. 24
Sự thay đổi màu của dung dịch quan sát được trong suốt thời gian phản ứng là
do việc hấp thụ photon do cộng hưởng Plasmon bề mặt của các hạt nano vàng trong
vùng ánh sáng nhìn thấy. Hiện tượng này chỉ xảy ra ở ranh giới của chất dẫn điện
(nano vàng) và chất dẫn điện. Tùy thuộc vào kích thước, thành phần hóa học, hình
thái của bề mặt, tương của dao động Plasmon với photon sẽ khác nhau. Các photon
với bước sóng xác định sẽ được truyền qua, hay hấp thụ và bị phản xạ. Đặc tính này
chỉ xảy ra trong kích thước nano mét, đối với hạt nano vàng nhỏ hơn 100 nm, bước
sóng ánh sáng bị phản xạ sẽ rơi vào trong khoảng ánh sáng nhìn thấy. Khi càng giảm
kích thước hạt, các bước sóng lớn hơn sẽ bị phản xạ, và màu của hạt sẽ dịch tới khu
vực cuối của violet của dải ánh sáng nhìn thấy.
Mục đích của chúng tôi là chế tạo được dung dịch AuNPs thể huyền phù với các
hạt có kích thước ~ 20 nm có gắn sẵn nhóm chức –COOH trên bề mặt hạt nano để sẵn
sàng gắn với các phân tử kháng thể đồng thời màu đỏ đặc trưng của dung dịch nano do
hiệu ứng cộng hưởng plasmon phải đủ độ “mạnh” cho mục đích đánh dấu sinh học với
mật độ hạt nhất định, màu đỏ đặc trưng của dung dịch sẽ đóng vai trò như một sensor
màu.
Quy trình tổng hợp hạt AuNPs như sau:
- Dùng pipette nhỏ 100 µl dung dịch muối vàng chloauric (HAuCl4) 5% vào một
bình tam giác chứa 80 ml nước khử ion. Bình được đặt trên bếp khuấy từ gia nhiệt
và đun đến khi dung dịch bắt đầu sôi.
- Thanh khuấy từ được đặt trong bình tam giác khi bắt đầu phản ứng và khuấy ở
1200 vòng/phút. Nhỏ lượng dung dịch natri citrate (C6H5O7Na3) 1% thích hợp vào
trong bình khi tiếp tục gia nhiệt. Phản ứng bắt đầu xảy ra.
- Trong khoảng 20 giây, dung dịch bắt đầu chuyển sang màu tím sẫm. Tại thời điểm
này phản ứng kết tủa các hạt Au0
đã bắt đầu hình thành.
- Tiếp tục gia nhiệt và khuấy trong 20 phút. Trong suốt thời gian phản ứng này, màu
của dung dịch sẽ chuyển sang sẫm màu hơn giữa tím và da cam tùy thuộc vào tỉ số
giữa C6H5O7Na3và HAuCl4 được sử dụng trong phản ứng.
- Khi phản ứng đã đạt tới thời gian sau 20 phút, chuyển ngay bình phản ứng ra khỏi
bếp khuấy từ và nhúng ngay vào nước đá. Khi bị làm lạnh đột ngột, phản ứng hóa
học sẽ dừng lại và kích thước hạt sẽ không bị thay đổi nhiều.
Sự tồn tại của các hạt keo vàng có thể được nhận ra bởi việc chiếu chùm tia
laser phân cực và dung dịch. Khi chùm tia phân cực chiếu vào dung dịch, chúng ta có
thể nhìn thấy chùm sáng theo một hướng nhất định, nó sẽ biến mất nếu quan sát theo
một hướng trực giao với phương vừa quan sát.

33. 25
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu các nhân tố ảnh hướng đến chất lượng mẫu
Để đánh giá chất lượng của mẫu dung dịch nano vàng với các thống số kỹ
thuật phù hợp cho công việc của luận văn như: kích thước hạt đồng đều, hiệu ứng
màu đặc trưng của dung dịch trên hiện tượng cộng hưởng plasmon, độ bền của dung
dịch theo thời gian…chúng tôi đã nghiên cứu sự phụ thuộc của chúng vào các điều
kiện phản ứng khác nhau như: thời gian phản ứng, thay đổi lượng chất khử natri
citrate, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản.
2.2.2.1. Thời gian phản ứng
Chúng tôi tiến hành tổng hợp các dung dịch AuNPs khác nhau với cùng lượng
muối vàng HAuCl4, chất khử Na3C6H5O7Na3 nhưng trong các khoảng thời gian phản
ứng khác nhau, thay đổi lần lượt trong khoảng từ 2 đến 40 phút phản ứng. Bảng 2.1 là
các phản ứng tạo hạt vàng với các thời gian khác nhau.
Bảng 2.1. Tổng hợp hạt nano vàng với các khoảng thời gian phản ứng khác nhau
Mẫu H2O (ml) HAuCl4 5% (µl)
Na3C6H5O7Na3
1% (ml)
Thời gian
phản ứng
(phút)
No1 80 100 3,5 2
No2 80 100 3,5 5
No3 80 100 3,5 7
No4 80 100 3,5 9
No5 80 100 3,5 12
No6 80 100 3,5 15
No7 80 100 3,5 20
No8 80 100 3,5 30
No9 80 100 3,5 40
2.2.2.2. Thay đổi lượng chất khử Na3C6H5Na3
Để kiểm tra ảnh hưởng của lượng chất khử natri citrate, chúng tôi cũng tiến
hành các phản ứng tạo nano vàng với các lượng chất khử khác nhau (bảng 2.2).

34. 26
Bảng 2.2. Thay đổi lượng chất khử lượng Na3C6H5Na3 khác nhau
Mẫu H2O (ml) HAuCl4 (5%) (µl)
Na3C6H5O7Na3 1%
(µl)
Thời gian
phản ứng
(phút)
N1 80 100 700 20
N2 80 100 1.5 20
N3 80 100 3.5 20
N4 80 100 5 20
N5 80 100 9 20
N6 80 100 12 20
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu kích thước, hình thái và cấu trúc hóa học
của AuNPs.
Các mẫu nano vàng sau khi chế tạo được phân tích bằng hiển vi điện tử quét
(SEM), phân tích thành phần EDX, phổ hấp thụ UV-vis, phổ hồng ngoại FTIR nhằm
tìm hiểu hình dạng, kích thước, cấu trúc hóa học của hạt nano vàng cũng như phân
tích được thành phần của vật liệu sau khi chế tạo.
2.2.3.1. Phân tích bằng phổ hấp thụ UV
Nguyên lý của phương pháp được mô tả như sau: chiếu một chùm tia đơn sắc
có cường độ I0 vào một môi trường vật chất độ dày 1 cm và nồng độ C (mol/l), chùm
tia này bị môi trường vật chất này hấp thụ và truyền qua. Cường độ I của chùm tia
truyền qua môi trường này sẽ bị giảm theo quy luật Beer-Lamber (Khi hấp thụ tia đơn
sắc , độ hấp thụ phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ chất hấp thụ. Tùy từng chất, định
luật Beer-Lamber thường đứng trong một khoảng nồng độ).
Log(I0/I ) = K.n hay là log(I0/I) = ε 1C
Trong đó K là hệ số hấp thụ mol hay độ hấp thụ của môi trường, n là số mol chất cần
đo đặt trên đường đi của tia bức xạ.
Đại lượng log(I0/I ) được gọi là mật độ quang học D hoặc độ hấp thụ A.
ε là hệ số hấp thụ mol có giá trị bằng mật độ quang của dung dịch khi nồng độ chất
hấp thụ bằng một đơn vị và độ dày chất hấp thụ bằng một đơn vị. Hệ số hấp thụ chỉ
phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ và bước sóng của bức xạ bị hấp thụ. Độ
truyền qua của môi trường là T= I/I0.

35. 27
Hình 2.3. Sơ đồ máy đo phổ hấp thụ UV/vis hai chùm tia
Sự hấp thụ thường tập trung vào từng vùng phổ hẹp nên người ta hay dùng các
vùng phổ hẹp như vùng nhìn thấy, vùng tử ngoại, vùng hồng ngoại…
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ Kv vào tần số ν hoặc
bước sóng tới λ gọi là đường cong hấp thụ (phổ hấp thụ). Mỗi chất hấp thụ đều hấp
thụ lọc lựa ở những tần số sóng khác nhau.
2.2.3.2. Phân tích bằng hiển vi điện tử quét (SEM)
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy) là thiết bị phân tích
hữu hiệu cho vật liệu nano. SEM cho phép chúng ta biết những thông tin về địa hình,
hình thái học, thành phần, thông tin tinh thể học. Chữ “quét” (scanning) ở đây để thể
đặc tính quét tia điện tử trên mẫu để quan sát vùng tại điện tử quét qua. Sơ đồ cấu tạo
của kính hiển vi điện tử có thể mô tả như hình 2.4.
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa cấu tạo của kính hiển vi điện tử quét
Nguyên lý hoạt động của SEM: Một dòng tia điện tử được tạo ra bằng một
nguồn phát điện tử (Electron source) và được gia tốc đến mẫu nhờ việc sử dụng một
hiệu điện thế dương, dòng điện tử này được giam giữ và hội tụ nhờ sử dụng các độ
mở kim loại. Sau đó, chùm tia điện tử đơn sắc được hội tụ và quét lần lượt lên bề mặt
mẫu thành những đường riêng lẻ (giống như nguyên lý quét của ti vi). Khi các điện tử
Tải bản FULL (65 trang): https://bit.ly/317XH3R
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

36. 28
đến va chạm với mẫu dẫn đến các phản ứng khác nhau xảy ra trong mẫu. Các tương
tác này sẽ được ghi nhận và chuyển thành hình ảnh bằng nhiều công cụ hỗ trợ khác
nhau. Trước khi chuyển sang điểm quét tiếp theo của bề mặt mẫu, các thiết bị hỗ trợ
sẽ tính toán số các tương tác và hiển thị chúng thành một pixel trên màn hình. Quá
trình này sẽ lặp đi, lặp lại cho đến khi kết thúc. Trên thiết bị TEM hoặc SEM thường
tích hợp thiết bị phân tích thành phần vật liệu bằng phương pháp phân tích phổ tán xạ
tia X –EDX (Energy Dispersive X-ray). Nguyên lý của phương pháp dựa trên tác
động của chùm tia electron lên bề mặt mẫu, tương tác này làm phát ra tia X, năng
lượng photon của tia X là đặc trưng cho từng nguyên tố mà chỉ riêng nó mới có.
Chính vì thế mà có thể biết được chính xác thành phần hóa học các chất có bên trong
mẫu. Thậm chí, phân bố thành phần theo từng diện tích xác định, vì tia điện tử từ
nguồn phát điện tử sê quét theo từng khu vực cụ thể. Hệ thống vi phân tích sẽ thu
thập tia X, sắp xếp thứ tự, phân bố chúng thành giản đồ năng lượng, tự động gán tên
của từng thành phần hóa học có bên trong mẫu tương ứng với những đỉnh của phân
bố năng lượng.
Mẫu được phân tích bằng máy S- 4800 FESEM- Viện Khoa học Vật liệu và
Trung tâm đánh giá sai hỏng vật liệu, Viện Khoa học Vật liệu.
2.2.3.3. Phân tích bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR
Phổ hấp thụ hồng ngoại chính là phổ dao động quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng
ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. Tất cả các
phân tử được cấu tạo từ các nguyên từ các nguyên tử nối với nhau bằng các liên kết
hóa học. Dao động của các nguyên tử liên kết hóa học giống như dao động của hệ
thống các quả cầu nối với nhau bằng các lò xo. Chuyển động của các quả cầu lò xo
này có thể coi là kết quả của sự chồng chập hai dao động: kéo căng và uốn cong.
Tần số dao động không chỉ phụ thuộc và bản chất của từng liên kết riêng biệt
như: C-H hay C-O, mà còn phụ thuộc và cả phân tử và môi trường xunh quanh nó.
Tương tự như hệ các quả cầu tự do, cả hệ thống tác động lên dao động của các điện tích
cũng tăng lên dưới sự va đập. Tương tự như vậy, biên độ dao động của các liên kết hóa
học và cùng với chúng là dao động của các điện tích cũng tăng lên khi trường điện tử
tác động lên chúng. Sự khác nhau giữa hệ cầu lò xo và phân tử nằm ở mức năng lượng
của dao động phân tử lượng tử hóa. Do đó các phân tử chỉ hấp thụ các bước sóng trong
phổ hồng ngoại có năng lượng tương ứng với khoảng cách giữa hai mữc năng lượng
dao động của nguyên tử. Do đó, biên độ dao động tăng theo kiểu nhảy bậc. Đối với các
phân tử có nhiều nguyên tử, dao động quay thường rất phức tạp, tuy nhiên, có thể quy
một chuyển động phức tạp thành một số những dao động đơn giản hơn gọi là dao động
riêng. Mỗi dao động riêng lại có mức năng lượng nhất định. Trường hợp 2-3 dao động
có cùng một mức năng lượng gọi là dao động suy biến.
Tải bản FULL (65 trang): https://bit.ly/317XH3R
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

37. 29
Hình 2.5. Mô hình một máy quang phổ FTIR cơ bản
Người ta phân biệt dao động riêng thành hai loại:
1. Dao động hóa trị (ký hiệu là υ) là những dao động làm thay đổi góc liên kết
2. Dao động biến dạng (ký hiệu là δ) là những dao động làm thay đổi góc liên kết
nhưng không làm thay đổi chiều dài liên kết của các nguyên tử trong phân tử.
Mỗi loại dao động còn được phân chia thành dao động đối xứng (ký hiệu là υs
và δs ) và bất đối xứng (ký hiệu là υas và δas).
Cường độ và hình dạng phổ:
Phổ hồng ngoại được ghi dưới dạng đường cong sự phụ thuộc của phần trăm
truyền qua (100I/I0) vào số sóng. Sự hấp thụ của các nhóm nguyên tử được thể hiện
bởi những đám phổ với các đỉnh phổ ở các số sóng xác định. Việc định lượng chính
xác cường độ thường gặp khó khăn, sai số lớn nên các phổ thường chỉ được đánh giá
định tính với độ mạnh, trung bình và yếu.
Khi phân tích phổ hồng ngoại, ngoài việc xem xét vị trí như đã trình bày, phân tử
không thể hấp thụ bức xạ một cách hỗn loạn, mà chỉ hấp thụ những bức xạ tương ứng
6812470