Nghiên cứu đặc điểm kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở Việt Nam.pdf

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Thị Mỹ Lệ
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHUẨN
CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP
TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT Ở VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Thị Mỹ Lệ
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHUẨN
CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ MỘT
SỐ THỰC VẬT Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
TS. Lê Hồng Điệp
Hà Nội - 2019

3. i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộ Viện
Vi sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hƣớng
dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm, giúp tôi hoàn thành luận văn theo
đúng định hƣớng ban đầu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
TS. Lê Hồng Điệp, cán bộ tại Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Khoa
Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện
cho tôi hoàn thành luận văn này.
CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh cùng toàn thể cán bộ, sinh viên tại
Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình
giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình làm thực nghiệm.
Đề tài “Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa định hƣớng ứng
dụng trong thực phẩm, dƣợc phẩm và thức ăn chăn nuôi” - Bộ khoa học và
Công nghệ đã hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện
luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè và các anh
chị đồng học luôn ở bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi vƣợt qua những khó khăn
trong thời gian học tập suốt 2 năm vừa qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Thị Mỹ Lệ

4. ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
MỤC LỤC.................................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ vi
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.............................................2
1.1.Sơ lƣợc về các loài thực vật dùng trong nghiên cứu ............................................2
1.2.Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB).......................................................4
1.2.1.Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic .............................................................4
1.2.2.Trao đổi chất của vi khuẩn lactic ..................................................................6
1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn lactic............7
1.2.4.Ứng dụng của vi khuẩn lactic........................................................................9
1.3.Bacteriocin..........................................................................................................10
1.3.1.Định nghĩa...................................................................................................11
1.3.2.Phân loại......................................................................................................11
1.3.3.Cơ chế hoạt động của bacteriocin ...............................................................13
1.3.4.Phƣơng pháp tinh sạch bacteriocin .............................................................14
1.3.5.Lợi ích và hạn chế của bacteriocin..............................................................16
1.3.6.Ứng dụng của bacteriocin ...........................................................................17
1.3.7.Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ LAB ..................................................19
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................23
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................23
2.1.1. Nguồn phân lập...........................................................................................23
2.1.2. Nguồn vi sinh vật........................................................................................23
2.1.3. Môi trƣờng, hóa chất và thiết bị .................................................................24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................26
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................26

5. iii
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn lactic........................................................27
2.2.3. Xác định hoạt tính và hoạt độ bacteriocin ..................................................27
2.2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật bằng sinh học phân tử ........................28
2.2.5. Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin....30
2.2.6. Một số tính chất của bacteriocin.................................................................30
2.2.7. Tinh sạch bacteriocin..................................................................................31
2.2.8. Phƣơng pháp thống kê sinh học..................................................................33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................34
3.1. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin và định danh .................34
3.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin............................34
3.1.2. Hoạt độ bacteriocin của chủng UL830 .......................................................36
3.1.3. Định danh chủng UL830 ............................................................................37
3.2. Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của
chủng vi khuẩn L. plantarum UL830........................................................................37
3.2.1. Thời gian nuôi cấy ......................................................................................37
3.2.2. Nhiệt độ nuôi cấy........................................................................................38
3.3. Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn L. plantarum UL830 ............39
3.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn .................................................................................39
3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830..................42
3.3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830 .........43
3.3.4. Ảnh hƣởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt tính bacteriocin từ chủng UL830...44
3.4. Tinh sạch bacteriocin .........................................................................................45
3.4.1. Kết quả tinh sạch bacteriocin bằng sắc ký trao đổi cation..........................45
3.4.2. Kết quả tinh sạch bacteriocin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .......47
KẾT LUẬN...............................................................................................................49
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................51

6. iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AU Activity Unit
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High-Performance Liquid Chromatography)
kDa Kilo Dalton
LAB Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria)
LB Luria Bertani
MRS Man, Rogosa, Sharpe
PCR Polymerase chain reaction
TSBYE Tryptic Soy Broth Yeast Extract

7. v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tác dụng y học của 10 loài thực vật...........................................................2
Bảng 1.2. Một số bacteriocin quan trọng sinh tổng hợp bởi Lactobacilli [83].........12
Bảng 1.3. Tinh sạch một số bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi LAB [60].............15
Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn kiểm định .................................................................23
Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật gây bệnh................................................................24
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập.................................................34
Bảng 3.2. Khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của các chủng lựa chọn .................35
Bảng 3.3. Hoạt độ bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng UL830 ..............................36
Bảng 3.4. Kết quả đƣờng kính vòng kháng khuẩn....................................................41
Bảng 3.5. Tinh sạch bacteriocin của chủng L. plantarum UL830 bằng sắc ký trao
đổi cation....................................................................................................46

8. vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của bacteriocin [82] .....................................................14
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm .......................................................................................26
Hình 2.2. Cách pha loãng mẫu theo hệ số 2..............................................................27
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA genome của chủng UL830 (A) và điện di sản phẩm
PCR khuếch đại gen 16S rDNA (B) ..........................................................37
Hình 3.3. Hoạt tính bacteriocin của chủng L. plantarum UL830 tại các nhiệt độ nuôi
cấy khác nhau.............................................................................................39
Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng UL830 ................................................40
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum
UL830 ........................................................................................................42
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum
UL830 ........................................................................................................43
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của trypsin (A) và chymotrypsin (B) đến hoạt tính bacteriocin
từ chủng L. plantarum UL830 ...................................................................44
Hình 3.8. Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng UL830 qua cột Hitrap SP FF 1 mL.........45
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn rửa giải..............46
Hình 3.10. Sắc ký phân tích HPLC của bactericoin sinh tổng hợp bởi chủng UL830..47
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra hoạt tính bacteriocin các đỉnh HPLC ..........................48

9. 1
MỞ ĐẦU
Thực phẩm chứa mầm bệnh ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe con
ngƣời và là nguyên nhân chính gây ra các dịch bệnh. Mặc dù các tiến bộ kỹ thuật
trong công nghệ và nguyên tắc về vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP,…) đã
đƣợc áp dụng, nhƣng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế
biến thực phẩm ngày càng tăng. Chính vì thế, các chất bảo quản hóa học đƣợc sử
dụng tràn lan. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các chất phụ gia trong thực phẩm
gây ra tác dụng không mong muốn cho ngƣời tiêu dùng. Do đó, việc tìm ra các hợp
chất có hoạt tính kháng khuẩn từ nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu đang đƣợc
quan tâm.
Trƣớc những yêu cầu trên, vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn đƣợc tập
trung nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn
nhƣ acid lactic, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin và
reutericyclin. Trong đó, bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn thu hút đƣợc nhiều sự
quan tâm. Chúng có khả năng kháng các vi sinh vật gây hỏng trong thực phẩm nhƣ
Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella… Do
tính chất an toàn đối với con ngƣời và cả động vật, LAB đã đƣợc ứng dụng rộng rãi
trong chế biến thực phẩm và là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong
những năm qua.
Việt Nam là nƣớc nhiệt đới gió mùa với nguồn động thực vật phong phú.
Nguồn thực vật dồi dào, gần gũi với đời sống con ngƣời nhƣ lá lô hội, ngải cứu,
rau muống, lá sung… không chỉ là thực phẩm hàng ngày mà còn có tác dụng
trong y học. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm
kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở Việt Nam”.
Mục tiêu ban đầu là phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng
sinh tổng hợp bacteriocin và định danh. Qua đó, xác định ảnh hƣởng của pH,
nhiệt độ, enzyme tiêu hóa đến hoạt tính bacteriocin và sơ bộ tinh sạch
bacteriocin nhằm góp phần làm phong phú thêm những thông tin cũng nhƣ tiềm
năng ứng dụng từ bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB.

10. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Sơ lƣợc về các loài thực vật dùng trong nghiên cứu
Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú và đa dạng. Thống kê
cho thấy ở Việt Nam có đến 12000 loài thực vật có mạch bậc cao, sinh trƣởng trong
các điều kiện sinh thái và hình thành các kiểu thảm thực vật khác nhau [2]. Từ trƣớc
đến nay có rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu các cây thuốc và vị thuốc
để chữa trị các bệnh nhƣ: GS. Đỗ Tất Lợi (1999) trong cuốn “Những cây thuốc và vị
thuốc Việt Nam” giới thiệu 800 cây để làm thuốc; sách “Cây thuốc Việt Nam” của
lƣơng y Lê Trần Đức (1997) có ghi 830 cây thuốc; TS. Võ Văn Chi (1997) với cuốn
“Từ điển cây thuốc Việt Nam” có ghi 3200 cây thuốc trong đó có cả các loài cây
thuốc nhập ngoại… Theo tài liệu của Viện dƣợc liệu (2000) thì Việt Nam có đến
3820 loài cây làm thuốc. Nhƣng qua điều tra tìm hiểu thì con số này có thể đƣợc
nâng lên vì kiến thức sử dụng cây thuốc của ngƣời dân còn chƣa đầy đủ. Ngoài
công dụng làm thực phẩm trong cuộc sống hàng ngày thì một số tác dụng y học của
mƣời loài thực vật đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu đƣợc trình bày trong Bảng
1.1 dƣới đây:
Bảng 1.1. Tác dụng y học của 10 loài thực vật
STT Tên thực vật Tác dụng y học
1
Cải xanh
Brassica juncea L., họ cải
Brassicaceae
- Lợi tiểu, chữa ho, viêm khí quản, trị đau
dây thần kinh [2,10].
2
Sung
Ficus racemosa, họ Dâu tằm
Moraceae
- Trị kém ăn, mất ngủ; ghẻ lở ở trẻ em, da
mẩn sƣng đỏ…[2].

11. 3
3
Rau muống
Ipomoea aquatica Forssk, họ
Khoai lang Convolvulaceae
- Thanh nhiệt, giải các chất độc xâm nhập
vào cơ thể (nấm độc, sắn độc, cá thịt độc,
lá ngón, khuẩn độc hoặc do côn trùng, rắn
rết cắn...), mƣng nhọt, quai bị, lở ngứa,
loét ngoài da; rôm sẩy, sởi, thủy đậu…[2].
4
Lô hội
Aloe vera, họ Huệ tây
Liliaceae
- Thông đại tiện, hạ nhiệt, ăn uống không
tiêu, đắp ngoài trị phỏng, rôm sảy.
- Chống viêm nhiễm dị ứng, lão hóa tế
bào, giải độc cơ thể, điều trị các triệu
chứng lâm sàng nhƣ: táo bón, đau lƣng, trị
mụn nhọt, trị rôm sảy [9,14].
5
Rau càng cua
Peperomia pellucida, họ Hồ
tiêu Piperaceae
- Thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết,
thƣờng dùng để chữa các bệnh nhiễm
trùng đƣờng hô hấp, viêm họng, viêm ruột
thừa, viêm gan truyền nhiễm, viêm dạ dày
- ruột, tiêu hóa kém, đau nhức xƣơng
khớp, sốt rét [12].
6
Chanh
Citrus aurantifolia, họ Cửu
lý hƣơng Rutaceae
- Trị ho, thanh nhiệt, chữa cảm cúm.
- Chữa bệnh chƣớng bụng ở trẻ nhỏ, tiểu
bí, sốt rét và hen phế quản [2].
7
Mồng tơi
Basella alba L., họ Mồng tơi
Basellaceae
-Giải độc, thanh nhiệt, chữa đại tiện bí
kết, đại tiện xuất huyết, tiểu tiện khó, tiểu
dắt, chữa kiết lỵ hiệu quả [2].
8
Ngải cứu
Artemisia vulgris L, họ Cúc
- Chữa trị các bệnh nhƣ kinh nguyệt
không đều, bụng lạnh đau, tử cung lạnh

12. 4
Asteraceae không thể có thai, trị mụn trứng cá, mẩn
ngứa, tẩy tế bào chết, giúp máu lƣu thông
mạnh hơn, các cơ đang bị đau và chỗ bị
sƣng hay viêm [5].
9
Lá lốt
Piper lolot C., họ Hồ tiêu
Piperaceae
- Chống lạnh bụng, giảm đau, nôn mửa,
đầy hơi, ngƣời bị bệnh tê thấp, hay đổ mồ
hôi tay, chân, chữa sâu răng, nhức răng
[2].
10
Húng quế
Ocimum basilicum L., họ
Hoa môi Lamiaceae
- Chữa cảm cúm, ho, kinh nguyệt không
đều, thấp khớp, dùng ngoài da trị rắn cắn
và sâu bọ đốt, viêm da, giảm đau, chữa
đau dạ dày, kém tiêu hóa, chữa đau sâu
răng [1].
1.2.Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB)
1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB) là nhóm thu nhận năng lƣợng
nhờ quá trình phân giải carbohydrate kị khí và sinh ra acid lactic. Chúng thuộc họ
Lactobacteriaceae, không hình thành bào tử, Gram dƣơng, hình que hoặc hình cầu,
không di động, phản ứng oxidase và catalase âm tính [17]. Vi khuẩn lactic bao gồm
các chi: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus
Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella và Bifìdobacterium
[31,51]. Trong đó, các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus, Lactococcus và
Enterococcus đƣợc ứng dụng nhiều trong lên men thực phẩm. Những vi sinh vật
này góp phần tạo hƣơng vị cho sản phẩm và ức chế vi khuẩn gây bệnh bằng cách
tạo các hợp chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic cùng với các acid hữu cơ khác,
hydrogen, peroxide, peptide kháng khuẩn và bacteriocin [26,28,35].

13. 5
 Lactobacillus
Lactobacillus là chi lớn nhất trong bộ Lactobacillales với hơn 80 loài và phân loài
đƣợc công nhận [61]. Các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus là Gram dƣơng, không sinh
bào tử, không di động và catalase âm tính. Các chủng Lactobacillus có thể thực hiện trao
đổi chất theo cả hai con đƣờng lên men đồng hình và dị hình. Nhiệt độ tăng trƣởng dao
động từ 2 đến 53o
C và chúng có thể phát triển trong khoảng pH từ 3 đến 8 nhƣng điều
kiện tăng trƣởng tối ƣu thƣờng là 30 - 40o
C và pH 5,5 - 6,2 [64]. Chúng phân bố rất
nhiều trong tự nhiên và nhiều loài đã đƣợc ứng dụng trong thực phẩm do chúng có mặt
trong cơ thể ngƣời (khoang miệng, đƣờng tiêu hóa,...) và trong một số thực phẩm lên
men nhƣ thịt, sữa, rau quả, ngũ cốc [42].
 Lactococcus
Chi Lactococcus đƣợc phát sinh từ một nhánh của chi Streptococcus. Những
nghiên cứu gần đây cho thấy chi này có 5 loài, gồm L. lactis, L. garviae, L. plantarum,
L. raffinolactis, L. piscum; trong đó loài L. lactis có 3 dƣới loài là L. lactis subsp. lactis;
L. lactis subsp. cremoris và L. lactis subsp. hordniae [74]. Chúng là vi khuẩn Gram
dƣơng, hình cầu, dị dƣỡng, ƣa ẩm và không sinh bào tử. Nhiệt độ tăng trƣởng tối ƣu là
30o
C nhƣng chúng có thể tồn tại ở 10o
C và không sống sót ở 45o
C. Ngoài ra các chủng
Lactococcus có khả năng tăng trƣởng trong môi trƣờng có pH từ 3,5 - 9,2 nhƣng bị
chết ở pH 9,6 cũng nhƣ tồn tại đƣợc trong môi trƣờng có nồng độ NaCl thấp hơn 6,5%.
Chúng đƣợc ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa, sản xuất protein tái tổ hợp và
mới nhất hiện nay là sử dụng trong các liệu pháp điều trị chống lại các bệnh truyền
nhiễm và không truyền nhiễm [71].
 Enterococcus
Chi Enterococcus thuộc Gram dƣơng, không bào tử, catalase âm tính,
oxidase âm tính và kị khí. Theo Foulquie´ Moreno và cộng sự, đến năm 2006, có 28
loài là E. asini, E. avium, E. canis, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E.
dispar, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. flavescens, E. gallinarum, E. gilvus, E.
haemoperoxidus, E. hirae, E. malodoratus, E. moraviensis, E. mundtii, E. pallens,

14. 6
E. phoeniculicola, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. ratti, E. saccharolyticus, E.
saccharominimus, E. solitarius, E. sulfureus và E. villorum đã đƣợc phát hiện. Nhiệt
độ sinh trƣởng dao động từ 10 đến 45o
C, nhƣng tối ƣu là ở 35o
C. Ngoài ra, các
chủng Enterococcus cũng có thể phát triển trong môi trƣờng chứa NaCl 6,5%, ở pH
9,6 và chúng tồn tại ở -60o
C trong 30 phút [39].
1.2.2. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic đƣợc chia thành hai nhóm dựa trên đặc điểm lên men:
 Lên men đồng hình: sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose.
Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đƣờng theo con đƣờng EMP
(Embden - Meyerhof - Parnas Pathway).
Phƣơng trình tóm tắt của quá trình lên men đồng hình nhƣ sau:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP
Glucose Acid lactic
Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thƣờng gặp là Lactococus lactis,
L.casei, L. delbrueckii, Streptococcus cermoris… [40,43].
 Lên men dị hình: sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lƣợng ethanol,
acid acetic và CO2.
Phƣơng trình tóm tắt của quá trình lên men dị hình nhƣ sau:
C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal
Glucose Acid lactic Ethanol
Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thƣờng gặp là L. amylovorus, L.
reuteri, L. manihotivorans, Leucnostoc, Oenococcus, Weissella... [40,43].

