Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Đánh giá độc tính của sodium benzoate, propyl gallate, Tartrazine, amaranth, monosodium glutamate và formaldehyde trên mô hình phát triển phôi cá ngựa vằn

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Nguyễn Tiến Lung
SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA
SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI
TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2013
BÌA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Vũ Anh Tuấn
ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SODIUM BENZOATE,
PROPYL GALLATE, TARTRAZINE, AMARANTH,
MONOSODIUM GLUTAMATE VÀ FORMALDEHYDE
TRÊN MÔ HÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI CÁ NGỰA VẰN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2015

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Vũ Anh Tuấn
ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SODIUM BENZOATE,
PROPYL GALLATE, TARTRAZINE, AMARANTH,
MONOSODIUM GLUTAMATE VÀ FORMALDEHYDE
TRÊN MÔ HÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI CÁ NGỰA VẰN
Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60.42.0114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Lai Thành
TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh
Hà Nội – 2015

3. LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS. TS. Nguyễn Lai
Thành, người thầy đã thu nhận, hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và
kinh nghiệm trong suốt thời gian học tập nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Thầy đã
luôn theo sát, chỉ bảo cho tôi những góp ý quý báu để tôi có thể hoàn thành tốt công
việc.
Tôi cũng rất biết ơn TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi kiến
thức, kỹ năng mới để tôi hoàn thiện được luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến NCS. Đinh Duy Thành, người đã chỉ dạy, hướng
dẫn cho tôi từ những ngày đầu tôi vào làm việc tại phòng, truyền đạt cho tôi những
kinh nghiệm trong công việc cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô công tác tại bộ môn Sinh
học Tế bào cũng như các thầy cô trong khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi những
kiến thức cơ sở, làm nền tảng cho việc thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn tất cả các anh chị, các bạn và các em sinh viên đang học tập
và công tác tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa
học Sự sống, đặc biệt là học viên cao học Lưu Hàn Ly đã luôn bên cạnh giúp đỡ, hỗ
trợ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin được chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, đã luôn ở
bên, động viên cho tôi có thêm nghị lực để vượt qua được khó khăn trong suốt thời
gian qua.
Hà Nội, tháng 12 năm 2015
Học viên
Vũ Anh Tuấn

4. MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................3
1.1. THỰC TRẠNG SỬ DỤNG HÓA CHẤT ........................................................... 3
1.2. PHỤ GIA THỰC PHẨM....................................................................................... 4
1.2.1. Sơ lược về phụ gia thực phẩm..................................................................4
1.2.2. Các loại phụ gia thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu...............6
1.2.2.1. Chất bảo quản - Sodium benzoate...................................................6
1.2.2.2. Chất chống ô xy hóa - Propyl gallate..............................................7
1.2.2.3. Chất tạo màu vàng - Tartrazine ......................................................8
1.2.2.4. Chất tạo màu đỏ - Amaranth ...........................................................9
1.2.2.5. Chất điều vị - Monosodium glutamate ............................................9
1.2.2.6. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng - Formaldehyde ......................10
1.3. CÁC MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH HÓA CHẤT................................. 10
1.3.1. Sử dụng động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất ........11
1.3.2. Mô hình thay thế động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa
chất ............................................................................................................12
1.3.2.1. Mô hình đánh giá độc tính sử dụng tế bào nuôi cấy in vitro.........12
1.3.2.2. Mô hình phôi cá ngựa vằn trong đánh giá độc tính ......................12
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................18
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............................................................................. 18

5. 2.2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ................................................................. 18
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị.......................................................................................18
2.2.2. Hóa chất ....................................................................................................19
2.3. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM............................................................................... 21
2.3.1. Quy trình nuôi cá bố mẹ và thu phôi.....................................................21
2.3.2. Phơi nhiễm với hóa chất .........................................................................21
2.3.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất phụ gia tới sự phát triển phôi
dựa trên hình thái và sức sống ...............................................................23
2.3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa
vằn .............................................................................................................25
2.3.5. Phân tích thống kê ...................................................................................25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................27
3.1. SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SỨC SỐNG CỦA PHÔI CÁ NGỰA VẰN
KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA............................................. 29
3.1.1. Hình thái phôi cá ngựa vằn đối chứng ..................................................29
3.1.2. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu ......................30
3.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102)..................30
3.1.2.2. Phơi nhiễm với chất tạo màu đỏ Amaranth (E123).......................34
3.1.3. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất bảo quản ....................36
3.1.3.1. Phơi nhiễm với sodium benzoate (E211).......................................36
3.1.3.2. Phơi nhiễm với propyl gallate (E310) ...........................................39
3.1.4. Nhóm chất điều vị - Monosodium glutamate (E621)..........................41
3.1.5. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng – Formaldehyde (E240) ...............43
3.1.6. Sự ảnh hưởng của hóa chất đến tỷ lệ phôi nở ......................................47

6. 3.2. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HÓA CHẤT THỬ NGHIỆM ĐẾN NHỊP
TIM PHÔI CÁ NGỰA VẰN............................................................................... 49
3.3. ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHẤT PHỤ GIA TRONG NGHIÊN CỨU............. 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................59

7. DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sự tương đồng về gen hoạt động giữa người, chuột, gà và cá ngựa vằn ..13
Hình 1.2: So sánh kết quả từ thử nghiệm độc tính trên các loài cá và thử nghiệm
trên phôi cá ngựa vằn...............................................................................15
Hình 1.3. Các lĩnh vực nghiên cứu sử dụng phôi cá ngựa vằn và số lượng nghiên
cứu được công bố từ 1992 đến 2015 .......................................................17
Hình 2.1. Hình thái cá ngựa vằn trưởng thành..........................................................18
Hình 2.2. Phân bố nồng độ trên đĩa 24 giếng............................................................22
Hình 2.3. Hình thái phôi cá ngựa vằn ở một số giai đoạn theo Kimmel ..................24
Hình 3.1. Hình thái phôi và ấu thể cá ngựa vằn đối chứng.......................................29
Hình 3.2. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine nồng độ 8 g/l................30
Hình 3.3. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở
thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau thụ tinh ...................................................31
Hình 3.4. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine......................................32
Hình 3.5. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở
thời điểm 96 giờ sau thụ tinh...................................................................34
Hình 3.6. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Amaranth 35
Hình 3.7. Phôi cá ngựa vằn sau 96 giờ phơi nhiễm với Amaranth...........................36
Hình 3.8. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Sodium benzoate.................................37
Hình 3.9. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Sodium benzoate
.................................................................................................................38
Hình 3.10. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Propyl gallate
.................................................................................................................39
Hình 3.11. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Propyl gallate ....................................40
Hình 3.12. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Monosodium glutamate ....................41
Hình 3.13. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với
Monosodium glutamate ...........................................................................42
Hình 3.14. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Formaldehyde ...................................44

8. Hình 3.15. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Formaldehyde
.................................................................................................................45
Hình 3.16. Tỷ lệ các loại dị dạng quan sát được ở 96 giờ sau thụ tinh.....................46
Hình 3.17. Tỷ lệ phôi nở ở thời điểm 72 giờ sau thụ tinh.........................................48
Hình 3.18. Nhịp tim/phút của ấu thể cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với các phụ gia..50
Hình 3.19. Chỉ số LC50 thu được ở các thời điểm của các chất...............................53
Hình 3.20. Các chỉ số độc học của các chất ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh ...........54
Hình 3.21. Chỉ số độc học TI của các chất ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh.............55

9. DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại phụ gia thực phẩm ......................................................................4
Bảng 2.1. Dụng cụ, thiết bị được sử dụng trong luận văn ........................................18
Bảng 2.2. Các loại hóa chất được thử nghiệm ..........................................................20
Bảng 2.3. Một số tiêu chí đánh giá sự phát triển phôi cá ngựa vằn ..........................23
Bảng 3.1. Các dải nồng độ thí nghiệm của các chất .................................................28
Bảng 3.2. Liều lượng an toàn để sử dụng hàng ngày chấp nhận được .....................56

10. BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
ADI
EC50
LC50
LOEC
NOEC
OECD
TI
Viết đầy đủ
Acceptable Daily Intake - Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận
được
Median effective concentration - Nồng độ gây ảnh hưởng 50% cá
thể thí nghiệm
Median lethal concentration - Nồng độ gây chết 50% cá thể thí
nghiệm
Lowest observed effect concentration - Nồng độ thấp nhất quan sát
thấy ảnh hưởng đáng kể so với đối chứng
No Observed Effect Concentration - Nồng độ cao nhất không quan
sát thấy sự ảnh hưởng đáng kể so với đối chứng
Organization for Economic Co-operation and Development – Tổ
chức hợp tác và phát triển Kinh tế
Teratogenic index – chỉ số gây quái thai

11. 1
MỞ ĐẦU
Hóa chất được sản xuất ra trên toàn cầu đang tăng lên nhanh chóng cả về số
hợp chất và sản lượng tạo ra mỗi năm. Cùng với những lợi ích đối với nền kinh tế,
nhiều hóa chất cũng có thể là mối nguy hại tiềm tàng với sức khỏe con người và
môi trường. Việc sử dụng các chất chưa biết độc tính có thể gây ra những hậu quả
nghiêm trọng như việc sử dụng thalidomide dẫn đến hàng ngàn trường hợp chết non
hoặc khuyết tật bẩm sinh [39] hay việc sử dụng DDT đã đe dọa đến sức khỏe của rất
nhiều động vật hoang dã và cả con người [87]... Do đó, việc đánh giá ảnh hưởng
của các hóa chất là rất cần thiết, đòi hỏi phải có các phương pháp kiểm định toàn
diện ở nhiều mức độ.
Việc xác định độc tính hóa chất cho đến nay vẫn đang gặp phải nhiều thách
thức. Thứ nhất, số lượng lớn các hóa chất đã được đăng kí trên thị trường cùng với
những hóa chất mới được tổng hợp chưa được đánh giá độc tính một cách kĩ lưỡng,
chưa kể đến khả năng tương tác giữa các chất có thể gây ra những ảnh hưởng kết
hợp khó đoán trước, do đó đòi hỏi sự ra đời các phương pháp kiểm nghiệm nhanh
chóng và ít tốn kém. Thứ hai, cho đến nay vẫn chưa có một mô hình hoàn hảo để dự
đoán tác động của hóa chất đối với cơ thể người. Mô hình gần nhất với con người là
thử nghiệm trên động vật có vú thì không thể thực hiện trên quy mô lớn do các vấn
đề chi phí và các rào cản bảo vệ động vật. Mô hình thực hiện trên tế bào nuôi cấy lại
không mang tính đại diện cho toàn bộ cơ thể phức tạp, không đánh giá được ảnh
hưởng của các sản phẩm chuyển hóa trong cơ thể [12], thử nghiệm trên động vật
không xương sống thì lại có sự khác biệt rất lớn với con người về các mặt di truyền,
sinh lý, chuyển hóa.
Phôi cá ngựa vằn là mô hình thử độc tính đầy hứa hẹn có thể khắc phục được
những khó khăn trên. Phôi cá ngựa vằn 4-5 ngày sau thụ tinh vẫn chưa được coi là
động vật do đó không bị ràng buộc bởi các quy định nghiêm ngặt đối với động vật
thí nghiệm, phôi có thể được chủ động sản xuất với số lượng lớn, sự phát triển phôi
sớm và hình thành cơ quan ở cá ngựa vằn rất giống với các động vật có xương sống

12. 2
khác nhưng tốc độ phát triển nhanh hơn nhiều: chỉ sau 3 ngày từ phôi đã phát triển
thành ấu thể; phôi cá trong suốt cho phép quan sát được sự ảnh hưởng của hóa chất
trong suốt quá trình phát triển phôi sớm [40], bộ gen cá ngựa vằn cũng có nhiều
điểm tương đồng với động vật có xương sống cao hơn, đặc biệt có trên 12 nghìn
gen tương đồng với con người [32]. Ngoài ra, mô hình phôi cá ngựa vằn không chỉ
có thể đưa ra dự đoán nguy cơ đối với sức khỏe con người mà còn cho phép đánh
giá các ảnh hưởng đến môi trường nói chung [79]. Vì thế mô hình này ngày càng
nhận được sự chú ý của các nhà khoa học trong thử nghiệm độc tính.
Một nhóm hóa chất được có vai trò rất quan trọng trong đời sống hàng ngày
của con người là nhóm các phụ gia thực phẩm. Không ai có thể phủ nhận những ưu
điểm của chúng trong việc cải thiện màu sắc, hương vị của thức ăn cũng như bảo
quản thức ăn trong thời gian dài. Tuy nhiên, mức độ an toàn cũng như độc tính của
chúng đối với sức khỏe con người vẫn là điều cần phải xem xét, những chất đang
được sử dụng hàng ngày có thể có những tác động không mong muốn. Trên cơ sở
đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá độc tính của sodium benzoate, propyl
gallate, Tartrazine, amaranth, monosodium glutamate và formaldehyde trên mô
hình phát triển phôi cá ngựa vằn” nhằm mục tiêu đánh giá được độc tính của các
phụ gia thực phẩm đang được sử dụng là Sodium benzoate, Propyl gallate,
Tartrazine, Amaranth, Monosodium glutamate cùng với một chất phụ gia đã bị cấm
sử dụng là Formaldehyde dựa trên các biến đổi về hình thái và một số hoạt động
chức năng của phôi và ấu thể cá ngựa vằn. Kết quả đề tài cũng góp phần bổ sung
thông tin cho nguồn dữ liệu độc tính của các chất này.

13. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. THỰC TRẠNG SỬ DỤNG HÓA CHẤT
Cùng với sự phát triển của khoa học, kỹ thuật và nhu cầu ngày càng cao của
xã hội, việc sản xuất hóa chất đặc biệt là các hóa chất mới hàng năm đang tăng lên
một cách đáng kể. Theo thống kê của Nordbeck và cộng sự, từ năm 1930 đến 2001,
lượng hóa chất toàn cầu đã tăng từ 1 triệu tấn lên hơn 400 triệu tấn và riêng trên thị
trường liên minh châu Âu EU có khoảng 143 nghìn hợp chất đã được đăng ký,
trong số đó có 30 đến 70 nghìn chất được dùng hàng ngày [59]. Trước khi có quy
định mới trong EU – REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and
Restriction of Chemicals), tất cả các hóa chất trên thị trường trước năm 1981 đều
được sử dụng mà không có bất kì thử nghiệm nào theo quy định của luật để chứng
minh sự an toàn với con người [7]. Mặc dù những hóa chất được sản xuất với khối
lượng lớn trên 1000 tấn một năm đã được kiểm tra, đánh giá kỹ lưỡng hơn nhưng
khoảng 21% trong số này không có bất kì dữ liệu an toàn nào và 65% có rất ít thông
tin [59].
Theo cùng với những lợi ích đối với sự phát triển kinh tế, nhiều hóa chất còn
có thể trở thành mối nguy hại tiềm tàng với sức khỏe con người và môi trường. Việc
sử dụng các chất mà chưa được nghiên cứu đầy đủ mức độ độc tính có thể gây ra
những ảnh hưởng nghiêm trọng. Hai trường hợp được biết đến nhiều là sử dụng
thalidomide như một chất điều hòa miễn dịch, thuốc an thần dẫn đến hàng ngàn
trường hợp thai nhi chết non hoặc khuyết tật bẩm sinh [6, 45] và việc sử dụng
dichloro diphenyl trichlorothane (DDT) đã đe dọa đến sức khỏe của rất nhiều động
vật hoang dã và cả con người [87, 89]... Điều đáng nhắc đến ở đây là có rất nhiều
loại hóa chất mà độc tính của chúng còn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ vẫn
đang được sử dụng trong cuộc sống hàng ngày của con người, chưa kể đến tác động
đồng thời khi chúng kết hợp lại với nhau.

14. 4
1.2. PHỤ GIA THỰC PHẨM
1.2.1. Sơ lược về phụ gia thực phẩm
Phụ gia thực phẩm là nhóm chất được sử dụng hàng ngày, hàng giờ trong
cuộc sống của con người. Theo Ủy ban Bảo vệ Thực phẩm Hoa Kỳ (Food
Protection Committee – FPC), phụ gia thực phẩm là một chất hoặc một hỗn hợp các
chất tuy không phải thành phần cơ bản của thực phẩm nhưng chúng được thêm vào
trong thực phẩm một cách có chủ đích trong các công đoạn của quá trình sản xuất
thực phẩm như chế biến, bảo quản và đóng gói sản phẩm [4].
Ước tính trên thị trường có hơn 2.500 chất phụ gia khác nhau đang được sử
dụng trong thực phẩm [4]. Tại Châu Âu và một số nước trên thế giới, tất cả các loại
phụ gia thực phẩm được quản lý theo hệ thống E, theo đó, mỗi chất được phê duyệt
sẽ được kí hiệu là “E cộng số”, ví dụ Propyl gallate là E310, sodium benzoate là
E211, Tartrazine là E102… Chúng có thể được chia thành sáu nhóm chính là chất
bảo quản, chất phụ gia bổ sung dinh dưỡng, chất tạo màu, chất điều vị, các chất hỗ
trợ chế biến và nhóm các chất khác (Bảng Error! No text of specified style in
document..1).
Bảng Error! No text of specified style in document..1. Phân loại phụ gia thực
phẩm [4, 30]
Phân loại Chức năng Ví dụ
Chất bảo
quản
Chất chống oxy
hóa
Ngăn chặn quá trình oxy hóa
lipid và vitamin
Butylated hydroxy
hydroxyanisole
(E320)
Chất kháng sinh Tránh sự ảnh hưởng của vi
sinh vật và nấm
Sodium acetate
(E262), sodium
benzoate (E211)
Chất chống các
phản ứng hóa
nâu
Chống lại sự hình thành màu
nâu, đen, xám, đỏ không mong
muốn
Sodium sulfite
(E221), Sodium
bisulfite (E222)

15. 5
Chất bổ
sung
dinh
dưỡng
Bổ sung vitamin, các amino
axit, các axit béo và các
khoáng chất
Vitamin B12;
Glutamic acid
Manganese sulfate
Chất tạo
màu
Cải thiện màu sắc, tăng độ hấp
dẫn cho món ăn
Tartrazine (E102)
Amaranth (E123)
Chất điều
vị
Bổ sung vị ngọt, vị chua, và
làm cho món ăn ngon miệng
hơn
Monosodium
glutamate (E621)
Saccharin (E954)
Các chất
hỗ trợ
chế biến
Chất nhũ hóa Giúp các thành phần phân tán
đều trong thực phẩm
Polyoxyethene
(40) stearate
(E431)
Chất ổn định Tạo kết cấu mong muốn, giữ
hương vị lâu hơn
Oat gum (E411)
Chất giữ ẩm Sodium
silicoaluminate
Các loại
khác
Các enzyme,
chất tạo phức,
tạo bọt
Amylase (E1100)
Proteases (E1101)
Theo Cansın Güngörmüş và cộng sự, trung bình mỗi năm, tính cả các loại
đường, muối, tiêu, mật ong … một người tiêu thụ khoảng 139 lbs (khoảng 63kg);
nếu không tính những chất phổ biến đó thì khoảng 2,27 kg phụ gia được sử dụng
[24]. Mặc dù các chất phụ gia thực phẩm đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ qua do
các ưu điểm trong việc cải thiện màu sắc, mùi vị thực phẩm, giúp bảo quản, giảm
thiểu sự hư hỏng thực phẩm do tác động của vi khuẩn và nấm nhưng về cơ bản,
chúng cũng như tất cả các loại hóa chất khác đều tiềm ẩn nguy cơ gây hại cho sức
khỏe con người đặc biệt là khi sử dụng với liều lượng lớn. Ảnh hưởng này có thể
ngay lập tức hoặc tác động về lâu dài nếu sử dụng liên tục trong thời gian dài. Các
tác dụng ngay lập tức có thể bao gồm đau đầu, giảm sự tập trung, thay đổi hành vi

16. 6
hoặc các phản ứng miễn dịch. Ảnh hưởng về lâu dài có thể làm tăng nguy cơ ung
thư, các bệnh tim mạch… [4, 22]. Nghiên cứu của McCann và cộng sự trên 297 trẻ
em cho thấy việc sử dụng hỗn hợp các chất phụ gia gồm hai nhóm là
E102/E110/E122/E124/E211 và E104/E110/E122/E129/E211 có liên quan đến
chứng tăng động ở những đứa trẻ này [49]. Sự tương tác của một số chất khi chúng
kết hợp với nhau cũng đã được Lau Karen và cộng sự nghiên cứu. Cụ thể, hai hỗn
hợp là E104/E951 và E133/L-glutamic axit được cho là ức chế sự biệt hóa dòng
nguyên bào thần kinh chuột NB2a thành các sợi thần kinh và làm tăng tỷ lệ tế bào
chết của dòng tế bào nuôi cấy [44]. Ngoài ra gần đây, một số phụ gia thực phẩm
chậm phân hủy có trong chất thải ra môi trường từ hoạt động của con người đã tích
tụ, gây ô nhiễm và ảnh hưởng đến môi trường nước như butylated hydroxyanisole
(E320) và butylated hydroxytoluene (E321) hay propyl gallate (E310) ảnh hưởng
đến hệ sinh thái trong nước [53, 93]. Vì vậy, việc kiểm tra đánh giá ảnh hưởng của
các phụ gia thực phẩm lên sức khỏe con người và tìm giới hạn an toàn của chúng
trong sản xuất và chế biến thực phẩm là điều rất cần thiết.
1.2.2. Các loại phụ gia thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá độc tính của năm loại phụ gia
đang được sử dụng thuộc ba nhóm là nhóm chất bảo quản với hai đại diện là
Sodium benzoate và Propyl gallate, nhóm chất tạo màu với hai đại diện là
Tartrazine và Amaranth và nhóm chất điều vị với đại diện là Monosodium
glutamate cùng với một phụ gia đã bị cấm sử dụng là Formaldehyde để kiểm chứng
lại độc tính của một phụ gia đã được xác định là độc tới mức không được phép đưa
vào trong thực phẩm.
1.2.2.1. Chất bảo quản - Sodium benzoate
Sodium benzoate có công thức phân tử là NaC6H5CO2, được tạo ra bằng
phản ứng giữa natri hydroxit và axit benzoic. Đây là một chất phụ gia thực phẩm
được kí hiệu là E211, có tác dụng bảo quản thực phẩm tránh khỏi bị hư hỏng bằng
cách kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong môi trường có tính axit.
Trung bình mỗi năm, khoảng 100 nghìn tấn E211 có thể được sản xuất trên toàn thế

17. 7
giới. Theo ủy ban chuyên về phụ gia thực phẩm (JECFA - Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food Additives), liều lượng an toàn để sử dụng hàng ngày với
Sodium benzoate tối đa là 5mg/kg trọng lượng [82]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng
Sodium benzoate có tiềm năng thấp gây ra chứng mề đay do sự hình thành axit
benzoate tiếp xúc trên da [57]. E211 cũng được cho là làm thay đổi nồng độ ion
kẽm trong não dẫn đến sự thay đổi hành vi ở chuột [3, 16]; ảnh hưởng đáng kể đến
sợi trục tế bào thần kinh và các nút thần kinh từ đó gây độc thần kinh ở ấu thể cá
ngựa vằn [8].
1.2.2.2. Chất chống ô xy hóa - Propyl gallate
Propyl gallate (E310) là propyl este của axit 3,4,5-trihydroxybenzoic có công
thức cấu tạo là C12H12O5, tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu kem, không
mùi. Propyl gallate còn có tên gọi khác là gallic acid propyl ester hay Progallin P,
được sử dụng với vai trò là chất chống oxy hóa trong các loại thực phẩm (chủ yếu
có trong thực phẩm chứa hàm lượng chất béo cao), dược phẩm và mỹ phẩm [71].
Vai trò của Propyl gallate trong việc bảo quản nhiều loại sản phẩm phục vụ đời
sống con người là không cần bàn cãi. Tuy nhiên, việc sử dụng như thế nào và liều
lượng là bao nhiêu thì cần phải có các nghiên cứu rất cẩn thận và chi tiết. Trong bản
báo cáo khoa học đánh giá về propyl gallate của ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu
năm 2014, lượng được phép sử dụng mỗi ngày trên 1 ki-lô-gam trọng lượng cơ thể
(Intake Acceptable Daily - ADI) chỉ ở mức 0,5 mg/kg/ngày [15]. Cùng với đó,
nhiều nghiên cứu về tác động của propyl gallate theo các cách khác nhau cũng đã
được công bố. Speijers và cộng sự năm 1993, sau 13 tuần thử nghiệm trên chuột đã
đưa ra nồng độ không quan sát thấy tác dụng phụ (NOAEL) của E310 là 135
mg/kg/ngày và nồng độ cao nhất trong thử nghiệm (527 mg/kg/ngày) đã gây ảnh
hưởng xấu tới hệ thống tạo máu. Khả năng gây đột biến, ung thư của phụ gia thực
phẩm này cũng đã được một số nhà khoa học phát hiên thấy khi có mặt của Cu(II)
và Fe(III) EDTA thông qua sản phẩm chuyển hóa là axit gallic [41]. Tuy nhiên, một
số thử nghiệm khác trên động vật lại không cho thấy propyl gallate có khả năng gây

18. 8
ung thư [85]. Ngoài ra, trên lĩnh vực bảo vệ an toàn môi trường thì E310 đã được đề
nghị xếp vào nhóm gây độc cho sinh vật thủy sinh [93].
1.2.2.3. Chất tạo màu vàng - Tartrazine
Tartrazine có tên hóa học là 3-carboxy-5-hydroxy-1-(4'-sulphophenyl)-4-(4'-
sulphophenylazo) pyrazole trisodium với công thức phân tử C16H9N4Na3O9S2 và
khối lượng phân tử (mole) là 534,36 gam, được kí hiệu là E102 trong danh mục các
phụ gia thực phẩm. Đây là một trong những phẩm màu nhân tạo đươc sử dụng rộng
rãi, không chỉ được dùng để tạo màu vàng cho thực phẩm, đồ uống mà còn được
tìm thấy trong các loại thuốc và mỹ phẩm [51]. Tartazine được các nước thuộc Liên
minh Châu Âu (EU) công nhận là một phụ gia thực phẩm được cho phép và đã
được đánh giá bởi Ủy ban chuyên về phụ gia thực phẩm của FAO/WHO (JECFA)
năm 1996 và Ủy ban Khoa học về thực phẩm (SCF) năm 1984. Các tổ chức này đều
đưa ra lượng Tartrazine được phép đưa vào cơ thể trong một ngày trên 1 kg cân
năng cơ thể (ADI) là 7,5 mg [43]. Tuy nhiên, nhiều báo cáo đã được công bố về
việc Tartrazine có thể gây ra một số phản ứng tiêu cực khi sử dụng như gây ra bệnh
hen suyễn, đau nửa đầu hoặc lupus [66, 74, 84]. Nhiều nghiên cứu đã được thực
hiện trên cả in vitro và in vivo về khả năng gây đột biến hoặc gây ung thư của
Tartrazine cho những kết quả khác nhau. Nghiên cứu của Das năm 2004 sử dụng
thử nghiệm đột biến Ames và thử nghiệm trên tủy xương chuột cùng với nghiên cứu
của Poul năm 2009 sử dụng phương pháp kiểm tra vi nhân tế bào ruột (gut
micronucleus test) cho thấy rằng Tartrazine không gây ảnh hưởng đến genome [11,
67]. Trong khi đó, kết quả nghiên cứu của Sasaki và cộng sự năm 2002 và nghiên
cứu của Mpountoukas năm 2010 lại cho rằng Tartrazine gây ra một số ảnh hưởng
như tăng sai hỏng trong nhiễm sắc thể, ức chế phân bào và tổn thương DNA ở niêm
mạc ruột và bàng quang [52, 77]. Năm 2011, Gao và cộng sự công bố Tartrazine
còn ảnh hưởng tới khả năng học tập và ghi nhớ ở chuột [20]. Do còn nhiều ý kiến
trái ngược về tác động của Tartrazine nên rất cần thêm nhiều nghiên cứu chuyên
sâu, toàn diện về phụ gia thực phẩm này.

19. 9
1.2.2.4. Chất tạo màu đỏ - Amaranth
Amaranth (E123) là chất tạo màu đỏ có công thức cấu tạo
C20H11N2Na3O10S3. Danh pháp theo IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemistry) là trisodium 2-hydroxy-1-(4-sulphonato-1-naphthylazo)
naphthalene-3,6-disulphonate. Amaranth đã được đánh giá bởi tổ chức SCF Châu
Âu năm 1976, 1979, 1883 và tổ chức JECFA vào các năm 1972, 1975, 1978 và
1984 trước khi được cho phép sử dụng như là phụ gia thực phẩm. Dựa trên nghiên
cứu trên chuột trong 90 ngày, SCF đưa ra chỉ số ADI cho Amaranth là từ 0-
0,8mg/kg/ngày còn theo nghiên cứu khác trên chuột về khả năng gây ung thư của
Amaranth nếu sử dụng trong thời gian dài, JECFA đưa ra chỉ số ADI thấp hơn từ 0-
0,5mg/kg/ngày [14]. Từ những năm 70 và 80, các nhà khoa học đã cho rằng
Amaranth có khả năng gây đột biến tuy nhiên nghiên cứu trên vi khuẩn và nấm
không phát hiện thấy khả năng này [2]. Gần đây hơn, Sasaki (2002) đưa ra kết luận
Amaranth gây tổn thương DNA khi phơi nhiễm với tế bào lympho người và ở chuột
[52] trong khi đó, nghiên cứu của Das và cộng sự năm 2004 lại cho thấy kết quả trái
ngược [11]. Nghiên cứu của Mohamed và cộng sự năm 2011 trên chuột mang thai
còn cho thấy rằng khi cho chuột cái uống Amaranth với liều 47 mg/kg vào ngày thứ
sáu đến ngày 15 của thai kỳ, phôi chuột có dấu hiệu chậm phát triển cùng với một
số bất thường về tim, phổi và xương [26].
1.2.2.5. Chất điều vị - Monosodium glutamate
Monosodium glutamate có công thức phân tử là C5H8NO4Na, tên hóa học là
Sodium 2-aminopentanedioate. Đây là một chất phụ gia thực phẩm (E621) có tác
dụng làm tăng cường vị ngọt đặc trưng (vị Umami) cho món ăn. Lượng tiêu thụ
glutamate trên toàn thế giới đã tăng lên đáng kể trong những thập kỉ gần đây [27].
Nghiên cứu của He và cộng sự năm 2008 chỉ ra rằng glutamate có thể làm tăng
nguy cơ thừa cân béo phì [27] nhưng đến năm 2009, Ebert đã phản đối ý kiến này
[13]. Nhiều nghiên cứu lại cho rằng E621 có liên quan đến chứng hen suyễn [19],
co thắt phế quản, nổi mề đay và viêm mũi [91] tuy nhiên những kết quả này kém

20. 10
thuyết phục. Nghiên cứu của Narayanan và cộng sự năm 2010 cho rằng E621 gây ra
sự thay đổi đáng kể hành vi của chuột [56].
1.2.2.6. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng - Formaldehyde
Formaldehyde đã từng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, giúp bảo
quản thực phẩm khô, khử trùng hộp đựng, bảo quản cá và một số loại dầu, chất béo
[36], được ký hiệu là E240. Đây là aldehyde đơn giản nhất có công thức phân tử là
CH2O, thường được biết đến ở dạng dung dịch với nồng độ 37-40% bão hòa trong
nước hay còn được gọi là dung dịch foocmalin. Trong tự nhiên, Formaldehyde được
hình thành từ các chất hữu cơ bởi các quá trình quang hóa trong khí quyển. Nó còn
được hình thành do các chất hữu cơ cháy không hoàn toàn nên có thể được tìm thấy
trong các quá trình đốt khí như khói ô tô, lò hơi hoặc thuốc lá [73]. Formaldehyde
được sử dụng rất phổ biến, có vai trò rất quan trọng trong một loạt các ngành công
nghiệp nhựa, ô tô, hàng không, dệt và ngành công nghiệp xây dựng [63, 70]. Ngoài
ra, nó còn được sử dụng trong lĩnh vực y tế, nông nghiệp, thuộc da [63].... Trên toàn
thế giới năm 1992, lượng E240 được sản xuất ước tính là khoảng 12 triệu tấn [33].
Tuy nhiên, nó cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường và sức khỏe con
người. Phơi nhiễm với Formaldehyde có thể gây ung thư biểu mô vòm họng, bệnh
bạch cầu tủy [58, 81].
1.3. CÁC MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH HÓA CHẤT
Việc xác định độc tính các loại hóa chất nói chung và nhóm phụ gia thực
phẩm nói riêng cho đến nay vẫn đang gặp phải nhiều thách thức. Thứ nhất, theo ước
tính có 1060
phân tử nhỏ [37], trên 61 triệu hợp chất đã được xác định (theo cơ sở dữ
liệu PubChem Compound - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound). Ở các nước
thuộc liên minh châu Âu (EU), có khoảng 2700 chất mới được kiểm tra nguy cơ đối
với con người và môi trường theo đúng quy định [59]. Yêu cầu kiểm định chất mới
được tổng hợp cùng với việc tái kiểm định những hóa chất đang có mặt trên thị
trường, chưa kể đến việc phải xem xét sự ảnh hưởng kết hợp khó đoán trước khi
chúng tương tác với nhau đòi hỏi phải có một phương pháp xác định độc tính một
cách nhanh chóng chính xác. Thứ hai, chưa có một mô hình nào hoàn hảo để dự

21. 11
đoán tác động trên con người. Mô hình gần nhất với con người là thử nghiệm trên
động vật có vú thì không thể thực hiện trên quy mô lớn do chi phí và các rào cản
đạo đức. Các mô hình khác thì đều có các ưu nhược điểm riêng.
1.3.1. Sử dụng động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất
Nói đến các động vật được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu thì cá là loài
chỉ đứng sau các động vật có vú trong việc đánh giá độc tính hóa chất và các mối
nguy hại cho môi trường (theo Ủy ban của cộng đồng châu Âu năm 1996). Chúng
nhận được sự quan tâm chú ý với vai trò là chỉ thị nhằm theo dõi hệ sinh thái thủy
sinh, bảo vệ môi trường nước khỏi các chất ô nhiễm [55]. Thử nghiệm độc cấp tính
trên cá đóng một vai trò rất quan trọng trong việc đánh giá các rủi ro cho môi
trường vì từ những kết quả này có thể ước tính mức độ độc tính của hóa chất cho
các động vật khác [90]. Hơn nữa, theo quy định thì đây là thử nghiệm bắt buộc với
những chất có khối lượng sản xuất từ 1 tấn/năm trở lên trước khi được cấp phép
[18].
Nhiều loài cá khác nhau được sử dụng như sinh vật mô hình trong đánh giá
độc tính sinh thái (ecotoxicology) được đề xuất trong các tài liệu hướng dẫn của tổ
chức OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) như cá
hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá tuế đầu bẹt (Pimephales promelas), bluegill
(Lepomis macrochirus), cá ngựa vằn (Danio rerio), medaka (Oryzias latipes), cá
bảy màu (Poecilia reticulata), và cá chép (Cyprinus carpio) [61, 62]. Thực tế,
không có thử nghiệm trên một loài duy nhất nào có thể áp dụng cho tất cả các chất
và nếu chỉ sử dụng giá trị LC50 từ một loài thì khó đảm bảo độ chính xác về mức
độ độc hại của hóa chất [5]. Vì vậy, cần tiến hành thí nghiệm trên nhiều loài trước
khi đưa ra kết luận. Tuy nhiên, xét cho cùng thì cá vẫn là động vật và vẫn được bảo
vệ theo quyền lợi động vật (theo Chỉ thị 2010/63/EU [17]). Trong hai thập kỷ qua,
nhiều nỗ lực đáng kể đã được các nhà khoa học thực hiện để phát triển phương pháp
thay thế động vật trong các thí nghiệm. Pháp lý quản lý hóa chất mới của châu Âu
(REACH) ủng hộ phương pháp thay thế các thử nghiệm trên động vật nếu có thể
[47].

