1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29269
(51) C12N 1/04 (2006.01)
C12N 11/00 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0075.1
(22) 22.01.2014
(45) 15.12.2014, бюл. №12
(72) Бияшев Кадыр Бияшевич; Тулемисова Жанара
Кенесовна; Бияшев Биржан Кадырович;
Киркимбаева Жумагуль Слямбековна; Кожахметова
Зубайра Амирбековна; Касенова Гулмира
Тынышбаевна
(73) Бияшев Кадыр Бияшевич
(56) Сидякина М.Т. Консервация микроорганизмов,
1985
(54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ
БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА
"ТОРУКОЛ"
(57) Изобретение относится к медицинской и
ветеринарной микробиологии, в том числе и к
технической, и касается сред (способов),
применяемых для хранения коллекций
микроорганизмов.
Исследованием выявлено, что наиболее
подходящей для консервации микроорганизмов,
является среда, содержащая криопротекторы:
мелласа, кукурузная мука, сахароза и желатина.
Среды, содержащие указанные криопротекторы,
способствуют выживаемости и обеспечивают
жизнеспособность всех исследуемых культур,
причем выживаемость составляет 85-100%, а
жизнеспособность сохраняется до двенадцати
месяцев, рост культур в этих случаях отмечен при
максимальном разведении до 10-6
.
(19)KZ(13)A4(11)29069

2. 29269
2
Изобретение относится к медицинской и
ветеринарной микробиологии, в том числе и к
технической, и касается сред (способов),
применяемых для хранения коллекций
микроорганизмов.
Опыт работы с коллекциями микроорганизмов
свидетельствует о том, что ряд современных
методов консервации оказывается относительно
эффективным при поддержании лабораторных
культур микроорганизмов.
Существующая практика консервации
ориентируется обычно на задачу создания по
возможности немногочисленных и
специализированных приемов, позволяющих
перевести в анабиотическое состояние вегетативные
клетки разнообразных микроорганизмов.
Поддержание штаммов в рабочем состоянии,
сохранение их ценных свойств являются важными
условиями практически любой работы с
микроорганизмами - от первичного изучения до
использования их в производстве различных
биопрепаратов.
Известно, что жизнеспособность
микроорганизмов поддерживается различными
методами: субкультивирование (периодический
пересев на питательные среды), в условиях низких и
ультранизких температур, под вазелиновым маслом
и лиофилизацией.
Известно, что при периодических пересевах
используют свежие питательные среды и пересевы
проводят один-два раза в месяц (иногда
еженедельно). Недостатком метода является
необходимость соблюдения регламентов пересевов,
возможность заражения, краткосрочность хранения,
а также трудоемкость работы и расход в больших
количествах реактивов, входящих в состав
питательных сред. При частых пересевах штаммы-
продуценты из-за спонтанной диссоциации нередко
могут снижать способность к выработке целевых
продуктов (Н. С. Егорова. М., 1989, Промышленная
микробиология) .
Известно хранение микроорганизмов в условиях
низких и ультранизких температур, для подготовки
клеток их суспензируют в среде, содержащей
криопротекторы. В качестве криопротекторов
применяют либо 20%-ное снятое молоко, либо
24%-ный раствор сахарозы, разведенный равным
объемом ростовой среды, либо 10%-ный декстран,
либо лошадиную сыворотку, инозит, 10-20%-ный
глицерин, 7-10%-ный диметилсульфоксид и
10%-ный поливинилпирролидон. Недостатком
такого хранения микроорганизмов является
необходимость специального оборудования, кроме
того, при высоких скоростях охлаждения
образуются внутриклеточные кристаллы льда,
вызывающие повреждения и гибель клеток.
Известны факты изменения структуры и физико-
химических свойств микроорганизмов в результате
такого метода консервации : задержка скорости
роста и пигментообразования, снижение
антибиотической и бродильной активностей или
даже потеря отдельных признаков (Ф Герхардта. М.,
1983 Методы общей бактериологии) .
Наиболее близким техническим решением к
изобретению является широко распространенный
способ хранения микроорганизмов на питательных
средах под слоем вазелинового масла. Для этого
культуру микроорганизмов выращивают на
благоприятной питательной среде и заливают
стерильным вазелиновым маслом. Слой масла (0,5-
1,0 см) замедляет скорость обменных процессов
микроорганизмов и предохраняет поверхность
среды от высыхания. Недостатком прототипа
является краткосрочность хранения, необходимо
проводит пересевы культур один-два раза в год,
трудоемкость работы. Хранение под маслом иногда
вызывает задержку роста микробов (1,5-2 раза по
сравнению с периодическими пересевами культур) и
снижает скорость использования ими питательных
субстратов. У некоторых микроорганизмов после
хранения под маслом обнаружены снижения
скорости роста, образование нетипичных колоний
(Т. М. Сидякина. Консервация микроорганизмов,
1985).
Целью изобретения является сохранение
жизнеспособности и удлинение сроков активности
комплексного бактериального препарата «Торукол»
с использованием метода лиофилизации.
Лиофилизация (сублимационное высушивание,
замораживание - высушивание) - способ
высушивания биоматериалов из замороженного
состояния, при котором вода испаряется в условиях
вакуума без оттаивания льда, что позволяет
полностью сохранять первичную структуру объекта
сушки. При его использовании многие
физиологически разнородные виды бактерий и
бактериофаги удается сохранять в жизнеспособном
состоянии десятки лет и более. Для этого
высушенные клетки должны быть защищены от
действия кислорода, влаги и света.
Успех лиофилизации зависит от используемых
защитных веществ - криопротекторов. При
криоконсервации новых бактериальных штаммов
следует предварительно проверить действие на них
различных типов криопротекторов и выбрать среди
них наиболее подходящий для консервации
микроорганизмов.
Это достигается тем, что в питательную среду, с
выросшими культурами бактерий, вносили
защитные среды. В качестве криопротекторов
применяли сахарозожелатиновый раствор (10%
сахароза + 2% желатины), или (мелласа +
кукурузная мука +сахароза + желатина). В работе
использовали следующие культуры: Lactobacillus
acidophilus В-143, Lactococcus lactis В-263,
Torulopsis kefir Y - 252 и Escherichia coli 64.
Штаммы защищены предварительными патентами
Комитета по правам интеллектуальной
собственности Республики Казахстан
соответственно за №15969, №41176, №41176 и
№23876.
Культуры Lactobacillus acidophilus В-143,
Lactococcus lactis В-263, Torulopsis kefir Y - 252 и
Escherichia coli 64, входящие в состав
пробиотического препарата «Торукол» выращивали
раздельно в питательной среде.

3. 29269
3
Культуры Lactobacillus acidophilus В-143,
Lactococcus lactis B-263, Torulopsis kefir Y - 252
выращивали раздельно на обезжиренном молоке
при температуре 37-38°С до образования сгустка (в
течение 40-50ч.). Полученную культуральную массу
подщелачивали до pH 6,0-6,2, определяли
количество жизнеспособных клеток (109
К.О.Е. в
1 мл), затем добавляли в неё при перемешивании
компоненты, служащие защитной средой при
последующей сушке в 1-ом варианте: мелласу в
количестве 15 г/л, кукурузную муку в количестве
50 г/л, 2% желатины и 10% - сахарозы; во 2-ом
варианте: только сахарозожелатиновый раствор
(10% сахароза + 2% желатины).
Штамм Esherichia coli 64 выращивают на бульоне
Хоттингера в течение 16-18 ч при 37-38°С. После
проверки полученной микробной массы на чистоту
и типичность роста ее доводили до концентрации
109
К.О.Е. в 1 мл по оптическому стандарту
мутности ГЙСК им. Тарасевича. затем добавляли
стерильную среду высушивания. В 1-ом варианте:
мелласу в количестве 15 г/л, кукурузную муку в
количестве 50 г/л, 2% желатины и 10% - сахарозы;
во 2-ом варианте: среда высушивания содержит 2%
желатины и 10% - сахарозы, рH среды - 7,8-8,0.
Полученные культуральные суспензии из
штаммов Lactobacillus acidophilus В-143, Lactococcus
lactis В-263, Torulopsis kefir Y - 252 и Esherichia coli
64 смешивали в соотношениях 1:1:1:1. Разливали во
флаконы объемом 20,0 см3
, содержащие взвесь
культур В-143, В-263, Y - 252 и 64 в первом случае с
защитной средой: мелласа, кукурузная мука,
сахароза и желатина, во втором случае в качестве
защитной среды являлись только сахароза и
желатина. Затем подвергали лиофильной сушке до
получения сухого продукта - пробиотика. Флаконы
укупоривали резиновыми пробками и обкатывали
алюминиевыми колпачками, и упаковывали в
коробки. Сохраняли препарат при температуре 4-
6°С.
Препарат проверяли на чистоту, типичность
роста, Через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения
определяли выживаемость и жизнеспособность
исследуемых культур.
Для определения чистоты и типичности роста
использовали 5 флаконов с препаратом.
Содержимое каждого флакона разводили в 4 мл
стерильного физиологического раствора. Проводили
посев по 0,2 мл из каждого флакона на специальные
питательные среды. Препарат не содержал
посторонней микрофлоры. Питательные среды с
посевом выдерживали в течение 10 суток при
температуре 37-38°С.
Для определения сохранности живых культур
различными методами общепринято использовать в
качестве критерия подсчет их колоний, выросших
после предварительного культивирования на
богатых питательных средах, или только
констатировать факт роста на соответствующей
жидкой или плотной среде. Процент выживаемости
микроорганизмов определяют по отношению числа
сохранившихся клеток к первоначальному числу
жизнеспособных клеток (до начала хранения),
принятому за 100%.
Выживаемость культур определяли следующим
образом: содержимое флаконов разводили в 4 мл
стерильного физиологического раствора. Проводили
посев по 0,2 мл из флаконов на соответствующие
специальные питательные среды, через 18-20 ч
культивирования при 37°С проводили учет
выросших колоний микроорганизмов.
Способность к размножению определяли
следующим образом: содержимое флаконов
переносили в 1 мл питательной среды и
культивировали при 37°С в течение 18-20 ч. Затем
проводили количественное определение выросших
микроорганизмов путем высева на плотную
питательную среду с последующим подсчетом
выросших колоний. Способность к размножению
определяли после предварительных разведений на
специальных питательных средах констатированием
роста при наибольшем разведении, где отмечен
визуально рост с последующим подсчетом
количества выросших колоний.
Полученные экспериментальные данные
приведены в табл. 1.
Как видно, из данных приведенной в табл. 1
использование питательной среды, содержащей
криопротекторы: мелласа, кукурузная мука,
сахароза и желатина приводит к увеличению
жизнеспособности Lactobacillus acidophilus В-143,
Lactococcus lactis В-263, Torulopsis kefir Y - 252 и
Esherichia coli 64 до 12 месяцев хранения, при этом
рост отмечен до 10-6
разведения, а выживаемость
составляет 85-100% по сравнению с питательной
средой, содержащей только сахарозу и желатину. В
среде содержащей только сахарозу и желатину
хранение до 9 месяцев идет с потерей
жизнеспособности, рост культуры отмечается
только до 105
разведения, выживаемость при этом
составляет 40- 50%.
Питательная среда под слоем вазелинового масла
пригодна для хранения микроорганизмов. При
хранении в данной питательной среде
жизнеспособность культур сохраняется только в
течении 8 месяцев, при этом жизнеспособность, т. е.
рост отмечается только до разведения 10-3
, а
выживаемость составляет 30%, через 8 месяцев
хранения не отмечено рост культур как при
минимальном, так и при максимальном содержании.
Нами проведены исследования по проверке
безвредности и активности препарата «Торукол»
через 12 месяцев хранения.
Безвредность препарата проверяли на 10 белых
мышах массой 14-16г, которым препарат вводили
перорально, в дозе 107
К.О.Е. в объеме 0,5 мл. Для
испытания использовали два флакона препарата. В
течение 10 суток наблюдения все подопытные
белые мыши оставались живыми. Препарат считали
безвредной.
Активность препарата проверяют на 10 белых
мышах массой 14-16 г, которым препарат вводили
перорально в дозе 107
К.О.Е. в объеме 0,5 мл.
Спустя 24 часа всем подопытным (10) и 10
контрольным белым мышам вводили перорально

4. 29269
4
вирулентную культуру Е. coli в смертельных дозах.
Все подопытные животные выжили при падеже всех
контрольных мышей. Срок наблюдения 10 суток.
В результате исследований выявлено, что
наиболее подходящей для консервации
микроорганизмов, является среда, содержащая
криопротекторы: мелласа, кукурузная мука,
сахароза и желатина. Среды, содержащие указанные
криопротекторы, способствуют выживаемости и
обеспечивают жизнеспособность всех исследуемых
культур, причем выживаемость составляет 85-100%,
а жизнеспособность сохраняется до двенадцати
месяцев, рост культур в этих случаях отмечен при
максимальном разведении до 10-6
.
Таблица 1
Определение выживаемости и жизнеспособности культур, использованных для изготовления препарата
«Торукол»
Сроки проверки выживаемости в месяцах и в процентахНаименование сред
содержащих
криопротекторы
Разведение
культур Через 3 месяца % Через 6 месяцев % Через 9 месяцев
%
Через 12
месяцев %
103
100 100 100 100
104
100 100 100 100
105
100 100 100 100
106
100 100 100 85
Среда (мелласа,
кукурузная мука.
сахароза ижелатин)
107
100 100 70 60
10J
100 80 70 30
104
100 80 60 20
105
100 60 50 10
106
100 30 30 10
Среда (сахароза и
желатин)
107
100 20 20 -
103
100 30 - -
104
100 10 - -
105
80 - - -
106
60 - - -
Среда (под
вазелиновым маслом)
107
40 - -
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ хранения бактериального препарата
«Торукол», включающий использование метода
лиофилизации, отличающийся тем, что
лиофилизацию культуральной суспензии проводят
из штаммов Lactobacillus acidophilus В-143,
Lactococcus lactis В-263, Torulopsis kefir Y-252 и
Esherichia coli 64 смешанных в соотношении 1:1:1:1
с добавлением защитной среды: мелласа 15 г/л,
кукурузная мука 50 г/л, сахароза 10% и желатина
2%.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова