Документ описывает инновационный патент на способ получения антигена для серологической диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей с использованием штамма грибка cryptococcus farciminosus f-0241. Новый метод позволяет производить высокоактивный и стабильный антиген, способный выявлять латентные формы инфекции и обеспечивать высокую чувствительность серологических реакций. Полученный антиген может храниться до 6 месяцев в стерильных ампулах и до 2-3 лет в лиофилизированном виде, при этом сохраняет свою активность и специфичность.

1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28902
(51) A61K 39/02 (2006.01)
A61B 10/00 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1320.1
(22) 08.10.2013
(45) 15.09.2014, бюл. №9
(72) Шалабаев Болат Абуович; Кадыров Серикбай
Оразбаевич
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) Таранюк П.С. Опыты по изготовлению
антигенов для РСК, их применению для
диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей
// Сборник научных работ Сиб. НИВИ, вып. 4. Омск,
1952, с.111-120
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ
СЕРООЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
ЭПИЗООТИЧЕСКОГО ЛИМФАНГОИТА
ЛОШАДЕЙ
(57) Изобретение относится к области ветеринарной
микологии и может быть использовано при
изготовлении препаратов для серологической
диагностики эпизоотического лимфангоита
лошадей.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением выражается в получении
высокоактивного и стабильного антигена для
постановки серологической реакции при
диагностике эпизоотического лимфангоита
лошадей.
Способ получения антигена для серологической
диагностики эпизоотического лимфангоита
лошадей, включающий выращивание культуры
криптококков на питательной среде,
автоклавирование, высушивание в эксикаторе над
хлористым кальцием, приготовление суспензии,
центрифугирование и получение надосадочной
жидкости, в качестве штамма гриба используют
штамм Cryptococcus farciminosus F-0241, который
выращивают на мясопептонном бульоне с
добавлением глицерина, глюкозы и маннита, затем
разрушают клетки культуры путем двухкратного
воздействия ультразвуком при частоте 22 кГц и
мощностью 100 Вт/см2
с интервалом 30 мин, после
чего полученную суспензию центрифугируют при
6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к
надосадочной жидкости добавляют 96% раствор
охлажденного этилового спирта в соотношении 1:3
соответственно, тщательно перемешивают и
выдерживают в течение 10 час при температуре 5°С,
полученный осадок вновь центрифугируют при 6000
об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость
отбрасывают, осадок растворяют в
физиологическом растворе, доводят pH до 7,5 и
концентрацию белка до 1 мг/см3
.
(19)KZ(13)A4(11)28902

2. 28902
2
Изобретение относится к области ветеринарной
микологии и может быть использовано при
изготовлении препаратов для серологической
диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей.
Известен способ получения антигена для
серологической диагностики эпизоотического
лимфангоита лошадей, включающий выращивание
культуры криптококков на питательной среде,
автоклавирование, высушивание в эксикаторе над
хлористым кальцием, приготовление суспензии,
центрифугирование и получение надосадочной
жидкости [Таранюк П.С. Опыты по изготовлению
антигенов для РСК, их применению для диагностики
эпизоотического лимфангоита лошадей // Сборник
научных работ Сиб. НИВИ, вып. 4. Омск, 1952, с.11-
120].
Недостатком данного способа является то, что
полученный антиген не позволяет выявлять латентные
формы инфекции.
Задачей изобретения является получение
высокоактивного и стабильного антигена,
позволяющего выявлять латентные формы
криптококковой инфекции и обладающего
достаточной активностью и специфичностью.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением выражается в получении
высокоактивного и стабильного антигена для
постановки серологической реакции при диагностике
эпизоотического лимфангоита лошадей.
Способ получения антигена для серологической
диагностики эпизоотического лимфангоита лошадей,
включающий выращивание культуры криптококков на
питательной среде, автоклавирование, высушивание в
эксикаторе над хлористым: кальцием, приготовление
суспензии, центрифугирование и получение
надосадочной жидкости, в качестве штамма гриба
используют штамм Cryptococcus farciminosus F-0241,
который выращивают на мясопептонном бульоне с
добавлением глицерина, глюкозы и маннита, затем
разрушают клетки культуры путем двухкратного
воздействия ультразвуком при частоте 22 кГц и
мощностью 100 Вт/см2
с интервалом 30 мин, после
чего полученную суспензию центрифугируют при
6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к
надосадочной жидкости добавляют 96% раствор
охлажденного этилового спирта в соотношении 1:3
соответственно, тщательно перемешивают и
выдерживают в течение 10 час при температуре 5°С,
полученный осадок вновь центрифугируют при
6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную
жидкость отбрасывают, осадок растворяют в
физиологическом растворе, доводят pH до 7,5 и
концентрацию белка до 1 мг/см3
.