15. 7
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi
khuẩn lactic
1.2.3.1. Carbohydrate
Carbohydrate là nguồn cung cấp carbon và năng lƣợng chính cho sự sinh
trƣởng của vi khuẩn lactic bằng cách tạo ra các hợp chất khác nhau (chủ yếu là acid
lactic) thông qua quá trình lên men. Ngoài ra, carbon cũng có thể đƣợc lấy từ
protein, acid amin và glycerol. Vi khuẩn lactic sử dụng đƣợc hầu hết các loại
đƣờng, nhƣng glucose là nguồn carbon thích hợp nhất và tùy từng loại LAB khác
nhau mà nguồn carbon phù hợp đƣợc lựa chọn. Ví dụ, L. acidophilus đã cho thấy
tăng trƣởng tốt hơn khi glucose đƣợc thay thế bằng maltose; S. thermophilus thƣờng
sử dụng đƣờng lactose không phải glucose. Sự khác biệt về nhu cầu đƣờng có thể
đƣợc sử dụng để phân lập và nhận dạng các chủng LAB. MRS đƣợc bổ sung
fructose thích hợp cho việc tuyển chọn chủng L. bulgaricus và MRS có maltose để
lựa chọn chủng L. acidophilus. Nồng độ đƣờng cũng có thể ảnh hƣởng đến sự tăng
trƣởng của LAB [43].
1.2.3.2. Amino acid và peptide
Nito ở dạng amino acid hoặc peptide là nguồn dinh dƣỡng rất quan trọng
cho sự phát triển sinh khối của vi khuẩn lactic. Amino acid và peptide có thể thu
nhận qua quá trình phân giải protein bởi các proteinase và peptidase. Tiếp đó, dƣới
tác dụng của các peptidase thì peptide sẽ đƣợc chuyển hóa thành peptide ngắn hơn
và amino acid tự do. Amino acid có thể đƣợc tiếp tục chuyển đổi thành các hợp
chất khác nhau, chẳng hạn nhƣ aldehyde, rƣợu và este. Quá trình sinh trƣởng của
LAB phụ thuộc vào nguồn cung cấp nito hữu cơ do vi khuẩn này ít có khả năng
sinh tổng hợp amino acid từ nguồn nito vô cơ. Nhu cầu amino acid của LAB khác
nhau tùy theo chủng, loài [43].
1.2.3.3. Vitamin
Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic có thể phân chia thành 3 nhóm:
vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không thiết yếu. Sự sinh trƣởng

16. 8
và phát triển của vi khuẩn lactic có thể giảm từ 34 - 67% nếu không có các nhóm
vitamin này trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Trong đó, acid pantothenic (vitamin
B5), acid riboflavin (vitamin B2) và acid nicotinic (vitamin B3 hay vitamin PP)
là những loại vitamin rất cần thiết cho hầu hết các chủng LAB. Khi thiếu
riboflavin, sự sinh trƣởng L. plantarum bị ức chế hoàn toàn. Một số vitamin (nhƣ
vitamin H, vitamin C,…) có thể là yếu tố kích thích cho sự tăng trƣởng của một
số chủng LAB nhƣng lại không có ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng của một số
chủng LAB khác. Nhu cầu vitamin của LAB khác nhau tùy chủng và một số
vitamin có thể thay thế lẫn nhau [43].
1.2.3.4. Khoáng chất
Các khoáng chất đóng vai trò quan trọng cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn
lactic nhƣ là chất kích hoạt hoặc cofactor của nhiều loại enzyme, tham gia vận
chuyển màng và cấu tạo nên các hợp chất phân tử. Một số ion thiết yếu có thể kể
đến nhƣ K+
, Na+
, Mg2+
, Mn2+
, Fe2+
và Cl-
. Trong đó, Mg2+
kích thích sự tăng
trƣởng, trao đổi chất và khả năng sống của LAB. Mn2+
có tác dụng sinh học lên cấu
trúc và kích hoạt nhiều enzyme nhƣ glutamine synthetase, RNA polymerase, lactate
dehydrogenase và phosphatase kiềm. Mg2+
là khoáng chất thiết yếu cho sự phát
triển của vi khuẩn L. delbrueckii, S. thermophilus, L. plantarum, L. casei, L. lactis,
L. helveticus và L. acidophilus; còn Mn2+
kích thích Leuconostoc mesenteroides, L.
plantarum [43].
1.2.3.5. Nhiệt độ
Nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng từ 15 - 40o
C. Trong đó, 24 -
30o
C là khoảng nhiệt độ tối ƣu nhất cho sự phát triển của LAB cũng nhƣ quá trình
lên men để tạo ra acid lactic. Các loài có nhiệt độ phát triển tối ƣu trong khoảng 40 -
45o
C đƣợc gọi là vi khuẩn ƣa nhiệt; trong khoảng 20 - 40o
C là vi khuẩn ƣa ấm.
Những loài vi khuẩn lactic sống trong đƣờng ruột của ngƣời và động vật hầu hết
thuộc loại ƣa ấm [56].

17. 9
1.2.3.6. pH
Vi khuẩn lactic hoạt động trong dải pH rộng. Khả năng điều chỉnh pH trong
tế bào chất là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng nhất giúp cho vi khuẩn
này có khả năng chịu acid thấp hơn so với nhiều loài vi khuẩn khác. Đa số các vi
khuẩn lactic có dải pH tối ƣu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilus); 6 - 6,5 (L.
plantarum); 5,5 - 6,5 (Pediococcus) và 6,3 - 6,5 (Leuconostoc) [79].
1.2.4. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp,
nông nghiệp, y dƣợc… và nhiều nhất là chế biến và bảo quản thực phẩm. Trong
những năm gần đây, vi khuẩn lactic đƣợc quan tâm nghiên cứu nhƣ là nguồn vi sinh
vật hữu ích với vai trò probiotic cho ngƣời và vật nuôi.
1.2.4.1. Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic đƣợc sử dụng để lên men thu acid lactic. Acid này có vị chua
dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối các loại nƣớc uống nhẹ,
tinh dầu, dịch quả, mứt, acid hóa rƣợu vang và hoa quả nghèo acid. Đặc biệt, chúng
có ý nghĩa quan trọng đối với ngành công nghiệp sữa. Chủng lên men thƣờng sử
dụng nhất là S. thermophilus, S. lactis, L. acidophilus, L. bulgaricus [3,4,49,81].
1.2.4.2. Trong nông nghiệp và môi trường
Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium, loại nấm
gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây
yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng.
Chế phẩm EM (Effective Microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu
bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả
của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô
nhiễm môi trƣờng.

