Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC
CHỊU NHIỆT SỬ DỤNG TRONG THỨC ĂN CHO
CHĂN NUÔI HEO, GÀ QUY MÔ PILOT
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Phạm Huỳnh Ninh
Sinh viên thực hiện : Trần Lệ Quyên
MSSV: 1311100608 Lớp: 13DSH04
TP. Hồ Chí Minh, 2017

2. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực
Sinh viên thực hiện
Trần Lệ Quyên

3. LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi
Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã
hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:
Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả
những người thân trong gia đình đã nuôi em khuôn lớn nên người và tận tâm lo lắng,
tạo mọi điều kiện cho em được học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp .
Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn
năm qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong
cuộc sống.
Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, các Thầy
Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh
đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và
làm tốt công việc sau này.
TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân
Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt
tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp
Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng và
Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và
giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án
Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm
– Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em
trong quá trình nhận đề tài

4. i
MỤC LỤC
MỤC LỤC........................................................................................................................i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................................ v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................vii
LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 3
1.1 Đại cương về probiotic.............................................................................................................3
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic..................................................................................................3
1.1.2 Định nghĩa probiotic.................................................................................................................4
1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp..............................................................................................4
1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic..............................................................7
1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic................................................................................................8
1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi ...............................................................................11
1.1.7 Probiotic từ bào tử...................................................................................................................12
1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam....................13
1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus...........................................................................................18
1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus...........................................................................................18
1.2.2 Bào tử Bacillus.........................................................................................................................22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................... 25
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài……...………...…………………………...... .........25
2.2 Vật liệu ........................................................................................................................25
2.2.1 Chủng vi sinh vật:..................……………………………….……….........................………25
2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ……………………………………….….......................…....25
2.3 Môi trường nghiên cứu………………………………………………..…………26
2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)…………........... 30
2.5 Phương pháp nhuộm Gram……………………………………………… .......…31

5. ii
2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton..................................... ….32
2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc……………….......…………32
2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang………….....................….33
2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng………………………………........... .....................................34
2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử…………………………………….........................................35
2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic………………………………………............…...…..….35
2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày…………………………………… ........................…35
2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật…………………………………… .........................…..36
2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ….……………………..........................…..37
2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường
vuông góc Cross Streak……………………………………………….......................................….40
2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử……………………………………...........................…….40
2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất…………………….......................….41
2.8.7 Sản xuất bào tử dạng pilot……………………………………………............................….42
2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu……………………………………………............................….44
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………...................................….45
3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic…………………………............………………………..45
3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày……………………………………...................………………..45
3.1.2 Khả năng chịu muối mật…………………………………………............................………46
3.1.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase)……..................…48
3.1.4 Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường
vuông góc Cross Streak………………………………………….… .................... ……51
3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn………………….......…………..53
3.2.1 Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi…………………………........................……..53
3.2.2 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi………...................……..54
3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub…………….........……………………….54
3.3.1 Thiết lập đường chuẩn……………………………………………….............................…...54

6. iii
3.3.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng………………………………..........................……….56
3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi…………….........……………………….56
3.4.1 Thiết lập đường chuẩn………………………………………………....................................56
3.4.2 Thiết lập đường cong tăng trưởng…………………………..........................…………….58
3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các
chủng Sub và Yoi……………………………………………………………..….....................……58
3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất………………… .......……………..59
3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot……………………………………………….............……...61
3.7.1 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô
pilot………………………….………………………………………..….....................................……61
3.7.2 Tiến hành tạo bào tử…………...……………………………….................................…..…..62
3.8 Tạo chế phẩm………………………………………………………………..................……..64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ……………………… …………………....65
4.1 Kết luận………………………………………………………..………...…. …….65
4.2 Kiến nghị……………………………………………………………….…...................………65
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… ................…66
PHỤ LỤC…………………………………………………………………….…......... 74
Phụ lục I: Bảng biểu…………………………………………… ………………….….74
Phụ lục II: Hình ảnh………………………………................................………….….85

7. iv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
KL Khuẩn lạc
MT Môi trường
N Mật độ tế bào
TB Tế bào
TN Thí nghiệm
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật

8. v
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị
trường............................................................................................................................17
Bảng 1.2. Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử...........................23
Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn trong môi trường pH
thấp................................................................................................................................45
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật
2%........................................... ......................................................................................47
Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus.......... .........................49
Bảng 3.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định ..........51
Bảng 3.5. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi... ......................54
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub....................................................55
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi....................................................57
Bảng 3.8. Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô
pilot............................................. ..................................................................................63
Bảng 5.1. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH
thấp................................................................................................................................74
Bảng 5.2. Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường
muối mật 2%................................................ .................................................................75
Bảng 5.3. Số liệu đường chuẩn của chủng Sub.............................................................76
Bảng 5.4. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng
Sub.................................................................................................................................77
Bảng 5.5. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub.......... .......................................78
Bảng 5.6. Số liệu đường chuẩn chủng Yoi.............. .....................................................79
Bảng 5.7. Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng
Yoi.................................................................................................................................80
Bảng 5.8. Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi................. ................................81

9. vi
Bảng 5.9. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào
và bào tử của các chủng Sub.........................................................................................82
Bảng 5.10. Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào
và bào tử của các chủng Yoi............................... ..........................................................82
Bảng 5.11. Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi.......... .83
Bảng 5.12. Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian
khảo sát khác nhau........................ ................................................................................83
Bảng 5.13. Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp khác nhau
.......................................................................................................................................84
Bảng 5.14. Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô
pilot............. .................................................................................................................. 85
Bảng 5.15. Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot.................86

10. vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật…….....................…..9
Hình 1.2. Các cấu trúc chính của bào tử B. Subtilis......................................................23
Hình 1.3. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus...... .............. .24
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................................. .....30
Hình 3.1. Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase)
của các chủng Bacillus…… ..............................……………………………........50
Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillu… ............... .52
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub.................... 53
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi ................... .53
Hình 3.5. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub ........................... 55
Hình 3.6. Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian......................................56
Hình 3.7. Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi ........................... .57
Hình 3.8. Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian… .................................. 58
Hình 3.9. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và
Yoi………………….....................................................................……………………59
Hình 3.10. Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của
chủng Bacillus subtilis ..……………… ...................................................................... .60
Hình 3.11. Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis.......................61
Hình 5.1. Máy ly tâm Avanti JXN Series .................................................................... .87
Hình 5.2. Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis… ......................................... 87
Hình 5.3. Hệ thống lên men 5 L………………........................................................... .88

11. 1
LỜI MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ
không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại
chăn nuôi. Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột
và hệ tiêu hóa. Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh
đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác. Không chỉ vậy, trong chăn
nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác
hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh
dưỡng. Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng
suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất
hiện nay. Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống
lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn
có hại trong hệ tiêu hóa.
Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối
và sử dụng trong chăn nuôi. Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc
các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men. Số lượng và chủng loại chế
phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng. Tuy
nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu,
điều kiện chăn nuôi Việt Nam. Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia
nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông
nghiệp đang phát triển như Việt Nam. Nguyên nhân lớn nhất xuất phát từ hệ sinh thái
vi sinh từng nơi.
Hiện nay, trong công nghiệp chế biến thức ăn dạng viên thì nguyên liệu thức ăn
sẽ được xử lý ở nhiệt độ từ 70 - 80o
C, có khi lên đến 90o
C nhằm kiểm soát nguy cơ về
nhiễm khuẩn, ví dụ như Salmonella (Jones và cộng sự, 2004; Doyle và cộng sự, 2006)

12. 2
cũng như để hồ hóa tinh bột. Quá trình xử lý nhiệt làm giảm đáng kể số lượng vi sinh
vật probiotic trong chế phẩm (chứa các tế bào sinh dưỡng). Vì vậy để đảm bảo cung
cấp đủ lượng vi sinh vật probiotic trong thức ăn viên thì cần phải chọn ra một chủng vi
khuẩn có hoạt tính probiotic và có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Bào tử vi khuẩn
probiotic thuộc chi Bacillus được xem là một giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng
trong thức ăn ép viên cho chăn nuôi gia súc và gia cầm. Bào tử Bacillus khá bền nhiệt,
tính kháng axit cao hơn so với tế bào sinh dưỡng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy bào
tử Bacillus nảy mầm và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật nuôi khoảng 70 - 90%. Ở
Việt Nam, hiện có rất ít các nghiên cứu về việc sử dụng bào tử của các chủng Bacillus
bổ sung vào thức ăn cho động vật, hoặc là chưa được quan tâm thực hiện hoặc đã thực
hiện nhưng không công bố, nếu có cũng rất hạn chế về số lượng các nghiên cứu.
Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên
cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu
cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao
của ngành chăn nuôi an toàn và góp phần hạn chế nhập khẩu, chủ động nguồn sản
phẩm và làm giảm giá thành sản phẩm. Đây là cơ sở cho việc thực hiện khóa luận
“ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho
chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”.
Mục đích đề tài
Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot
Nhiệm vụ của đề tài
 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt
 Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng
 Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít )
 Tạo chế phẩm Probiotic

13. 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1Đại cương về probiotic
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser
(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc
bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe
mạnh [53].
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng
minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật
đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở
Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên
nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo
cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53].
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang
tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [37].
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn
lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [38]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu
Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo
bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường
ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung
cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản
xuất ra được [37]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult”
từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái
niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm
lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên
80 [38].

14. 4
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus
được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm
chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.
1.1.2 Định nghĩa probiotic
Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic
được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và
những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [26]. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic
đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được
đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng
có lợi cho vật chủ.
Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất.
Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của
probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) probiotic là “chất bổ
sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu
hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001),
probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số
lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.
1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp
Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích. Đó là các TB sống
của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng
đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính
đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12].
Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau:
Các nhóm VSV cơ bản:
 Nhóm VK lactic [17]:
Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự nhiên, chúng
phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà

15. 5
muối, mắm chua, sữa chua…Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và
dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi
chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin,
brevin,…Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi
với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh
đường tiêu hóa cho người và vật nuôi.
Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L.
acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes,
Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S. faecalis…[24].
Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của
Hàn Quốc (100% là L. acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B.
subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học
Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S
và nấm men..) [17].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các VK lactic có một vai trò quan trọng
trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Nhờ khả năng sản sinh ra axit
lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzyme…nên có tác dụng ức
chế VSV đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ…
 Nhóm VK Bacillus
Các VK Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện nhưng
trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên.
Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người
và động vật. Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như
protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào khá mạnh như:
amylase, cellulase, protease [17].

16. 6
Ngoài các enzyme trên, các VK này còn có khả năng sinh bacterioxin-chất có
hoạt tính kháng sinh có khả năng ức chế một số VSV gây bệnh đường ruột đặc biệt là E.
coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi.
Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống
Bacillus sau: B. subtilis, B. mesentericus, B. megathericum, B. licheniformis, B.
clausii,…[8, 17]. Các chủng này rất có ích, không gây bệnh cho người và vật nuôi.
 Nấm men Saccharomyces:
Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm
bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vang…Trong thành phần của TB nấm men rất giàu
protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm
probiotic để làm giàu sinh khối TB [17]. Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài,
tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt
động và sinh sản [14, 20]. Ngoài ra, TB nấm men có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm,
giúp cải thiện mùi cho MT và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi.
Để sản xuất probiotic, người ta thường dùng các chủng sau: S. cerevisiae, S.
carlsbergensis, S. vini hoặc S. pombe [13], đặc biệt là S. boulardii. S. boulardii có tác
động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh
và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori [10].
 Nấm mốc:
Điển hình là Asp. oryzae, Asp. niger. Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai
trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase,…nhằm tăng cường khả năng tiêu
hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế
phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do
vật nuôi bài tiết ra [17].
Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm
probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ,

17. 7
giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S… như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas),
VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh
(Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas
palustris…) [17]
1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic
Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an
toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt
trong đường tiêu hóa vật chủ. Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các
tiêu chuẩn chủ yếu sau:
- Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày:
Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu
hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên,
các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp
lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm
probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô
ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ. Vì vậy,
đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan
trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic [10].
- Khả năng chịu muối mật:
Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi
sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ
dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật.
Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong
những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic [10, 21, 23]. Thông
thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1 – 3 % [50]. Để tồn tại

18. 8
và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ
muối mật ≥ 2%
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào:
Một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh
enzym tiêu hoá như: amylase, cenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm
tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ
- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh:
Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính
quan trọng nhất trong phát triển probiotic. Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế
vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella và Staphylococcus aureus. Hoạt tính kháng
khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:
+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin.
+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic.
+ Tạo ra H2O2.
+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau.
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt.
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh.
- Khả năng sinh enzyme ngoại bào:
1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic
Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn
nhiều ý kiến khác nhau. Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được
nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26].
Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27]

19. 9
Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật
- Probiotic giúp duy trì hệ VSV có lợi trong đường ruột bằng hoạt động đối kháng
với VSV gây bệnh [28].
Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế
hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác. Một số nhà khoa học cho
Cải thiện sức
khỏe và năng suất
Tăng độ hữu dụng
của chất dinh dưỡng
Phân giải các chất dinh
dưỡng như protein,…
Vi sinh vật có lợi
đường ruột
Giảm thiểu sự sản sinh
nhóm amin độc hại
Tổng hợp
vitamin
Cải thiện sự cân bằng
hệ VK dạ dày – ruột
Cải thiện sự hấp
thu
Cạnh tranh với
VK gây bệnh
Sản xuất axit hữu cơ
Làm giảm pH
Sản xuất kháng
sinh
Ức chế sự phát
triển của VK gây
bệnh
Kích thích miễn
dịch
Trung hòa các độc tố đường ruột

20. 10
rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển
nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV
khác
Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm:
 Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành chất
dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra. Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh,
thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được. Từ đó có thể ức
chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Phương
pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn
nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh [24]
 Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với VSV
gây bệnh, VSV probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt
tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol,… Những
chất này được sinh ra trong quá trình sống của VSV, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc
các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột [17, 20].
- Gia tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính
thèm ăn, làm tăng tích lũy mỡ, nitrogen, Ca, P, Cu, Mn, tiết các enzyme tiêu hóa như
amylase, cellulase, lipase, protease…giúp phân giải các chất dinh dưỡng phức tạp
thành chất đơn giản dễ hấp thụ.
- Tổng hợp vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, B12, làm giảm hoạt tính urease
trong ruột non, ngăn chặn tổng hợp những amin độc, giảm nồng độ NH3 trong phân gia
súc, gia cầm, do đó có ảnh hưởng tốt đối với MT [17].
- Kích thích hệ thống miễn dịch: yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ
thống miễn dịch là thành phần của vách TB vi khuẩn (peptidoglycan). Sự phân hủy
peptidoglycan tạo ra chất muramyl peptid có tác dụng kích thích hoạt động của đại
thực bào (Tannock, 1997). Saarela và cộng sự (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm
mạc ruột của probiotic tạo nên sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống

21. 11
lympho bào đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và
tạo nên sự ổn định của hàng rào bảo vệ ruột [24].
Tóm lại, probiotic được xem là sản phẩm hữu hiệu cho việc phòng ngừa và điều
trị bệnh tiêu chảy ở vật nuôi nhờ cơ chế cạnh tranh và đối kháng với VSV gây bệnh,
sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể
vật chủ… Tuy nhiên, lợi ích của nó chỉ thể hiện rõ khi vật nuôi có sức khỏe kém, stress
hoặc có sự xáo trộn hệ VSV đường ruột [4].
1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi [17]
Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi như gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy
sản. Cụ thể như sau:
- Probiotic giúp phát triển hệ VSV đường ruột bình thường, tăng cường khả năng
tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ, probiotic còn
giúp hệ VSV dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn.
- Ức chế và có thể tiêu diệt được các VSV có hại. Làm tăng sức đề kháng và khả
năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh
thường gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E. coli.
Nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002) về tác dụng kháng khuẩn
của chế phẩm EM1 (do Nhật Bản sản xuất) cho thấy: chế phẩm này có tác dụng ức chế
E. coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococcus,
Clostridium perfringens, Sarcina lutea. Sau khi dùng chế phẩm EM1 trộn với thức ăn
cho heo (khoảng 109
cfu /kg thức ăn), kết quả kiểm tra số lượng E. coli trong 1g phân
heo đã giảm 7% ở heo từ 1 - 21 ngày tuổi, giảm 5,3% ở heo từ 22 - 60 ngày tuổi [24].
- Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt và tăng năng suất
chăn nuôi [17].
Lã Văn Kính (1998) đã tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả nước
ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt với kết quả như sau: Đối
với gà đẻ, sản lượng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg probiotic/kg thức ăn (Mohal