В изобретении используется штамм гриба
Cryptococcus farciminosus F-0241 коллекционный
номер № БС 68 КазНИВИ, депонированный в
Лаборатории по изучению генофонда
микроорганизмов ТОО «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт».
Штамм характеризуется следующими признками,
которыми обладает гриб Cryptococcus farciminosus.
Морфологические признаки. Вакцинный штамм
Cryptococcus farciminosus F-0241 коллекционный
номер №БС 68 КазНИВИ обладает морфологическими
признаками, характерными для возбудителя
лимфангоита лошадей. Окрашенные по Грамму
культуры гриба грамположительные.
Культуральные свойства. Молодые 7-дневные
колонии совершенно гладкие, ровные. Колония на
средах значительно улучшает рост мицелия
добавление к среде глюкозы, маннита, глицерина и
особенно, дополнительная прибавка пептона, к
10-му дню достигает диаметра 12-16 мм, на среде
Чапека - 10-12 мм. После 10-14 дней становятся
складчатыми, иногда с трещинами, бархатисто-
пушистыми, зелено-коричневыми. Бахромчатые,
погруженные в субстрат края колонии коричневого
цвета. Обратная сторона колоний темно-коричневого;
в зрелых и старых культурах темного цвета. Мицелий
септированный, ветвящиеся, шириной до 3-5 мкм,
редко завитки (спирали и кольцевидные) окончания
гиф и интеркалярными хламидоспорами диаметром 3-
5-10 × 3-4 мкм.
Многочисленные хломидоспоры встречается по
разной форме, округлые, грушевидной, толстостенной
и с зернистой на коротких ножках расположены по
бокам мицелия. Средние размеры их 3-5 мкм.
Артроспоры встречается в старых культурах.
Биохимические свойства. Штамм гриба
Cryptococcus farciminosus F-0241 коллекционный
номер №БС 68 КазНИВИ хорошо растет на МПА,
значительно улучшает рост мицелия добавление к
среде глюкозы, маннита, глицерина и особенно,
дополнительная прибавка пептона, избирательно
поражаемом данным грибом. Культивирует при
температуре 25-27°С в течение 8-10 дней. В этих
условиях наблюдается ускорение лагфазы и
усиливается накопление биомассы (у эталонного
штамма за 15 сут). Бахромчатые, погруженные в
субстрат края колонии коричневого цвета. Обратная
сторона колоний темно-коричневого; в зрелых и
старых культурах темного цвета. Из числа углеводов
плохо усваивается сахароза. Факторами роста
является глюкоза, глицерин, пептон и маннит.
Элементами питания является азот, углерод, водород,
кислород, а наиболее важные микроэлементы - фосфор
и сера. Все эти микро и макроэлементы участвуют во
всех биохимических реакциях происходящих в
клетках.
Сероводород и индол не образуют.
Антигенные свойства. На введения культуры
штамма в организме лошадей, кроликов и морских
свинок образуются специфические агглютинины в
титрах 1:40- 1 : 1280.
Маркерные признаки. Биохимические - на МПА
при pH 7,4-7,6 до концентрации белка 6-8 мг/см3
.
Многочисленные хломидоспоры, округлые,
грушевидной, толстостенной и с зернистой; на тонких
коротких ножках расположены по бокам мицелия.
Средние размеры их 3-7 × 2-3 мкм.
Артроспоры встречается старых культурах; по
форме они слегка булавовидные, удлиненно -
овальные с тупым наружным концом, размером 4-8
мкм в диаметре.
Физиологические - хемогетеротроф. По
отношению к кислороду аэроб. Не обладает

3. 28902
3
метаболическими свойствами. В минеральном
питании для основного обмена грибов, необходимо
азот, углерод, кислород, водород, фосфор, калий,
магний, железо, медь, цинк, марганец, молибден,
кальций, кобальт, ванадий.
Иммунохимические - в реакциях РДСК титры
антител составляет от 1:10 до 1: 1280; отличается от
эпизоотических штаммов слабой вирулентностью,
высокой спорогенностью и активностью при
внутримышечном введении.
Патогенные свойства. Штамм гриба Cryptococcus
farciminosus F-0241 коллекционный номер №БС 68
КазНИВИ патогенный для лошадей, ослов и мулов.
Иммуногенность. При двукратном
внутримышечном введении штамма в дозе 5,0 см3
создают напряженный иммунитет у привитых
лошадей, продолжительностью не менее 12 месяцев.
Реактогенность. Штамм гриба Cryptococcus
farciminosus F-0241 коллекционный номер №БС 68
КазНИВИ слабореактогенен для лошадей при
внутримышечном введении.
Спорообразование. Максимальный уровень
спорообразования на МПА 300-350 млн/см3
.