22. 12
1.3.2. Mô hình thay thế động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất
1.3.2.1. Mô hình đánh giá độc tính sử dụng tế bào nuôi cấy in vitro
Một sự thay thế khá hiệu quả là sử dụng các dòng tế bào nuôi cấy. Nhiều
nghiên cứu đã cho thấy có mối tương quan cao giữa các dòng tế bào khác nhau và
giữa các phòng thí nghiệm [78]. Do sự tương tác ban đầu giữa các chất độc với cơ
thể là ở cấp độ phân tử và tế bào nên từ kết quả mô hình in vitro chúng ta có thể dự
đoán tác động trên cơ thể động vật [80]. Hơn nữa, phương pháp này cũng ít tốn kém
và cũng không mất nhiều thời gian tiến hành nên thường được dùng với mục đích
sàng lọc nhanh số lượng lớn các chất tiềm năng gây độc. Tuy nhiên, độ nhạy của
phương pháp này tương đối thấp có thể là do trong quá trình nuôi cấy thời gian dài
đã làm mất đi một số đặc tính cụ thể như các thụ thể, các enzyme hoặc việc sử dụng
huyết thanh trong môi trường nuôi cấy làm ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm
[78]. Đồng thời, thực hiện trên tế bào nuôi cấy lại không mang tính đại diện cho
toàn bộ cơ thể phức tạp bao gồm sự tương tác và ảnh hưởng qua lại giữa các tế bào
cũng như không đánh giá được ảnh hưởng của các sản phẩm chuyển hóa diễn ra
trong cơ thể sinh vật.
1.3.2.2. Mô hình phôi cá ngựa vằn trong đánh giá độc tính
Phôi cá ngựa vằn là mô hình thay thế đầy hứa hẹn có thể khắc phục được
những khó khăn trên. McKim sau khi tham khảo 150 nghiên cứu độc học sử dụng
các giai đoạn sống khác nhau của cá, ông cho rằng sự ảnh hưởng ở các giai đoạn
đầu có thể được dùng để dự đoán cho ít nhất 80% kết quả độc tính ảnh hưởng lâu
dài [50]. Theo hướng dẫn OECD 236 năm 2013, thử nghiệm áp dụng trên phôi cá
chỉ kéo dài 4-5 ngày [62]. Trong thời gian này, ấu thể cá chưa có khả năng tự kiếm
ăn được nên chưa được coi là một cơ thể động vật [17]. Do đó việc sử dụng phôi
không bị ràng buộc bởi các quy định nghiêm ngặt đối với động vật thí nghiệm. Hơn
nữa, một cá cái có thể đẻ được từ 50-200 trứng mỗi lần ghép [40]. Vì vậy, trong
điều kiện phòng thí nghiệm, số lượng lớn phôi có thể được sinh ra một cách chủ
động nên có khả năng đánh giá của số lượng lớn các chất. Thời gian tiến hành thí
nghiệm cũng như lượng hóa chất sử dụng ít hơn nhiều so với việc đánh giá độc tính

23. 13
trên cá do thực hiện trên đĩa nuôi cấy 24 giếng [62]. Quá trình phát triển phôi sớm
và hình thành cơ quan ở cá ngựa vằn khá giống với các động vật có xương sống
khác nhưng tốc độ phát triển nhanh hơn: sau 3 ngày từ phôi đã phát triển thành ấu
thể và nhiều các cơ quan đã hoàn thiện về chức năng, bên cạnh đó phôi cá trong
suốt cho phép quan sát được sự ảnh hưởng của hóa chất trong quá trình phát triển
phôi sớm [40].
Cá ngựa vằn là sinh vật mô hình phổ biến được sử dụng ở nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới từ khá lâu và trình tự hệ gen đã được giải mã đầy đủ. Các phân
tích trên hệ gen cá ngựa vằn cho thấy có trên 12 nghìn gen tương đồng với hệ gen
người và khoảng 70% gen của người có ít nhất một gen tương đồng trên cá ngựa
vằn (Hình Error! No text of specified style in document..1) [31].
Hình Error! No text of specified style in document..1. Sự tương đồng về gen hoạt
động giữa người, chuột, gà và cá ngựa vằn [31]
Có nhiều cấp độ, tiêu chí có thể được thực hiện trong các thử nghiệm trên mô
hình này. Cấp độ đánh giá đơn giản nhất là dựa trên các tác động của hóa chất đến
hình thái bên ngoài của phôi và ấu thể cá ngựa vằn. Mọi loại hóa chất đều có thể
gây độc tùy thuộc vào giá trị nồng độ sử dụng. Ở một ngưỡng nào đó, tác động của
chúng sẽ biểu hiện ra hình thái bên ngoài gây dị dạng, quái thai hoặc ảnh hưởng đến

24. 14
sức sống của phôi/ấu thể thí nghiệm. Đích tác động và cũng là tiêu chí quan sát để
so sánh với đối chứng rất đa dạng: có thể là mắt, vùng tim, vùng noãn hoàng, hình
dạng trục cơ thể … Số liệu thu được sẽ được phân tích thống kê để xây dựng đường
cong thể hiện sự đáp ứng với các nồng độ thí nghiệm và tính một số chỉ số độc học
như giá trị LC50 (Median lethal concentration) là nồng độ của chất thử gây chết
50% tổng số phôi/ ấu thể trong lô thí nghiệm hoặc giá trị EC50 (Median effective
concentration) là nồng độ chất thử gây dị dạng 50% số phôi/ấu thể sống sót [62].
Nhiều sàng lọc di truyền quy mô lớn đã phát hiện nhiều đột biến gen cá ngựa
vằn tương đồng với những đột biến gen gây bệnh ở người, từ đó gây ra các dạng
kiểu hình giống nhau, ví dụ như bệnh lý tế bào của đột biến thoái hóa cơ cá ngựa
vằn biểu hiện tương tự chứng loạn dưỡng cơ ở người. Một trong những đột biến là
sapje - đột biến mang khiếm khuyết làm suy yếu gen dystrophin ở cá ngựa vằn, cái
mà tương đồng với gen người khi bị ảnh hưởng trong hội chứng loạn dưỡng cơ
Duchenne – một dạng thường gặp của hội chứng loạn dưỡng cơ ở người [46]. Khi
phơi nhiễm với cùng loại hóa chất, các đặc điểm hình thái quan sát được trên phôi
cá ngựa vằn cũng có nhiều điểm tương đồng với các bệnh trên con người. Ví dụ,
Ethanol gây hiện tượng cyclopia – hiện tượng hai mắt gần sát nhau trên ấu thể cá
ngựa vằn khi phơi nhiễm từ giai đoạn phôi vị cũng là một loại kiểu hình được quan
sát thấy ở các em bé tiếp xúc với nồng độ cồn cao trong thời gian ở trong bụng mẹ
[48]. Ethanol cũng gây ra các khiễm khuyết thị giác ở ấu thể cá ngựa vằn [25] và sự
ảnh hưởng tương tự cũng được ghi nhận ở người. Do đó, hình thái phôi/ ấu thể cá
ngựa vằn phơi nhiễm với hóa chất cũng có thể được sử dụng để dự đoán tác động
của hóa chất trên cơ thể người.
Năm 2009, với mục tiêu đưa ra một sự ủng hộ có tính khoa học cho việc thay
thế các thử nghiệm độc cấp tính trên cá trưởng thành (theo hướng dẫn OECD 203
[60]) bằng thử nghiệm trên phôi cá, Lammer và cộng sự đã tiến hành thu thập các
kết quả các nghiên cứu áp dụng mô hình thử nghiệm trên một số loài cá theo hướng
dẫn của OECD trong đó có cá ngựa vằn đã được công bố trên cơ sở dữ liệu US EPA
ECOTOX (US EPA, 2002: http://cfpub.epa.gov/ ecotox/) và cơ sở dữ liệu ECETOC

25. 15
Aquatic Toxicity [83] để so sánh với kết quả từ các nghiên cứu trên mô hình phôi
các loài cá [42]. Phân tích kết quả cho thấy mô hình phôi cá ngựa vằn có sự tương
đồng cao với mô hình thí nghiệm trên cá ngựa vằn trưởng thành nói riêng (Hình
Error! No text of specified style in document..2A) cũng như với các loài cá do
OECD chỉ dẫn nói chung (Hình Error! No text of specified style in document..2B).
Điều này cũng chứng tỏ rằng phôi cá ngựa vằn là mô hình hiệu quả có thể thay thế
cho các phương pháp đánh giá sử dụng động vật thí nghiệm.
Hình Error! No text of specified style in document..2: So sánh kết quả từ thử
nghiệm độc tính trên các loài cá và thử nghiệm trên phôi cá ngựa vằn
Giá trị LC50 thu được của các thử nghiệm phôi cá ngựa vằn được so sánh với thử nghiệm
cá ngựa vằn trưởng thành sử dụng 21 hợp chất (hình A) và với các thử nghiệm trên nhiều
loài cá của OECD sử dụng 70 hợp chất (hình B)
Trong quá trình phát triển phôi sớm ở cá ngựa vằn, bắt đầu từ khoảng 30-36
giờ sau thụ tinh thì tim phôi bắt đầu đập những nhịp đầu tiên. Sau đó, tim đập
thường xuyên và đều đặn hơn [40]. Việc phơi nhiễm với hóa chất có thể ảnh hưởng
đến chức năng của cơ quan này và biểu hiện bởi số nhịp tim trong một phút, sự khử
cực và tái phân cực. Nhịp tim cũng là một trong các chỉ tiêu được sử dụng nhiều
trong các nghiên cứu sàng lọc thuốc cũng như đánh giá ảnh hưởng của các chất đến
chức năng tim [21, 23, 65].

26. 16
Ngoài chức năng của tim, chức năng của một số cơ quan khác trong quá trình
phát triển phôi cá ngựa vằn cũng được dùng trong đánh giá như gan, thận, mắt…
[9]. Để nghiên cứu sự ảnh hưởng đến hệ vận động cũng như ảnh hưởng đến thần
kinh, biểu hiện hành vi của ấu thể cá khi phơi nhiễm với hóa chất là tiêu chí được
lựa chọn [68]. Các thử nghiệm chức năng cơ quan, hệ cơ quan có thể cho độ nhạy
cao hơn so với các đánh giá hình thái thông thường.
Những nghiên cứu chuyên sâu hơn được áp dụng trên mô hình này là đánh
giá mức độ biểu hiện của gen, protein bằng các phương pháp RT-PCR, lai tại chỗ.
Chuyển gen sử dụng các công cụ hướng đích mới như Zinc-finger [92], CRISPR
[34, 35] cũng có thể áp dụng trên mô hình phôi cá ngựa vằn để nghiên cứu sự thay
đổi di truyền và ung thư. Ngoài ra, việc nghiên cứu một số quá trình sinh học như
apoptosis, lưu thông máu trong mạch, sự hình thành xương trên phôi/ấu thể cá cũng
được nghiên cứu bằng cách nhuộm với các thuốc nhuộm đặc hiệu [29].
Mô hình phôi cá ngựa vằn còn được ứng dụng trong việc sàng lọc các phân
tử nhỏ có hoạt tính sinh học hoặc sàng lọc thuốc [64, 75]. Vì tất cả các lý do trên,
mô hình này nhận được sự quan tâm rất lớn từ các nhà khoa học trên thế giới từ rất
nhiều lĩnh vực như khoa học môi trường, dược học, hóa sinh học, y tế, nông nghiệp,
khoa học vật liệu….(Hình Error! No text of specified style in document..3A) Số
lượng bài báo khoa học đã công bố sử dụng phôi cá ngựa vằn tăng qua các năm
cũng minh chứng cho điều này (Hình 1.3B).

27. 17
Hình Error! No text of specified style in document..3. Các lĩnh vực nghiên cứu sử
dụng phôi cá ngựa vằn (Hình A) và số lượng nghiên cứu được công bố từ 1992
đến 2015 (Hình B)

28. 18
Số liệu được lấy từ cơ sở dữ liệu Scopus (Scopus.com) với kết quả là các bài báo đã được
công bố có chứa cụm từ:(rerio hoặc zebrafish hoặc "zebra fish") và (embryo* *toxic*)
xuất hiện trong tiêu đề/tóm tắt/từ khóa tính đến tháng 11 năm 2015
CHƯƠNG 2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Từ một số cửa hàng cá cảnh tại Hà Nội, chúng tôi thu thập cá ngựa vằn
trưởng thành (Danio rerio) có chiều dài từ 3-5 cen-ti-mét, có các sọc vằn đặc trưng
chạy dọc theo chiều dài cơ thể, vây và đuôi như mô tả bởi Dahm năm 2006 (Hình
Error! No text of specified style in document..4). Sau đó, chúng được lựa chọn qua
2 - 3 thế hệ tại phòng Công nghệ Tế bào động vật – khoa Sinh học – Trường Đại
học Khoa học Tự Nhiên trước khi sử dụng cho nghiên cứu.
Hình Error! No text of specified style in document..4. Hình thái cá ngựa vằn
trưởng thành [10]
Thước đo có độ dài 1 cen-ti-mét
2.2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài được liệt kê trong Bảng Error! No text of
specified style in document..2.

29. 19
Bảng Error! No text of specified style in document..2. Dụng cụ, thiết bị được sử
dụng trong luận văn
STT Tên dụng cụ, dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Kính hiển vi soi nổi Zeiss Đức
2 Cân gam Sartorius Đức
3 Cân mi-li-gam Precisa Anh
4 Tủ hút khí độc ESCO Singapore
5 Máy lọc nước RO Kangaroo Đài Loan
6 Máy ảnh Canon Nhật Bản
7 Pipetman 200 µl Gilson Pháp
8 Pipetman 1000 µl Gilson Pháp
9 Đĩa 24 giếng Corning Mỹ
10 Đĩa 6 giếng Corning Mỹ
11 Đĩa petri Corning Mỹ
12 Ống Falcon 50ml Corning Mỹ
13 Bơm pipet Mỹ
14 Pipet 10ml Corning Mỹ
2.2.2. Hóa chất
Trong nghiên cứu này, năm loại phụ gia thực phẩm được sử dụng ở dạng bột
là Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine, Amaranth, Monosodium glutamate,
riêng Formaldehyde ở dạng dung dịch với nồng độ gốc là 36% (Bảng Error! No
text of specified style in document..3). Tất cả các loại phụ gia nêu trên đều được

30. 20
hòa tan thành dung dịch gốc và pha loãng thành các dải nồng độ thí nghiệm bằng
môi trường nuôi phôi tiêu chuẩn E3 với thành phần: NaCl 5 mmol/L; KCl 0,17
mmol/L; CaCl2 0,4 mmol/L và MgSO4 0,16 mmol/L.

31. 21
Bảng Error! No text of specified style in document..3. Các loại hóa chất được thử
nghiệm
Tên hóa chất
Hãng
sản xuất
Công thức cấu tạo
Khối
lượng
phân tử
Sodium benzoate
(E211)
Sigma
Aldrich
144,1
Propyl gallate
(E310)
Fluka 212,2
Tartrazine (E102)
Sigma
Aldrich
534.36
Amaranth (E123)
Sigma
Aldrich
604.47
Monosodium
glutamate (E621)
Sigma
Aldrich
187,13
Formaldehyde
(E240)
Merck 30,03

32. 22
2.3. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM
Dựa theo tài liệu hướng dẫn của tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD
về việc thử độc trên phôi cá ngựa vằn năm 2013 [62] và hướng dẫn đánh giá chất
lượng nước thải của tổ chức tiêu chuẩn thế giới ISO, chúng tôi tiến hành thí nghiệm
theo các bước sau: nuôi và ghép cá bố mẹ, thu – rửa phôi, chọn phôi, phơi nhiễm
với hóa chất, thu và phân tích kết quả.
2.3.1. Quy trình nuôi cá bố mẹ và thu phôi
Cá ngựa vằn bố mẹ được nuôi duy trì ở điều kiện nhiệt độ 260
C ± 10
C và chu
kì sáng/tối là 14/10 giờ. Nước bể nuôi được lọc liên tục để đảm bảo độ sạch. Cá
được cho ăn bằng sản phẩm thương mại bán sẵn cho cá cảnh 1-2 lần/ngày và được
bổ sung bằng thức ăn tươi là ấu trùng muỗi lắc Chironomus.
Vào cuối chu kì sáng trước ngày thu phôi, cá bố mẹ sẽ được bắt vào bể ghép
với tỉ lệ 1:1. Cá đực và cái sẽ được ngăn cách nhau bằng một tấm lưới với mục đích
ngăn cản sự giao phối trong đêm. Chúng tôi tiến hành ghép cá vào đầu chu kì sáng
ngày hôm sau bằng việc rút tấm lưới ngăn cách để chúng giao phối đồng thời đặt
tấm lưới phía dưới đáy để ngăn cản cá bố mẹ ăn trứng. Thời điểm này sẽ được tính
là 0 giờ sau thụ tinh (hour post fertilization).
Sau 30 phút giao phối và đẻ trứng, cá bố mẹ được đưa trở lại bể nuôi. Phôi cá
sẽ được thu và đặt vào đĩa petri rồi được được rửa nhiều lần bằng môi trường E3 để
loại bỏ các chất bẩn cùng những phôi không được thụ tinh. Việc ghép cá thường
được thực hiện với ít nhất 3 bể và chỉ phôi ở những bể có tỉ lệ thụ tinh trên 90% mới
được sử dụng cho thí nghiệm.
2.3.2. Phơi nhiễm với hóa chất
Thí nghiệm của chúng tôi được xây dựng dựa theo hướng dẫn thử nghiệm
độc tính hóa chất trên phôi cá ngựa vằn của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế
(OECD 236 công bố ngày 26/7/2013) và hướng dẫn đánh giá chất lượng nước thải
theo ISO 15088:2007. Theo đó, việc phơi nhiễm phôi nên được thực hiện sớm nhất
có thể và muộn nhất là không quá 3 giờ sau thụ tinh (giai đoạn 128 tế bào) [62].

33. 23
Sau khi được rửa sạch, phôi thụ tinh giai đoạn 4 đến 32 tế bào được chuyển
vào đĩa 6 giếng đã có sẵn hóa chất thí nghiệm (trên 25 phôi/một nồng độ/giếng).
Những phôi khỏe mạnh, phát triển bình thường sẽ được chọn dưới kính hiển vi soi
nổi với độ phóng đại tối thiểu là 20x. Giai đoạn phân cắt từ 4 tế bào trở đi, phôi chất
lượng tốt có thể dễ dàng phân biệt với phôi không thụ tinh hoặc bất thường dựa vào
sự trong suốt, đĩa phôi được phân cắt đồng đều, đối xứng, màng phôi và khối noãn
hoàng nguyên vẹn. Những phôi tốt được chuyển ngẫu nhiên mỗi phôi vào một
giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng đã có sẵn 1ml hóa chất ở mỗi giếng theo sơ đồ bố
trí nồng độ thí nghiệm như Hình Error! No text of specified style in document..5.
Hóa chất thí nghiệm được pha theo một dải từ sáu đến tám nồng độ sử dụng
môi trường E3. Dải này thu được sau nhiều thí nghiệm kiểm tra giới hạn tác động
(limit test) với mục đích tìm ra khoảng nhỏ nhất có chứa nồng độ gây chết toàn bộ
phôi và nồng độ không quan sát thấy ảnh hưởng sau khi kết thúc thí nghiệm. Mỗi
nồng độ được tra vào 20 giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng, 4 giếng còn lại là đối
chứng nội là dung môi hòa tan các chất thử (trong thí nghiệm này là môi trường E3)
(Hình Error! No text of specified style in document..5).
Hình Error! No text of specified style in document..5. Phân bố nồng độ trên đĩa
24 giếng
T: các giếng có cùng nồng độ hóa chất thí nghiệm, C: đối chứng
Cứ sau 24 giờ, mỗi giếng trong các đĩa thí nghiệm lại được thay khoảng
700µl/giếng bằng dung dịch mới có nồng độ hóa chất tương ứng. Quy trình được

34. 24
tiến hành tương tự với đĩa đối chứng (môi trường E3) để so sánh đối chiếu. Toàn bộ
thí nghiệm được giữ ở nhiệt độ 260
C ± 10
C. Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3
lần.
2.3.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất phụ gia tới sự phát triển phôi dựa
trên hình thái và sức sống
Tại các thời điểm 24, 48, 72, 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi sẽ quan sát phôi
dưới kính hiển vi soi nổi và đánh giá theo các tiêu chí như Bảng Error! No text of
specified style in document..4. Việc đánh giá hình thái phôi sẽ dựa vào các đặc
điểm phôi cá ngựa vằn theo mô tả của Kimmel và cộng sự (Hình Error! No text of
specified style in document..6) [40]. Kết quả của thí nghiệm chỉ được chấp nhận khi
tỷ lệ phôi còn sống của đối chứng ở thời điểm kết thúc thí nghiệm đạt trên 90%.
Bảng Error! No text of specified style in document..4. Một số tiêu chí đánh giá sự
phát triển phôi cá ngựa vằn
Tiêu chí Miêu tả
Thời gian (giờ sau
thụ tinh)
24 48 72 96
Tiêu chí gây chết
Đông tụ Phôi màu trắng đục và không nhận rõ cấu
trúc
x x x x
Tim không đập Không quan sát thấy tim đập x x
Tiêu chí dị dạng
Cong vẹo trục cơ
thể
Trục cơ thể bị uốn cong ở một vài điểm
Dị tật đuôi Đuôi ngắn hoặc cong so với bình thường x x
Sắc tố Giảm sắc tố mắt và thân x x
Phù màng bao tim Màng bao ngoài tim bị phù x x
Phù túi noãn
hoàng
Màng bao noãn hoàng xuất hiện túi chứa
dịch
x x x

35. 25
Noãn hoàng xù xì Bề mặt khối noãn hoàng xù xì x
Phù đầu
Hoại tử
Phần đầu xuất hiện túi chứa dịch
Đầu hoặc thân xuất hiện khối tế bào chết
x x x
x x
Nghẽn mạch máu
Chưa nở
Xuất hiện các điểm máu tụ trên cơ thể
Phôi còn sống nhưng chưa thoát khỏi lớp
màng phôi
x x x
x
Tiêu chí đánh giá trên được xây dựng dựa theo tiêu chí được mô tả bởi Nagel
và cộng sự năm 2002 [54].
Hình Error! No text of specified style in document..6. Hình thái phôi cá ngựa vằn
ở một số giai đoạn theo Kimmel [40]
Nhiệt độ môi trường khi quan sát 28o
C. Thanh kích thước chuẩn có độ dài 250 µm,

36. 26
hpf: giờ sau thụ tinh; tb: tế bào

37. 27
2.3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa
vằn
Phôi cá ngựa vằn giai đoạn 4 đến 32 tế bào sẽ được phơi nhiễm với các nồng
độ hóa chất và đối chứng E3 trên đĩa 6 giếng; 10 phôi mỗi nồng độ/giếng. Nhịp tim
của ít nhất 5 trên 10 phôi này (chọn ngẫu nhiên) sẽ được ghi lại bằng máy quay
phim dưới dạng các video có độ dài một phút và thí nghiệm sẽ được tiến hành hai
lần. Số nhịp tim của phôi/ấu thể cá khi phơi nhiễm với hóa chất sẽ được đếm và so
sánh thống kê với phôi/ấu thể đối chứng của chính lô thí nghiệm đó theo tỷ lệ phần
trăm sử dụng phần mềm GraphPad Prism 6.07.
2.3.5. Phân tích thống kê
Các phép tính toán cơ bản được tính bằng công cụ Microsoft Excel 2013.
Phần mềm GraphPad Prism 6.07 thực hiện tất cả các phân tích thống kê bao gồm
các phép hồi quy và các so sánh giữa các lô thí nghiệm với lô đối chứng.
Kết quả của thí nghiệm về tỷ lệ phôi còn sống cũng như tỷ lệ phôi dị dạng sẽ
xử lý hồi quy với dạng bốn tham số của phương trình Sigmoidal:
Trong đó: Top và Bottom là giá trị cao nhất và thấp nhất của Y
Y là tỷ lệ phôi chết/sống hoặc dị dạng
X là log của nồng độ thí nghiệm
XC50 có thể là giá trị LC50 hoặc EC50
HillSlope thể hiện độ dốc của đường cong
Từ đó, phần mềm cho phép đưa ra biểu thức và đồ thị thể hiện mối quan hệ
giữa nồng độ thí nghiệm và sự ảnh hưởng của hóa chất đối với sự phát triển phôi cá
ngựa vằn đồng thời tính các chỉ số độc tính LC50 – nồng độ gây chết 50% phôi thí
nghiệm và EC50 – nồng độ gây ảnh hưởng đến 50% phôi hoặc ấu thể. Dựa trên kết
quả thu được, chỉ số gây quái thai TI (Teratogenic index) sẽ được xác định bằng tỷ

38. 28
số LC50/EC50. Một chất được cho là gây quái thai khi TI >1 và được cho là gây
chết phôi khi TI < 1 [69].
Phương pháp Mann Whitney test được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa
lô đối chứng và các nồng độ thí nghiệm về tỷ lệ phôi nở ở 72 giờ cũng như số nhịp
tim/phút. Sự khác biệt được cho là có ý nghĩa khi p < 0,05.
Chỉ số NOEC (No Observed Effect Concentration) cho biết nồng độ hóa chất
thí nghiệm cao nhất không có ảnh hưởng đáng kể đến phôi thí nghiệm và chỉ số
LOEC (Lowest observed effect concentration) cho biết nồng độ thấp nhất tác động
đáng kể đến phôi thí nghiệm theo các tiêu chí đã nêu ở trên được xác định bằng
Dunnett’s test với độ tin cậy 95%.

39. 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD và tổ chức tiêu chuẩn quốc tế
ISO đã đưa ra các tài liệu hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất sử dụng phôi cá
ngựa vằn (OECD 236 và ISO 15088:2007). Dựa vào đó, nhóm nghiên cứu của
chúng tôi đã xây dựng quy trình thí nghiệm áp dụng trong điều kiện sẵn có của
phòng thí nghiệm và ứng dụng trong đánh giá độc tính của ba dung môi là ethanol,
dimethyl sulfoxide và acetone [1]. Kết quả thu được có độ tương đồng cao với kết
quả được đưa ra bởi OECD. Phương pháp sử dụng trong luận văn này giống với
phương pháp trong nghiên cứu trên chứng tỏ kết quả đưa ra có thể được chấp nhận
và có độ tin cậy cao.
Để xác định dải nồng độ cho thí nghiệm đánh giá độc tính của các chất,
chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với nhiều nồng độ để tìm ra một khoảng nồng độ
hẹp nhất mà vẫn đảm bảo giá trị dưới không gây bất kì ảnh hưởng nào đến phôi, ấu
thể thí nghiệm và giá trị trên gây chết toàn bộ phôi sau khi thí nghiệm kết thúc (96
giờ sau thụ tinh). Dung dịch gốc của các chất thử nghiệm được chuẩn bị bằng cách
hòa tan từ dạng bột (với Sodium benzoate, Propyl gallate, Amaranth, Tartrazine,
Monosodium glutamate) và từ dạng dung dịch Formaldehyde 36% trong môi trường
E3 sau đó cũng được pha loãng thành các dải nồng độ bằng môi trường E3. Ở một
vài thử nghiệm đầu, hóa chất sẽ được đánh giá ở những dải nồng độ rộng rồi thu
hẹp dần dựa trên kết quả thu được của thí nghiệm trước đó. Sự tác động của các hóa
chất đến sinh vật thường tuân theo phương trình Sigmoidal với giá trị nồng độ biểu
diễn theo thang logarit. Do đó, chúng tôi chia khoảng nồng độ đã xác định thành
một dải gồm sáu đến tám nồng độ dựa theo một cấp số nhân với giá trị công bội tùy
thuộc vào từng chất thí nghiệm. Cuối cùng, chúng tôi thu được các dải nồng độ
đánh giá cho từng chất như Bảng 3.1.

40. 30
Bảng Error! No text of specified style in document..5. Các dải nồng độ thí nghiệm của các chất
Tên hóa chất
Kí
hiệu
Độ tan trong
100 ml nước
Đơn vị
pha loãng
Dải nồng độ thí nghiệm
Sodium
benzoate
E211 62,87 g mg 25 45 80 145 260 350 500 650
Propyl gallate E310 350 mg mg 15 20 26 35 45 60 75
Amaranth E123 5 g g 0,1 0,2 0,5 1 2 4 8
Tartrazine E102 14 g g 0,25 0,5 1 2 4 8 16
Monosodium
glutamate
E621 10 g g 2 5 10 15 25 40 60
Formaldehyde E240 37-40 g ppm 140 170 200 240 290 350 420

41. 31
3.1. SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SỨC SỐNG CỦA PHÔI CÁ NGỰA
VẰN KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA
3.1.1. Hình thái phôi cá ngựa vằn đối chứng
Hình thái của phôi, ấu thể cá ngựa vằn ở lô đối chứng cũng được ghi nhận và
được sử dụng như một tiêu chuẩn để xác định sự dị dạng khi phơi nhiễm với hóa
chất. Ở 24 giờ sau thụ tinh, bên trong phôi đã xuất hiện những chuyển động tự phát.
Mắt, đá tai đã hình thành, đồng thời đuôi đã phát triển dài và tách khỏi khối noãn
hoàng. Phần mở rộng của noãn hoàng cũng đã thấy rõ ràng (Hình Error! No text of
specified style in document..7).
Ở 48 giờ sau thụ tinh, chúng ta có thể dễ dàng quan sát thấy rõ nhịp đập đều
đặn của tim cùng với dòng vận chuyển máu dọc theo trục cơ thể và trên noãn hoàng.
Sắc tố cũng hình thành đầy đủ ở mắt và dọc theo cơ thể đến tận cuối của đuôi. Các
chất trong noãn hoàng được sử dụng làm chất dinh dưỡng nuôi cơ thể nên kích
thước của noãn hoàng giảm đi rõ rệt so với thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Đến thời
điểm 96 giờ sau thụ tinh, ấu thể đã thoát ra khỏi lớp màng phôi và có thể bơi tự do.
Lúc này, trục cơ thể đã trở nên thẳng, vây bơi hình thành, khối hoãn hoàng thon
gọn, sắc tố trên thân tập trung nhiều quanh khu vực hình thành bóng bơi nên vùng
này sậm màu hơn các vùng khác. Ngoài ra, miệng ấu thể cũng đã nhô về phía trước
(Hình Error! No text of specified style in document..7).

42. 32
Hình Error! No text of specified style in document..7. Hình thái phôi và ấu thể cá ngựa
vằn đối chứng
A: 24 giờ sau thụ tinh; B: 48 giờ sau thụ tinh; C: 96 giờ sau thụ tinh
3.1.2. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu
3.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102)
Khi phơi nhiễm với Tartrazine, chỉ sau hai giờ phơi nhiễm với các nồng độ
từ 8 g/l trở lên, sự phát triển phôi cá ngựa vằn đi theo hai hướng rõ ràng. Hướng thứ
nhất, phôi có hình thái và sự phát triển không có nhiều khác biệt so với đối chứng.
Những phôi này vẫn sẽ tiếp tục phát triển bình thường qua thời điểm 24 giờ sau thụ
tinh. Chiều hướng thứ hai là phôi cá sẽ hình thành nhiều bất thường như đĩa phôi xù
xì, các phôi bào có thể tách nhau ra, không còn liên kết thành một khối trên cực
động vật, hoặc cả đĩa phôi sau đó khối noãng hoàng sẽ bị tan ra dẫn đến việc chúng
không thể sống đến thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified
style in document..8).
Hình Error! No text of specified style in document..8. Phôi cá ngựa vằn khi phơi
nhiễm với Tartrazine nồng độ 8 g/l
Sau 2 giờ phơi nhiễm, một số phôi xù xì mất đi sự liên kết giữa các phôi bào (A) và sẽ tan
ra khi quan sát ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (B)
Tại thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, sức sống của phôi thí nghiệm chỉ bị ảnh
hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 8g/l trở lên. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của

43. 33
hai nồng độ 8g/l và 16 g/l lần lượt là khoảng 10% và 90%. Tiếp tục phơi nhiễm đến
72 giờ sau thụ tinh, số lượng phôi chết gần như không tăng thêm. Các đường đồ thị
tương quan giữa nồng độ E102 và sức sống phôi ở ba thời điểm đầu quan sát trong
Hình Error! No text of specified style in document..9 (đường màu đỏ) gần như
trùng khít lên nhau cũng thể hiện điều này. Hiện tượng này có thể giải thích do đích
tác động gây chết của Tartrazine tập trung chủ yếu ở thời điểm phát triển phôi sớm
trước thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, vì thế ở các giai đoạn tiếp sau, khi mà các cơ
quan đã tương đối hoàn thiện thì chất này không gây chết thêm phôi.
Các dị dạng trên phôi cá ngựa vằn quan sát được ở thời điểm 48 giờ sau thụ
tinh là phù túi noãn hoàng, tụ máu và chỉ xuất hiện khi phơi nhiễm với Tartrazine ở
nồng độ từ 8 g/l trở lên. Vị trí tụ máu thường quan sát được sự tụ máu là phía trên
phần phình noãn hoàng, trên đầu hay cả ở đuôi sát với phần kéo dài của noãn hoàng
(Hình Error! No text of specified style in document..10 A, B, C).
Hình Error! No text of specified style in document..9. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ
phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau
thụ tinh
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên
tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm

44. 34
Hình Error! No text of specified style in document..10. Phôi cá ngựa vằn khi phơi
nhiễm với Tartrazine
A, B, C: nồng độ 8 g/l ở 48 giờ sau thụ tinh; D, E, F, G nồng độ 1g/l ở 96 giờ sau thụ tinh
e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử
Ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi nhận thấy vài điểm đặc biệt khi
phơi nhiễm với Tartrazine. Thứ nhất là mức độ dị dạng của phôi cá khi phơi nhiễm
với E102 ở nồng độ thấp hơn lại nặng nề hơn nhiều so với phơi nhiễm nồng độ cao
trong dải nồng độ thí nghiệm. Cụ thể ở đây là nồng độ 1-2 g/l và nồng độ 8 g/l trở
lên. Hình Error! No text of specified style in document..10D-G cho thấy rằng nồng
độ 1 g/l gây ra hiện tượng phần phình của khối noãn hoàng của ấu thể không còn
giữ được hình dạng elip mà có thể bị tách ra thành nhiều phần nhỏ, hoặc phù nề
nghiêm trọng kèm theo việc xuất hiện một khối hoại tử bên trong. Do bị phù, màng
noãn hoàng lúc này rất yếu và rất dễ vỡ làm các thành phần bên trong, kể cả khối
hoại tử tràn ra ngoài. Noãn hoàng phình to, dị dạng kéo theo hiện tượng trục cơ thể
của ấu thể cũng bị cong, gập tại vị trí đó. Hiện tượng phù nề không chỉ bắt gặp ở
khối noãn hoàng mà cả ở phần thân cạnh noãn hoàng, trên đầu, dưới mắt và cả vây
ngực. Ngoài ra, ấu thể còn bị dị tật phần cuối đuôi, hoại tử trên cơ thể cũng như bị
tụ máu. Trong khi đó, phôi được phơi nhiễm với nồng độ 8g/l chỉ phù màng bao
h
h, e
h
h
h
h
e
e
e
n

45. 35
tim, hoại tử và phù nhẹ màng bao noãn hoàng, tụ máu, một vài trường hợp bị cong
đuôi. Hiện tượng nêu trên có thể là một bằng chứng của hiệu ứng liều thấp (low
dose effect) – mức độ ảnh hưởng ở nồng độ thấp nghiêm trọng hơn nồng độ cao.
Một vài lý do được đưa ra để giải thích cho hiện tượng này là chất thử nghiệm có
cấu trúc tương tự một loại hormone nào đó nên cũng tương tác với các thụ thể hoặc
ảnh hưởng đến quá trình tạo hormone, đến các con đường di chuyển hormone [88].
Thứ hai, hiện tượng tụ máu là kiểu dị dạng phổ biến nhất khi phơi nhiễm với
Tartrazine (Hình Error! No text of specified style in document..22C). Từ thời điểm
48 giờ sau thụ tinh, chúng tôi thấy việc tăng đáng kể tế bào máu đỏ xuất hiện quanh
khối noãn hoàng. Có thể vì thế nên dẫn tới sự tắc nghẽn mạch máu trên vài phôi ở
thời điểm này và hầu hết ấu thể ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh. Ấu thể có thể bị
một hoặc một vài điểm, ở nhiều vị trí và hình thức khác nhau. Điểm tụ máu quan sát
được có thể ngay dưới miệng, ở noãn hoàng gần sát vùng tim hoặc bên trong noãn
hoàng gần phần cơ, trên đầu hoặc dưới đuôi. Hình thức có thể là một khối nhỏ màu
đỏ hoặc tăng mạnh lượng tế bào máu đỏ tại một vị trí nào đó cũng có thể khiến cả
phần phù nề ở noãn hoàng có màu hồng hơn bình thường (Hình Error! No text of
specified style in document..10 E). Hiện tượng tụ máu bắt gặp nhiều có thể do
Tartrazine đã tác động đến các gen liên quan đến quá trình đông máu hoặc làm tăng
sự hình thành, phát triển mạch máu. Tuy nhiên vẫn cần thực hiện các nghiên cứu
chuyên sâu để khẳng định giả thuyết này.
Thứ ba, bên cạnh những phôi bị dị dạng, ở hầu hết các nồng độ trong dải
nồng độ thí nghiệm đều tồn tại một vài phôi không quan sát thấy bất kì sự ảnh
hưởng nào đến hình thái phôi sau 96 giờ phơi nhiễm. Hiện tượng này được thể hiện
trong Hình Error! No text of specified style in document..11 với tỷ lệ phôi dị dạng
khi phơi nhiễm với Tartrazine không đạt tới 100% hay tỷ lệ các loại dị dạng kể cả dị
dạng hay gặp nhất là tụ máu cũng không đạt được 100% phôi còn sống (Hình
Error! No text of specified style in document..22C). Vậy cơ chế nào bảo vệ những
phôi này chống lại tác động của E102?

46. 36
Thứ tư, tỷ lệ phôi dị dạng cũng như tỷ lệ phôi chết khi phơi nhiễm với
Tartrazine dường như không tuân theo quy luật thông thường (Hình Error! No text
of specified style in document..11, Phụ lục 1). Hai tỷ lệ này không tăng liên tục theo
chiều tăng nồng độ mà chững lại ở khoảng nồng độ 4 đến 8 g/l. Do nồng độ 1 g/l và
2 g/l ảnh hưởng nghiêm trọng đến hình thái phôi ngay sau khi phôi nở ở 72 giờ sau
thụ tinh nên đến thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, hai nồng độ này làm chết nhiều phôi
hơn nồng độ 4 và 8 g/l. Nồng độ 12 và 16 g/l đã gây tác động lớn ngay từ thời điểm
hai giờ sau phơi nhiễm nên tỷ lệ chết tính tới thời điểm 96 giờ sau thụ tinh vẫn cao
hơn các nồng độ còn lại. Tỷ lệ ấu thể dị dạng ở nồng độ 2 g/l là cao nhất (khoảng
93%) trong khi ở nồng độ 12 g/l chỉ khoảng 72%.
Hình Error! No text of specified style in document..11. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ
lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên
tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
3.1.2.2. Phơi nhiễm với chất tạo màu đỏ Amaranth (E123)
Sự tác động của Amaranth đến sự phát triển phôi cá ngựa vằn khá giống với
Tartrazine nhưng sự ảnh hưởng xuất hiện khi phơi nhiễm với nồng độ thấp hơn. Sau
2 giờ phơi nhiễm, phôi cá phơi nhiễm với Amaranth nồng độ từ 4 trở lên cũng quan
sát thấy hiện tượng làm tan đĩa phôi và noãn hoàng cùng với hệ quả gây chết sau 24

47. 37
giờ sau thụ tinh (Phụ lục 2). Sở dĩ Amaranth và Tartrazine gây ra tác động nhanh
chóng như vậy là vì chúng không bị hoặc rất ít bị ngăn cản bởi màng phôi. Tính
thấm qua màng phôi bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố; một trong số đó là đặc tính ưa
lipit (Lipophilicity) của chất được thử nghiệm. Những chất này có thể dễ dàng đi
qua lớp màng phôi để ảnh hưởng trực tiếp đến phôi [28] và hai phụ gia E102 và
E123 đều có đặc tính này.
Sức sống của phôi thí nghiệm ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh chỉ bị ảnh
hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 4 và 8 g/l. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của hai
nồng độ này lần lượt là 55% và 100%. Ở 48 giờ sau thụ tinh, Amaranth không gây
chết thêm phôi so với 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified style in
document..12, Phụ lục 3). Cùng với đó, E123 rất ít gây ảnh hưởng đến hình thái
phôi thí nghiệm ở hai thời điểm này.
Hình Error! No text of specified style in document..12. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ
phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Amaranth
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên
tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
Sau khi phôi cá ngựa vằn nở, Amaranth lại tác động rất lớn đến cả hình thái
cũng như sức sống của ấu thể. Tại thời điểm 72 giờ sau thụ tinh, nồng độ 0,5 g/l và

48. 38
1 g/l đã làm chết lần lượt khoảng 17% và 35% ấu thể còn nồng độ 4g/l gây chết đến
82%. Ở 96 giờ sau thụ tinh, mức độ ảnh hưởng của ba nồng độ này tương ứng là
31,7%; 60,1% và 93% (Hình Error! No text of specified style in document..12). Hình
thái phôi cũng bị biến đổi rất nhiều ở thời điểm này. Hiện tượng phơi nhiễm ở nồng
độ thấp hơn lại ảnh hưởng đến hình thái ấu thể nhiều hơn khi phơi nhiễm với nồng
độ cao hơn trong dải thí nghiệm cũng được ghi nhận ở các nồng độ 0,5 g/l; 1 g/l và
4 g/l. Kiểu dị dạng quan sát được cũng tương tự như ảnh hưởng của Tartrazine:
noãn hoàng biến dạng, trục cơ thể bị cong, phù đầu và tụ máu (Hình Error! No text
of specified style in document..13). Sự biến dạng noãn hoàng do Amaranth gây ra
có hơi khác với Tartrazine: khối noãn thường bị hoại tử nhiều và có thể bị chia
thành nhiều phần, sự phù túi noãn hoàng cũng ít gặp hơn và hiếm thấy có khối hoại
tử bên trong và Amaranth không gây ra hiện tượng tụ máu nhiều như Tartrazine. Tỷ
lệ phôi chết và dị dạng ghi nhận được do tác động của E123 vẫn tăng khi nồng độ
tăng.
Hình Error! No text of specified style in document..13. Phôi cá ngựa vằn sau 96
giờ phơi nhiễm với Amaranth
A, B, C, D: phôi bị dị dạng khi phơi nhiễm với E123 nồng độ 0,5 và 1 g/l;
E, F: phôi phơi nhiễm với nồng độ 4 g/l
c: cong vẹo trục cơ thể; e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử
eh
c
e
c
cn
e, n h n

49. 39
3.1.3. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất bảo quản
3.1.3.1. Phơi nhiễm với sodium benzoate (E211)
Sau 24 giờ phơi nhiễm với dải gồm tám nồng độ thí nghiệm là 25; 45; 80;
145; 260; 350; 500 và 650 mg/l, Sodium benzoate không ảnh hưởng lớn đến hình
thái cũng như sức sống của phôi cá ngựa vằn. Ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh, E211
không gây chết thêm phôi thí nghiệm nhưng tác động nhiều đến hình thái của phôi.
Kiểu dị dạng phổ biến nhất quan sát được là hoại tử noãn hoàng khi phơi nhiễm với
nồng độ từ 80 mg/l trở lên. Từ nồng độ 260 mg/l, phôi bị phù túi noãn hoàng cùng
với tụ máu. Hiện tượng phù màng bao tim chỉ bắt gặp từ nồng độ 650 mg/l trở lên
(Hình Error! No text of specified style in document..14 A, B).
Hình Error! No text of specified style in document..14. Phôi cá ngựa vằn phơi
nhiễm với Sodium benzoate
A, B: phôi phơi nhiễm với nồng độ 650mg/l ở 48 giờ sau thụ tinh;
C, D: phôi phơi nhiễm với nồng độ 145mg/l ở 96 giờ sau thụ tinh
c: cong đuôi; e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử
e
c
n
n
e
h

50. 40
Tại thời điểm 72 giờ sau thụ tinh, nồng độ 350 mg/l đã cho thấy sự tác động
đến sức sống của phôi/ấu thể, cụ thể là làm chết 10%. Đến nồng độ 650 mg/l, 23%
phôi còn sống và 3% khi phơi nhiễm 850 mg/l.
Ở 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi quan sát thấy có thêm hai kiểu dị dạng là
hoại tử phần đầu và cong vẹo hoặc dị tật đuôi (Hình Error! No text of specified
style in document..14 C, D). Hoại tử phần noãn hoàng vẫn là kiểu phổ biến nhất khi
phơi nhiễm với E211và được quan sát từ nồng độ 45 mg/l trên 16,7% ấu thể. Hiện
tượng phù màng bao tim, phù noãn hoàng và hoại tử cũng được bắt gặp từ nồng độ
145 mg/l. Ngoài ra, phần kéo dài của noãn hoàng có thể không có hoặc bị gián
đoạn. Mặc dù sự dị dạng đã xảy ra từ nồng độ 45 mg/l nhưng phải đến nồng độ 145
mg/l, chúng tôi mới quan sát thấy tác động gây chết phôi đáng kể (khoảng 15%).
Nồng độ 650 mg/l làm chết gần như toàn bộ ấu thể (Hình Error! No text of
specified style in document..15, Phụ lục 4).
Hình Error! No text of specified style in document..15. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ
phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Sodium benzoate
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên
tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm

51. 41
Sau 96 giờ phơi nhiễm với Sodium benzoate ở nồng độ cao thì số loại và tỷ
lệ các dị dạng có xu hướng tăng. Như đã đề cập ở trên, hoại tử noãn hoàng là kiểu
phổ biến nhất, chiếm 100% ở nồng độ 350 và 500 mg/l. Có một điều khá thú vị,
hoại tử phần đầu và tụ máu là hai loại dị dạng đều bắt đầu hình thành ở nồng độ 145
mg/l và tỷ lệ của hai loại này luôn bằng nhau ở các nồng độ thí nghiệm (Hình
Error! No text of specified style in document..22A). Có thể, Sodium benzoate đã tác
động đến một gen/protein nào đó mà hệ quả là gây ra cả hai loại dị dạng cùng lúc.
Tuy nhiên, cần thực hiện nhiều thí nghiệm chuyên sâu hơn để chứng minh cho giả
thuyết này

52. 42
3.1.3.2. Phơi nhiễm với propyl gallate (E310)
Khác với Sodium benzoate, Propyl gallate lại ảnh hưởng khá nhiều ở giai
đoạn sớm. Ở 24 giờ sau thụ tinh, nồng độ 26 mg/l đã gây chết 3% còn nồng độ 75
mg/l làm chết 99% tổng số phôi thí nghiệm. Tác động gây dị dạng đã quan sát thấy
từ nồng độ 35 mg/l trên 15% phôi; con số này ở nồng độ 60 mg/l lên tới 88% (Hình
Error! No text of specified style in document..16, Phụ lục 5). Ở thời điểm này, phôi
thường có dấu hiệu hoại tử cả phần đầu và thân ngoại trừ khối noãn hoàng cùng với
đuôi bị ngắn và xù xì (Hình Error! No text of specified style in document..17 B).
Một số phôi quan sát thấy hiện tượng phù màng noãn hoàng.
Hình Error! No text of specified style in document..16. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi
dị dạng khi phơi nhiễm với Propyl gallate
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên
tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
Tiếp tục phơi nhiễm với Propyl gallate, tỷ lệ phôi sống chỉ giảm nhẹ và giảm
khá đều nhau ở các thời điểm quan sát tiếp theo. Tỷ lệ này chỉ giảm từ 5,3% đến
14% và giảm nhiều nhất ở nồng độ 45 mg/l. Các đường cong nồng độ - tỷ lệ phôi
sống (màu đỏ) của E310 ở Hình Error! No text of specified style in document..16

53. 43
phân bố khá sát nhau cũng thể hiện tác động gây chết của E310 diễn ra liên tục,
đồng đều qua các khoảng thời gian thí nghiệm. Hiện tượng này có thể do tác động
gây chết của Propyl gallate không đặc trưng cho một giai đoạn phát triển cụ thể nào
mà là độc tính chung.
Hình Error! No text of specified style in document..17. Phôi cá ngựa vằn phơi
nhiễm với Propyl gallate
Phôi cá sau 24 giờ (A), sau 48 giờ (B) và sau 96 giờ (D) phơi nhiễm với nồng độ 60 mg/l
Hình C: phơi nhiễm nồng độ 35 mg/l ở 96 giờ sau thụ tinh
e: phù nề; n: hoại tử; t: dị tật đuôi
Sau 96 giờ phơi nhiễm với Propyl gallate, chúng tôi ghi nhận được sự ảnh
hưởng đến hình thái ấu thể từ nồng độ 20 mg/l cho 15% tổng số phôi. Tỷ lệ phôi dị
dạng đạt 100% thấy được khi phơi nhiễm với nồng độ 60 mg/l. Tỷ lệ phôi bất
thường tăng đáng kể theo nồng độ E310 trong môi trường. Hình Error! No text of
specified style in document..22B cho thấy rằng, tỷ lệ tất cả các loại dị dạng quan sát
được đều tăng khi tăng nồng độ. Các kiểu tác động quan sát được cũng khá giống
với Sodium benzoate: hoại tử, đuôi cong vẹo, ngắn; phù màng tim, phù noãn hoàng.
Kiểu dị dạng quan sát được nhiều nhất và xuất hiện từ những nồng độ nhỏ của hai
phụ gia này là hoại tử. Có thể, hai chất này ảnh hưởng nhiều đến những gen liên

54. 44
quan đến sự hoại tử đặc biệt là hoại tử noãn hoàng. Tuy nhiên, Propyl gallate gây ra
hiện tượng hoại tử nhiều ở phần đầu nhưng ít gây ra hiện tượng phù màng noãn
hoàng hơn và tụ máu.

55. 45
3.1.4. Nhóm chất điều vị - Monosodium glutamate (E621)
Trong số các chất được thử nghiệm trong nghiên cứu này, Monosodium
glutamate là chất duy nhất làm chậm sự phát triển của phôi ở nồng độ cao nhất là 40
g/l. Tại thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, phôi phơi nhiễm với nồng độ này chưa hình
thành mắt, đuôi mới tách khỏi khối noãn hoàng, ngắn và xù xì (Hình Error! No text
of specified style in document..18). Hình thái này chiếm tỷ lệ khoảng 50% tổng số
phôi. Những phôi này ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh thường có ít sắc tố hơn so với
đối chứng, thường bị phù noãn, đuôi ngắn và cong vẹo, xù xì và đa số bị chết sau 96
giờ phơi nhiễm.
Hình Error! No text of specified style in document..18. Phôi cá ngựa vằn phơi
nhiễm với Monosodium glutamate
A: nồng độ 40g/l ở 24 giờ sau thụ tinh; B: nồng độ 40 g/l ở 48 giờ sau thụ tinh; F, G: nồng
độ 15 g/l ở 96 giờ sau thụ tinh
c: cong vẹo trục cơ thể; e: phù nề; h:tụ máu; n: hoại tử; t: dị tật đuôi
Nồng độ 40 g/l cũng gây chết 12% tổng số phôi ở 24 giờ sau thụ tinh. Tỷ lệ
phôi bị chết tăng lên rất ít ở thời điểm 48 và 72 giờ sau thụ tinh. Tuy nhiên, đến thời
điểm 96 giờ sau thụ tinh, số lượng phôi chết do tác động bởi nồng độ 40 g/l tăng lên
t
e
h
n
c

56. 46
nhiều và đạt 95%. So với thời điểm 48 giờ sau thụ tinh, tỷ lệ phôi bị dị dạng tăng
lên đáng kể. Nồng độ 10 g/l, 15 g/l và 25g/l lần lượt gây dị dạng cho khoảng 12%;
42% và 86% phôi còn sống (Hình Error! No text of specified style in document..19,
Phụ lục 6). Các dị dạng quan sát được là phù màng tim, phù, cong vẹo, dị tật đuôi
và hoại tử. Ngoài ra, một số phôi còn bị phù màng bao noãn hoàng và tụ máu ở
nồng độ 25 g/l.
Tại thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, tỷ lệ ấu thể bị dị tật đuôi (thường là cong)
và hoại tử noãn hoàn tăng lên theo chiều tăng nồng độ. Hiện tượng hoại tử đầu chỉ
bắt gặp khi phơi nhiễm với nồng độ 15 g/l trở lên. Tỷ lệ dị tật này tăng từ khoảng
8% ở nồng độ 15 g/l lên 53% ở nồng độ 25 g/l sau đó lại giảm ở nồng độ 40 g/l có
thể do mức độ ảnh hưởng lớn đến sức sống của Monosodium glutamate ở nồng độ
này. Các kiểu phù màng bao tim hay tụ máu không quan sát thấy ở nồng độ 40 g/l
(Hình Error! No text of specified style in document..22E).
Hình Error! No text of specified style in document..19. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ
lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Monosodium glutamate
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống, đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên
tổng số phôi còn sống, thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm

57. 47

58. 48
3.1.5. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng – Formaldehyde (E240)
Formaldehyde đã được xác định là chất gây độc, gây ung thư do đó nó đã bị
cấm sử dụng trong bảo quản thực phẩm. Việc đánh giá độc tính của chất này trên
mô hình phôi cá ngựa vằn nhằm kiểm chứng khả năng gây độc của nó lên quá trình
phát triển phôi. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy sự tác động khá đặc
biệt của chất này lên phôi cá ngựa vằn. Khi phơi nhiễm với Formaldehyde từ nồng
độ 200 ppm trở lên, phôi cá ngựa vằn đã hình thành một lớp màng bám sát với phôi,
nằm phía bên trong màng phôi. Cấu trúc màng này khiến cho phôi chỉ vận động rất
hạn chế, một vài trường hợp đuôi của phôi chỉ cử động tại chỗ (Hình Error! No text
of specified style in document..20B). Nồng độ càng cao thì số lượng phôi bị ảnh
hưởng theo cách này càng tăng lên và đạt 100% ở nồng độ 420 ppm. Có hai giả
thiết được đặt ra, thứ nhất là lớp màng trong cùng của phôi tách ra khỏi các lớp
màng khác và co lại do ảnh hưởng làm kết tủa của Formaldehyde. Thứ hai, dựa vào
kết quả của Henn và cộng sự năm 2011 thì màng phôi cá ngựa vằn gồm ba lớp trong
đó lớp trong cùng có độ dày chiếm tới 80%, đây là lớp gây cản trở sự xâm nhập của
các chất bất lợi vào phôi [28]. Do chính khả năng cố định làm kết dính các phân tử
protein lại với nhau của Formaldehyde [86], ở nồng độ có lượng phân tử đủ lớn thì
Formaldehyde đã nhanh chóng cố định các protein màng để tạo thành lớp màng
protein kết tủa có liên kết khá chặt chẽ làm cho các phân tử khác kể cả
Formaldehyde cũng khó xâm nhập được vào bên trong nên phôi vẫn phát triển được
ở mức độ nhất định. Tác động này được xem như một tiêu chí đánh giá dị dạng
riêng của Formaldehyde.

59. 49
Hình Error! No text of specified style in document..20. Phôi cá ngựa vằn phơi
nhiễm với Formaldehyde
Phôi phơi nhiễm với nồng độ 290 ppm ở 24 giờ sau thụ tinh (A) và 48 giờ sau thụ tinh (B)
C, D: Phôi phơi nhiễm với nồng độ 200 ppm ở 96 giờ sau thụ tinh
y: noãn hoàng xù xì; n: hoại tử
Sau 24 giờ phơi nhiễm, chỉ những nồng độ cao nhất trong dải nồng độ thí
nghiệm mới có tác động đến sức sống của phôi. Nồng độ 350 ppm và 420 ppm lần
lượt gây chết khoảng 5% và 35% tổng số phôi thí nghiệm. Đến thời điểm 48 giờ sau
thụ tinh, do sự vận động của phôi nên lớp màng mới được hình thành bị vỡ ra hình
thành một vùng mờ bên trong khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình Error! No text
of specified style in document..20 D). Tỷ lệ phôi chết do sự ảnh hưởng bởi hai nồng
độ 350 ppm và 420 ppm ở thời điểm này tăng lên đến khoảng tương ứng là 17% và
57%. Tỷ lệ dị dạng ghi nhận được cũng tăng đáng kể: nồng độ 240 ppm và 350 ppm
gây dị dạng cho khoảng 60 và 80% tổng số phôi (Hình Error! No text of specified
style in document..21, Phụ lục 7).
Kể từ thời điểm bắt đầu nở, vì không còn được sự bảo vệ của lớp màng ở giai
đoạn trước nữa nên phôi và ấu thể dễ bị tác động bởi Formaldehyde làm cho phôi bị
hoại tử và chết nhanh chóng sau đó. Tỷ lệ phôi chết tăng lên rất nhanh từ thời điểm

60. 50
48 giờ đến 72 giờ sau thụ tinh. Nồng độ 290 ppm làm chết thêm 25% tổng số phôi
còn nồng độ 350 ppm làm chết thêm khoảng 77%. Tỷ lệ này tiếp tục tăng khi quan
sát ở 96 giờ sau thụ tinh. Nồng độ 240 ppm đã làm chết khoảng 35 % còn nồng độ
350 ppm gây chết toàn bộ phôi thí nghiệm (Hình Error! No text of specified style in
document..21, Phụ lục 7). Như vậy, tỷ lệ phôi chết tăng theo thời gian phơi nhiễm.
Hình Error! No text of specified style in document..21. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi
dị dạng khi phơi nhiễm với Formaldehyde
Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên
tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm
Formaldehyde là chất gây ít kiểu dị dạng nhất. Chúng tôi chỉ ghi nhận được
hai kiểu ảnh hưởng là noãn hoàng xù xì và hoại tử ở 96 giờ sau thụ tinh. Một lý do
để giải thích cho hiện tượng này là một khi phôi, ấu thể đã bị hoại tử ở một vị trí
nào đó thì sẽ rất nhanh chóng bị hoại tử toàn bộ cơ thể và dẫn đến hiện tượng phôi
chết. Tỷ lệ hoại tử ghi nhận được cao nhất ở nồng độ 240 ppm có thể do nồng độ
cao hơn đã làm chết những phôi hoại tử tại thời điểm quan sát. Trái lại, hiện tượng
noãn hoàng bị xù xì có thể không ảnh hưởng ngay đến sức sống ấu thể do đó tỷ lệ
phôi bị dị tật này quan sát được tăng dần theo chiều tăng nồng độ (Hình Error! No
text of specified style in document..22F).