22. 12
và ctv, 1995). Khi bổ sung hỗn hợp L. acidophilus và L. casei (khoảng 106
cfu /kg
thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và chất lượng lòng
trắng (Tortuero và Fernandez, 1995). Đối với gà thịt, tăng trọng cao và tiêu tốn thức ăn
thấp hơn đối chứng. Đặc biệt là hiệu quả sử dụng thức ăn đã cải thiện 2% khi bổ sung
hỗn hợp L. acidophilus và S. faecium (2 x 109
cfu /kg thức ăn) cho gà thịt. [9]
- Góp phần cải thiện chất lượng nước, chống ô nhiễm MT nước, tăng cường khả
năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng độ N và P, kích thích sinh trưởng của tảo,
giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tôm, cá,…[3, 27, 28]. Chẳng hạn như sử
dụng chế phẩm chứa B. subtilis, B. licheniformis, B. polymixa, B. circulans, B.
laterosporus đã làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng của ấu
trùng cá tầm Acipenser nudiventris [59].
- Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi
sẽ làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối gây ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi. Có thể
dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể vật nuôi như chó, lợn…sẽ mất mùi
thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái khi cho con bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại
[17].
Tóm lại, probiotic đã trở thành sản phẩm hữu hiệu, là bạn đồng hành của người
chăn nuôi, giúp người chăn nuôi tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi [1, 8] .
1.1.7 Probiotic từ bào tử
Probiotic từ bào tử đang ngày càng được dùng rộng rãi dưới dạng thực phẩm bổ
sung cho người và động vật dưới dạng các chất thúc đẩy sinh trưởng và cạnh tranh với
vi khuẩn có hại; trong thủy sản để thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm, cá; và dùng để
phòng ngừa bệnh tật. Hiện nay không chỉ ở nước ngoài mà ở tại Việt Nam, nhiều sản
phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng. Các loài được
nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus
coagulans và Bacillus licheniformis.[41]

23. 13
Các ưu điểm của probiotic từ bào tử:
- Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều
kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống.
- Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH axit của dịch vị dạ dày
[30,54], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [58]. Một
liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ
lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi
khuẩn sống và phát huy tác dụng.
- Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn,
các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B. clausii, B. subtilis, B. cereus, B.
licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau.
1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacilllus trong
chăn nuôi gia súc và gia cầm trên thế giới và Việt Nam
Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen phong phú,
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực
phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học… Đặc biệt là trong chăn nuôi, con
người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm
probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc, gia cầm…
1.1.8.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế
giới
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura
từ B. subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp.
Flavus, Asp. Paraciticus. Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ
sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc dạng lỏng chứa B. subtilis chủng IP
5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm. Năm 1962, Guy Albot còn

24. 14
phát hiện B. subtilis có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và
viêm đại tràng mãn tính. Còn khi trộn thêm với VK lactic, B. subtilis chữa chứng loạn
khuẩn rất hiệu quả ở người và vật nuôi.
Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M. (Effective
Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS. TeRuo Higa, Trường Đại học
Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980. Chế phẩm này được sử dụng
nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường và đã mang lại hiệu quả
khả quan. Cho đến nay, đây là chế phẩm được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng,
đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc,
Thái Lan và Việt Nam.
Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP
122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí
nghiệm này được tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng B. toyoi
với liều 106
cfu/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B. licheniformis với liều 106
và 107
cfu/kg
thức ăn. Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều có tỷ lệ tiêu chảy và tình
trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng. Ngoài ra, sự tăng trọng và tiêu
tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng. Trong đó, lô sử dụng 107
cfu B.
licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất.
Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu ăn liên
tục trong 7 ngày với liều 6 x 106
cfu/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải của E.coli
O157:H7. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E. coli trong phân thấp hơn so với
đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn.
1.1.8.2Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt
Nam
Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng
dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [5].

25. 15
Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản
xuất chế phẩm B. subtilis dạng viên, nuôi cấy trên MT đậu tương, cua đồng,…hấp thu
bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống với liều 0,5 - 1g/kg thể trọng. Kết
quả sau khi sử dụng chế phẩm, heo tăng trọng nhanh.
Năm 1979-1984, Phan Thanh Phượng và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất chế
phẩm Biolactyl để phòng và trị bệnh đường ruột ở heo.
Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm Coli-
subtyl (E.coli và B. subtilis) đã làm giảm tỷ lệ tái phát tiêu chảy ở heo so với phương
pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt.
Năm 1996, Lê Thị Tài sử dụng Biseptol và Biosubtyl kết hợp với
Cloramphenicol trong điều trị loạn khuẩn đường ruột ở heo con và chó con. Kết quả
ghi nhận được như sau: trên heo con sau cai sữa, tỷ lệ khỏi bệnh khi dùng Biseptol là
80%, Cloramphenicol là 70%, Biosubtyl là 68%, Biseptol + Biosubtyl là 98% và
Biosubtyl + Cloramphenicol là 95 %; còn trên chó con, sử dụng Biseptol cho tỷ lệ khỏi
bệnh là 80%, Biseptol + Biosubtyl là 95% và Cloramphenicol là 80%.
Năm 1998, Lã Văn Kính đã thử nghiệm probiotic trên gà đẻ cho kết quả sản
lượng tăng 5% so với đối chứng không sử dụng probiotic.
Năm 1999, Lưu Thị Uyên sử dụng chế phẩm EM (Effective Microorganisms)
của Nhật Bản trong phòng ngừa và điều trị hội chứng tiêu chảy ở heo, cho thấy số
lượng E.coli trong 1g phân giảm từ 31,1 đến 80,95 triệu vi khuẩn.
Năm 2001, Lê Thị Phượng ghi nhận hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy ở heo con
của các chế phẩm sinh học Paciflor (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109
cfu/g)
và Pacicoli (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109
cfu/g + các kháng sinh:
Colistin 4mg + Lincomycin 3mg). Chế phẩm Paciflor bổ sung trong thức ăn heo nái
mang thai giai đoạn cuối và liên tục 28 ngày sau khi sinh đã làm giảm số lượng E. coli
trong phân heo nái và heo con, giảm tỷ lệ tiêu chảy của heo con theo mẹ; heo con ăn

26. 16
thức ăn có bổ sung Paciflor hoặc Pacicoli thì số lượng E. coli trong phân giảm, giảm tỷ
lệ tiêu chảy và cải thiện tăng trọng heo.
Cũng trong năm 2001 này, Phan Ngọc Kính sử dụng chế phẩm EM trong chăn
nuôi heo thịt cho thấy chênh lệch tăng trọng so với đối chứng tăng từ 20 - 34%, tỷ lệ
thịt xẻ tăng 1,3%, tỷ lệ nạc tăng 4,5%.
Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo mẹ với
liều 0,8, 1,0 và 1,2 tỷ cfu /kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ
tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa.
Cũng trong năm 2002 này, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng chế
phẩm VITOM 1.1 và VITOM 3 (do Nga sản xuất, chứa B. subtilis chủng VKPMV-
7092-) để phòng, trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà. Qua đó nhận thấy khi dùng
VITOM 3 tăng trọng trên heo tăng 6%, tỷ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỷ lệ khỏi
bệnh đạt 100% và không có tái phát, còn khi dùng VITOM 1.1 tăng trọng trên gà tăng
11,8%, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 99%.
Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử dụng
probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con sau
cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E. coli thải qua phân, giảm tỷ lệ tiêu chảy,
cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn.
Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã
nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi. Kết quả đã tìm
ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng sinh trưởng vật nuôi 10%,
tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỷ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi.
Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

27. 17
Bảng 1.1: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt
trên thị trường
Sản phẩm Nước sản xuất
Vi sinh vật sử dụng và mật độ (cfu/g)
Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men
BioGuard Việt Nam 107
E.lac Hàn Quốc 2 x 107
4 x 107
BioSix Việt Nam 105
105
Lactacids Việt Nam 107
Adepro Việt Nam 107
Lactizym Việt Nam 6 x 105
Ferment Trung Quốc 109
Lacto-Sacc Mỹ 2,5 x 108
4,6 x 106
Tóm lại, các công trình nghiên cứu được tóm lược ở trên đã sử dụng các chế
phẩm probiotic trên gia súc, gia cầm. Mỗi công trình nghiên cứu về những khía cạnh
khác nhau nhưng điều kết luận là probiotic có ảnh hưởng tốt cho vật nuôi như ức chế
VSV gây bệnh, phòng ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và hệ số tiêu tốn
thức ăn,…
1.1.8.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng probiotic dạng bào tử Bacillus
Hồ Thị Việt Thu (2012) đã nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh của bào tử Bacillus
subtilis biểu hiện Interferon alpha gà (B. subtilis - ChIFN), một sản phẩm của bộ môn
Vi sinh Ký sinh – Khoa Dược, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, trong phòng
bệnh Newcastle cho gà được thực hiện trên gà giống Tam Hoàng 3 tuần tuổi. Trong
nghiên cứu này, nhóm tác giả thử nghiệm cho gà uống với liều 0,5 x 1010
bào tử B.
subtilis - ChIFN, sau đó công cường độc virus Newcastle độc lực cao với liều 104
ELD50 cho mỗi gà thí nghiệm, đồng thời so sánh hiệu quả của ChIFN chuẩn với liều
104 IU. Kết quả thí nghiệm cho thấy bào tử B.subtilis - ChIFN có khả năng phòng

28. 18
bệnh Newcastle với tỷ lệ bảo hộ là 79,17% cao hơn so với tỷ lệ bảo hộ bởi ChIFN
chuẩn (45,83%) và so với lô đối chứng Bacillus subtilis (12,50%).
Phạm Kim Đăng và cộng sự (2016) nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm
probiotics NeoAvi GroMax chứa Bacillus dạng bào tử (trộn thức ăn với tỷ lệ 0,3%) đến
khả năng sản xuất gà thịt, giống Ri Ninh Hoà và gà được bổ sung kháng sinh BMD
(Bacitracin Methylene-Disalicylate) 10% (0,4g/kg thức ăn). Kết quả cho thấy rằng số
lượng vikhuẩn E. coli và Salmonella sp.trong hồi tràng và trong phân giảm xuống; số
lượng Lactobacillus sp. trong hồi tràng tăng lên, đồng thời chiều cao và chiều dày lông
nhung biểu mô tá tràng và không tràng tăng lên. Điều này chứng minh tác dụng của
probiotics dạng bào tử chịu nhiệt đến năng suất gà thịt thông qua tác dụng cải thiện hệ
vi sinh vật đường ruột và sức khỏe biểu mô ruột.
Hầu hết các sản phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus hiện đang bán tại Việt
Nam đều được nhập khẩu từ nước ngoài hay sản xuất tại Việt Nam nhưng nguyên liệu
thô được nhập từ nước ngoài (ví dụ như NeoPig Topgold và PigMax chứa bào tử
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans và Bacillus indicus với các
nồng độ khác nhau dùng cho heo hay Neoavi Supamax dùng cho gà của Biospring,
Anh Quốc). Một sản phẩm nữa chứa bào tử Bacillus đang được phân phối tại Việt Nam
là BioPlus®
YC của công ty Evonik, sử dụng cho tất cả các loại vật nuôi.
1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus
1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus
- Đặc điểm phân loại: Theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,
Bacillus thuộc: [46]
Giới: Bacteria
Nghành:Firmicutes
Lớp: Bacilli

29. 19
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus, Geobacillus
Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio
subtilis”. Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B. subtilis (Gordon, 1981). Đó là thành viên
của một chi lớn và đa dạng được Cohn nghiên cứu đầu tiên, là một phần của họ
Bacillaceae. Họ Bacillaceae được chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus,
Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng của họ này là hình thành nội
bào tử [33, 39]
- Đặc điểm hình thái:
Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 -7 µm. Các tế
bào thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông. Là VK Gram dương,
hầu hết có catalase dương tính. Chúng thường di động nhờ roi.
Họ Bacillaceae được Fischer trình bày có hệ thống năm 1895 thì nội bào tử
được dùng trong khóa phân loại vi khuẩn. Đặc điểm của chi Bacillus là tất cả có nội
bào tử, hiếu khí, có thể bắt buộc hay tùy ý, hình que và tạo catalase. Một tế bào chỉ có
thể hình thành duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ. Bào tử
có khả năng chịu nhiệt, axit, sự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp
xúc không khí. Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà
vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên
một chút [17]. Tùy theo loài, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [13, 34].
Tuy nhiên, cũng có một số loài thuộc chi Bacillus không tạo bào tử như B.
thermoamylovorans, B. halodenitrificans [46]
- Đặc điểm phân bố:
Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới
các điều kiện khác nhau. Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ

30. 20
nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, không khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa,
lớp mùn...chủ yếu là đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [28, 33].
- Dinh dưỡng và tăng trưởng:
Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu năng
lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino axit, axit hữu cơ,... Một
số VK tự dưỡng không bắt buộc (B. schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường
chỉ có CO2. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong
khi một số loài khác như B. sphaericus, B. cereus cần các hợp chất hữu cơ (vitamin,
axit amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng như B.
thuringiensis, B. popllae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus,
B. anthracis gây bệnh trên người) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát
triển được trong môi trường VK thông thường như NA, NB [28, 29, 33].
Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là VK hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, nhiệt
độ sinh trưởng tối ưu từ 30 – 45o
C, một số VK chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối
ưu lên tới 65o
C, hoặc ưa lạnh (5o
C – 25o
C). Các loài VK thuộc chi Bacillus sinh trưởng
trong khoảng pH rộng từ 2 – 11. Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng
tối ưu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút. Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và
muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài [23, 28]
- Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên:
B. subtilis có khuẩn lạc khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn
hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch. Khuẩn lạc có mép nhăn bám vào
MT thạch. Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, tế bào đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Nhiệt độ
tối ưu cho sinh trưởng là 36 - 50o
C, tối đa là 60o
C. Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao,
có hình bầu dục, phân bố lệch tâm. Nhờ khả năng sinh một số enzyme ngoại bào
(amylase, cellulase, protease,…) và sinh tổng hợp được nhiều loại KS như subtilin,

31. 21
subtilosin A, sublancin,…mà B. subtilis được ứng dụng rất rộng rãi trong chăn nuôi, y
học, thực phẩm,…[17]
B. amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự B. subtilis.
Nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh và
lên men glucose chậm. Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước. Do có khả năng sinh
tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease [73], lipase [48], phytase, xenlulase
và xylanase [36] nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công
nghiệp thuộc da [31, 39]. Ngoài ra, B. amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các
lĩnh vực khác như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như
vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [42, 43], chất kháng khuẩn
(bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA [39, 42,
43, 56]. Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ Bacillus
amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lượng môi trường nước, tăng cường các
phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV gây bệnh cho tôm,
cá,…[46].
B. licheniformis là vi khuẩn hoại sinh, bào tử hình ovan, phát tán chủ yếu trong
đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc. Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng
đục, bề mặt nhăn nheo. Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt
buộc.
B. pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B. subtilis.
Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào B.
subtilis.
B. megaterium có khuẩn lạc hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép
tròn hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem, trông giống như giọt bạch lạp (nến trắng),
thường có vòng hoặc các vòng đồng tâm trên mặt. Tế bào dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp
thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm. B. megaterium được sử dụng trong sản
xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin amidase. Bên cạnh đó, chúng còn có

32. 22
thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh học, sản sinh vitamin B12, oxetanocin,
cytochromes P450 và một số axit amin khác
B. polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra xung quanh,
mép đôi khi có thùy. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Bào tử hình
bầu dục kéo dài. Loại vi khuẩ này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Ngoài ra,
chúng còn có khả năng cố định đạm. Đây là một vi khuẩn rất phổ biến trong đất.
B. cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục. Tế bào đứng
riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch tâm, tế bào chất có
chứa các hạt và không bào nhỏ. Chúng thường phát tán khắp nơi, sinh sôi, nảy nở trên
thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
1.2.2 Bào tử Bacillus
1.2.2.1 Cấu tạo bào tử vi khuẩn Bacillus
Quan sát bào tử khi không nhuộm, thấy có lớp màu đen ở mép rất sáng và chiết
quang, cấu trúc bào tử bao gồm
- Vỏ bào tử (spore coat): bao quanh lớp màng ngoài, gồm những protein di động,
phức tạp, gồm ba lớp khác nhau. Có chức năng bảo vệ lớp peptidoglycan của bào tử
khỏi bị các tác nhân bên ngoài tấn công như enzyme, UV, chất oxy hóa,...
- Cortex: lớp peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong. Cortex là thành
phần quan trọng giúp bào tử không bị khử nước, do đó tạo sự bền vững và dạng sống
tiềm sinh. Lớp cortex tích điện âm, trong quá trình nảy mầm, lớp này sẽ nhanh chóng
bị thủy giải do enzyme có sẵn trong bào tử
- Lõi tế bào (core): đây là thành phần quan trọng nhất của bào tử, bao gồm đầy đủ
các thành phần gần giống như tế bào sinh dưỡng như protein bào tương, ribosom, thể
nhân chứa DNA. Tuy nhiên, thành phần bào tưởng của bào tử chứa khoảng 30 – 50%
nước, trong khi tế bào sinh dưỡng là 70 – 88% nước.

33. 23
Hình 1.2 Các cấu trúc chính của bào tử Bacillus [57]
Bảng 1.2 Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử [2]
Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử
Cấu trúc Tế bào Gram dương, điển
hình
Vỏ bào tử dày, khó thấm
nước
Thành phần hóa học
Canxi Thấp Cao
Protein Thấp hơn Cao hơn
Hoạt tính enzyme Cao Thấp
Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao
Đặc tính chịu bức xạ Kém Mạnh
Đặc tính chịu các chất hóa
học và axit
Yếu Cao
Khả năng bắt màu chất
nhuộm
Dễ nhuộm Phải sử dụng phương
pháp đặc biệt

34. 24
1.2.2.2 Quá trình hình thành và nảy mầm của bào tử vi khuẩn Bacillus
Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử.
Quá trình bào tử hóa bắt đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức ăn cạn
kiệt hoặc có tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại.
Bào tử vi khuẩn Bacillus có khả năng chịu nhiệt, chịu chất độc và enzyme phân
giải. Trong thời kỳ mới bắt đầu hình thành nội bào tử, vi khuẩn Bacillus tiết ra chất
kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh.
Ở các loài thuộc chi Bacillus được nghiên cứu, quá trình hình thành bào tử
tương tự nhau. Toàn bộ quá trình diễn ra trong khoảng từ 8 – 10 giờ, bắt đầu bằng việc
phân chia DNA, tách một nhiễm sắc thể bao quanh bởi màng sinh chất tạo thể nguyên
sinh là dạng bào tử sơ khởi, và kết thúc bằng việc hình thành vỏ bào tử, rút hết nước
tạo thành bào tử trưởng thành và phóng thích ra khỏi tế bào mẹ
Sự nảy mầm bào tử là quá trình chuyển bào tử từ trạng thái ngủ sang trạng thái
sinh dưỡng của vi khuẩn. Quá trình này gồm 3 giao đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và sinh
trưởng. Có thể hoạt hóa bào tử bằng cách nâng nhiệt độ trong thời gian ngắn, hạ thấp
pH, xử lý hóa chất. Ví dụ bào tử B. subtilis có thể được hoạt hóa bằng cách đun 65o
C
trong 5 phút.
Hình 1.3 Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus [44]

35. 25
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện tại phòng công nghệ sinh học, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn
chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ
Thời gian thực hiện : 4/2017 – 7/2017
2.2Vật liệu
2.2.1 Chủng vi sinh vật:
11 chủng Bacillus do phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn
chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ cung cấp
3 chủng vi sinh vật gây bệnh: Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella
typhimurium (ATCC 14028), Streptococcus aureus (ATCC 65338)
2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
2.2.2.1 Hóa chất
- Peptone, cao nấm men, cao thịt, NaOH, NaCl, glucose, (NH4)2SO4, K2HPO4,
MgSO4.7H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnCl2.4H2O, ZnCl2, CuCl2, CoCl2.6H2O,
Na2MoO4, KCl, Agar…
- Thuốc nhuộm: tím kết tinh, lugol, safranin, lục malachite…
2.2.2.2 Dụng cụ
Que cấy vòng, ống nghiệm, đĩa petri, pipetman 100μl, 1000μl, 5000μl, đầu típ,
becher 100ml, 500ml, erlen 250ml, 1L, đèn cồn, đèn cồn, bật lửa, ống đong, chai nắp
xanh, bông thấm nước, bông không thấm, lame, lamel…

36. 26
2.2.2.3 Thiết bị
Các loại máy móc: tủ ấm, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ sấy,
máy đo OD, kính hiển vi quang học, cân phân tích điện tử, tủ lạnh, máy đo pH, tủ giữ
giống, bồn lên men 5l Biostat, máy ly tâm Avanti JXN Series
2.3Môi trường nghiên cứu
- Môi trường 1: (Môi trường LB) (MT1) (g/l)
Cao nấm men 5g
Peptone 10g
NaCl 10g
Agar 18g
Nước cất 1000ml
- Môi trường 2: ( MT2) (g/l)
Glucose: 10 g
(NH4)2SO4: 2 g
K2HPO4: 13,6 g
MgSO4.7H2O: 0,2 g
Dung dịch muối khoáng :10 ml
Nước cất 1000ml
Dung dịch muối khoáng:
CaCl2: 0,42 g
FeSO4.7H2O: 2,29 g
MnCl2.4H2O: 0,1 g
ZnCl2: 0,17 g
CuCl2: 0,03 g
CoCl2.6H2O: 0,06 g
Na2MoO4: 0,06g

37. 27
Nước cất 1000ml
- Môi trường 3: ( MT3) (g/l)
Peptone 5g/l
Cao thịt 3g/l
KCl 1g/l
MgSO4 0,25g/l
Nước cất 1000ml
- Môi trường 4: (MT4) (g/l)
Peptone 10g/l
Cao thịt 6g/l
KCl 2g/l
MgSO4 0,5g/l
Nước cất 1000ml
- Môi trường 5 (MT5) (g/l):
Glucose 2g/l
MgSO4.7H2O 0,5g/l
MnCl2.4H2O 0,5g/l
KH2PO4 6g/l
Cao thịt hoặc cao nấm men 5g/l
Peptone 3g/l
Nước cất 1000ml
- Môi trường 6 (MT6) (g/l):
Glucose 3g
MgSO4.7H2O 0,6g
Cao nấm men 10g
K2HPO4 6g
Peptone 5g

38. 28
NaCl 0,01g
FeSO4.7H2O 0,1M 1,14ml
ZnSO4.7H2O 0,1M 0,3ml
CaCl2 0,1M 9,9ml
MnCl2 0,1M 30ml
Nước cất 1000ml
- Môi trường 7 (MT7) (g/l)
Peptone 10g
Cao thịt 3g
NaCl 3g
B.complex ( vitamin B1) 0,5ml
Nước cất 1000ml
- MT8: ( MT định tính khả năng sinh amylase) (g/l)
Peptone 10g
Cao thịt 3g
NaCl 3g
Tinh bột tan 1%
Agar 18g
Nước cất 1000ml
- MT9( MT định tính khả năng sinh protease) (g/l)
Peptone 10g
Cao thịt 3g
NaCl 3g
Gelatin 1%
Agar 18g
Nước cất 1000ml
- MT10 (MT định tính khả năng sinh cellulase ) (g/l)

39. 29
Peptone 10g
Cao thịt 3g
NaCl 3g
CMC 1%
Agar 18g
Nước cất 1000ml
Các chất của môi trường nói trên được hòa theo thứ tự vào nước, các thành phần
khoáng được hòa tan với nước cất trước rồi mới cho vào hỗn hợp môi trường theo thứ
tự của công thức môi trường, điều chỉnh pH cho phù hợp với từng môi trường và hấp
khử trùng 121o
C trong 15 phút

40. 30
2.4Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
11 Chủng Bacillus
Sàng lọc chủng
Bacillus có đặc tính
probiotic tốt
Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày
Khảo sát khả năng chịu muối mật
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn
kiểm định
Chủng Bacillus
được chọn
Dựng đường cong tăng trưởng
Khảo sát các môi trường tạo bào tử
Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều
nhất
Sản xuất bào tử
quy mô pilot
Tạo chế phẩm

41. 31
2.5Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc
- Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết
tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào
- Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan
làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi
khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này  Đỏ vàng với
Safranin hay đỏ tía với Fuchsin
- Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại
do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào  màu tím
Cách tiến hành
- Làm tiêu bản:
 Dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi trên lame
 Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
- Nhuộm tiêu bản:
 Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal Violet trong 30 giây
 Rửa nước
 Nhuộm lugol trong 1 phút
 Rửa nước
 Tẩy cồn 960
trong 20 – 30 giây, để ngiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt
cồn cho đến khi tan hết màu.
 Rửa nước
 Nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin từ 10 – 30 giây
 Rửa nước
 Thấm khô
 Quan sát [16]

42. 32
2.6Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton
Nguyên tắc
Dựa trên cấu trúc đặc biệt của bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit.
Trước hết xử lí để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit.
- Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và TB bằng thuốc nhuộm có hoạt tính
mạnh.
- Tẩy màu tế bào chất TB đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế
bào chất của bào tử và tế bào chất TB bắt màu phân biệt.
Cách tiến hành
- Dùng dây cấy vòng vô trùng lấy sinh khối vi khuẩn cần xác định làm vết bôi
trên lame
- Đặt 1 cốc nước trên bếp từ và đun sôi. Sau đó đặt lên trên miệng cốc một miếng
giấy lọc
- Cho dung dịch Malachite Green 5% vào vết bôi và đặt lame có sinh khối của vi
khuẩn lên miếng giấy lọc trên cốc và để trong thời gian 5 phút
- Sau đó, rửa vết bôi bằng nước trong khoảng thời gian 30 giây
- Nhuộm bổ sung với thuốc nhuộm Fuchsin trong khoảng 60 – 90 giây
- Rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô
- Quan sát dưới kính viển vi
Đọc kết quả
- Bào tử  màu xanh
- Tế bào sinh dưỡng  màu đỏ [11, 16]
2.7Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Nguyên tắc
Đếm số KL mọc trên MT từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL
được hình thành từ một TB duy nhất

43. 33
Cách tiến hành
- Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Dùng pipetman hút 1ml dịch nuôi cấy đưa sang
ống nghiệm có 9ml NaCl 0,85%, ta được độ pha loãng 10-1
, tiếp tục pha loãng
để được các độ pha loãng 10-2
,10-3
, 10-4
, 10-5
, 10-6
.
- Chuẩn bị MT thạch đĩa: MT1 được vô trùng cẩn thận.
- Cấy và dàn đều dịch pha loãng.
 Dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10-4
, 10-5
,
10-6
cho vào mỗi đĩa Petri, mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa.
 Dùng que trang trang mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng
TB. Ghi vào nắp hộp Petri các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy, chủng cấy mẫu.
- Lật ngược các đĩa Petri vừa cấy, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37o
C.
- Sau 24 giờ, đếm số KL trong mỗi đĩa. Ghi nhận các độ pha loãng có số KL từ
25 đến 250 KL/đĩa [16, 22, 25, 28]
Cách tính kết quả:
Số lượng tế bào VK trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức:
X (CFU/ml) =
𝑁
n1V𝑓1 + … + 𝑛𝑖V𝑓𝑖
Trong đó: X: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn (trong khoảng
25 – 250 khuẩn lạc)
n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường
f: độ pha loãng tương ứng
2.7.1 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang
Nguyên tắc:
Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh
sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng. VSV trong MT nuôi cấy có thể hấp thu

44. 34
hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Do đó, số lượng ánh
sáng được hấp thu hoặc phân tán có mối tương quan thuận với số lượng VSV trong
dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị OD (Optical Density) đo được ở bước sóng
600nm (OD600nm) trên máy quang phổ (dựa trên sự tương quan tuyến tính giữa OD600nm
và mật độ TB (cfu /ml) [12, 25]
Cách tiến hành
2.7.1.1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ TB (đường
chuẩn)
- Pha loãng huyền phù chứa chủng Bacillus cần xác định thành các huyền phù
khác nhau có độ đục đo ở OD600nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Xác
định giá trị thực tế OD600nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế
- Dùng phương pháp đếm KL, xác định mật độ TB (cfu/ml) của các huyền phù
này.
- Tính giá trị log N (cfu /ml) cho mỗi giá trị mật độ tương ứng với mỗi giá trị độ
đục. Vẽ đường chuẩn biểu diễn của log N (cfu/ml) (trục tung) theo OD600nm (trục
hoành). Xác định khoảng tuyến tính giữa log N (cfu /ml) và OD600nm
- Dùng phần mền Microsoft office Excel 2010 để phân tích sự tuyến tính giữa log
N (cfu /ml) - giá trị OD600nm và dựng đường chuẩn bằng công cụ Insert Charts
2.7.1.2Xác định mật độ TB theo độ đục và OD600nm
- Sau khi nuôi cấy VK trong MT lỏng với các điều kiện phù hợp, lấy dịch sau
nuôi cấy đo OD600nm (dịch nuôi cấy VK cần được pha loãng trước khi đo OD600nm).
- Từ giá trị OD600nm đo được, dựa vào đường chuẩn suy ra số lượng TB (cfu /ml)
của mẫu và nhân với độ pha loãng.
2.7.2 Lập đường cong tăng trưởng
Chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm được tăng sinh trong 50ml môi trường LB
ở 37o
C, 24 giờ

45. 35
Cấy 1 lượng dịch vi khuẩn Bacillus thử nghiệm đã huyền phù vào erlen chứa
450ml môi trường LB sao cho OD xấp xỉ khoảng 0,1 - 0,5; đem nuôi cấy lắc 150
vòng/phút ở 37o
C
Xác định đường cong tăng trưởng: đo OD dịch nuôi cấy lắc sau mỗi 2 giờ nuôi
cấy, ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn
2.7.3 Khảo sát sự tạo thành bào tử
Kiểm tra mật độ bào tử bằng phương pháp xử lý nhiệt ở 80o
C trong vòng 15
phút trong bể điều nhiệt. Pha loãng và cấy trang ở các độ pha loãng thích hợp
2.8Khảo sát các đặc điểm probiotic
2.8.1 Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày
Nguyên tắc:
Dạ dày của gia súc có pH thấp (1 – 3) là nơi có ảnh hưởng mạnh đến khả năng
sống sót của các chủng VSV được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi.
Dựa vào khả năng chịu pH thấp (1 - 3) của dạ dày và tồn tại sau thời gian tiêu
hóa ở dạ dày (1 - 3 giờ) làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic [15, 23]
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong
MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37o
C
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có pH=2 được điều chỉnh bằng
HCl 1N. Thí nghiệm lặp lại 3 lần
- Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị
- Ủ mẫu ở 37o
C. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng
mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3
- Ủ mẫu sau khi trang ở 37o
C, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ
lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau
Kiểm tra kết quả

46. 36
- Tính tỷ lệ TB sống sót (%)
𝑁𝑖
𝑁𝑜
× 100
Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút)
No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút
- Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở pH 2 và thời gian khác nhau để chọn
chủng Bacillus
2.8.2 Khảo sát khả năng chịu muối mật
Nguyên tắc:
Các chủng VSV probiotic khi qua ruột non sẽ chịu tác động của muối mật trong
đường ruột.
Dựa trên khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác động của muối mật
trong đường ruột làm cơ sở để tuyển chọn các chủng probiotic. [15, 23]
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong
MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37o
C
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT1 có bổ sung 2% muối mật. Thí
nghiệm lặp lại 3 lần
- Chuyển dịch huyền vào ống nghiệm đã chuẩn bị
- Ủ mẫu ở 37o
C. Tại các thời điểm 0, 60, 180 phút tiến hành pha loãng
mẫu bằng cách cấy trang theo mục 3.4.3
- Ủ mẫu sau khi trang ở 37o
C, 24 giờ. Đếm số KL mọc trên đĩa và tính tỷ
lệ sống sót của TB sau các khoảng thời gian khác nhau
Kiểm tra kết quả
- Tính tỷ lệ TB sống sót (%)
𝑁𝑖
𝑁𝑜
× 100

47. 37
Trong đó: Ni: mật độ TB sau thời điểm i (i là 60 và 180 phút)
No: mật độ TB ở thời điểm 0 phút
- Căn cứ vào tỷ lệ TB sống sót ở muối mất 2% và thời gian khác nhau để
chọn chủng Bacillus
2.8.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
2.8.3.1Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
Nguyên tắc:
Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh enzyme protease thủy phân
gelatin. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành
vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của
enzyme [11, 16, 24]
Cách tiến hành:
- Nuôi VK trong MT9 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3,
lắc 150 vòng/phút, 37o
C
- Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau
đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại.
- Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% gelatin vào đĩa petri. Chờ môi
trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi
trường thạch tạo thành các giếng
- Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37o
C.
Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh protease sẽ
tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch.
Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt
tính enzym cao:

48. 38
- Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo
đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì
khả năng sinh enzym càng nhiều
2.8.3.2Xác định hoạt tính amylase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [19]
Nguyên tắc:
Xác định chủng Bacillus có khả năng sinh hệ enzyme amylase thủy phân
tinh bột thành glucose. Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân
hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh
hoạt tính của enzyme
Cách tiến hành:
- Nuôi VK trong MT8 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3,
lắc 150 vòng/phút, 37o
C
- Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau
đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại.
- Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% tinh bột tan vào đĩa petri. Chờ môi
trường nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi
trường thạch tạo thành các giếng
- Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37o
C.
Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh amylase sẽ
tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch
Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt
tính enzym cao:
- Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo
đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì
khả năng sinh enzym càng nhiều

49. 39
2.8.3.3Xác định hoạt tính cellulase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân [11]
Nguyên tắc:
Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành
vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của
enzyme
Cách tiến hành:
- Nuôi VK trong MT10 (không bổ sung agar) như đã trình bày ở mục 3.3,
lắc 150 vòng/phút, 37o
C
- Sau 24 giờ, lấy dịch nuôi cấy ly tâm 5000v/p, 15phút, thu dịch nổi, sau
đó lọc qua màng cellulose hoặc phi lọc để loại bỏ hoàn toàn tế bào còn sót lại.
- Đổ môi trường thạch đĩa có chứa 1% CMC vào đĩa petri. Chờ môi trường
nguội đông lại dùng khuyên đục lỗ (đường kính d=0,7cm), đục 3 lỗ trên môi trường
thạch tạo thành các giếng
- Dùng pipetMan hút 20μl dịch cho vào mỗi lỗ thạch, để yên và ủ ở 37o
C.
Sau 24 giờ, dùng thuốc nhuộm lugol đo vòng kháng khuẩn. Nếu VK sinh cellulase sẽ
tạo vòng trong suốt quanh lỗ thạch
Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt
tính enzym cao:
- Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo
đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì
khả năng sinh enzym càng nhiều

50. 40
2.8.4 Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp
đường vuông góc Cross Streak
Nguyên tắc:
Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy VK vào MT thạch,
những nơi nào có chất ức chế khuếch tán thì nơi đó VSV kiểm định không sinh trưởng
được và tạo thành đường vô khuẩn
Cách tiến hành
- Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu và các chủng vi sinh vật
gây bệnh được tăng sinh trong MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37o
C.
- Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu, dùng que cấy vòng
lấy một ít sinh khối và cấy chủng VK dọc theo một đường ngang trên đĩa thạch LA, ủ
37o
C
- Sau 24 giờ ủ, tiến hành cấy vi khuẩn gây bệnh đã được tăng sinh trước đó
theo các vạch thẳng góc với vạch vi khuẩn đã mọc. Ủ 37o
C, 24 giờ.
- Đo khoảng cách giữa mép của vạch vi khuẩn với chỗ vi sinh vật gây bệnh
bắt đầu sinh trưởng
2.8.5 Khảo sát môi trường tạo bào tử
- Chuẩn bị giống: Các chủng Bacillus nghiên cứu được tăng sinh trong
MT1 (không bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37o
C
- Chuẩn bị môi trường tạo bào tử: MT1 đến MT8.
MT1 (môi trường LB) đây là môi trường cơ bản cho tất cả các chủng Bacillus
để sinh trưởng và phát triển tốt. [60]
MT2 được sử dụng để khảo sát tạo mật độ bào tử Bacillus subtilis R14 với mật
độ đạt được 108
cfu/ml. [32]
MT3 cho mật độ tế bào Bacillus subtilis 7,5 × 109
cfu/ml, mật độ bào tử: 3,6 ×
109
cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 48%. Trong khi đó MT4 cho mật độ TB

51. 41
Bacillus subtilis: 6,2 × 109
cfu/ml, mật độ bào tử: 4,8 × 109
cfu/ml, hiệu suất hình thành
bào tử 77% [51]
MT5 mật độ TB Bacillus subtilis EA-CB0575 đạt được 2,01 × 109
cfu/ml, mật
độ bào tử 1,87 × 109
cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử 93,2% [45]
Chủng Bacillis EA-CB0575 khảo sát trên MT6 cho mật độ bào tử là 1,4 × 109
cfu/ml, hiệu suất hình thành bào tử là 94% [35]
Vitamin cần thiết cho sự hình thành bào tử. Vì vậy MT7 sử dụng môi trường
NA kết hợp với B. complas để tạo môi trường kích thích tạo bào tử [49]
- Sau 24 giờ tăng sinh các chủng Bacillus nghiên cứu được cấy chuyển vào
8 môi trường khác nhau. Ủ 37o
C, 150 rpm
- Lấy mẫu kiểm tra: kiểm tra mật độ tế bào sau 24 giờ bằng cách đo OD và
mật độ bào tử sau 72 giờ nuôi cấy
2.8.6 Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất
- Chọn chủng có hoạt tính probiotic tốt nhất khảo sát điều kiện tạo bào tử
tốt nhất
- Các điều kiện khảo sát: cô đặc, nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng,
nâng pH, tăng nhiệt độ nuôi cấy
Cách tiến hành
- Chuẩn bị giống: Chủng Bacillus tốt nhất được tăng sinh trong MT1 (không
bổ sung agar) trong 24 giờ ở 37o
C
- Chuẩn bị môi trường: LB, nước muối sinh lý, môi trường tối ưu tạo bào tử
- Sau 24 giờ tăng sinh cấy chuyển chủng vào bình erlen có chứa 450ml môi
trường LB
- Sau 24 giờ nuôi cấy thì bắt đầu xử lý các điều kiện tạo bào tử nhiều nhất:

52. 42
 Cô đặc: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử
được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh khối ly tâm có chứa một lượng nhỏ
môi trường LB được nuôi cấy lắc ở 150rpm
 Nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng: Bình erlen có chứa
450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được ly tâm ở 5000 vòng/phút, 5 phút. Sau đó sinh
khối ly tâm được nuôi cấy tiếp trong môi trường nước muối sinh lý, lắc ở 150rpm
 pH: Bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo bào tử được
nâng pH = 9, 10, 11 bằng NaOH 10N, lắc ở 150rpm
 Nhiệt độ: Chuyển bình erlen có chứa 450ml môi trường tối ưu tạo
bào tử vào điều kiện nuôi cấy là 45o
C, lắc ở 150rpm.
- Lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào và mật độ bào tử sau các khoảng thời gian
khác nhau:
Kiểm tra kết quả:
- Hiệu suất hình thành bào tử (%)
𝑀ậ𝑡 độ 𝑏à𝑜 𝑡ử 𝑔𝑖ờ 𝑖𝑛
𝑀ậ𝑡 độ 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑖𝑜
× 100
Trong đó: in: là mật độ bào tử tại các thời điểm khảo sát (cfu/ml)
io: mật độ tế bào nhiều nhất (cfu/ml)
2.8.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot
Từ các kết quả đã khảo sát ở trên đề xuất quy trình lên men trong môi trường
lỏng để thu bào tử của chủng Bacillus với mẻ 3,5 L (trong bồn lên men 5 L thuộc
Biostat, Sartorius, Đức )
2.8.7.1 Khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất
Vì thời gian có hạn nên không thể khảo sát hết các yếu tố cần thiết, nên:

53. 43
- Thừa kế thông số về tốc độ khuấy, oxy hòa tan (pO2) từ các nghiên cứu
khác (Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự, 2012; Trần Hữu Tâm, 2014; S. M. S.
Monteiro và cộng sự, 2014).
- pH: thừa kế thông số về pH như khảo sát ở các thí nghiệm trên
- Xác định thời gian có mật độ tế bào cao nhất: 4 giờ lấy mẫu pha loãng và
cấy trang trên môi trường LB rắn
2.8.7.2 Tiến hành tạo bào tử
- Sau khi có thời gian tối ưu cho mật độ tế bào nhiều nhất, bắt đầu chỉnh
pH từ pH 7 lên 9 để tạo điều kiện bất lợi giúp cho quá trình hình thành bào tử
- Theo nghiên cứu của Fabrízio Siquer Boniolo và cộng sự (2012) thì tiếp
tục khuấy và sục khí để hình thành bào tử. Mặt khác theo Sarrafzadeh và Navarro
(2006) thấy rằng sự gián đoạn cung cấp oxy ảnh hưởng đến việc hình thành bào tử
2.8.7.3 Sản xuất chế phẩm
Sử dụng kết quả của mục 2.8.7.1 và 2.8.7.2
Cách tiến hành
Chuẩn bị giống: Tăng sinh chủng Bacillus trong bình erlen chứa 350 ml môi
trường LB ở 37o
C, 150rpm
Sau 24 giờ tăng sinh, cấy chuyển sang bồn lên men có chứa 3150ml môi trường
tạo bào tử tối ưu.
- Thời gian lấy mẫu: 4 giờ lấy mẫu 1 lần. Sau 24 giờ bắt đầu xử lý pH từ
pH 7 lên pH 9 bằng NaOH và tiếp tục 4 giờ lấy mẫu 1 lần.
- Kiểm tra bào tử: xử lý nhiệt ở 80o
C, 15 phút bằng bể điều nhiệt. Sau đó
tiến hành cấy trang và pha loãng ở độ pha loãng phù hợp
- Thu bào tử: ly tâm ở 5000 vòng/phút, 10 phút
- Sấy: Bào tử sau ly tâm được trộn với bột mì đã được hấp tiệt trùng ở
121o
C, 15 phút, 1 atm và đem sấy ở nhiệt độ 40o
C đến khi khô

54. 44
- Tạo chế phẩm: sau khi bào tử khô được nghiền mịn, bổ sung các chất
mang và đóng gói.
2.8.8 Phân tích thống kê dữ liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel, trong bộ
Microsoft Office phiên bản 2010

55. 45
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1Khảo sát các đặc điểm probiotic
Căn cứ vào các tiêu chuẩn chọn chủng VSV làm probiotic, tiến hành sàng lọc và
tuyển chọn chủng Bacillus đáp ứng yêu cầu tạo chế phẩm probiotic
3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày
Khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của pH thấp ở dạ dày là
một trong những đặc tính quan trọng của chủng VSV được chọn làm probiotic.
Do vậy, tiến hành khảo sát khả năng chịu pH thấp của chúng ở pH 2 tại các thời
điểm 0, 60, 180 phút (tương ứng với thời gian thức ăn lưu lại tại dạ dày). Đếm số
khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, từ đó tính tỷ lệ tế bào sống sót (%) của các chủng VK
khảo sát với các khoảng thời gian khác nhau (mục 1.4.7.1).
Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường pH thấp
STT
Kí hiệu
chủng
Tỷ lệ tế bào sống sót ở pH 2 qua các
khoảng thời gian (%)
0 phút 60 phút 180 phút
1 BI1 100 158,97 27,32
2 BI2 100 30,35 10,58
3 BI3 100 25,61 12,56
4 BI4 100 16,50 10,43
5 MN1 100 25,83 9,87
6 MN2 100 51,75 11,32
7 Sub 100 84,73 43,45
8 Yoi 100 115,80 48,44
9 Liche 100 0 0
10 Natto 100 0 0

56. 46
11 BA 100 0 0
Số liệu ở bảng trên cho thấy rằng dưới tác động của pH thấp (pH 2), hầu hết các
chủng khảo sát đều có xu hướng giảm tỷ lệ sống sót khi kéo dài thời gian xử lý (0 phút
đến 180 phút). Trong 11 chủng thử nghiệm chỉ có 8 chủng (BI1, BI2, BI3, BI4, MN1,
MN2, Sub, Yoi) có khả năng tồn tại ở điều kiện pH thấp cụ thể như sau:
Sau 60 phút khảo sát thì cả 3 chủng Liche, Natto, BA đều không sống sót được
trong môi trường pH 2 (0%). Trong khi đó sau 180 phút khảo sát của 8 chủng còn lại,
tỷ lệ tế bào sống sót cao nhất thu được từ chủng Yoi (48,4%), kế đến là Sub (43,4%),
BI1, BI3, MN2, BI2, BI4, và thấp nhất là MN1 (9,1%). Trong đó chủng BI1 sau 60
phút có sự phát triển trong môi trường pH 2, điều này cho thấy chủng BI1 thích nghi
tốt trong điều kiện này, tuy nhiên sau 180 phút thì tỷ lệ sống sót của chủng giảm mạnh.
Mặt khác, so sánh với các nghiên cứu của nhóm tác giả Hồ Trung Thông và Hồ
Lê Huỳnh Châu (2009) về khả năng chịu pH thấp của các chủng probiotic: sau 180
phút khảo sát ở pH 2, tỷ lệ TB sống sót của 4 chủng LA5, LA6, LA7 và LA11 lần lượt
là 53,56%, 28,42%, 23,23% và 27,81% [21]. Đồng thời, nghiên cứu của Trần Thị Bích
Quyên (2012) cho thấy tỷ lệ sống sót trong điều kiện pH 2 của 4 chủng Q1, Q16, Q22
và Q29 lần lượt là 42,52%, 42,38%, 45,93% và 38,94% [18]. Từ đây có thể thấy khả
năng chịu pH thấp của 8 chủng là tương đối thấp so với các nghiên cứu đã đề cập ở
trên.
Tóm lại, qua 180 phút khảo sát thì chủng Sub và Yoi có tỷ lệ sống sót cao nhất
(48,4%, 43,4%) tương đồng với khá nhiều tác giả
3.1.2 Khả năng chịu muối mật
Trong hệ tiêu hóa, sau khi trải qua điều kiện khắc nghiệt với pH thấp ở dạ dày,
các VSV probiotic lại phải tiếp xúc với muối mật trong đường ruột. Muối mật được coi
là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV
gây bệnh.