1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29650
(51) G12N 5/00 (2006.01)
G12N 5/07 (2006.01)
G12N 9/00 (2006.01)
A61K 8/66 (2006.01)
A61K 8/98 (2006.01)
A61K 8/96 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0530.1
(22) 18.04.2014
(45) 16.03.2015, бюл. №3
(72) Султанкулов Болат Мухтарович
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Клеточная терапия"
(74) Тусупова Меруерт Кырыкбаевна; Дюсенов
Еркебулан Рамазанович
(56) RU 2396084 С1, 10.08.2010
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ,
СОДЕРЖАЩЕЙ АУТОЛОГИЧНЫЙ
КЛЕТОЧНЫЙ КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ
МАТЕРИАЛ
(57) Изобретение относится к способам получения
композиции, содержащей аутологичный клеточный
культуральный материал и может быть применено
для регенерации подкожной или кожной ткани и
долгосрочного увеличении плотности кожи
субъектов, в частности для уменьшения морщин,
растяжек, рубцов, кожных впадин, а также в
косметическом увеличении губ.
Техническим результатом является получение
композиции, содержащей аутологичный клеточный
культуральный материал, свободных от
иммуногенных белков, эффект по уменьшению
морщин, растяжек, рубцов, кожных впадин за
короткий период времени и сохранение этих
эффектов в течение длительного времени.
Это достигается тем, что способ получения
композиции, содержащей аутологичный клеточный
культуральный материал, включающий стадии
переваривания, культивирования,
центрифугирования и суспендирования
аутологичного клеточного культурального
материала, согласно изобретению, включает
следующие стадии:
а) переваривания аутологичного клеточного
культурального материала путем обработки
ферментной смесью с последующим разделением их
на отдельные клетки,
б) центрифугирование обработанного
аутологичного клеточного культурального
материала со скоростью 1400-1600g при 10°С,
в) культивирование в среде DMEM до
достижения 1000-5000 осажденного аутологичного
клеточного культурального материала с
последующим их культивированием в
бессывороточной среде,
г) подготовка композиции, содержащей
аутологичный клеточный культуральный материал
и фосфатно-буферный раствор при соотношении
500 млн.: 500 мкл.
(19)KZ(13)A4(11)29650
2. 29650
2
Изобретение относится к способам получения
композиции, содержащей аутологичный клеточный
культуральный материал и может быть применен
для регенерации подкожной или кожной ткани и
долгосрочного увеличении плотности кожи
субъектов, в частности для уменьшения морщин,
растяжек, рубцов, кожных впадин, а также в
косметическом увеличении губ.
Известен способ увеличения подкожной или
кожной ткани субъекта, включающий стадий:
(I) получение суспензии аллогенных фибробластов
кожи; и (II) введение эффективного объема
суспензии в ткани, так что ткань увеличивается.
Суспензия дополнительно содержит человеческий
фибрин с конечной концентрацией от 0,1 до
20 мг/мл /WO 2006125991 А1, 30.11.2006 г./.
Недостатками данного аналога являются
недостаточные возможности для получения
аутологичных клеток, свободных от иммуногенных
белков, недостаточный эффект по уменьшению
морщин, растяжек, рубцов, кожных впадин за
короткий период времени. Недостатком данного
метода также является использование аллогенных
клеток, то есть, клеток не принадлежащих субъекту.
Известен способ получения композиции филлера
для мягких тканей для инъекции, выбранный в
качестве наиболее близкого аналога, для облегчения
или лечения повреждения кожи вследствие
механических или физиологических причин,
включающий стадии: 1) переваривания
аутологичной дермальной ткани, выделенной из
собственной кожи пациента путем обработки
раствором панкреатина/EDTA, и разделения на
отдельные клетки; 2) культивирования и
пролиферации выделенных дермальных клеток
посредством бессывороточной культивации in vitro
в среде, содержащей фактор роста и активационный
фактор для получения аутологичного клеточного
культурального материала дермального
происхождения, содержащего дермальные
фибробластные стволовые клетки, дермальные
фибробластные переходные делящиеся клетки,
дермальные фибробласты и коллаген; 3)
центрифугирования аутологичного клеточного
культурального материала дермального
происхождения для отделения аутологичного
клеточного осадка дермального происхождения; и 4)
суспендирования аутологичного клеточного осадка
дермального происхождения в глюкозном растворе
для инъекции или произвольном растворе для
инъекции с получением суспензии для инъекции.
Предложена композиция, полученная указанным
способом, которая содержит от 1×107 до 8×107
клеток/мл аутологичных клеток дермального
происхождения и от 10 до 100 мг/мл коллагена в
качестве эффективного ингредиента. /RU 2396084
С1, 10.08.2010 г./.
Недостатками данного аналога являются
недостаточные возможности для получения
аутологичных клеток, свободных от иммуногенных
белков, недостаточный эффект по уменьшению
морщин, растяжек, рубцов, кожных впадин за
короткий период времени.
Задачей изобретения является разработка
способа получения композиции, содержащей
аутологичный клеточный культуральный материал с
улучшенными техническими характеристиками.
Техническим результатом является получение
композиции, содержащей аутологичный клеточный
культуральный материал, свободных от
иммуногенных белков, эффект по уменьшению
морщин, растяжек, рубцов, кожных впадин за
короткий период времени и сохранение этих
эффектов в течение длительного времени.
Это достигается тем, что способ получения
композиции, содержащей аутологичный клеточный
культуральный материал, включающий стадии
переваривания, культивирования,
центрифугирования и суспендирования
аутологичного клеточного культурального
материала, согласно изобретению, включает
следующие стадии:
а) переваривания аутологичного клеточного
культурального материала путем обработки
ферментной смесью с последующим разделением их
на отдельные клетки,
б) центрифугирование обработанного
аутологичного клеточного культурального
материала со скоростью 1400-1600 g при 10°С,
в) культивирование в среде DMEM до
достижения 1000-5000 осажденного аутологичного
клеточного культурального материала с
последующим их культивированием в
бессывороточной среде,
г) подготовка композиции, содержащей
аутологичный клеточный культуральный материал и
фосфатно-буферный раствор при соотношении
500 млн.: 500 мкл.
На стадии в) в среду DMEM добавляют, по
меньшей мере, одно вещество, выбранное из
группы: глутамин, пируват натрия, фетальная бычья
сыворотка, антибиотик (пенициллин 1% и
стрептомицин 1%).
Аутологичный клеточный культуральный
материал представляет собой, по меньшей мере,
один материал, выбранный из группы: дермальные
фибробластные стволовые клетки, дермальные
фибробластные переходные делящиеся клетки,
дермальные фибробласты.
Ферментная смесь представляет собой смесь
коллагеназ типов I, II, III, IV, диспаз типов I и IV
при соотношении между собой 1:1 с концентрацией
каждого типа коллагеназ и диспаз 100 МЕ/мл, а
также дополнительно содержит 0,05% раствор
трипсина в фосфатном буфере.
Изобретение основано, в частности, на
признании того, что идеальным материалом для
увеличения плотности дермы и подкожной
клетчатки являются живые клетки, а именно
фибробласты, которые обычно присутствует в
дерме. Изобретение также основано на признании
того, что желаемое количество аутологичных клеток
с косметическим эффектом могут быть выделены и
культивированы из образца биопсии, взятого за
4-5 недель перед инъекцией.
3. 29650
3
Аутологичный клеточный культуральный
материал (дермальные фибробластные стволовые
клетки, дермальные фибробластные переходные
делящиеся клетки, дермальные фибробласты)
получают следующим образом. Полученный
тканевой биоптат кожи подвергается обработке
ферментативной смесью, состоящей из 4-типов
коллагеназ (I, II, III, IV), диспаз (I, IV) и трипсина в
растворе ДМЕМ, содержащего смесь из
антибиотиков пенициллина и стрептомицина
(100 МЕ/мл, 100 мкг/мл) с концентрацией каждого
из ферментов 100 МЕ/мл в течений 6-12 часов.
После инкубирования при 37°С и 5% СO2 клеточная
суспензия подвергается центрифугированию при
1200-1500 g в течении 5 минут и осадок переносится
в соответствующую клеточную плашку,
содержащую питательную среду для
культивирования дермальных фибробластов. После
24 часов инкубирования плашки в соответствующем
СО2 инкубаторе, прогениторные клетки
фибробластов начинают образовывать колонии как
показано на фиг.1.
Колониеобразующими фибробластами являются
прогениторные клетки фибробластов с активным
пролиферативным потенциалом способных давать
начало дифференцированным дермальным
фибробластам человека. Данные колонии
образуются после 24 часов инкубирования биоптата
в питательной среде в инкубаторе при температуре
37°С и 5% СО2. После того как плотность клеток
покрывает 90% культуральной плашки, дермальные
фибробласты подвергаются воздействию раствора
0,05% трипсина в течение 5 минут. Данная
процедура отцепляет клетки от поверхности
плашки, тем самым позволяет пересадить клетки на
плашку с большей поверхностной площадью. После
инкубирования клеток в 0,05% растворе трипсина
производится инактивация ферментной активности
добавлением равного объема питательной среды.
Раствор с клетками переносится в пробирку и
клетки собираются путем центрифугирования при
скорости 1500 g. Полученный осадок клеток
разбавляется питательной средой и переносится на
новую культуральную плашку для дальнейшего
роста аутологичного клеточного культурального
материала (дермальные фибробластные стволовые
клетки, дермальные фибробластные переходные
делящиеся клетки, дермальные фибробласты).
На фиг.1 изображено образование колонии
фибробластов прогениторными дермальными
фибробластами.
На фиг.2 изображено увеличение плотности
дермы после введения аутологичного материала (на
12% в первую неделю, и 80-90% в течении
12 месяцев).
Изобретение осуществляется следующим
образом.
Настоящее изобретение поясняется конкретным
примером, который наглядно демонстрирует
возможность достижения приведенной
совокупностью признаков требуемого технического
результата, однако не является единственно
возможным.
Пример.
Изобретение может быть осуществлено путем
введения любых недифференцированных
мезенхимальных клеток, количественно
расширенных в культуре. Предпочтительно,
данными клетками являются фибробласты.
Дермальная культура фибробластов
инициируется из одного биоптатного материала
кожи размером 4×4 мм, взятого за ухом пациента.
Перед началом культуры фибробластов,
полученный биоптатный материал промывают
антибиотиком, состоящей из смеси пенициллина и
стрептомицина. В процессе выделения
аутологичных фибробластов из дермы человека
используется смесь из двух антибиотиков:
пенициллина и стрептомицина. Рабочей
концентрацией для пенициллина составляет
100 МЕ/мл, а для стрептомицина 100 мкг/мл.
Каждый из используемых растворов в обязательном
порядке обогощается смесью пенициллина и
стрептомицина и проходит фильтрацию через
мембрану с порами 0,1 мкм.
Далее кусочек кожи (биоптатный материал)
подвергается перевариванию путем обработки
ферментной смесью, состоящей из коллагеназ типов
I, II, III, IV, диспаз типов I и II, а также трипсина.
Смесь ферментов является неотъемлемой частью
процесса выделения фибробластов. В заявленном
изобретении используются смесь из коллагеназ
типов I, II, III, IV, диспаз типов I и IV, а также
трипсина. Соотношения каждых типов колагеназ и
диспаз между собой составляет 1:1. Количественно,
100 ME каждого типа коллагеназы/диспазы на 1 мл
раствора ДМЕМ со смесью из антибиотиков.
Трипсин используется для поднятия культуры
выделенных аутологичных фибробластов и не
участвует в самой процедуре выделения.
Концентрация используемого трипсина составляет
0,05% раствор трипсина в фосфатном буфере. Для
поднятия клеток с культуральной плашки
используется количество раствора трипсина,
покрывающее всю площадь поверхности, на
которую прикреплены клетки.
Высвобождаемые клетки собираются путем
центрифугирования при 1400-1600 g при 10°С.
После чего клетки переносятся в среду DMEM с
добавлением 2 мМ глутамина, пирувата натрия
110 мг/л, 10% (объемных) фетальной бычьей
сыворотки и смеси антибиотиков (пенициллин 1% и
стрептомицин 1%) для последующего
культивирования в колбе Т-25.
Когда количество фибробластов достигает 1000-
5000 клеток, что занимает 3-5 дней в зависимости от
количества выделенных клеток, среда заменяется на
бессывороточную среду. Инкубацию клеток в
бессывороточной среде в значительной степени
удаляет белки, которые являются производными от
эмбриональной бычьей сыворотки, которые, если
присутствуют, могут вызвать аллергическую
реакцию.
В течение 3-5 недель клетки пересаживают из
культуральных колб при помощи трипсинизаций.
4. 29650
4
Далее 300-500 млн. клеток вводятся субъектам в
фосфатно-буферном растворе, более приближенном
по составу к физиологической жидкости человека,
при этом 50 млн. клеток разбавляется в 500 мкл
фосфатно-буферного раствора.
Введение аутологичных дермальных
фибробластов модифициирует экстрацеллюлярный
матрикс дермы человека за счет синтеза новых
структурных элементов таких как различные типы
коллагена и эластин, так как вводимые
аутологичные фибробласты в себе содержат
прогениторные клетки, способные активно делиться
и давать начало дифференциированным
дермальным фибробластам, после введения
дермальный слой насыщается здоровыми и
активными фибробластами, способными
восстановить целостную структуру дермы. Как
показано на фиг.2, введение аутологичного
материала увеличивает плотность дермы на 12% в
первую неделю, и данная цифра растет в течении
12 месяцев и достигает 80-90%. В долгосрочном
плане введение дермальных фибробластов за счет
активного деления в структуре дермы может
использоваться, как для эстетических целей, так и
для заживления шрамов различного происхождения.
Так как материал является аутологичным, не
имеются какие либо иммунологические реакции в
виде отторжения клеток или активации
воспалительных процессов у пациентов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения композиции, содержащей
аутологичный клеточный культуральный материал,
включающий стадии переваривания,
культивирования, центрифугирования и
суспендирования аутологичного клеточного
культурального материала, отличающийся тем, что
включает следующие стадии:
а) переваривания аутологичного клеточного
культурального материала путем обработки
ферментной смесью с последующим разделением их
на отдельные клетки,
б) центрифугирование обработанного
аутологичного клеточного культурального
материала со скоростью 1400-1600 g при 10°С,
в) культивирование в среде DMEM до
достижения 1000-5000 осажденного аутологичного
клеточного культурального материала с
последующим их культивированием в
бессывороточной среде,
г) подготовка композиции, содержащей
аутологичный клеточный культуральный материал
и фосфатно-буферный раствор при соотношении
500 млн.: 500 мкл.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на
стадии в) в среду DMEM добавляют, по меньшей
мере, одно вещество, выбранное из группы:
глутамин, пируват натрия, фетальная бычья
сыворотка, антибиотик.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в
качестве глутамина используют глутамин с
концентрацией 2 мМ.
4. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в
качестве пирувата натрия используют пируват
натрия с концентрацией 110 мг/л.
5. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в
качестве в качестве фетальной бычьей сыворотки
используют фетальную бычью сыворотку с
концентрацией 10% (объемных).
6. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в
качестве антибиотика используют смесь 100 МЕ/мл
пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что
аутологичный клеточный культуральный материал
представляет собой, по меньшей мере, один
материал, выбранный из группы: дермальные
фибробластные стволовые клетки, дермальные
фибробластные переходные делящиеся клетки,
дермальные фибробласты.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что
ферментная смесь представляет собой смесь
коллагеназ типов I, II, III, IV, диспаз типов I и IV
при соотношении между собой 1:1 с концентрацией
каждого типа коллагеназ и диспаз 100 МЕ/мл.
9. Способ по пп.1 и 8, отличающийся тем, что
ферментная смесь дополнительно содержит 0,05%
раствор трипсина в фосфатном буфере.