Реверсабельность и реактогенность. Штамм гриба
отличается от эпизоотических изолятов слабой
вирулентностью, отсутствием заражения при контакте
между животными, высокой активностью при
внутримышечном введении.
Стабильность свойств при пассировании.
Основные биологические свойства штамма гриба
Cryptococcus farciminosus F-0241 коллекционный
номер №БС 68 КазНИВИ стабильно сохраняются на
протяжении 5 лет при условии редких пересевов
(2-3 раза в год), не ослабляя патогенные свойства.
Штамм гриба Cryptococcus farciminosus F-0241
коллекционный номер №БС 68 КазНИВИ не снижает
активности при температуре 2-10°С в течение 12
месяцев в нативном состоянии в течение 6 месяцев, в
замороженном при минус 40°С в течение 6 месяцев,
при 20°С в течение 2 лет.
Способ получения антигена состоит в следующем.
Пример 1. Способ получения антигена для
серологической диагностики эпизоотического
лимфангоита лошадей, включающий в качестве
штамма гриба используют штамм Cryptococcus
farciminosus F-0241, выращивают на мясопептонном
бульоне с добавлением глицерина, глюкозы и маннита,
затем разрушают клетки культуры путем двухкратного
воздействия ультразвуком при частоте 22 кГц и
мощностью 100 Вт/см2
с интервалом 30 мин, после
чего полученную суспензию центрифугируют при
6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к
надосадочной жидкости добавляют 96% раствор
охлажденного этилового спирта в соотношении 1:3
соответственно, тщательно перемешивают и
выдерживают в течение 10 час при температуре 5°С,
полученный осадок вновь центрифугируют при
6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную
жидкость отбрасывают, осадок растворяют в
физиологическом растворе, доводят pH до 7,5 и
концентрацию белка до 1 мг/см3
.
Пример 2. При титровании комплемента морской
свинкой в реакции длительного связывания
комплемента (РДСК) и приготовленного антигена в
рабочем титре полученные одинаковые титры
комплемента, что свидетельствует об отсутствии
антикомплементарного свойства приготовленного
антигена.
Активность полученного описанным способам
антигена была проверена в лабораторных условиях
при постановке РДСК с сыворотками крови от
здоровых и больных лошадей.
Результаты оценки активности предлагаемого
антигена для РДСК при эпизоотическом лимфангоите
лошадей приведены в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что антиген, полученный
описанным способам, с серопозитивными
сыворотками в разведениях 1:5 и 1:10 дает
положительные результаты при разведении антигена
1:80, с серонегативными дает отрицательные
результаты, что доказывает его достаточно высокую
активность и специфичность. Это позволит
использовать его в качестве антигена для в РДСК,
обладающего высокой чувствительностью в
выявлении эпизоотическом лимфангоите лошадей.
Готовый антиген расфасовывают в стерильные
ампулы по 1 мл подвергают сублимационной сушке.
Антиген может храниться до 6 мес. при температуре
4°С и в лиофилизированном виде 2-3 года, не теряя
своего исходного титра. Перед использованием его
необходимо титровать с положительными и
отрицательными сыворотками.
Предложенный способ получения антигена для
серологической диагностики эпизоотического
лимфангоита лошадей обеспечивает высокую
активность и специфичность антигена, что позволяет
повысить достоверность серологических реакций.
Таблица 1
Оценка активности предлагаемого антигена для РДСК при эпизоотическом лимфангоите лошадей
Разведение антигенаНаименование Разведение
сывороток 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160
1:5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++Положительной
1:10 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++
Отрицательной 1:10 - - - - - -
Контроль (физ.раствор) - - - - - - -

4. 28902
4
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения антигена для серологической
диагностики эпизоотического лимфангиота
лошадей, включающий выращивание культуры
криптококков на питательной среде,
автоклавирование, высушивание в эксикаторе над
хлористым кальцием, приготовление суспензии,
центрифугирование и получение надосадочной
жидкости, отличающийся тем, что в качестве
штамма гриба используют штамм Cryptococcus
farciminosus F - 0241, который выращивают на
мясопептонном бульоне с добавлением глицерина,
глюкозы и маннита, затем разрушают клетки
культуры путем двухкратного воздействия
ультразвуком при частоте 22 кГц и мощностью
100 Вт/см2
с интервалом 30 мин, после чего
полученную суспензию центрифугируют при
6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к
надосадочной жидкости добавляют 96% раствор
охлажденного этилового спирта в соотношении 1:3
соответственно, тщательно перемешивают и
выдерживают в течение 10 час при температуре 5°С,
полученный осадок вновь центрифугируют при 6000
об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость
отбрасывают, осадок растворяют в
физиологическом растворе, доводят рН до 7,5 и
концентрацию белка до 1 мг/см3
.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч