Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net Download luận án tiến sĩ ngành sinh học với đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe), cho các bạn tham khảo Ảnh hưởng của chất kích kháng lên một số gen ở tế bào nghệ đen

1. ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH
KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN
THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
CURCUMINOID
Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria
Roscoe)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
Mã số: 9420112
Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC

2. HUẾ - NĂM 2019
LỜI CÁM ƠN
Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cán bộ giảng viên của Bộ môn Sinh học
Ứng dụng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa
học, Đại học Huế; Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện tài nguyên,
Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2013-2014); Viện
Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban
Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và hợp tác Quốc tế; Phòng Đào tạo
Sau đại học -Trường đại học Khoa học; Ban chủ nhiệm Khoa sinh học-Trường
Đại học Khoa học- Đại học Huế ; Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa cơ bản,
Bộ môn Sinh học-Trường Đại học Y Dược Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu,
tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án.
Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng
tôi hoàn thành luận án.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia
đình đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ cả vật chất lẫn tinh thần.
Xin trân trọng cảm ơn!
Huế, ngày tháng năm 2019
Tác giả
Trương Thị Phương Lan

3. i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu
hoàn toàn trách nhiệm.
Tác giả luận án
Trương Thị Phương Lan

4. ii
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
BAP 6-benzylaminopurine
CoA coezyme A
cs cộng sự
CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide
CzDCS Curcuma zedoaria DCS
CzCURS1 Curcuma zedoaria CURS1
CzCURS2 Curcuma zedoaria CURS2
CzCURS3 Curcuma zedoaria CURS3
ĐC đối chứng
DPPH 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
dw dry weight (khối lượng khô)
FRAP ferric reducing antioxidant power
fw fresh weight (khối lượng tươi)
HPLC high-performance liquid chromatography
IBA 3-indolebutyric acid
KIN kinetin
MAPK mitogen-activated protein kinase
MeJA methyl jasmonate
MS Murashige and Skoog (1962)
NAA naphthaleneacetic acid
NO nitric oxide
PAA phenyl acetic acid
ROS reactive oxygen species
SA salicylic acid
SNP sodium nitroprusside
YE yeast extract (dịch chiết nấm men)

5. iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ii
MỤC LỤC........................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC BẢNG..............................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ....................................................................viii
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................ 1
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.......................................................................... 2
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................................ 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 5
1.1. CÂY NGHỆ ĐEN...................................................................................... 5
1.1.1. Đặc điểm thực vật học......................................................................... 5
1.1.2. Phân bố................................................................................................ 5
1.1.3. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen....................................... 6
1.1.3.1. Tinh dầu ........................................................................................... 6
1.1.3.2. Curcuminoid..................................................................................... 7
1.1.4. Công dụng của nghệ đen..................................................................... 8
1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau........................................................................... 8
1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư................................................................... 9
1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan ........................................................................ 9
1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét ................................................ 9
1.1.4.5. Hoạt tính chống oxy hóa................................................................ 10
1.1.4.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm............................................ 10
1.1.4.7. Các hoạt tính khác.......................................................................... 11
1.3. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG......................................................... 15

6. iv
1.3.1. Elicitor............................................................................................... 15
1.3.1.1. Khái niệm....................................................................................... 15
1.3.1.2. Phân loại......................................................................................... 15
1.3.1.3. Cơ chế kích kháng.......................................................................... 16
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự kích kháng ...................................... 18
1.3.2. Ứng dụng của elicitor........................................................................ 20
1.3.2.1. Elicitor sinh học ............................................................................. 20
1.3.2.2. Elicitor phi sinh học....................................................................... 26
1.4. CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID ........................ 27
1.4.1. Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid...................................... 27
1.4.2. Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid......... 31
1.4.2.1. Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS)...................... 31
1.4.2.2. Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS).......................... 31
1.4.2.3. Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase.................................. 32
1.4.2.4. Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase........................................ 33
1.4.2.5. Các gen khác .................................................................................. 34
1.4.3. Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp ........................ 35
1.4.4. Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor .................................. 37
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 39
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 39
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 39
2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen ......................................................... 40
2.2.1.1. Khử trùng mẫu vật ......................................................................... 40
2.2.1.2. Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro ....................................................... 41
2.2.1.3. Nuôi cấy callus............................................................................... 41
2.2.1.4. Nuôi cấy tế bào .............................................................................. 41
2.2.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid........................................... 42
2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số................................................................. 42

7. v
2.2.2.2. Khuếch đại PCR............................................................................. 43
2.2.2.3. Tạo dòng và chú giải gen............................................................... 43
2.2.2.4. Xây dựng cây phả hệ...................................................................... 45
2.2.3. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid ............... 46
2.2.3.1. Xử lý elicitor .................................................................................. 46
2.2.3.2. Phân tích RT-PCR.......................................................................... 46
2.2.3.3. Phân tích HPLC ............................................................................. 48
2.2.4. Xử lý thống kê................................................................................... 49
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 50
3.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO.......................................................... 50
3.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro..................................................... 50
3.1.1.1. Tái sinh chồi................................................................................... 50
3.1.1.2. Tạo rễ in vitro................................................................................. 52
3.1.2. Nuôi cấy callus.................................................................................. 54
3.1.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN........................................................ 54
3.1.2.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA ...................................................... 55
3.1.2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và AgNO3................................................... 55
3.1.3. Nuôi cấy tế bào nghệ đen.................................................................. 57
3.2. NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID.................... 59
3.2.1. Phân lập gen...................................................................................... 59
3.2.2. Phân tích biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid.................... 68
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
CURCUMINOID ............................................................................................ 72
3.3.1. Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng
hợp curcuminoid ......................................................................................... 72
3.3.2. Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid ......................................... 74
3.3.3. Tích lũy curcumin ............................................................................. 76
Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 79

8. vi
4.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO.......................................................... 79
4.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro..................................................... 79
4.1.2. Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen............................................ 81
4.2. PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID......................... 83
4.2.1. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid ................................................. 83
4.2.2. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid .............................. 85
4.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN
CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID........................................... 85
4.3.1. Đặc điểm của các elicitor sử dụng trong nghiên cứu........................ 85
4.3.1.1. Dịch chiết nấm men ....................................................................... 85
4.3.1.2. Salicylic acid.................................................................................. 87
4.3.2. Ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng của tế bào...................... 89
4.3.3. Ảnh hưởng của elicitor lên mức độ biểu hiện gen............................ 90
4.3.4. Ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin ........... 92
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 95
KẾT LUẬN..................................................................................................... 95
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 95
DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.................... 96
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 97

9. vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại các elicitor khác nhau ..................................................... 17
Bảng 1.2. Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất
thứ cấp trong nuôi cấy in vitro........................................................................ 21
Bảng 2.1. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen
tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen................................................................... 45
Bảng 2.2. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các
gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen............................................................ 47
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in
vitro nguyên vẹn.............................................................................................. 51
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in
vitro đã được chẻ đôi....................................................................................... 52
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro........ 53
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng
của callus nghệ đen ......................................................................................... 55
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng
của callus nghệ đen ......................................................................................... 56
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh
trưởng của callus nghệ đen.............................................................................. 56
Bảng 3.7. Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen
CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ
đen ................................................................................................................... 70
Bảng 3.8. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ở các gen tổng hợp
curcuminoid..................................................................................................... 76
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các elicitor lên sinh trưởng và tích lũy curcumin trong
tế bào nghệ đen................................................................................................ 77

10. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin .................................................. 8
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng .. 30
Hình 1.3. Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ở
nghệ vàng. ....................................................................................................... 32
Hình 2.1. Cây nghệ đen................................................................................... 39
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm. ............................................................................ 40
Hình 2.3. Vector pGEM®
-T Easy (Promega, Mỹ).......................................... 44
Hình 2.4. Vị trí của primer xuôi và ngược trên gen CzCURS1 ...................... 48
Hình 3.1. Cây nghệ đen in vitro 2 tháng tuổi.................................................. 53
Hình 3.2. Callus nghệ đen 2 tuần tuổi sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 1
mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) và đối chứng sinh trưởng trên môi trường
có 2,4-D 3 mg/L kết hợp với BAP 3 mg/L (B)............................................... 57
Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen. ............................... 58
Hình 3.4. Tế bào nghệ đen nuôi trong bình tam giác chứa môi trường MS bổ
sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L................................................................ 59
Hình 3.5. Sinh khối tươi (A) và khô (B) của tế bào nghệ đen........................ 59
Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA
tổng số của nghệ đen....................................................................................... 61
Hình 3.7. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp
curcuminoid ở nghệ đen.................................................................................. 61
Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzDCS
(MF663785) ở nghệ đen và DCS ở nghệ vàng (AB495006.1)....................... 62
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS1
(MF402846) ở nghệ đen và CURS1 ở nghệ vàng (AB495007.1).................. 63
Hình 3.10. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS2
(MF402846) ở nghệ đen và CURS2 ở nghệ vàng (AB506762.1)................... 64

11. ix
Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS3
(NCBI: MF987835) ở nghệ đen và CURS3 ở nghệ vàng (NCBI: AB506763.1).
......................................................................................................................... 65
Hình 3.12. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzDCS và DCS
(C0SVZ5.1)..................................................................................................... 66
Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS1 và CURS1
(AJF45913.1)................................................................................................... 66
Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS2 và CURS2
(BAW81545.1)................................................................................................ 67
Hình 3.15. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS3 và CURS3
(AJF45914.1)................................................................................................... 67
Hình 3.16. Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid..................... 68
Hình 3.17. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1,
CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. ................ 70
Hình 3.18. Phổ HPLC của curcumin chuẩn.................................................... 71
Hình 3.19. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen.......................................... 71
Hình 3.20. Phổ HPLC của dịch chiết callus nghệ đen.................................... 72
Hình 3.21. RNA tổng số của các mẫu tế bào sau khi được xử lý elicitor....... 73
Hình 3.22. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzCURS1 (A) và
CzCURS3 (B) sau khi được xử lý elicitor....................................................... 74
Hình 3.23. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp
curcuminoid ở nghệ đen.................................................................................. 75
Hình 3.24. Phổ HPLC của curcumin chuẩn.................................................... 78
Hình 3.25. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày
nuôi cấy. .......................................................................................................... 78
Hình 3.26. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với SA 100 µM sau 5
ngày nuôi cấy. ................................................................................................. 79

12. 1
MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae)
còn được gọi là nga truật, tam nại hay ngải tím là loài thảo dược bản địa ở Ấn
Độ và Indonesia, nhưng cũng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản,
Brazil, Nepal, Thái Lan [78] và Việt Nam [7]. Nghệ đen từ lâu đã được sử dụng
trong y học cổ truyền của nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các
bệnh về da như các vết thương và các vết lở loét, cũng như sự bất thường của
chu kỳ kinh nguyệt [157].
Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các dẫn xuất của nó
như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin là nhóm hợp chất chính
tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của củ nghệ [76]. Các nghiên cứu gần
đây cho thấy curcuminoid, đặc biệt là curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý
rộng như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống
tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u và bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid)
[14], [58], [116]. Curcuminoid được chiết xuất từ củ (thân rễ) của các loài nghệ
khác nhau, chẳng hạn C. caesia [24], C. amada [50], C. longa [67], C.
aromatica [74] và C. zedoaria [78]. Curcuminoid hiện đang được sử dụng như
dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư
trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến… [35]. Nhiều
nghiên cứu cũng đã cho thấy curcuminoid có độ an toàn cao, dung nạp tốt với
cơ thể, không độc đến liều 8 g/kg thể trọng [46].
Hiện nay, các gen tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid ở nghệ
vàng (C. longa) đã được xác định và phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai
nhóm gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase là diketide-CoA
synthase (DCS) và các curcumin synthase (CURS1, CURS2 và CURS3) [66],
[67]. Trước đó, Brand và cs. (2006) cũng đã mô tả một gen mã hóa enzyme

13. 2
type III polyketide synthase khác là chalcone synthase (CHS) có ở cây
Wachendorfia thyrsiflora, và gen này cũng tham gia vào quá trình tổng hợp
curcuminoid [28]. Behar và cs. (2016) khi phân tích biểu hiện của các gen tham
gia tổng hợp curcuminoid ở C. caesia bao gồm DCS, CURS, CURS2, CURS3
và CHS1 đã nhận thấy mức độ biểu hiện của chúng trong củ cao hơn ở lá [24].
Tuy nhiên, các gen tham gia tổng hợp curcuminoid ở loài nghệ đen đến nay vẫn
chưa được công bố.
Elicitor là những chất hóa học được dùng để tác động vào con đường
chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp các chất có giá trị dược
phẩm trong nuôi cấy tế bào thực vật [62], [111]. Theo Abraham và cs (2011),
dịch chiết nấm men (YE) đã được ứng dụng trong nuôi cấy in vitro thực vật do
khả năng kích thích cơ chế bảo vệ, tăng sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp
có hoạt tính sinh học [9]. Salicilic acid (SA) được xem là một trong những tín
hiệu quan trọng trong phản ứng tự vệ của cây và cũng được sử dụng rộng rãi
trong sản xuất các chất chuyển hóa từ nuôi cấy tế bào thực vật [22]. Methyl
jasmonate (MeJA) cũng đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan
trọng trong việc truyền tín hiệu điều chỉnh khả năng phòng vệ của thực vật và
có thể kích thích sự sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp trong nuôi cấy tế bào
[158], [169].
Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng
của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình
tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm
xác định các loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng để điều hòa tăng biểu
hiện của các gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase trong con đường
phenylpropanoid ở tế bào nghệ đen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ cung
cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò của SA, YE và MeJA như là những chất
điều hòa dương tính của biểu hiện gen ở loài dược liệu có giá trị này.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

14. 3
Mục tiêu lý thuyết
Cải thiện mức độ biểu hiện của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và
CzCURS3 tham gia trong con đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng
hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro bằng một số elicitor.
Mục tiêu thực nghiệm
Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính của nhóm
chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ở tế bào nghệ đen
nuôi cấy in vitro.
3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
- Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao bằng cách bổ
sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Phân lập các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS tham gia
trong quá trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) ở nghệ đen.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor như YE, SA và MeJA lên mức
độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và khả năng tích lũy curcumin
trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro.
4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Luận án có các đóng góp mới như sau:
- Các nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây nghệ đen trước đây đều chưa
sử dụng AgNO3 để tăng hiệu quả nuôi cấy, trong nghiên cứu này, bổ sung
AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo cây in vitro, nuôi cấy
callus) đều làm tăng hiệu quả của quá trình nuôi cấy so với các nghiên cứu
trước đây.
- Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình tổng hợp
curcuminoid, các gen này tương đồng 99% so với các gen tương ứng ở cây
nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã số lần lượt là

15. 4
MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835. Các gen này đều có sự biểu
hiện ở trong củ và callus của cây nghệ đen.
- Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp curcumin ở cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của gen này quyết định
trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được.
- Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của một số loại elicitor (dịch chiết nấm
men và salicilic acid) lên khả năng tích lũy curcumin và mức độ biểu hiện của
các gen liên quan. Giá trị tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1
g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu hiện cao hơn 2,78 lần so với đối chứng.

16. 5
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY NGHỆ ĐEN
1.1.1. Đặc điểm thực vật học
Nghệ đen là cây thân thảo sống nhiều năm hoặc hàng năm, cao khoảng 1-
1,5m; có củ hình trứng, có khía chạy dọc, củ tỏa theo hình chân vịt; cây mẫm
và chắc. Cây có nhiều củ, ngoài củ chính ra còn có những củ phụ, vỏ củ có màu
xám, bên trong củ có màu vàng lưu huỳnh nhạt hoặc vàng sáng, khi già có nhiều
vòng màu xanh tím. Củ nghệ khô có mùi thơm camphor nhẹ và có vị đắng hơi
cay. Chồi lá nghệ đen có thể cao tới 1 m với 5 lá. Lá có bẹ ôm vào thân cây
phía dưới, dài 30-60 cm, rộng 7-8 cm, dọc theo gân chính giữa có những đốm
màu đỏ, cuống lá ngắn hay hầu như không có. Cụm hoa mọc ngang, dài 15-20
cm. Lá bắc phía dưới hình trứng hay hình mác tù, màu xanh lục nhạt, mép đỏ;
lá bắc phía trên màu vàng nhạt, đầu lá màu đỏ, không mang hoa. Hoa màu vàng,
đài hoa có thùy hình mác tù dài 15 mm, thùy giữa nhọn, cánh môi hẹp ở phía
dưới nhưng hơi mở rộng phía trên [59], [105].
Trong hai tháng 3 và 4, các cụm hoa từ chồi nách của thân và chồi đỉnh
của củ bắt đầu vươn lên mặt đất. Trên các điểm gần cụm hoa thường phát triển
các chồi và từ đó bắt đầu hình thành các nhánh mới. Vào mùa thu, lá trên mặt
đất bắt đầu lụi. Từ tháng 11 đến tháng 12, các chất chuyển hóa thứ cấp ở củ bắt
đầu được tích lũy [7].
1.1.2. Phân bố
Cây nghệ đen được xem như là cây bản địa của vùng Đông Bắc Ấn Độ
nhưng hiện đang được trồng khắp nơi ở Ấn Độ, Malaysia, Nhật Bản, Trung
Quốc, Thái Lan và Việt Nam. Ở Việt Nam, nghệ đen phân bố ở các tỉnh miền
núi và trung du phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái… và một số tỉnh ở

17. 6
miền Trung. Hiện nay, cây nghệ đen cũng đã được trồng tại một số địa phương
khác của miền Bắc và Tây Nguyên [6].
1.1.3. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen
Nghệ đen là loài thảo dược có củ chứa các nhóm chất chủ yếu như tinh
dầu (sesquiterpene và monosesquiterpene) và curcuminoid (curcumin,
demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin). Ngoài ra, cây nghệ còn chứa
một số hợp chất khác như tinh bột, chất dẻo và các chất có vị đắng như tannin,
flavonoiod [76].
1.1.3.1. Tinh dầu
Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của tinh
dầu củ nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như α-pinen, borneol, camphen,
camphor và cineol bên cạnh các sesquiterpene, nhưng không phân lập và xác
định được loại sesquiterpene nào. Xingyi (1999) khi nghiên cứu tinh dầu nghệ
đen ở Trung Quốc nhận thấy chúng chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó
chủ yếu là curzerenone (45,02%), curcumenol (8,31%), β-elemene (5,79%) và
isocurcumenol (4,05%) [164]. Trong tinh dầu nghệ đen sinh trưởng ở vùng
Đông Bắc Ấn Độ, Tohda và cs (2006) đã thu được 37 hợp chất, chiếm 87,7%
lượng tinh dầu tổng số, chủ yếu là curzerenone (22,3%), tiếp đến là 1,8-cineole
(15,9%) và germacrone (9%), β-tumerone (19,88%) và zingiberene (7,84%)
[155]. Duke và cs (2003) đã tìm thấy trong củ nghệ đen một số sesquiterpenoid
như ar-turmerone zederone, β-turmerone, curcumadiol, curcumenol, curcumol,
curcolone, curdione, curzerene, curzerenone, dehydrocurdione,
epicurzerenone, furanodiene, isocurcumenol, procurcumenol và zingiberene
[41].
Ở Việt Nam, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đã và đang
được quan tâm nghiên cứu. Thành phần chính trong tinh dầu củ nghệ thu được
tại Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [3], trong khi tinh dầu nghệ

18. 7
đen ở Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) đều giàu epicurzerenon
và germacrone. Các hợp chất khác trong tinh dầu có hàm lượng thấp hơn đó là
α-cadinol, β-elemen, β-pinen, δ-cadinen, 1,8-cineol, 2,4-diisopropenyl-1-vinyl-
cyclohexan, benzofuran-6-ethyxyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5
isopropyl, camphor, germacrene, isoborneol, T-muurolol và zingiberen [1].
Thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở Đà Lạt có chứa các hợp
chất như γ-elemen (14,18-18,79%), curzeren (14,28-16,67%), và germacrone
(22,53-24,28%) [4].
1.1.3.2. Curcuminoid
Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu, các nghiên
cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng được quan tâm.
Syu và cs (1998) nhận thấy dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa các hợp
chất nhóm curcuminoid là curcumin, demethoxycurcumin và
bisdemethoxycurcumin (Hình 1.1) [149].
Curcumin (C21H20O6) là một hợp chất dạng tinh thể, màu vàng cam, có
trong các loài thực vật thuộc chi Curcuma, tan tốt trong các dung môi hữu cơ
như acetone, methanol, ethanol và isopropanol nhưng không tan trong nước.
Các dung môi hòa tan thích hợp để tách chiết curcumin là acetone,
dichloromethan, ethanol ethyl acetate, methanol, n-butanol và hexane.
Curcumin có thể được thu hồi bằng cách kết tinh từ dịch chiết [2], [60].