18. 10
1.2.4.3. Trong y dược
Gần đây, ngƣời ta đã phát hiện vai trò lớn của vi khuẩn lactic đối với sức
khỏe con ngƣời cũng nhƣ các động vật nuôi. Một số vi khuẩn lactic sinh “kháng
sinh” đƣợc sử dụng làm chế phẩm “men tiêu hóa sống” probiotic để chữa một số
bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột.
Trong đó, nổi bật là chi Axitophilus, khi đƣợc bổ sung vào đƣờng tiêu hóa, nó ức
chế một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Nhờ khả năng sinh acid lactic và chất
kháng khuẩn trong đƣờng ruột, Lactobacillus cải thiện đƣợc tình trạng tiêu chảy,
tăng nhu động đƣờng ruột, chữa đƣợc chứng táo bón. Các chế phẩm chứa
Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị các bệnh rối loạn và viêm
nhiễm, bao gồm: viêm ruột kết, đầy hơi, ung bƣớu, làm hạ cholesterol trong máu,
đau đầu, viêm âm đạo không điển hình và cải thiện đƣợc tình trạng không sử dụng
đƣợc lactose.
1.2.4.4. Trong bảo quản chế biến thực phẩm
Vi khuẩn lactic sử dụng để làm dƣa chua, làm chua hoa quả mà không làm
mất màu tự nhiên của quả, trong sản xuất tƣơng, đậu phụ, nem chua…
1.3. Bacteriocin
Báo cáo đầu tiên và lâu đời nhất là công trình của André Gratia và cộng sự vào
năm 1925. Họ đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của “colicin” đƣợc sinh tổng hợp
bởi E. coli. Năm 1928, khả năng ức chế của một số chủng Lactococci với các chủng
LAB khác đã đƣợc báo cáo; sau đó, vào năm 1947, Mattick và Hirsh nghiên cứu một
chất kháng khuẩn đƣợc phân lập từ chủng Lactococcus lactis subsp. lactis, đƣợc gọi là
nisin. Bacteriocin này ban đầu đƣợc tinh chế và tiêu thụ trên thị trƣờng ở Anh (1953) và
sau đó ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm vào năm 1969. Năm 1983, ở châu Âu,
nisin đã đƣợc thêm vào danh sách các chất phụ gia thực phẩm. Đến năm 1988, Cục Quản
lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng phô mai có bổ sung
nisin. Bên cạnh nisin thì pediocin đƣợc sinh tổng hợp từ các chủng Pediococcus
acidilactici, P. parvulus và L. plantarum WHE92, cũng đã đƣợc sử dụng làm chất bảo

19. 11
quản trong công nghiệp thực phẩm. Từ những ứng dụng đó, những hƣớng nghiên cứu
về bacteriocin đã bắt đầu phát triển [27,34].
1.3.1. Định nghĩa
Bacteriocin, đƣợc sinh tổng hợp bởi LAB, là chất kháng khuẩn có bản chất
peptide hoặc protein đƣợc tổng hợp theo con đƣờng ribosome ở cả vi khuẩn Gram
âm và Gram dƣơng để chống lại các vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng
[33]. Bacteriocin đƣợc sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm nhƣ một
chất bảo quản do nó không làm thay đổi hƣơng vị sản phẩm, không gây dị ứng và
không gây hại cho sức khỏe con ngƣời (do nó bị phân hủy bởi protease, lipase ở
đƣờng ruột) [23,84].
1.3.2. Phân loại
Theo Klaenhammer (1993), bacteriocin của LAB đƣợc chia làm 4 lớp. Hiện
nay, sự phân loại này đã đƣợc sửa đổi nhƣ sau [78].
1.3.2.1. Lớp I
Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lantibiotics là những peptide nhỏ (< 5 kDa,
với 19 - 38 amino acid), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Các lantibiotic
đƣợc chia thành 2 phân lớp là Ia, Ib dựa trên cấu trúc hóa học và phƣơng thức hoạt
động [24,57,78]. Một bacteriocin tiêu biểu và đƣợc nghiên cứu sâu của lớp này là
nisin, đƣợc sản xuất bởi một số chủng Lactococcus lactis subsp. lactis (chứa 34
amino acid). Nisin là bacteriocin duy nhất đƣợc ứng dụng trong ngành công nghiệp
thực phẩm do Tổ chức thực phẩm và nông nghiệp và Tổ chức Y tế Thế giới
(FAO/WHO) công nhận vào năm 1969 [31].
1.3.2.2. Lớp II
Lớp II còn đƣợc gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng
lƣợng phân tử <10 kDa, tƣơng đối bền nhiệt và không chứa lanthionine. Đây là
nhóm bacteriocin lớn nhất trong hệ thống phân loại này. Các peptide có thể chia
thành 3 phân lớp là IIa (nhóm pediocin hoạt động chống lại Listeria spp.), IIb (chứa

20. 12
2 loại peptide nhƣ lactocin G, Plantaricin EF, Plantaricin JK) và IIc (các bacteriocin
có liên kết cộng hóa trị giữa đầu C và N nhƣ Lactococcin 972) [27,36,57,78].
1.3.2.3.Lớp III
Lớp III bao gồm những peptide lớn, có trọng lƣợng phân tử > 30 kDa và
không bền nhiệt. Hầu hết các bacteriocin lớp này đƣợc sinh tổng hợp từ các vi
khuẩn thuộc chi Lactobacillus. Đại diện cho lớp III là helveticin J đƣợc sản xuất bởi
vi khuẩn L. helveticus 481 và enterolysin sinh tổng hợp từ Enterococcus faecium
[57,78,83]. Các loại bacteriocin phổ biến nhất sản xuất bởi LAB đƣợc tóm tắt trong
Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số bacteriocin quan trọng sinh tổng hợp bởi Lactobacilli [83]
Bacteriocin Chủng vi khuẩn sản xuất
Lactacin F L. johnsonii
Lactocin 705 L. casei
Lactoccin G L. lactis
Lactococcin MN Lactococcus lactis var cremoris
Nisin L. lactis
Leucocin H Leuconostoc spp.
Plantaricin EF, Plantaricin W
Plantaricin JK, Plantaricin S
L. plantarum
1.3.2.4. Lớp IV
Hiện nay có rất ít nghiên cứu về lớp này. Một cách tổng quát, các bacteriocin
lớp IV đƣợc định nghĩa là các bacteriocin phức tạp có chứa các nhóm chức lipid
hoặc carbohydrate. Ví dụ về bacteriocin của lớp này là các glycoprotein (lactocin

21. 13
27), lipoprotein (lacstrepcins)…[31,57,78]. Tuy nhiên, bacteriocin trong lớp này
chƣa đƣợc định nghĩa và mô tả đầy đủ về các đặc điểm sinh hóa [24].
1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
1.3.3.1. Phạm vi hoạt động
Hầu hết các bacteriocin đƣợc tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm có hoạt tính ức
chế các loài cùng họ hàng. Bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram
dƣơng có hoạt tính ức chế các loài vi khuẩn Gram dƣơng nhƣng đôi khi nó cũng ức
chế một số loài vi khuẩn Gram âm [70].
1.3.3.2. Cơ chế hoạt động
Các bacteriocin có thể hoạt động thông qua các cơ chế khác nhau để phát
huy tác dụng kháng khuẩn. Hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng cách tạo kênh
hay lỗ trên màng làm phá hủy năng lƣợng hữu ích của tế bào sống. Lớp lipid tích
điện âm của màng tế bào chất là receptor đầu tiên để bacteriocin bám vào và bắt đầu
hình thành lỗ trên màng. Các bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng thƣờng không
có receptor bám đặc hiệu mặc dù vẫn có những ngoại lệ. Chúng hoạt động khác với
vi khuẩn Gram âm ở 2 điểm chính [44]:
 Bacteriocin tạo ra không gây chết cho vi sinh vật sản xuất. Sự khác biệt
này là do cơ chế vận chuyển để giải phóng bacteriocin. Ở vi khuẩn Gram dƣơng có
sự điều hòa đặc hiệu cho bacteriocin nên các bacteriocin chỉ dựa vào hệ thống điều
hòa của tế bào chủ.
 Hầu hết các bacteriocin kích thƣớc nhỏ, hoạt động trong phạm vi pH
rộng từ 3 - 9, thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11. Điểm đẳng điện cao
cho phép chúng tƣơng tác với bề mặt điện tích âm của màng tế bào vi khuẩn. Sau
đó, các phân tử bacteriocin liên kết với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng làm
mất gradient và gây chết tế bào.
Các cơ chế hoạt động khác nhau nhƣ thay đổi hoạt động của enzyme, ức
chế sự nảy mầm của bào tử và ngừng hoạt động của các chất mang anion thông
qua sự hình thành các lỗ đã đƣợc đề xuất đối với các bacteriocin [13]. Để phát huy

22. 14
tác dụng kháng khuẩn, các bacteriocin của LAB hoạt động thông qua các cơ chế
rất đa dạng nhƣng màng tế bào thƣờng là đích đƣợc nhắm đến. Sự tƣơng tác tĩnh
điện ban đầu giữa màng tế bào và bacteriocin đƣợc cho là bƣớc đầu tiên cho các
tác động tiếp theo [30]. Các bacteriocin có thể có tính kháng khuẩn hoặc diệt
khuẩn và tác động này chịu ảnh hƣởng rất nhiều bởi một số yếu tố nhƣ: lƣợng
bacteriocin và độ tinh khiết của nó, tình trạng sinh lý của các tế bào sử dụng và
các điều kiện thí nghiệm [25].
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của bacteriocin [82]
1.3.4. Phương pháp tinh sạch bacteriocin
Quá trình tinh sạch là bƣớc cần thiết để nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc phân
tử, trình tự amino acid, cơ chế hoạt động, các đặc tính của bacteriocin cũng nhƣ xác
định những thông tin về trọng lƣợng phân tử. Một số phƣơng pháp tinh sạch
bacteriocin là kết tủa ammonium sulfate, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký
lỏng hiệu năng cao HPLC,… Trong đó, HPLC là kỹ thuật đƣợc áp dụng phổ biến
nhất bởi mức độ tinh sạch cao và chính xác. Kết quả tinh sạch một số bacteriocin
sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic đƣợc trình bày trong Bảng 1.3.

23. 15
Bảng 1.3. Tinh sạch một số bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi LAB [60]
Bacteriocin Phƣơng pháp tinh sạch
Các bƣớc
tinh sạch
Hiệu suất
thu hồi
bacteriocin
(%)
Plantaricin ST31
Kết tủa ammonium sulfate - Sep-
pack C18 cartridge - RP-HPLC
3 0,8
Sắc ký trao đổi cation 1 5,9
Nisin Z
Expanded bed, sắc ký trao đổi ion
(EB-IEC)
1 90
Enterocin AS48 Trao đổi cation - sắc ký đảo pha 2 24,3
Plantaricin C19 Hấp phụ - giải hấp phụ - RP-HPLC 2 15
Pediocin ACM Hấp phụ - giải hấp phụ - RP-HPLC 2 40,4
Salivaricin Kết tủa ammonium sulfate - C18 2 7,3
Bacteriocin chƣa
xác định tên
Kết tủa ammonium sulfate - kết tủa
Tricholoro acid acetic - siêu lọc
3 1,0 - 1,2
Pediocin PA-1 Kết tủa ethanol - điện di đẳng điện
- siêu lọc
3 29
Lactococcin B 3 41
Mesentericin
Y105
Sắc ký trao đổi cation - C18 -
HPLC
3 60
Sakacin A 3 10
Sakacin P 3 10
Enterocin A 3 66
Pediocin A-1 3 25
Divercin V41 3 10
Acidocin
D20079
Kết tủa ammonium sulfate - sắc ký
trao đổi cation - cột Octyl
Sepharose
3 16
Lacticin Q
Kết tủa acetone - sắc ký trao đổi
cation - RP-HPLC
3 64
Lactobin A
Kết tủa ammonium sulfate - chiết
cloroformmetanol - RP-FPLC
3 0,07
Divergicin M35
Sắc ký trao đổi cation - Sep-Pack
C18 - RP-HPLC
3 10

24. 16
Enterocin
CRL35
Kết tủa ammonium sulfate - sắc ký
rây phân tử Biogel P-6 - sắc ký trao
đổi cation - HPLC
4 2
Bozacin 14
Kết tủa ammonium sulfate - Sep-
Pack C18 - RP-HPLC
3 4,4
Mutacin
BNy266
Cột C18 - HPLC (x3) 4 1,0
Abp118
Kết tủa ammonium sulfate - tƣơng
tác kỵ nƣớc - sắc ký trao đổi cation
- C8/C18 RP-FPLC.
4 6,4
Macedocin
Kết tủa ammonium sulfate - sắc ký
trao đổi anion - sắc ký trao đổi
cation - sắc ký đảo pha - lọc gel
5 1,6
Michiganin A
Kết tủa ammonium sulfate - sắc ký
trao đổi cation - cột RPC - cột
pepRPC HR 5/5 - cột μRPC
C2/C18
5 3
Piscicocin
CS526
Kết tủa ammonium sulfate - lọc gel
- sắc ký trao đổi cation - C18 -
HPLC
5 7
Propionicin F
Kết tủa ammonium sulfate - sắc ký
trao đổi anion - sắc ký đảo pha (x3)
5 0,5
Pediocin PD-1
Kết tủa ammonium sulfate - thẩm
tách - đông khô - methanol - chiết
chloroform - trao đổi cation
6 34
1.3.5. Lợi ích và hạn chế của bacteriocin
1.3.5.1. Lợi ích của bacteriocin
Ngày nay, bacteriocin đƣợc ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm và
so với việc sử dụng những chất bảo quản hóa học nó đã mang đến những lợi ích
nhất định nhƣ:
 Bacteriocin chứng minh tính an toàn của chúng trong chuỗi thực phẩm
dành cho con ngƣời vì chúng là các phân tử đƣợc sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật
lên men trong thực phẩm lên men truyền thống [62]
 Không gây tác động đến môi trƣờng vì bị thoái biến nhanh chóng

25. 17
 Bacteriocin tác dụng đối với các vi sinh vật gây bệnh mà không làm ảnh
hƣởng đến vi khuẩn có lợi [58]
 Bacteriocin không làm thay đổi các tính chất cảm quan của thực phẩm [62]
 Chúng có phổ hoạt động rõ ràng.
 Bền nhiệt và hoạt động trong khoảng pH rộng.
1.3.5.2. Hạn chế của bacteriocin
Bên cạnh những lợi ích đáng kể trên thì bacteriocin cũng có một số mặt
bất lợi sau:
 Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein có trong
đƣờng tiêu hóa
 Chi phí cao trong việc đáp ứng các tính năng kỹ thuật
 Chỉ có hiệu quả chống lại một số loại vi khuẩn nào đó.
Trên thực tế, có những rào cản pháp lý yêu cầu sự công nhận và chấp thuận
cụ thể với việc sử dụng bacteriocin ở dạng tinh khiết và bán tinh khiết [62].
1.3.6. Ứng dụng của bacteriocin
Bacteriocin ngày càng thu hút nhiều sự quan tâm của giới khoa học nhờ
những công dụng quan trọng của chúng trong nhiều lĩnh vực. Những ứng dụng tiềm
năng của bacteriocin gồm: ứng dụng trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực
phẩm, ứng dụng trong bảo vệ sức khỏe con ngƣời và y tế…
1.3.6.1. Ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa
Nisin là chế phẩm bacteriocin đƣợc thƣơng mại hóa và sử dụng rộng rãi
trong bảo quản thực phẩm. Trong công nghệ chế biến sữa, nisin có thể đƣợc sử
dụng theo một trong hai cách là: bổ sung chế phẩm nisin trực tiếp vào sữa bột hay
vào nguyên liệu sữa trƣớc khi lên men chế biến phomat hoặc phối hợp sử dụng các
chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nisin trong quá trình lên men phomat, nhằm khắc
phục hiện tƣợng lên men gây mùi khó chịu và kiểm soát quá trình lên men butyric

26. 18
do vi khuẩn Clostridium gây ra. Do đặc thù độ acid thấp nên sản phẩm sữa
chocolate có nguy cơ nhiễm vi sinh vật khác khá cao. Bên cạnh đó, nhiệt độ thanh
trùng quá cao sẽ gây ảnh hƣởng đến mùi vị và chất lƣợng sản phẩm. Sử dụng nisin
cho phép hạ thấp nhiệt độ thanh trùng và giữ mùi vị sản phẩm. Nồng độ nisin
khoảng 80 IU/mL cho phép ngăn ngừa sự lên men thối sản phẩm sữa chocolate ở
nhiệt độ thƣờng trong vòng 6 tháng [32].
1.3.6.2. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
 Công nghệ chế biến đồ hộp
Sau quá trình thanh trùng, bào tử của một số loại vi khuẩn bền nhiệt vẫn còn
(ví dụ nhƣ Clostridium perfringens, Clostridium thermocaccharolyticum hay
Bacillus stearothermophilus) nên việc sử dụng nisin nhằm 2 mục đích là giảm khả
năng chịu nhiệt của vi khuẩn và kìm hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa. Nhóm sản
phẩm thƣờng áp dụng là: cà chua nghiền, cà rốt nghiền, các sản phẩm từ nấm, đậu
quả đóng hộp [44].
 Công nghệ chế biến các sản phẩm thịt
Trong công nghệ chế biến các sản phẩm thịt (thịt hun khói, xúc xích, dăm
bông...) các giải pháp công nghệ đang đƣợc nỗ lực tìm kiếm để thay thế cho việc sử
dụng nitrite và nisin hiện đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà sản xuất.
Hƣớng phối hợp nisin-nitrite cho hiệu quả rất tích cực và đang đƣợc tiếp tục thử
nghiệm [24].
 Bảo quản các loại hải sản
Năm 2001, Katla và cộng sự đã so sánh khả năng ức chế kháng lại Listeria
monocytogenes trong cá hồi hun khói đông lạnh của sakacin P và môi trƣờng có
chứa Lactobacillus sake. Mẫu cá hồi đã đƣợc đóng gói bằng chân không và đƣợc ủ
ở 10°C trong vòng 4 tuần. Sakacin P đã có hiệu quả ức chế ngay sự phát triển ban
đầu của Listeria monocytogenes trong khi môi trƣờng có Lactobacillus sake chỉ có
hiệu quả kìm hãm. Tác dụng tiêu diệt Listeria monocytogenes đã đƣợc quan sát
ngay khi bổ sung dung dịch có chứa Lactobacillus sake cùng với sakacin P [48].

27. 19
 Chế tạo màng đóng gói thực phẩm
Việc kết hợp bacteriocin vào màng thực phẩm giúp kiểm soát đƣợc quá trình
gây hỏng thực phẩm. Trong quy trình này, màng đóng gói phải tiếp xúc với bề mặt
thực phẩm để bacteriocin có thể khuếch tán vào bề mặt. Bacteriocin đƣợc giải
phóng từ màng đóng gói thực phẩm giúp tăng hiệu quả hơn so với cách ngâm hoặc
vẩy bacteriocin lên thực phẩm.
1.3.6.3. Ứng dụng trong bảo vệ sức khỏe con người, trong y học
Khi các vi khuẩn gây bệnh tăng nhanh thì cần phải có phƣơng pháp loại bỏ
sự lây nhiễm. Một trong những giới hạn trong việc sử dụng kháng sinh là chúng có
phổ ức chế rộng nên có khả năng tiêu diệt luôn các vi khuẩn có lợi cho sức khỏe con
ngƣời. Do đó, bacteriocin đƣợc sử dụng nhƣ một giải pháp thay thế. Chúng có phổ
ức chế hẹp nên có thể xem nhƣ “thuốc độc thiết kế” có tác dụng đặc hiệu với các vi
khuẩn gây bệnh [73].
Các nhà khoa học đã chứng minh rằng lanbiotic có tác dụng trong việc ngăn
ngừa sâu răng và viêm lợi. Nisin khi cho thêm vào nƣớc súc miệng thể hiện hoạt
tính kháng sinh với các vi khuẩn dịch hạch và viêm lợi. Lactic 3147 ngăn chặn sự
phát triển của Streptococcus mutans có liên quan đến sâu răng [22].
1.3.7. Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ LAB
Với sự kết hợp các phƣơng pháp hiện đại, bacteriocin đƣợc nghiên cứu ngày
càng nhiều. Trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, những nghiên cứu về bacteriocin
rất đa dạng nhƣng chủ yếu tập trung vào bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi vi
khuẩn lactic.
Vào những năm 1998-2000, từ chủng Lactobacillus sake (L45, MI401,
LB706 và LB674) đã tinh sạch đƣợc các bacteriocin nhƣ lactocin S (lớp I);
bavaricin A; sakacin A và sakacin P (phân lớp IIa). Các bacteriocin có khả năng
chống lại sự phát triển của nhiều loài khác nhau nhƣ Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Pediococcus, L. monocytogenes, L. innocua, Staphylococcus…
Lactococcin MMFII (khoảng 4,143 kDa) sinh tổng hợp bởi L. lactis MMFII đã

28. 20
đƣợc Ferchichi và cộng sự nghiên cứu với đặc điểm nhƣ bacteriocin giữ nguyên
hoạt tính ở 70o
C trong 30 phút, hoạt động trong khoảng pH khá rộng (pH 5 - 8),
nhạy với proteinase K, trypsin và papain, bền với glucoamylase, lipase, amylase và
lysozyme. Rodriguez và cộng sự đã thành công khi tìm ra pediocin PA-1 với trọng
lƣợng khoảng 4,624 kDa năm 2002. Pediocin PA-1 rất bền nhiệt (ổn định ở 80°C
trong 60 phút hoặc 100°C trong 10 phút), pH 4 - 6 (kém ổn định hơn khi pH tăng),
nhạy với trypsin, papain, ficin, α-chymotrypsin, protease IV, XIV, XXIV và
proteinase K, không bị tác động bởi phospholipase C, catalase, lysozyme, DNA,
RNA và lipase [24].
Nhóm tác giả Todorov S. D và Dicks K. M. (2007) đã nghiên cứu thành công
khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ
đƣợc phân lập từ boza (đồ uống ngọt lên men từ lúa mì ở Thổ Nhỹ Kỳ). Bacteriocin
ST712BZ (kích thƣớc 14 kDa) ức chế sự phát triển của L. casei, E.coli, P.
aeruginosa, E. faecalis, K. pneumoniae và L. curvatus [76].
Trong một nghiên cứu khác của Satish Kumar R., Arul V (2009), bacteriocin
phocaecin PI80 đã đƣợc sinh tổng hợp bởi chủng Streptococus phocae PI80 phân lập từ
tôm thẻ chân trắng Ấn Độ. Chất kháng khuẩn này nhạy với trypsin, proteinase, pepsin,
chymotrypsin và ức chế một số tác nhân gây bệnh quan trọng nhƣ: Listeria
monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V. fischeri [67]. Nhóm tác giả Todorov S. D
và cộng sự thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch, Nam Phi đã nghiên cứu thành
công khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng L. plantarum ST13BR phân lập từ
bia Barley. Chủng L. plantarum ST13BR sinh bacteriocin có kích thƣớc phân tử 10
kDa và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas
aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và E. coli [75]. Bacteriocin
AMA-K ức chế sự phát triển của E. faecalis, E. mundtii, E. coli, K. pneumoniae, L.
lactis subsp. lactis, L. casei, L. curvatus, L. sakei, E. faecium, L. innocua, L.
monocytogenes và L. ivanovii subsp. ivanovii. Sự sinh trƣởng của chủng L. plantarum
AMA-K tối ƣu trong môi trƣờng MRS có pH 5,5 - 6,0 [77]. Vào những năm gầy đây
(2016), Hu và cộng sự đã tách chiết bacteriocin 163-1 (khối lƣợng phân tử là 0,825

29. 21
kDa) đƣợc sinh tổng hợp bởi chủng vi khuẩn L. plantarum 163 phân lập từ củ cải muối.
Bacteriocin này rất bền nhiệt và hoạt động ổn định trong phạm vi pH rộng (pH 3 - 6),
nhạy với protease K, pepsin, đồng thời ức chế các tác nhân gây bệnh gồm vi khuẩn
Gram dƣơng và Gram âm [45].
Borrero và đồng tác giả (2017) đã thành công khi tách chiết Plantaricyclin A
(PlcA) (khoảng 5,57 kDa) từ chủng L. plantarum NI326 phân lập từ ô liu. PlcA cho
thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng khác nhau, bao gồm cả
Alicyclobacillus acidoterrestris - một loại vi khuẩn gây hỏng phổ biến, gây ra tổn
thất kinh tế đáng kể trong ngành công nghiệp nƣớc giải khát. Quá trình tinh sạch và
giải trình tự gen PlcA đã đƣợc nghiên cứu chuyên sâu [20]. Bacteriocin LBP102
đƣợc sinh tổng hợp từ L. plantarum NTU 102, ổn định ở pH 1 - 4, có hoạt tính
kháng khuẩn chống lại Vibrio parahaemolyticus BCRC 12864 và Cronobacter
sakazakii BCRC 13988. Điều này cho thấy tiềm năng của nó nhƣ là một chất bảo
quản tự nhiên ứng dụng trọng sản xuất phụ gia thực phẩm [50]. Một loại bacteriocin
sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus KS400 có hoạt tính kháng khuẩn chống lại
các mầm bệnh sinh dục đã đƣợc Gaspar và cộng sự nghiên cứu. Trọng lƣợng phân
tử của bacteriocin này xấp xỉ 7,5 kDa và ức chế sự phát triển của Gardnerella
vaginalis, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas [41]. Pediococcus acidilactici
kp10 sinh tổng hợp một loại bacteriocin có ký hiệu là BLIS. Với sự sinh trƣởng cao
nhất khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng M17, BLIS có khả năng ức chế sự phát triển
của ba vi sinh vật gây bệnh là L. monocytogenes, E. coli và Staphylococcus aureus.
BLIS vẫn giữ nguyên hoạt tính bacteriocin ở 100°C và mất hoàn toàn hoạt tính ở
121°C; hoạt động trong khoảng pH rộng (pH 2 - 7); hoạt tính của BLIS vẫn không
đổi ở -20°C và -80°C trong 1 tháng. Tuy nhiên, sau 3 và 6 tháng bảo quản ở 4, -20
và -80°C hoạt tính giảm hơn 80% [68]. Một bacteriocin mới, plantaricin LPL-1
(thuộc nhóm IIa) sản xuất bởi chủng L. plantarum LPL-1 phân lập từ thực phẩm cá
lên men. Plantaricin LPL-1 dễ dàng phân hủy bởi protease, hoạt động ở khoảng pH
rộng (2 - 10), ổn định ở nhiệt độ cao (121◦C, 20 phút), có hoạt tính kháng khuẩn
chống lại các vi sinh vật gây bệnh và gây hỏng thực phẩm [80].

30. 22
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bacteriocin đã đƣợc tiến hành. Năm 2004,
TS. Lê Thị Hồng Tuyết, TS. Hoàng Quốc Khánh tại Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có những nghiên cứu sơ bộ về một số đặc tính
của bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Vi khuẩn L.
acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây hỏng trong
thực phẩm nhƣ E. coli, Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác. Điều kiện sinh
trƣởng tối ƣu của vi khuẩn này là nhiệt độ 30 - 37o
C và pH 5 - 7, bacteriocin nhạy
với protease nhƣng lại ổn định với các dung môi hữu cơ, pH và nhiệt độ [11]. Một
nghiên cứu khác của TS. Phạm Thùy Linh là tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ
hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Đây là nghiên cứu đầu tiên về tạo
bacteriocin tái tổ hợp một cách có hệ thống tại Việt Nam. Sản phẩm protein Hisent
P tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn và các đặc tính sinh hóa tƣơng tự với
enterocin P tự nhiên. Protein này bƣớc đầu đã có khả năng kéo dài thời gian bảo
quản thực phẩm và đƣợc tiếp tục nghiên cứu phát triển làm phụ gia sinh học dùng
cho bảo quản [7]. Với mục tiêu thu nhận bacteriocin để ứng dụng trong quá trình
bảo quản thịt, tác giả Nguyễn Thúy Hƣơng đã nghiên cứu việc cố định tế bào vi
khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang cellulose của vi khuẩn (Bacterial Cellulose
- BC) [6].
Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic, nhƣng những công
trình nghiên cứu về bacteriocin sinh tổng hợp từ LAB là định hƣớng còn rất mới ở
Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm kháng
khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở Việt Nam” với mục đích sẽ
góp thêm nhiều thông tin về bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn
LAB đƣợc phân lập từ nguồn thực vật tƣơi sống ở nƣớc ta.

31. 23
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguồn phân lập
10 loài thực vật bao gồm: lô hội, sung, cải xanh, chanh, rau muống, ngải cứu,
lá lốt, húng quế, mồng tơi và càng cua đƣợc thu tại Hòa Lạc - Hà Nội.
2.1.2. Nguồn vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật đƣợc cung cấp bởi phòng Công nghệ Enzyme - Protein
và Bảo tàng giống - Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà
Nội. Các thông tin về môi trƣờng nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy của các chủng này
đƣợc liệt kê trong Bảng 2.1 và 2.2.
 Chủng vi khuẩn kiểm định
Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn kiểm định
STT Vi khuẩn kiểm định
Kí
hiệu
Môi
trƣờng
nuôi cấy
Nhiệt độ
nuôi cấy
1 Micrococcus luteus IFO 12708 KĐ24 TSBYE 30o
C
2
Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC
1935
KĐ26 MRS 30o
C
3
Lactobacillus sakei subsp.sakei JCM
1157
KĐ28 MRS 30o
C
4 Pediococcus pentosaceus JCM 5885 KĐ32 MRS 37o
C
5 Enterococcus faecalis JCM 5803 T KĐ34 MRS 37o
C

32. 24
 Các chủng vi sinh vật gây bệnh
Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật gây bệnh
STT Vi sinh vật gây bệnh
Môi trƣờng
nuôi cấy
Nhiệt độ
nuôi cấy
1 Escherichia coli VTCCB 482 LB 37o
C
2 Klebsiella pneumonia VTCCB 815 LB 37o
C
3 Acinetobacter baumannii VTCCB 823 LB 37o
C
4 Pseudomonas aeruginosa VTCCB 657 LB 37o
C
5 Salmonella enterica VTCCB 480 LB 37o
C
6 Staphylococcus aureus VTCCB 658 LB 37o
C
7 Bacillus cereus VTCCB 613 LB 37o
C
8 Enterobacter cloacae VTCCB 809 LB 37o
C
9 Vibrio parahaemolyticus VTCCB 652 LB 37o
C
10 Enterococcus faecalis VTCCB 998 MRS 37o
C
2.1.3. Môi trường, hóa chất và thiết bị
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
 Môi trường MRS (g/L)
Thành phần môi trƣờng MRS thạch bao gồm: pepton (10,0 g); cao thịt (10,0
g); cao nấm men (5,0 g); glucose (20,0 g); CH3COONa.3H2O (5,0 g); K2HPO4 (2,0
g); triammonium citrate (2,0 g); MgSO4.7H2O (0,5 g); MnSO4.4H2O (0,28 g);
CaCO3 (5,0 g) và agar (15,0 - 17,0 g).
 Môi trường TSBYE (g/L)
Thành phần môi trƣờng TSBYE thạch bao gồm: cao nấm men (1,8 g); bột đậu
tƣơng (0,9 g); glucose (0,75 g); NaCl (1,5 g); K2HPO4 (0,75 g) và agar (15,0 - 17,0 g)

33. 25
 Môi trường LB (g/L)
Thành phần môi trƣờng LB thạch bao gồm: triptone (10,0 g); NaCl (10,0 g);
cao nấm men (5,0 g) và agar (15,0 - 17,0 g)
2.1.3.2. Các hóa chất khác
 Xác định protein tổng số: Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB), ethanol,
acid phosphoric, albumin.
 Sắc ký trao đổi cation: đệm natri acetate 0,02M, pH 5,5 và đệm natri
acetate 0,02M, pH 5,5 có bổ sung NaCl 1M.
 Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC: acid trifluoroacetic (TFA), acetonitrile.
Các loại hóa chất có độ tinh khiết cao đƣợc mua từ những hãng sản xuất có
uy tín nhƣ Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma…
2.1.3.3. Thiết bị chuyên dụng
Các thiết bị đƣợc sử dụng thuộc phòng Công nghệ Enzyme - Protein của
Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đạt tiêu chuẩn
quốc tế nhƣ:
 Cân điện tử Sartorius, Đức
 Bốc cấy vô khuẩn Nuaire, Mỹ
 Máy PCR Eppendorf, Đức
 Tủ sấy Memmert, Tủ ấm Binder, Đức; Tủ lạnh Hitachi, Nhật Bản
 Lò vi sóng Delonghi, Ý
 Nồi hấp khử trùng Sturdy, Đài Loan
 Bể ổn nhiệt, Stuart, Anh
 Máy vortex, Stuart, Anh
 Máy đo pH, Hoa Kỳ
 Hệ thống tinh sạch protein AKTA (GE Healthcare)
 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

34. 26
 Máy quang phổ Beckman Coulter
 Máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417R, 5810R, Đức.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ thí nghiệm đƣợc trình bày trong Hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm
Phân lập vi khuẩn lactic
Xác định hoạt tính và
hoạt độ bacteriocin
Định danh vi khuẩn lactic
Khảo sát sự
ảnh hƣởng
của điều kiện
nuôi cấy
Nghiên cứu
sơ bộ
bacteriocin
Nhiệt độ
nuôi cấy
Thời gian
nuôi cấy
Tinh sạch
bacteriocin
(AKTA,
HPLC)
Đánh giá
sự ảnh
hƣởng của
pH, nhiệt
độ và
enzyme
Xác định
hoạt tính
kháng khuẩn

35. 27
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic
Các mẫu đƣợc rửa sạch, cắt nhỏ và cho lần lƣợt vào các ống nghiệm chứa 5
mL môi trƣờng MRS lỏng, ủ 30°C trong 48 giờ
Sau khi ủ, dung dịch mẫu đƣợc trải trên môi trƣờng MRS để lựa chọn khuẩn
lạc có vòng phân giải CaCO3 (nồng độ 5 g/L) trên đĩa và các khuẩn lạc này đƣợc
tiến hành tinh sạch để thu đƣợc các chủng vi khuẩn lactic sử dụng cho các nghiên
cứu tiếp sau.
2.2.3. Xác định hoạt tính và hoạt độ bacteriocin
Hoạt tính bacteriocin đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa
thạch [29]. Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn đƣợc nhỏ vào các giếng trên môi trƣờng
MRS đã chứa vi khuẩn kiểm định. Sau 24 - 48 giờ, vòng kháng khuẩn đƣợc quan
sát. Những mẫu có hoạt tính bacteriocin đƣợc pha loãng theo hệ số 2 (Hình 2.2) và
hoạt độ bacteriocin đƣợc tính theo công thức [46]:
(AU/mL) = 2n
* 1000/V
Trong đó: AU/mL: hoạt độ AU (Activity Unit)
2n
: Độ pha loãng nhỏ nhất theo hệ số 2 của mẫu không xuất hiện vòng kháng
khuẩn
V: Thể tích dịch mẫu đã nhỏ (µL)
Hình 2.2. Cách pha loãng mẫu theo hệ số 2

36. 28
2.2.4. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng sinh học phân tử
2.2.4.1. Phương pháp tách DNA genome
Tách chiết DNA genome đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Sambrook và
cộng sự bao gồm các bƣớc [65]:
- Chủng vi khuẩn lactic nuôi cấy trên môi trƣờng MRS lỏng ở 30°C trong 48 giờ
- Hút dịch nuôi cấy vào ống eppendorf 1,5 mL, ly tâm 10000 vòng/phút ở
4°C trong 10 phút để thu sinh khối tế bàoHòa cặn trong 0,5 mL Tris - HCl + MgCl2
pH 8 (Tris - HCl 30mM (1,2 g trong 300 mL H2O), MgCl2 3mM (0,2 g) để rửa tủa,
sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn lại
- Hòa cặn trong 0,5 mL đệm Tris - HCl, MgCl2 và bổ sung 250 µL Lysozyme
(nồng độ 20 mg/mL, 20 mg/1 mL đệm Tris - HCl pH 7,5). Trộn đều 2 - 3 phút. Sau
đó ủ 37o
C trong 2 giờ
- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút bỏ dịch. Hòa tan trong 0,5 mL đệm
Tris - HCl pH 7,5 và bổ sung 100 µL SDS 10% (w/v). Sau đó ủ 37o
C trong 15 phút
- Bổ sung 1 thể tích Cloroform : Isoamy alcohol (C : I = 24 : 1), trộn đều, ly
tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch trong ống phân 2 lớp, chuyển dịch phía
trên sang ống eppendorf 1,5 mL mới
- Bổ sung 1 thể tích Phenol : Cloroform : Isoamy alcohol (P : C : I = 25 : 24 :
1), trộn đều, ly tâm 13000 vòng/15 phút. Chuyển dịch phía trên sang ống eppendorf
1,5 mL mới
- Bổ sung 1 thể tích Cloroform : Isoamy alcolhool (24 : 1), trộn đều, ly tâm
13000 vòng/15 phút. Dịch trong ống phân 2 lớp, chuyển dịch phía trên sang ống
eppendorf 1,5 mL mới
- Bổ sung 1/10 thể tích natri acetate 3 M và 1 mL ethanol 96%, trộn đều, ủ đá
trong 30 phút. Ly tâm ở 13000 vòng/5 phút, bỏ lớp dịch trên
Tải bản FULL (69 trang): https://bit.ly/3KRmLEc
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

37. 29
- Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm nhanh 13000 vòng/1 phút, bỏ dịch,
để cồn bay hơi hết. Hòa tan DNA trong 50 µL nƣớc khử ion, voltex và bảo
quản ở -20o
C.
2.2.4.2. Xác định gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR
DNA genome sau khi tách đƣợc dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen mã
hóa cho 16S rDNA
Trình tự cặp mồi
Đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn đƣợc khuếch đại bằng cách sử dụng cặp
mồi có trình tự sau:
Mồi xuôi 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
Mồi ngƣợc 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR trong tổng thể tích 50 µL bao gồm 2x PCR
Master mix Solution (i-Taq): 25 µL, mồi 27F: 2,4 µL, mồi 1492R: 2,4 µL, DNA
khuôn (100X): 2,0 µL, H2O: 18,2 µL.
Chu trình nhiệt: 94°C (3 phút), 30 chu kỳ (94°C - 30 giây, 55°C - 30 giây,
72°C - 1 phút 30 giây), 72°C (10 phút).
Kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR bằng điện di trên gel agarose 1% với hiệu điện
thế 100V trong 30 phút. Bản gel đƣa vào máy soi gel (Biorad) và quan sát kết quả.
2.2.4.3. Giải, phân tích trình tự và định danh vi khuẩn lactic
Sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự tại hãng First Base (Singapore). Các trình
tự đƣợc phân tích bằng phần mềm Bioedit 7.1.3.0 và so sánh với các trình tự
nucleotide tƣơng đồng trên GenBank bằng cách sử dụng công cụ BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) để định danh chủng vi khuẩn lactic.
Tải bản FULL (69 trang): https://bit.ly/3KRmLEc
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

38. 30
2.2.5. Nghiên cứu điều kiện phù hợp cho khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin
Dịch nuôi cấy vi khuẩn đƣợc tiến hành ly tâm 10000 vòng/phút ở 4o
C trong
10 phút và thu dịch trong. Đƣờng kính vòng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy ở các
nhiệt độ (30, 37 và 40o
C) và thời điểm (24, 48 và 72 giờ) đƣợc so sánh để tìm ra
điều kiện nuôi cấy phù hợp cho sự sinh tổng hợp bacteriocin [55,66].
2.2.6. Một số tính chất của bacteriocin
2.2.6.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp
khuếch tán trên đĩa thạch [29,37]. Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn đƣợc nhỏ vào các
giếng trên môi trƣờng thích hợp đã chứa 1% (v/v) vi sinh vật gây bệnh (Bảng 2.2).
Sau 24 - 48 giờ, vòng kháng khuẩn đƣợc quan sát.
2.2.6.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin
Dịch nuôi cấy sau khi ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút đƣợc chỉnh đến
các giá trị pH 5, 6, 7, 8, 9, 10 bằng NaOH 1M và giữ các pH này ở 30o
C trong 1
giờ, 3 giờ. Mẫu đối chứng là môi trƣờng MRS lỏng đã đƣợc chỉnh đến các pH
tƣơng ứng. Sau đó các mẫu đƣợc xác định hoạt tính bacteriocin bằng phƣơng pháp
khuếch tán trên đĩa thạch. Hoạt tính bacteriocin của mẫu không xử lý đƣợc cho là
100% và phần trăm hoạt tính của các mẫu xử lý đƣợc tính theo hoạt tính này. Sau
24 - 48 giờ, đƣờng kính vòng kháng khuẩn của mẫu ở từng pH đƣợc so sánh với
nhau để đánh giá ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính bacteriocin.
2.2.6.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin
Dịch nuôi cấy sau ly tâm đƣợc xử lý ở 60o
C, 100o
C (5 phút, 10 phút, 15 phút,
30 phút, 45 phút, 60 phút) và 121o
C (15 phút). Sau đó dịch này đƣợc sử dụng để xác
định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin bằng phƣơng pháp khuếch
tán trên đĩa thạch [85]. Hoạt tính bacteriocin của mẫu không xử lý đƣợc cho là
100% và phần trăm hoạt tính của các mẫu xử lý đƣợc tính theo hoạt tính này.
6729008