19. 8
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin.
1.1.4. Công dụng của nghệ đen
Cây nghệ đen được trồng phổ biến dùng làm rau hoặc đồ gia vị ở các nước
vùng Đông và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Malaysia, Thái
Lan và Việt Nam [59], [135]. Từ lâu, nghệ đen đã được sử dụng như một vị
thuốc trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nghệ đen cũng được kê
trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều trị hội chứng “Oketsu” gây
ra do tắc nghẽn mạch máu, điều kinh và cải thiện kinh nguyệt với nhiều dạng
pha chế khác nhau [96]. Ở Thái Lan, nghệ đen được dùng để làm dịu cơn đau
dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt hoặc làm se các vết thương ở
ngoài da [135]. Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong
gân, ung nhọt và vết thương [41]. Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa
giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa
bệnh phù hay phong hủi [64], [109]. Ngày nay, nhiều hoạt chất sinh học của
nghệ đen đã được chứng minh có tác dụng giảm đau, bảo vệ gan, kháng ung
thư, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống đột biến…
1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau
Curcumin
H3CO
HO
OCH3
OH
O O
HO
OCH3
OH
O O
Demethoxycurcumin
HO OH
O O
Bisdemethoxycurcumin

20. 9
Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của hai loại sesquiterpene là
cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen trên thỏ và chuột thực nghiệm.
Kết quả cho thấy, cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối
[144]. De Navarro và cs (2002) khi nghiên cứu hoạt tính giảm đau của nghệ
đen ở Brazil đã nhận thấy hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao hơn
nhiều lần so với các loại thuốc giảm đau thông thường như aspirin và dipyrone
[38].
1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư
Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt
tính chống ung thư và kháng viêm. Khả năng ức chế sinh tổng hợp các chất
prostalandin và NO của dịch chiết nghệ được cho là có tiềm năng trong việc
kháng viêm và trong hóa trị liệu chống ung thư [59]. Seo và cs (2005) nhận
thấy dịch chiết nước của củ nghệ có hoạt tính chống di căn phổi của các tế bào
khối u ác tính B16 [140]. Syu và cs (1998) đã nghiên cứu hoạt tính kháng ung
thư của các curcuminoid thu được từ dịch chiết ethanol của củ nghệ. Kết quả
cho thấy, chúng có hoạt tính gây độc đối với các tế bào ung thư buồng trứng
OVCAR-3 ở người [149]. Các nghiên cứu của Jiang và cs (1996), Hanif và cs
(1997) cũng cho thấy curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả năng ức chế
sinh trưởng khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết và ung thư
biểu mô gan ở người [55], [63].
1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan
Matsuda và cs (1998) nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ đen
có hoạt tính bảo vệ gan, sesquiterpene và curcumin chống lại sự hình thành D-
galactosamine/lipopolysaccharide làm giảm tổn thương gan ở chuột [95]. Kết
quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen có thể được sử dụng
như một loại thuốc tiềm năng trong điều trị chứng xơ gan mãn tính [70].
1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét

21. 10
Nghệ đen còn được sử dụng như là phương thuốc chủ yếu để điều trị các
vị trí bị loét trong hệ tiêu hóa. Nghiên cứu của Raghuveer và cs (2003) cho thấy
dịch chiết nghệ đen có khả năng chống lại tình trạng tiết nhiều acid và viêm
loét dạ dày [122]. Watanabe và cs (1986) đã nghiên cứu hoạt tính kháng loét
của 8 loại dịch chiết từ nghệ đen trồng ở Yakushima (Nhật Bản) trên chuột gây
viêm loét dạ dày cấp tính. Các hợp chất furanogermenone và (4S, 5S)-(+)
germacrone 4,5-epoxide phân lập từ tinh dầu nghệ đen có hoạt tính ức chế sự
hình thành vết loét trên chuột thực nghiệm [161]. Jang và cs (2001) nhận thấy
ba hợp chất epiprocurcumenol, procurcumenol và 7-bis (4-hydroxyphenyl)-
1,4,6-heptatrien-3-one từ dịch chiết củ nghệ đen có hoạt tính kháng viêm [61].
1.1.4.5. Hoạt tính chống oxy hóa
Theo Matsuda và cs (1993), các hợp chất curcumin, demethoxycurcumin
và bisdemethoxycurcumin phân lập từ củ nghệ đen có hoạt tính chống oxy hóa
và kháng viêm tương đương với các chất này thu được từ củ nghệ vàng [94].
Dịch chiết ethanol của củ nghệ đen ở Thái Lan có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
với nồng độ ức chế 50% (EC50) từ 18,29-40,33 μg/mL (trung bình 25,71
μg/mL). Khả năng bắt gốc tự do của các curcuminoid phân tách từ dịch chiết
ethanol của nghệ đen lần lượt là: curcumin (EC50 = 7,89 μg/mL),
demethoxycurcumin (EC50 = 9,52 μg/mL) và bisdemethoxycurcumin (EC50 =
149,09 μg/mL) [114]. Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) nhận thấy tinh dầu nghệ
đen trồng ở Đà Lạt ở nồng độ 20 mg/mL có khả năng chống oxy hóa tương đối
cao, từ 74,8-77,8% [4]. Nghiên cứu của Loc và cs (2008) cho thấy hoạt tính của
các enzyme chống oxy hóa như peroxidase, superoxide dismutase và catalase
trong tế bào nghệ đen đạt giá trị cao nhất sau 14 ngày nuôi cấy, lần lượt là
0,63 U/mg, 16,60 U/mg và 19,59 U/mg protein [81].
1.1.4.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Hoạt tính kháng các loại vi khuẩn và nấm gây bệnh ở người và thực vật
của nghệ đen cũng được quan tâm nghiên cứu. Theo Wilson (2005), dịch chiết
từ củ nghệ đen có khả năng kháng năm chủng vi khuẩn khác nhau là Bacillus

22. 11
subtilis NCIM 2603, Escherichia coli NCIM 2574, Klebsiella pneumoniae
NCIM 2957, Micrococcus luteus NCIM 2103 và Proteus mirabilis NCIM
2300, và hai chủng nấm là Aspergillus niger NCIM 596 và Candida albicans
NCIM 3102 [162]. Dịch chiết ethanol của nghệ đen trồng ở Ấn Độ có khả năng
kháng B. cereus ở nồng độ 1.000 μg/mL và có hoạt tính ức chế tương đối với
C. albicans và K. pneumoniae [145]. Nghiên cứu của Giang và cs (2000) cho
thấy, dịch chiết củ nghệ đen trồng ở Việt Nam có phổ kháng khuẩn rộng. Các
chất như a-humulene, humulene-8-hydroperoxide, zerumbone và zerumbone-
2,3-epoxide có hoạt tính kháng lại các loài vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) được
thử nghiệm [49].
1.1.4.7. Các hoạt tính khác
Ansari và Ahmad (1991) nhận thấy dịch chiết alcohol từ củ nghệ đen nồng
độ 1-10 mg/mL có khả năng ức chế sự phát triển của amoeba (Entamoeba
histolytica) [16]. Champakaew và cs (2007) khi phân tích thành phần hóa học
và thử hoạt tính kháng muỗi Aedes aegypti mang virus gây bệnh sốt Dengue
của tinh dầu nghệ đen đã nhận thấy chúng thật sự có hiệu quả trong việc giết
chết các ấu trùng muỗi, đây được xem là nguồn tinh dầu thay thế triển vọng để
phát triển các loại thuốc diệt ấu trùng muỗi trong tương lai [30]. Daduang và cs
(2005) nghiên cứu khả năng kháng nọc độc rắn của dịch chiết nghệ đen cho
thấy nó có tác dụng ngăn cản nọc độc di chuyển trước khi bổ sung kháng thể
kháng độc [37].
1.2. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG SẢN XUẤT HỢP
CHẤT THỨ CẤP
1.2.1. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu dài
trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất dùng trong y học.
Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định về mặt chất lượng và số lượng
sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên. Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những

23. 12
thí nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp
khác nhau [5].
Các nghiên cứu cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản
xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó được chiết
từ cây ngoài tự nhiên. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một
cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở:
- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo
nên không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý, không cần phải vận chuyển và bảo
quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô.
- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại
bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật.
- Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong
tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng).
- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch
huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [5].
- Chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau.
- Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa
quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm sẽ tăng lên [108].
Thực vật có khả năng sản xuất số lượng lớn các hợp chất thứ cấp và sự
phân bố các hợp chất thứ cấp ở mức độ tế bào phụ thuộc vào con đường sinh
tổng hợp và đặc điểm cấu trúc của chúng [112]. Trong đó, các không bào dự
trữ thường chiếm 40-90% thể tích tế bào thực vật, chúng đóng vai trò then chốt
trong sự tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Sự tích lũy các hợp chất thứ
cấp trong không bào có ít nhất hai vai trò được xác định đó là lưu trữ tạm thời
các hoạt chất sinh học nội sinh trong tế bào và bảo vệ chúng khỏi quá trình dị
hóa [52]. Các nghiên cứu cũng cho thấy có hai cơ chế vận chuyển các hợp chất
thứ cấp chủ yếu trong không bào đó là vận chuyển theo gradient H+
qua kênh

24. 13
vận chuyển ion H+
và vận chuyển sơ cấp cần năng lượng trực tiếp bởi các chất
mang dạng hình hộp liên kết với phân tử ATP [93]. Một số nghiên cứu khác
cũng nhận thấy, gen không những liên quan đến sinh tổng hợp các hợp chất thứ
cấp mà còn liên quan đến các yếu tố vận chuyển chúng. Kết quả nghiên cứu
này sẽ hữu ích trong công nghệ trao đổi chất nhằm tăng khả năng sản xuất các
hợp chất thứ cấp có giá trị ở thực vật [165].
1.2.2. Các phương pháp nuôi cấy sử dụng trong sản xuất hợp chất thứ
cấp từ thực vật
1.2.2.1. Nuôi cấy callus
Nuôi cấy callus là quá trình nuôi cấy các tế bào thực vật không biệt hóa
được hình thành bằng cách nuôi cấy các mô trên môi trường chứa nồng độ
auxin cao hoặc kết hợp auxin và cytokinin trong điều kiện in vitro. Nuôi cấy
callus đã được ứng dụng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật đặc biệt
là các hợp chất flavonoid. Quy trình nuôi cấy callus ổn định và tối ưu là bước
quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy huyền phù để sản xuất
hợp chất thứ cấp ở quy mô lớn hơn [153].
1.2.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Nuôi cấy huyền phù tế bào là quá trình nuôi cấy các tế bào hay một khối
tế bào nhỏ không biệt hóa của thực vật trong môi trường lỏng và được duy trì
trong điều kiện sục khí, kích thích, ánh sáng, nhiệt độ và các thông số vật lý
thích hợp. Các tế bào nuôi cấy không chỉ có thể tạo ra các hợp chất hóa sinh
tiêu chuẩn xác định với khối lượng lớn mà còn loại bỏ sự hiện diện của nhiều
hợp chất không mong muốn khác với trong cây tự nhiên. Nuôi cấy huyền phù
tế bào được ứng dụng phổ biến nhất để sản xuất thứ cấp ở quy mô lớn. Một số
loại bioreactor khác nhau đã được sử dụng cho quá trình nuôi ấy. Ứng dụng
thương mại đầu tiên về nuôi cấy tế bào quy mô lớn được thực hiện trong các

25. 14
bioreactor bể khuấy có công suất 200 lít và 750 lít để sản xuất shikonin từ
Lithospermum erythrorhizon. Tế bào của Catharanthus roseus, Dioscorea
deltoidea, Digitalis lanata, Panax notoginseng, Taxus wallichiana và
Podophyllum hexandrum đã được nuôi cấy trong các bioreactor khác nhau để
sản xuất các sản phẩm thực vật thứ cấp. Những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy
tế bào để sản xuất các hợp chất dược phẩm đã tạo ra nhiều loại dược phẩm như
alkaloids, terpenoids, steroid, saponin, phenolics, flavanoid. Bằng cách cải biến
quy trình nuôi cấy, sản lượng hợp chất thứ cấp thu được có thể tăng cao (dẫn
theo Plunkett và cs. 2004) [119].
1.2.2.3. Nuôi cấy rễ tơ
Hệ thống nuôi cấy rễ tơ (hairy root) đã trở nên phổ biến trong hai thập
kỷ qua như một phương pháp để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp được
tổng hợp trong rễ. Rễ tơ là các rễ đột biến trong quá trình nuôi cấy biệt hóa
được tạo ra bởi sự lây nhiễm của Agrobacterium rhizogenes vào các loài thực
vật bậc cao bị tổn thương. Tác nhân gây bệnh này gây ra sự nhiễm bệnh dẫn
đến sự phát triển các khối u của rễ được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng cao
trong môi trường không chứa hormone và sự ổn định di truyền khi nuôi cấy
trong một thời gian dài. Rễ tơ có con đường tổng hợp các hợp chất cũng giống
với ở các cơ quan hoang dại nhưng lại cho năng suất cao hơn nhiều lần. Chính
đặc tính ổn định và năng suất cao cho phép khai thác rễ tơ là công cụ công nghệ
sinh học có giá trị để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật [113],
[119].
1.2.3. Vai trò của AgNO3 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nano bạc bao gồm các hạt bạc có kích thược nano, khoảng từ 1-100 nm,
thông thường kích thước đo được khoảng 25 nm. Theo Kumar và cs (2009) và

26. 15
Sandra & Maira (2013), AgNO3 khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô
thực vật có tác dụng ức chế hoạt động của ethylene nội sinh, vì thế quá trình
sinh trưởng của tế bào sẽ được thuận lợi hơn [73], [134].
Đến nay, AgNO3 đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật để
tái sinh chồi, tăng hệ số nhân giống, phát sinh cơ quan, cải thiện các thông số
hóa sinh và thậm chí chuyển gen thông qua Agrobacterium… (Kumar và cs.
2009) [73], Sandra và Maira. 2013 [134], Sgamma và cs. 2015 [141],
Sarropoulou và cs. 2016 [137], Mohiuddin và cs. 1997 [104], Tamini và cs.
2015 [151], Harathi và cs. 2016 [56], Da Silva và cs. 2013 [152]). Park và cs
(2016) cho rằng YE và AgNO3 có thể cảm ứng làm tăng mức độ biểu hiện của
gen sinh tổng hợp phenylpropanoid và tăng cường tích lũy rosmarinic acid
trong tế bào cây hoắc hương núi (Agastache rugosa) [115].
1.3. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG
1.3.1. Elicitor
1.3.1.1. Khái niệm
Elicitor (hay chất kích kháng) được định nghĩa như là một chất cơ bản mà
khi đưa một lượng nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì có thể khởi động hoặc cải
thiện sự sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào [111]. Sự kích kháng
thực vật (elicitation) là quá trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa thứ cấp nhờ tác động của các elicitor, giúp cho cây chống lại các
yếu tố bất lợi của ngoại cảnh như tác nhân gây bệnh hoặc điều kiện sinh thái
khắc nghiệt [143].
1.3.1.2. Phân loại
Elicitor có thể được phân loại dựa trên bản chất tự nhiên của chúng là
elicitor phi sinh học (abiotic elicitor) và elicitor sinh học (biotic elicitor), hoặc
dựa vào nguồn gốc của chúng là elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) và
elicitor nội sinh (endogenous elicitor). Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn

27. 16
gốc không thuộc sinh vật, chủ yếu là các muối vô cơ và các tác nhân vật lý, ví
dụ: các ion Cu2+
, Cd2+
, Ca2+
, độ pH cao... Elicitor sinh học là các chất có nguồn
gốc từ sinh vật, bao gồm các polysacharide của thành tế bào thực vật (cellulose
hoặc pectin) và vi sinh vật (chitin hoặc glucan), hoặc các glycoprotein, G-
protein hay các protein nội bào có chức năng gắn các receptor và tác động bằng
cách hoạt hóa hay bất hoạt một số các enzyme hoặc các kênh ion. Elicitor ngoại
sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các acid béo, các
polysaccharide và polyamine. Ngược lại, elicitor nội sinh là các chất có nguồn
gốc bên trong tế bào như là galacturonide, hepta-β-glucoside... (Bảng 1.1)
[111].
1.3.1.3. Cơ chế kích kháng
Elicitor là các chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây nên các đáp
ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh ra khi thực
vật chịu tác động của các tác nhân gây bệnh). Chúng có thể là các elicitor phi
sinh học như ion kim loại, hợp chất vô cơ hoặc elicitor sinh học có nguồn gốc
từ nấm, vi khuẩn hoặc động vật ăn cỏ, mảnh vỡ của thành tế bào thực vật cũng
như các chất được giải phóng ra tại vị trí tổn thương của thực vật do mầm bệnh
hoặc động vật tấn công.
Thực vật được xử lý elicitor hoặc bị mầm bệnh tấn công gây ra một loạt
các phản ứng phòng vệ, bao gồm sự tích lũy các hợp chất thứ cấp bảo vệ ở cả
trong cây tự nhiên cũng như trong nuôi cấy in vitro. Mặc dù đã có nhiều nghiên
cứu về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên quá trình sinh tổng hợp các chất thứ
cấp ở thực vật nhưng cơ chế của sự kích kháng vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có
nhiều giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+
, các yếu tố ảnh
hưởng đến sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đường ức chế/hoạt hóa nội
bào hay sự thay đổi áp suất thẩm thấu [111].
Bảng 1.1. Phân loại các elicitor khác nhau [111]
A. Theo bản chất

28. 17
Elicitor sinh học Elicitor phi sinh học
- Được giải phóng trực tiếp từ vi sinh
vật và được nhận diện bởi tế bào thực
vật (các enzyme, các mảnh vỡ của
thành tế bào).
- Được tạo thành bởi hoạt động của vi
sinh vật trên thành tế bào thực vật
(pectin).
- Được tạo ra từ hoạt động của
enzyme thực vật trên thành tế bào vi
khuẩn (chitosan, glucan).
- Các hợp chất nội sinh được hình
thành hoặc tiết ra bởi tế bào thực vật
khi đáp ứng các kích thích khác nhau.
- Tác dụng của các tác nhân vật lý
hoặc hóa học tự nhiên theo đường nội
sinh tạo thành các elicitor sinh học.
- Tia UV.
- Protein biến tính (RNase).
- Đông và rã đông.
- Các thành phần không thiết yếu của
môi trường (agarose).
- Kim loại nặng.
- Các loại hóa chất có ái lực cao với
DNA, có hoạt tính phá vỡ màng tế
bào, thuốc diệt nấm (benomyl,
butylamin, maneb), và thuốc diệt cỏ
(acifluorofen).
B. Theo nguồn gốc
Elicitor ngoại sinh Elicitor nội sinh
- Hình thành từ bên ngoài tế bào, bao
gồm các phản ứng trực tiếp hoặc qua
các chất nội sinh trung gian.
- Các polysaccharide: chitosan,
glucan, và glucomanose.
- Peptide và chuỗi các ion dương:
glycoprotein, monilicolin, polyamine,
và poly-L-lysine.
- Các enzyme: polygalacturonase,
cellulase, và endo-polygalacturonase
acid lyase.
- Các acid béo: acid arachidonic và
acid eicosapentanoic.
- Hình thành qua các phản ứng thứ
cấp, cảm ứng bằng một tín hiệu sinh
học hoặc phi sinh học trong tế bào.
- Alginate oligomer.
- Dodeca-β-1,4-D-galacturonide.
- Hepta-β-glucoside.
Một số nghiên cứu đã giả thiết có sự liên kết của elicitor vào các thụ thể

29. 18
trên màng sinh chất để kích hoạt quá trình chống chịu [32], [54]. Gelli và cs
(1997) cho rằng khi có kích kháng, Ca2+
di chuyển vào tế bào chất từ bên ngoài
tế bào [48]. Một số tác giả nhấn mạnh đến sự thay đổi nhanh chóng của quá
trình phosphoryl hóa protein và kích hoạt kinase chính là cơ chế của quá trình
kích kháng [47], [129]. Trong khi đó, nhiều tác giả khác nhận thấy có sự tích
lũy mitogen-activated protein kinase (MAPK) và kích hoạt G-protein trong quá
trình kích kháng [10], [40]. Armero và Tena (2001) cho rằng, có sự acid hóa
màng nguyên sinh chất gây ra bởi sự bất hoạt H+
-ATPase, trong khi giảm sự
phân cực của màng, tăng pH bên ngoài màng được quan sát thấy khi xử lý
elicitor [19]. Apostol và cs (1989), Bolwell và cs (1995) và Pugin và cs (1997)
giải thích rằng, việc sản xuất các ROS như anion superoxide và H2O2 tạo ra
hiệu ứng kháng khuẩn trực tiếp cũng như góp phần tạo ra các dẫn xuất của acid
béo có hoạt tính sinh học [17]. Tương tự, ROS tham gia vào quá trình liên kết
với protein giàu proline gắn trên thành tế bào sau đó hoạt động như là tín hiệu
thứ cấp và kích hoạt dịch mã các gen bảo vệ [89].
Theo một giả thuyết khác, sự tích lũy của các protein liên quan đến việc
bảo vệ thực vật khỏi các tác nhân gây bệnh như chitinase, glucanase và
endopolygalacturonase góp phần giải phóng các pectic oligomer tín hiệu
(elicitor nội sinh), glycoprotein giàu hydroxyproline và chất ức chế protease
[25]. Ngoài ra, sự kích hoạt phiên mã của các gen bảo vệ trong quá trình kích
kháng cũng đã được công bố [99], [139].
1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự kích kháng
Tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ nuôi cấy tế
bào thực vật bằng cách xử lý chúng với các elicitor thích hợp đã mở ra một
hướng nghiên cứu mới trong công nghiệp dược phẩm. Các thông số như thành
phần và nồng độ elicitor, thời gian xử lý, tuổi của tế bào, dòng tế bào, chất điều
hòa sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng và đặc điểm thành tế bào phù hợp có

30. 19
thể tăng khả năng tích lũy các sản phẩm thứ cấp [111].
Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá
trình kích kháng. Namdeo và cs (2002, 2007) nhận thấy sự tích lũy ajmalicine
cao trong tế bào cây dừa cạn (Catharanthus roseus) được xử lý dịch chiết nấm
Trichoderma viride, Aspergillus niger và Fusarium moniliforme ở các nồng độ
khác nhau. Lượng ajmalicine trong tế bào được xử lý elicitor nồng độ cao (5%)
lớn hơn so với nồng độ thấp (0,5%). Tuy nhiên, nồng độ elicitor >10% đã ảnh
hưởng bất lợi lên sự tích lũy ajmalicine do chúng gây ra hiện tượng đáp ứng
quá ngưỡng, dẫn đến chết tế bào [111], [110].
Thời gian xử lý elicitor: Nghiên cứu của Namdeo và cs (2002, 2007) cho
thấy lượng ajmalicine tăng khoảng 3 lần ở tế bào dừa cạn được xử lý dịch chiết
của T. viride trong 48 giờ, trong khi đó chất này chỉ tăng 2 lần ở tế bào được
xử lý dịch chiết của A. niger và F. moniliforme trong cùng thời gian. Khi thời
gian xử lý lớn hơn 96 giờ khả năng tích lũy ajmalicine của tế bào đã giảm rõ
rệt [111], [110].
Tuổi của tế bào: Thời điểm cấy chuyển là một yếu tố quan trọng trong
sản xuất các chất chuyển hóa sinh học từ các tế bào được xử lý elicitor. Namdeo
và cs (2002, 2007) nhận thấy lượng ajmalicine đạt cao nhất (166 µg/g khối
lượng khô (dw)) ở tế bào 20 ngày tuổi được xử lý dịch chiết của T. viride [111],
[110].
Môi trường dinh dưỡng: Thành phần môi trường cũng đóng một vai trò
quan trọng trong quá trình kích kháng. Theo Namdeo và cs (2002, 2007),
ajmalicine được tích lũy ở tế bào sinh trưởng trong môi trường Zenk nhiều hơn
so với môi trường MS [111], [110].
Ngoài ra, sự kích kháng cũng phụ thuộc vào đặc tính của các elicitor, dòng
tế bào hoặc chủng vi sinh vật được sử dụng làm elicitor, sự có mặt của các chất
điều hòa sinh trưởng cũng như các điều kiện nuôi cấy khác [111].

31. 20
1.3.2. Ứng dụng của elicitor
Đến nay, đã có nhiều công trình ứng dụng elicitor để kích thích sản xuất
các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy in vitro thực vật. Các nghiên cứu đều cho thấy
sự tích lũy của những chất này đã tăng lên đáng kể so với đối chứng sau khi
được xử lý với loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng (Bảng 1.2).
1.3.2.1. Elicitor sinh học
Thông thường, các elicitor có nguồn gốc phi sinh học hoặc kết hợp elicitor
sinh học và phi sinh học được sử dụng phổ biến hơn. Tuy nhiên, cũng có tác giả
chỉ sử dụng elicitor sinh học trong các nghiên cứu của mình. Chẳng hạn:
Cousins và cs (2010) đã nuôi cấy cây nghệ vàng (C. longa) trong hệ lên
men thể tích 2,5 L có bổ sung nhiều loại elicitor khác nhau để cải thiện khả
năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng. Chẳng hạn: 1)
phenylalanine được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ tuần thứ 12-17; và 2)
proline, dịch chiết cá giàu proline hoặc chitosan được bổ sung vào tuần thứ 20.
Ở trường hợp 1, sinh khối của cây và sự tích lũy các chất chống oxy hóa của
chúng đã giảm sau 5 tuần xử lý. Ở trường hợp 2, hàm lượng các hợp chất phenol
tăng lên 4,7% dw (đối chứng 4,1% dw) khi xử lý nitrogen ở nồng độ thấp sau
1,5 tuần [36].
Khi nuôi cấy in vitro cây nghệ C. mangga, Abraham và cs (2011) nhận
thấy xử lý YE không ảnh hưởng lên sinh khối và hình thành chồi ở cây con.
Ngoài ra, cây con có hình thái bất thường khi được xử lý YE ở nồng độ cao
(>3,5 mg/L). Tuy nhiên, ở các môi trường có bổ sung YE, cây con tích lũy
nhiều chất có hoạt tính bắt gốc tự do. Cây con được nuôi trên môi trường có bổ
sung chitosan 150 mg/L và YE 3,5 mg/L có hàm lượng chất bắt gốc tự do nhiều
hơn các môi trường khác [9].

32. 21
Bảng 1.2. Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro [111]
Loài thực vật Mẫu vật
nuôi cấy
Elicitor Sản phẩm thứ cấp Hàm lượng
Không xử lý Xử lý
Capsicum annum Tế bào T. viride (thô) Capdisol 0 1 mg/bình
Carthamus tinctorius Rễ tơ Vi khuẩn lam (thô) Kinobeon A 0,6 mg/L 5,78 mg/L
C. roseus Rễ tơ Penicillium sp. (thô) Alkaloids (indole) 3 mg/g dw 9 mg/g dw
C. roseus Tế bào Alteromonas macleodii, alginate Phosphodiesterase 0,022 U/mL <0,235 U/mL
C. roseus Tế bào Pythium sp. (thô) Ajmalicine 0 400 µg/L
C. roseus Tế bào T. viride Ajmalicine 79 µg/g dw 166 µg/g dw
C. roseus Tế bào Pythium aphanidermatum (thô) Alkaloids (indole) 50 µmol/L 75 µmol/L
Cupressus usitanica Tế bào Nấm β-thujaplicin 0 187 µg/g dw
Datura stramonium Tế bào Phytopthora megasperma (thô) Alkaloids (tropane) 0,85 mg/g dw 4,27 mg/g dw
D. stramonium Rễ tơ CuSO4 Rishitin 0 Vết
D. stramonium Rễ tơ CdCl2 Sesquiterpenes 0 140 nM/g
Dioscorea deltoidea Tế bào Rhizopus arrhizus (thô) Diosgenin 134 mg/L 230 mg/L
Eschscholtzia californica Tế bào Dịch chiết nấm men (thô) Sanguinarine 20 mg/L 60 mg/L

33. 22
Hyoscyamus muticus Rễ tơ Rhizoctonia solani Sesquiterpenes 0 1 mg/10 g fw
Lithospermum
erythrorhizon
Tế bào Các tác nhân nội sinh (thô) Shikonin 0 28 µg/10mL
Lotus corniculatus Rễ tơ Glutathione Isoflavonoids 0 160 µg/g
Morinda citrifolia Tế bào Chitin 50 (tinh khiết) Anthraquinones 3 µg/g dw 7 µg/g dw
Nicotiana tabacum Rễ tơ Dịch chiết nấm men Sesquiterpenes 1 µg/g dw 87 µg/g dw
N. tabacum Tế bào P. cryptogea (thô) Capsidiol 0 25 µg/mL
Panax ginseng Rễ tơ Selenium Ginseng saponin Đối chứng Tăng 1,33 lần
Papaver bracteatum Tế bào Dendryphion (thô) Sanguinarine 50 µg/g dw 450 µg/g fw
Sanguinaria canadensis Tế bào Verticillium dahliae (tế bào) Dopamine 3 mg/g fw 15 mg/g fw
S. canadensis Tế bào V. dahliae (thô) Sanguinarine 3 µg/g fw 12 µg/g fw
Tagetes patula Rễ tơ F. conglutanis (thô) Thiophene 0,2 g/100g dw 0,55 g/100 g
dw
T. patula Rễ tơ A.niger (thô) Thiophene 1,5 µM/g dw 3,5 µM/g dw
Taxus chinensis Tế bào Trifluoroethyl salicylate Taxuyunnanine C 14 mg/g dw 21,9 mg/g dw
Thalictrum rugosum Tế bào S. cerevisiae (thô) Berberine 0,5% dw 2% dw

34. 23
Ảnh hưởng của các oligosaccharide DP4, DP7 và DP10 tách chiết từ
chủng nấm F. oxysporum Dzf17 lên khả năng tích lũy diosgenin ở D.
zingiberensis đã được Li và cs (2011) nghiên cứu. Tế bào được xử lý với hỗn
hợp oligosaccharide nói trên ở nồng độ 20 mg/L sau 26 ngày nuôi và thu sinh
khối vào ngày thứ 32. Hàm lượng diosgenin đạt được cao nhất là 2,187 mg/L,
gấp 5,65 lần đối chứng. Xử lý từng oligosaccharide riêng lẻ từ 2-10 mg/L cho
thấy DP7 ở 6 mg/L cho hiệu quả cao nhất, lượng diosgenin đạt 3,202 mg/L,
gấp 8,27 lần đối chứng. Khi xử lý DP7 hai lần vào ngày 24 và 26 và thu vào
ngày 30, lượng diosgenin còn tăng lên cao hơn nữa đạt 4,843 mg/L, gấp 12,38
lần đối chứng [77].
Bota và cs (2012) dùng dịch chiết của hai chủng nấm Botrytis và
Sclerotinia để tăng hàm lượng flavonoid ở Digitalis lanata. Bổ sung 1-2 mL
dịch chiết nấm vào 100 mL dịch tế bào của dòng số 11 và 13 đã cải thiện sự
tích lũy flavonoid theo thời gian và nồng độ xử lý. Hàm lượng flavonoid thu
được sau 96 giờ nuôi dòng số 11 đạt 1.000 mg% (dịch chiết Botrytis) và 999,81
mg% (dịch chiết Sclerotinia), trong khi dòng số 13 đạt 1051,65 mg% (Botrytis)
và 1025,43 mg% (Sclerotinia) [27].
Khi bổ sung dịch chiết của A. niger, F. oxysporum và YE vào môi trường
nuôi cấy Hypericum triquetrifolium ở nồng độ từ 0,1-0,75 mg/L, Azeez và cs
(2013) nhận thấy các elicitor này có vai trò khác nhau trong việc sản xuất các
hợp chất thứ cấp. Dùng YE 0,5 mg/L đã tăng hàm lượng p-OH-benzoic acid và
chlorgenic acid lên đáng kể so với đối chứng. Sinh tổng hợp caffeic acid và
tannic acid giảm ở tất cả công thức xử lý nhưng catechin lại tăng khi bổ sung
dịch chiết A. niger. Hypersoid, quercitin và rutin cũng tăng lên nhiều trong các
công thức thử nghiệm [20].
Nuôi cấy rễ tơ cây rau sam (Portulaca oleracea) cũng đã được Pirian và
cs (2013) thực hiện. YE ở các nồng độ 125, 250, 500 và 1.000 mg/L được sử
dụng để cải thiện khả năng tích lũy noradrenaline với thời gian xử lý 2 ngày.

35. 24
Các tác giả nhận thấy YE ở nồng độ 250 và 500 mg/L là thích hợp nhất, hàm
lượng noradrenaline đã tăng 3-4 lần so với đối chứng [117].
Admeh và cs (2014) đã dùng dịch chiết của A. niger, P. notatum, YE và
chitosan để kích thích sản xuất psoralen trong nuôi cấy tế bào cây Psoralea
corylifolia. Bổ sung dịch chiết A. niger đã tăng lượng psoralen lên 9 lần so với
đối chứng. Trong khi dùng P. notatum, YE và chitosan lượng psoralen thu được
ít hơn 4-7 lần. Nói chung, dịch chiết A. niger 1% cho hiệu quả cao nhất, hàm
lượng psoralen đạt 9.850 μg/g sinh khối khô [12].
Nghiên cứu của Hasanloo (2014) cho thấy, chitosan có khả năng kích thích
tổng hợp silymarin trong nuôi cấy rễ tơ của loài Silybum marianum. Rễ tơ sau
30 ngày nuôi cấy được xử lý với chitosan có khối lượng phân tử trung bình.
Hàm lượng silymarin tổng số tăng lên 5,26 lần và khối lượng khô của rễ tơ đạt
cao nhất là 0,535 g sau 96 giờ xử lý với 30 mg/50 mL chitosan [57].
Hiệu quả của các elicitor sinh học cũng được Ebrahimi (2015) thử nghiệm
trong nuôi cấy tế bào Peganum harmala để tăng sinh tổng hợp hai loại alkaloid
β-carboline là harmaline và harmine. Nuôi cấy đã được xử lý với dịch chiết của
các loại nấm (Alternaria alternate, A. flavus, Coriolus versicolor, F.
oxysporum, Mucor sp., P. notatum và Rhizopus stonifer), dịch thủy phân casein
và YE ở các nồng độ khác nhau. Lượng harmine thu được cao nhất khi bổ sung
YE 1.000 mg/L là 91,2 μg/g dw, gấp 1,68 lần đối chứng. Khi bổ sung dịch thủy
phân casein từ 75-100 mg/L vào nuôi cấy, sinh khối tế bào đã tăng mạnh, lượng
harmaline và harmine cũng tăng lần lượt gấp 1,61 và 1,46 lần đối chứng [43].
Silene vulgaris là một loài thực vật được phân bố rộng rãi ở Bắc Mỹ chứa
các saponin loại oleanane có hoạt tính sinh học. Khả năng sản xuất saponin
bằng nuôi cấy rễ tơ của loài này đã được Kim và cs (2015) nghiên cứu thành
công. Rễ tơ của S. vulgaris được hình thành bằng cách lây nhiễm các mẫu lá
với năm chủng Agrobacterium rhizogenes khác nhau (LBA9402, R1000, A4,
13333 và 15834). Khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy, khả năng tích

36. 25
lũy saponin triterpenoid trong rễ tơ có sự thay đổi đáng kể. Lượng segetalic
acid và gypsogenic acid cao gấp 5 và 2 lần tương ứng so với đối chứng [71].
Arican (2016) nghiên cứu ảnh hưởng của các loại elicitor sinh học đến khả
năng tổng hợp triterpene trong nuôi cấy tế bào Alstonia scholaris. Nuôi cấy
được xử lý dịch chiết các loại nấm Candida albicans, F. oxysporum, P.
avelanium và YE. Các elicitor gây ra sự kích thích nhanh chóng quá trình trao
đổi chất thứ cấp của các tế bào A. scholaris dẫn đến tăng tổng hợp triterpenoid.
Khi tiếp xúc trong thời gian dài, một số dòng tế bào có khả năng tăng gấp đôi
sản lượng của triterpene. YE là elicitor tốt nhất cho tất cả các dòng tế bào được
khảo sát với lượng ursolic acid và oleanolic acid tích được tương ứng là 5 và 7
mg/g dw [18].
Hyoscyamine và scopolamine là hai loại alkaloid tropane rất có giá trị,
thường được sử dụng để làm chất chống đông máu, chống co thắt, chống dị
ứng, giảm đau và làm thuốc an thần. Các chất này được phát hiện có nhiều
trong loài Hyoscyamus reticulatus. Để tìm phương pháp sản xuất hyoscyamine
và scopolamine tốt nhất, Moharrami (2017) đã thử nghiệm nuôi cấy rễ tơ của
cây nảy mầm từ hạt được biến nạp chủng A. rhizogenes A7 có xử lý elicitor
sinh học ở các nồng độ và thời điểm khác nhau. Kết quả thu được cho thấy, YE
ở 500 và 250 mg/L sau 48 giờ xử lý là tốt nhất, hàm lượng hyoscyamine và
scopolamine đã tăng gấp 2 và 2,5 lần tương ứng so với đối chứng [103].
Năm 2018, Lee và cs đã nghiên cứu phương thức tăng khả năng tổng hợp
saponin trong nuôi cấy tế bào Kalopanax septemlobus bằng cách sử dụng
elicitor. Khi không bổ sung elicitor, hàm lượng saponin tổng số thu được là
1,56 mg/60 mL sau 15 ngày nuôi cấy. Khi bổ sung coronatine 1 μM, lượng
saponin được tích lũy tăng lên 160%. Ngoài ra, các tác giả nhận thấy coronatine
còn làm tăng biểu hiện sinh tổng hợp β-amyrin từ đó dẫn đến tích lũy oleanolic
acid (tiền thân của oleanan-một loại saponin triterpene) [75].

37. 26
1.3.2.2. Elicitor phi sinh học
Các elicitor phi sinh học thường được dùng phổ biến hơn elicitor sinh học,
nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành theo hướng này. Rezaei và cs
(2011) đã nghiên cứu sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào của cây thủy tùng
(Taxus baccata) bằng cách bổ sung SA từ 25-50 mg/L kết hợp với sóng siêu
âm có tần số 40 kHz trong 2 phút. Hàm lượng taxol thu được ở môi trường có
SA 50 mg/L cao gấp 8 lần đối chứng [126].
MeJA đã được Wang và cs (2015) sử dụng để tăng sản xuất flavonoid
trong nuôi cấy tế bào Hypericum perforatum. Khi bổ sung MeJA 100 μmol/L
vào môi trường trong 15 ngày đã thu được lượng flavonoid cao nhất là 280
mg/L, gấp 2,7 lần đối chứng. Nguyên nhân có thể do MeJA ức chế hoạt tính
catalase nhưng lại tăng hoạt tính phenylalanine ammonia lyase (PAL), những
enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp flavonoid, từ đó tăng tổng hợp
chất này trong quá trình nuôi cấy [159].
Năm 2016, Khojasteh và cs đã sản xuất thành công rosmarinic acid bằng
nuôi cấy tế bào Satureja khuzistanica trong nồi phản ứng sinh học (bioreactor).
Hai elicitor là MeJA (100 μM) và cyclodextrin (40 mM) đã được thử nghiệm
riêng rẻ hoặc kết hợp. Kết quả cho thấy chỉ có MeJA khi dùng riêng rẻ đã tăng
tích lũy rosmarinic acid gấp 3 lần đối chứng, đạt 3,9 g/L. Khi chuyển sang nuôi
cấy trong các bioreactor, lượng rosmarinic acid tích lũy tối đa đạt 3,1 g/L [69].
Manivannan và cs (2016) nghiên cứu ảnh hưởng của MeJA, SA và SNP
lên khả năng sinh tổng hợp các chất chống oxy hóa và các chất chuyển hóa thứ
cấp trong nuôi cấy tế bào Scrophularia kakudensis. Tất cả các elicitor đều có
ảnh hưởng tích cực đến khả năng tích lũy các chất này trong tế bào. Trong đó,
MeJA từ 150-200 μM cho hiệu quả tổng hợp các chất nhóm phenol và flavonoid
cao nhất [91].
Saeed (2017) khi nuôi cấy tế bào của rễ cây Ajuga bracteosa đã bổ sung
thêm MeJA và PAA. Kết quả cho thấy sinh khối tế bào đã tăng đáng kể, đạt tối

38. 27
đa 8,88 g/L dw ở ngày thứ 32 khi bổ sung MeJA 0,6 mg/L, và 8,24 g/L dw ở
ngày thứ 40 khi bổ sung PAA 1,2 mg/L. Ngoài ra, khả năng tích lũy các hợp
chất phenol, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa cũng tăng lên nhiều lần khi
sử dụng hai loại elicitor nói trên [131].
Estrada-Soto và cs (2018) đã nghiên cứu ảnh hưởng của MeJA và SA
trong nuôi cấy callus lá của Leptochinia caulescens để sản xuất ursolic và
oleanolic acid. Nhìn chung, cả hai loại elicitor nói trên đều có ảnh hưởng tích
cực lên quá trình sản xuất ursolic và oleanolic acid. Bổ sung MeJA trong 8 giờ
đã cho kết quả tốt nhất, hàm lượng các triterpen tăng gấp 5 lần đối chứng [45].
Bên cạnh việc sử dụng riêng lẻ các loại elicitor sinh học và phi sinh học,
rất nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng kết hợp các elicitor để mang lại hiệu
quả cao hơn. Artemisinin là chất thường được sử dụng để sản xuất thuốc chống
sốt rét ở các nước châu Á và châu Phi. Ahlawat và cs (2014) đã thiết lập nuôi
cấy rễ tơ cây Artemisia annua để sản xuất bằng cách bổ sung MeJA, dịch chiết
nấm (A. alternate, Curvularia limata, F. solani và Piriformospora indica),
farnesyl pyrophosphate và miconazole vào môi trường nuôi cấy. Kết quả xử lý
riêng rẽ các elicitor cho thấy hiệu quả cao nhất thu được khi sử dụng dịch chiết
P. indica, hàm lượng artemisinin cao gấp 1,97 lần đối chứng. Tuy nhiên, khi
kết hợp xử lý MeJA và P. indica, hàm lượng artemisinin đã tăng lên cao hơn,
đạt 2,44 lần [11].
1.4. CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID
1.4.1. Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid
Năm 1973, Roughly và Whiting đưa ra hai con đường sinh tổng hợp
curcumin ở thực vật dựa trên các dữ liệu phân tích 14
C. Ở con đường thứ nhất,
cinnamic acid kết hợp với malonyl-CoA (có nguồn gốc từ malonic acid) trong
một chuỗi phản ứng mà cuối cùng được aryl hóa thành một curcuminoid. Trong
con đường thứ hai, hai đơn vị muối cinnamate được kết hợp với nhau bằng

39. 28
malonyl-CoA. Cả hai cơ chế cùng sử dụng cinnamic acid có nguồn gốc từ
phenylalanine như điểm khởi đầu của chúng [72], [130].
Bằng cách sử dụng những chất đánh dấu đồng vị phóng xạ, một số nghiên
cứu cho thấy các hợp chất nhóm curcuminoid có nguồn gốc từ các chất trung
gian trong con đường phenylpropanoid kết hợp với các phân tử khác từ con
đường tổng hợp acetate hay chuỗi ngắn và vừa của acid béo. Dựa trên kết quả
này, Schröder (1997) cho rằng các enzyme tương tự như polyketide synthase
đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp các cấu trúc khung của curcuminoid
và sử dụng các CoA có nguồn gốc từ các hợp chất trung gian. Từ đó, hai con
đường sinh tổng hợp curcuminoid đã được đưa ra. Curcuminoid có thể được
hình thành từ sự kết hợp của hai phân tử p-coumaroyl-CoA với một phân tử
malonyl-CoA nhờ hoạt động của polyketide synthase (hoặc tương tự), có thể
do bổ sung diketide trung gian (Berbd và Schneider 2006). Kết quả,
bisdemethoxycurcumin được chuyển thành demethoxycurcumin, rồi thành
curcumin theo hai vòng liên tục của sự hydro hóa và methyl hóa. Mặt khác, có
khả năng enzyme tổng hợp curcuminoid sử dụng các dạng ester CoA của 2
phân tử p-coumaric acid và ferulic acid làm cơ chất. Trong tường hợp này, sự
hydro hóa và methyl hóa dẫn tới sự hình thành các nhóm chức methoxyl trong
phân tử curcumin tương tự như các phản ứng phát hiện trong con đường
phenylpropanoid (Hình 1.2) [124].
Để tìm hiểu quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở cây nghệ vàng (C.
longa), Kita và cs (2008) đã thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro cho loài dược
liệu này với các tiền chất bổ sung vào môi trường chứa 13
C. Kết quả phân tích
hàm lượng demethoxycurcumin và các dạng curcuminoid khác bằng phân tích
cộng hưởng từ hạt nhân 13
C cho thấy một phân tử acetic acid hoặc malonic acid
và hai phân tử phenylalanine hoặc phenylpropanoid (không phải tyrosine) kết
hợp tạo thành demethoxycurcumin. Sự kết hợp với các cơ chất giống nhau để
tạo thành demethoxycurcumin hay curcumin là tương tự nhau, theo thứ tự

40. 29
malonic acid > acetic acid, và cinnamic acid > p-coumaric acid > ferulic acid.
Kết quả này cho thấy có thể hai phân tử cinnamoyl-CoA và một phân tử
malonyl-CoA đã tạo nên curcuminoid, các gốc hydroxy và methoxy trên vòng
thơm được gắn vào sau khi hình thành cấu trúc khung của curcuminoid [72].
Xie và cs (2009) đã nghiên cứu các cơ chế điều hòa biểu hiện gen tổng
hợp các hợp chất thứ cấp ở cây nghệ vàng và nhận thấy có một cơ chế điều hòa
sinh tổng hợp ba dạng curcuminoid. Sự tồn tại của cơ chế điều hòa này đã chứng
minh cho giả thuyết rằng nhóm 3-methoxyl trên vòng thơm của phân tử
curcuminoid được hình thành trước sự hình thành của khung heptanoid trong
quá trình sinh tổng hợp curcumin cũng như sự tồn tại của nhiều gen mã hóa
enzyme thuộc nhóm polyketide synthases với nhiều cơ chất khác nhau, hình
thành nhiều diarylheptanoid trong cây nghệ vàng [163].

41. 30
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng. PAL: phenylalanine ammonia lyase. C4H: cinnamate 4-
hydroxylase. 4CL: 4-coumarate-CoA ligase. CST: p-coumaroyl shikimate transferase. CS3’H: p-coumaroyl 5-O-shikimate 3’-
hydroxylase. CCOMT: caffeoyl-CoA O-methyltransferase [124].

42. 31
1.4.2. Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid
Tham gia vào chu trình sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng có rất
nhiều enzyme khác nhau xúc tác cho nhiều phản ứng trung gian khác nhau,
phần lớn các gen/enzyme này đều đã được nghiên cứu cả về đặc điểm, chức
năng cũng như biểu hiện tái tổ hợp. Trong số đó, các enzyme thuộc nhóm
polyketide synthase type III đóng vai trò hết sức quan trọng. Đây là họ enzyme
thiết yếu trong quá trình sinh tổng hợp flavonoid và các hợp chất polyphenol ở
thực vật bằng cách gắn các nhóm acetyl từ malonyl-CoA lên vị trí liên kết
thioester trên trung tâm hoạt động của polyketide synthase (Hình 1.3) [125].
1.4.2.1. Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS)
Gen DCS mã hóa diketide-CoA synthase là một enzyme thuộc nhóm
polyketide synthase type III xúc tác tạo thành feruloyldiketide-CoA từ feruloyl-
CoA và malonyl-CoA (Hình 1.3) [66], [67].
1.4.2.2. Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS)
Gen CURS mã hóa curcumin synthase là enzyme xúc tác tạo thành
curcuminoid từ cinnamoyldiketide-N-acetylcysteamine và feruloyl-CoA. Hoạt
động đồng thời của DCS và CURS khi có sự hiện diện của feruloyl-CoA và
malonyl-CoA sẽ tạo ra nhiều curcumin, trong khi một mình CURS cho hiệu quả
tổng hợp curcumin thấp cùng với sự hiện diện của feruloyl-CoA và malonyl-
CoA. Như vậy, DCS tổng hợp feruloyldiketide-CoA trong khi CURS xúc tác
chuyển hóa diketide-CoA thành curcuminoid [66].
Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được có ba gen CURS mã hóa ba
enzyme CURS với các vai trò khác nhau. CURS1 xúc tác hình thành curcumin
từ feruloyl-CoA và feruloyldiketide-CoA (được tạo ra bởi hoạt động của gen
DCS). Hai enzyme DCS và CURS1 cùng tham gia xúc tác tạo thành curcumin,
cả hai gen đều sử dụng p-coumaroyl-CoA nhưng hiệu quả thấp, chúng cũng có

43. 32
khả năng sinh tổng hợp demethoxycurcumin từ feruloyl-CoA và malonyl-CoA
theo con đường tạo thành p-coumaroyldiketide-CoA. CURS2 tương tự CURS1
về tính đặc hiệu cơ chất với feruloyl-CoA là cơ chất khởi đầu. CURS3 cũng có
tính đặc hiệu cơ chất như CURS1 và CURS2, sử dụng cả p-coumaroyl-CoA và
feruloyl-CoA làm cơ chất khởi đầu. Giống như CURS1, CURS2 chủ yếu xúc
tác quá trình tạo thành curcumin và demethoxycurcumin bằng cách gắn
feruloyl-CoA với p-coumaroyldiketide-CoA hoặc feruloyldiketide-CoA. Trong
khi đó, CURS3 có khả năng tổng hợp cả 3 loại curcuminoid bằng cách gắn
feruloyl-CoA hoặc p-coumaroyl-CoA với p-coumaroyldiketide-CoA hoặc
feruloyldiketide-CoA. Sự tồn tại của ba gen CURS cho thấy các dạng
curcuminoid được tổng hợp trong củ nghệ không chỉ phụ thuộc vào cơ chất như
p-coumaroyl-CoA và feruloyl-CoA mà còn phụ thuộc vào mức độ biểu hiện
của các gen này (Hình 1.3) [67].
Hình 1.3. Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ở nghệ
vàng [67].
1.4.2.3. Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase

44. 33
Bên cạnh hệ thống enzyme sinh tổng hợp curcuminoid là DCS/CURS
trong củ nghệ vàng, hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện thêm một enzyme
khác thuộc nhóm polyketide synthase type III là curcuminoid synthase (CUS)
ở cây lúa (Oryza sativa) cũng có chức năng tương tự. Enzyme này xúc tác quá
trình tổng hợp curcuminoid như sau: đầu tiên, p-coumaroyl-CoA và malonyl-
CoA kết hợp tạo thành sản phẩm trung gian diketide-CoA. Sau đó, sự kết hợp
giữa diketide-CoA và phân tử p-coumaroyl-CoA khác tạo nên
bisdemethoxycurcumin. Bản thân enzyme CUS xúc tác cho cả 2 bước được
thực hiện riêng rẽ bởi DCS và CURS, vì sử dụng enzyme CUS sẽ đơn giản hơn
sử dụng hệ thống DCS/CURS nên có nhiều ưu thế hơn khi xây dựng hệ thống
tổng hợp curcuminoid trong vi sinh vật [68].
Mặc dù đều có khả năng tổng hợp curcuminoid nhưng hoạt động của hai
hệ enzyme CUS và DCS/CURS có một số điểm khác nhau. CUS tổng hợp
curcuminoid kèm theo sự hình thành của triketide pyrone. Trong khi đó, hệ
enzyme DCS/CURS chỉ tạo thành một lượng rất ít dehydrozingerone là sản
phẩm phụ (dạng vết), có nguồn gốc từ sự thủy phân không có sự tham gia của
enzyme (nonenzymatic hydrolysis) và sự decarboxyl hóa feruloyldiketide-
CoA. Do đó, hệ enzyme DCS/CURS chỉ tổng hợp curcumin và các chất trung
gian là feruloyldiketide-CoA. Hệ thống tổng hợp curcumin trong nghệ vàng
loại bỏ sản phẩm phụ triketide pyrone bằng cách chia quá trình tổng hợp thành
hai phần: phần sử dụng DCS và phần sử dụng CURS. Cơ chất để bắt đầu quá
trình tổng hợp của hai hệ enzyme cũng khác nhau, CUS sử dụng p-coumaroyl-
CoA trong khi cả DCS và CURS sử dụng feruloyl-CoA làm cơ chất khởi đầu
[66].
1.4.2.4. Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase
Chalcone synthase (CHS) là một enzyme thuộc nhóm polyketide synthase
type III, xúc tác cho sự hình thành các hợp chất thứ cấp chính của thực vật như

45. 34
acridone, bibenzyl, biphenyl, benzophenone, chalcone, chromone,
curcuminoid, phloroglucinol, pyrone, resorcinol và stilbene. Các phản ứng
được xúc tác bởi CHS được bắt đầu bằng cách chuyển nhóm acyl từ p-
coumaroyl-CoA lên trung tâm xúc tác cysteine của CHS. Sau đó, kết hợp với 3
phân tử malonyl-CoA đã bị decarboxyl để tạo nên chất trung gian tetraketide.
Phản ứng này được xúc tác bởi trung tâm hoạt động gồm Cys-Asn-His.
Tetraketide sau đó được đóng vòng thơm để tạo thành chalcone [66]. Gần đây,
các nhà khoa học đã tìm thấy gen CHSI (chalcone synthase like gene) và gen
CHSII ở cây nghệ C. caesia, các gen này đã được tạo dòng, phân tích chức năng
và đăng ký ở ngân hàng gen [23]. Trong quá trình sinh tổng hợp curcuminoid,
hoạt động mạnh của gen CHS sẽ làm giảm lượng curcuminoid tạo thành do sử
dụng các hợp chất trung gian là diketide-CoA và malonyl-CoA để tổng hợp nên
chalcone hay triketide pyrone [66].
Resmi và Soniya (2012) đã tìm ra hai gen mới mã hóa các enzyme thuộc
nhóm polyketide synthase type III là ClPKS9 và ClPKS10 từ nghệ vàng. Gen
ClPKS9 có trình tự tương đồng với gen CHS trong khi gen ClPKS10 tương
đồng với gen CUS. Hai gen này có sự biểu hiện khác nhau ở các mô khác nhau,
ClPKS9 biểu hiện mạnh ở chồi và củ hơn ở lá, trong khi đó gen ClPKS10 biểu
hiện mạnh trong lá nhưng rất ít trong rễ và củ [125].
1.4.2.5. Các gen khác
Bên cạnh các gen đã kể trên, con đường phenylpropanoid tổng hợp nhóm
chất curcuminoid còn có sự tham gia của một số gen khác (Hình 1.2).
Gen PAL mã hóa phenylalanine ammonia lyase, enzyme tham gia phản
ứng chuyển hóa đầu tiên trong chu trình phenylpropanoid, khởi đầu của quá
trình sinh tổng hợp curcuminoid. Enzyme này xúc tác phản ứng loại gốc amine
không oxy hóa của L-Phe tạo thành trans-cinnamic acid và NH4
+
[124].
Gen C4H mã hóa cinnamate 4-hydroxylase là monooxygenase phụ thuộc

46. 35
Cyt P450 đầu tiên, tham gia ở bước thứ 2 trong con đường phenylpropanoid.
Enzyme này xúc tác chuyển cinnamic acid thành p-coumaric acid. Hiện nay,
có hơn 20 gen C4H đã được phân lập [138].
Gen 4CL mã hóa 4-coumarate-CoA ligase, enzyme xúc tác phản ứng
chuyển hydroxycinnamic acid (p-coumaric acid, caffeic acid và ferulic acid)
sang dạng CoA esters (p-coumaroyl-CoA, caffeoyl-CoA và feruloyl-CoA)
[128].
Gen CST mã hóa p-coumaroyl shikimate transferase, enzyme tham gia
vào quá trình sản xuất methoxylate phenylpropanoid trong thực vật. Trong các
mô sản xuất curcuminoid, nếu thiếu enzyme này hoặc enzyme này ít hoạt động
thì curcumin sẽ được tổng hợp thông qua bisdemethoxycurcumin, trong đó tất
cả các chất trung gian trong con đường phenylpropanoid đều có nguồn gốc từ
p-coumaroyl-CoA chứ không phải từ feruloyl-CoA. Tuy nhiên, một số nghiên
cứu khác cho rằng enzyme này tham gia vào quá trình tạo ra khung cấu trúc
của curcuminoid và sử dụng cả p-coumaroyl-CoA và feruloyl-CoA làm cơ chất
[124].
1.4.3. Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp
Với sự hiểu biết về các gen cũng như vai trò của chúng trong con đường
sinh tổng hợp curcuminoid ở thực vật nói chung và nghệ vàng nói riêng,
Katsuyama và cs (2008) đã tạo ra hệ thống tổng hợp curcuminoid trong tế bào
E. coli. Trong hệ thống này, gen PAL có nguồn gốc từ nấm men Rhodotorula
rubra, gen 4CL từ cây L. erythrorhizon, gen ACC (acetyl-CoA carboxylase)
từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum và gen CUS từ lúa. Tế bào E. coli
tái tổ hợp được nuôi trong môi trường có tyrosine hoặc phenylalanine, hoặc
cả hai để tổng hợp nên bisdemethoxycurcumin, dicinnamoylmethane và
cinnamoyl-p-coumaroylmethane. Một hệ thống khác chứa hai gen 4CL và
CUS đã tổng hợp được lượng lớn curcuminoid từ các thành phần

47. 36
phenylpropanoid acid bổ sung từ bên ngoài như p-coumaric acid, cinnamic
acid và ferulic acid. Hàm lượng curcuminoid thu được khoảng 100 mg/L
[68], [65].
Rogrigues và cs (2015) đã xây dựng hệ thống tổng hợp curcuminoid nhân
tạo trong E. coli thông qua caffeic acid. Các tác giả đã sử dụng gen tổng hợp
4CL từ Arabidopsis thaliana, gen DCS và CURS1 từ nghệ vàng và đã thu được
70 mg/L curcumin với cơ chất là ferulic acid. Bisdemethoxycurcumin và
demethoxycurcumin cũng được tạo ra nhưng với hàm lượng thấp khi sử dụng
p-coumaric acid hoặc hỗn hợp p-coumaric acid và ferulic acid. Curcuminoid
cũng được tổng hợp từ tyrosine thông qua con đường caffeic acid. Để tạo ra
caffeic acid, gen TAL mã hóa hóa tyrosine ammonia lyase từ Rhodotorula
glutinis, gen C3H mã hóa 4-coumarate 3-hydroxylase từ Saccharothrix
espanaensis đã được sử dụng. Gen COMT mã hóa catechol-O-
methyltransferase từ cỏ linh lăng (Medicago sativa) được sử dụng để chuyển
caffeoyl-CoA thành feruloyl-CoA. Sử dụng caffeic acid, p-coumaric acid hoặc
tyrosine làm cơ chất, các tác giả đã thu được hàm lượng curcumin tương ứng
lần lượt là 3,9, 0,3, và 0,2 mg/L. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng gen DCS
và CURS1 để tổng hợp curcuminoid trong điều kiện in vitro và curcumin được
sản xuất từ tyrosine [128].
Wang và cs (2015) đã sử dụng 7 enzyme khác nhau từ thực vật và vi khuẩn
để tổng hợp nên các hợp chất có giá trị trong E. coli như 4 loại phenylpropanoid
acid (cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeic acid và ferulic acid), 3 chất thuộc
nhóm stilbenoid (resveratrol, piceatannol và pinosylvin), và 3 chất thuộc nhóm
curcuminoid (curcumin, bisdemethoxycurcumin và dicinnamoylmethane).
Trong đó, các gen PAL có nguồn gốc từ Trifolium pretense, 4CL từ A. thaliana,
CUS từ lúa, TAL và C3H từ Saccharothrix espanaensis, COMT từ cỏ linh lăng
và STS mã hóa stilbene synthase từ cây lạc (Arachis hypogaea). Ban đầu, các
tác giả đã biểu hiện các gen PAL, 4CL và CUS trong E. coli để tổng hợp

48. 37
dicinnamoylmethane. Sau đó, họ sử dụng TAL thay cho PAL, biểu hiện đồng
thời TAL, 4CL và CUS trong E. coli đã tạo ra sản phẩm là
bisdemethoxycurcumin (28,9 mg/L). Các tác giả này cũng nhận thấy có thể
tổng hợp curcumin từ L-tyrosine khi biểu hiện đồng thời 4CL và CUS trong E.
coli [160].
1.4.4. Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor
Những nghiên cứu theo hướng này còn chưa nhiều. Park và cs (2016) đã
xử lý YE và AgNO3 để tăng cường mức độ biểu hiện của các gen trong chu
trình phenylpropanoid và sự tích lũy của rosmarinic acid khi nuôi cấy tế bào
cây Agastache rugosa. Kết quả cho thấy bổ sung YE 0,5 g/L và AgNO3 30
mg/L ở các thời điểm khác nhau đều kích hoạt sự biểu hiện của các các gen và
sự tích lũy của rosmarinic acid. Mức độ biểu hiện của các gen RAS mã hóa
rosmarinic acid synthase và HPPR mã hóa hydroxyl phenylpyruvate
reductase tăng lên cao nhất là 1,84, 1,97 và 2,86 lần khi được xử lý YE trong
các thời gian khác nhau 3, 6 và 12 giờ. Đối với gen PAL, mức độ phiên mã tăng
lên tới 52,31 lần khi xử lý bằng AgNO3 sau 24 giờ. Xử lý YE cũng làm tăng
mức độ tích lũy rosmarinic acid lên 4,98 mg/g, trong khi xử lý AgNO3
rosmarinic acid chỉ đạt 0,65 mg/g. Như vậy, có sự tương đồng cao trong việc
tăng mức độ biểu hiện của các gen trong chu trình phenylpropanoid và sự tích
lũy của rosmarinic acid khi được xử lý bằng YE [115].
Loc và cs (2016) đã nghiên cứu tăng cường mức độ biểu hiện của các gen
CaSQS, CabAS và CaCYS trong con đường chuyển hóa phytosterol và
triterpene ở cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban) được xử lý bởi salicilic
acid (50-200 µM). Phân tích PR phiên mã ngược (RT-PCR) và Northern blot
cho thấy các gen CaSQS, CabAS và CaCYS biểu hiện ở cả trong cây tự nhiên
và trong tế bào nuôi cấy (có và không có xử lý elicitor). Trong tế bào được xử
lý elicitor, mức độ biểu hiện của các gen CaSQS, CabAS và CaCYS phụ thuộc
rất lớn vào nồng độ và thời gian xử lý salicilic acid. Mức độ biểu hiện cao nhất

49. 38
được quan sát thấy khi xử lý salicilic acid 100 µM vào ngày thứ 10 của quá
trình nuôi cấy. Salicilic acid nồng độ từ 50-200 µM làm giảm mức độ biểu hiện
của các gen CaCYS và CaSQS trong tế bào được xử lý elicitor so với đối chứng
không xử lý elicitor [88].
Sarkate và cs (2007) đã sử dụng YE để tăng cường sản xuất các hợp chất
thứ cấp nhóm phenol và chất chống oxy hóa từ tế bào cây táo (Malus domestica
‘florina’). Ở các công thức xử lý YE, hàm lượng các hợp chất nhóm phenol và
chất chống oxy hóa đều tăng lên đáng kể, thông qua sự tăng cường hoạt động
của enzyme PAL. Dịch chiết methanol được phân tích HPLC cho thấy các hợp
chất phenol là chlorogenic acid (112 µg/g), 4-coumaric acid (122 µg/g), ferulic
acid (212 µg/g), benzoic acid (244 µg/g) và rutin (348 µg/g) đều tăng lên sau
khi tế bào được xử lý YE. Bên cạnh đó, hoạt tính của các chất chống oxy hóa
như DPPH và FRAP cũng đều tăng lên khi được xử lý YE, tương ứng với sự
tăng tích lũy các hợp chất phenol [136]./.

50. 39
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là sự biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình
sinh tổng hợp curcuminoid trong tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria
Roscoe). Cây nghệ đen có nguồn gốc từ tỉnh Đắk Lắk, được trồng tại thành phố
Huế trước khi được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu (Hình 2.1).
Hình 2.1. Cây nghệ đen.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ thí nghiệm ở hình 2.2 và
sử dụng các phương pháp sau:

51. 40
2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen
2.2.1.1. Khử trùng mẫu vật
Chồi mầm tách từ củ nghệ được rửa sạch bằng nước xà phòng loãng và
nước máy nhiều lần trước khi khử trùng. Chồi được ngâm 30 giây trong cồn
70% và sau đó 20 phút trong dung dịch AgNO3 1% [101]. Sau cùng rửa lại
bằng nước cất vô trùng 5 lần trước khi cấy lên môi trường dinh dưỡng thích
hợp.
Cây nghệ đen
Chồi mầm của củ nghệ Phân lập các gen tổng hợp
curcuminoid
Tái sinh chồi in vitro
Nhân cụm chồi
Tạo rễ
Nhân giống cây in vitro
Củ nghệ
Nuôi cấy callus Phân tích biểu hiện
(RT-PCR và HPLC)
Nuôi cấy tế bào Xử lý elicitor Phân tích biểu hiện
(RT-PCR và HPLC)
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm.