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Nuove strategie nel trattamento delle lesioni condrali e osteocondrali 2
- 1. Università Politecnica delle Marche SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN ORTOPEDIA E TRAUMATOLOGIA Direttore: Prof. Antonio Gigante OSPEDALI RIUNITI DI ANCONA SOD – Clinica Ortopedica Direttore: Prof. Nicola Specchia Anno Accademico 2015/2016 Relatore: Prof. Antonio Gigante DR. LUCA DEI GIUDICI
- 3. Avascolare Alta differenziazione Assenza della quota multipotente Attività mitotica inversamente proporzionale all’età
- 6. ៚ Curl et al 1997 ៚ 63% in 31000 artroscopie ៚ 20% IV grado Outerbridge ៚ Hjelle et al 2002 ៚ 61% in 1000 artroscopie ៚ Widuchowski et al 2007 ៚ 60% in 25000 artroscopie ៚ Età media 39 anni ៚58% traumatiche
- 8. The demographics and epidemiology of OCD of the knee in children and adolescents Kessler JI et al AJSM 2013 ៚ Prima descrizione – 1888 ៚ 15-29/100000 ៚ M:F 1,7:1 (13:1 massimo descritto) ៚ 12 – 19 anni ៚ Bilaterale 14% - 30% (asimmetrica) ៚ Giovanile vs Adulta ៚ 69% localizzata al CFM ៚ Ieri ៚ Infiammazione ៚ Ischemia ៚ Genetica ៚ Oggi Microtraumi ripetuti causa di fratture da stress subcondrali. Il potenziale di guarigione ossea viene prevalso. L’area di sofferenza va in necrosi, dissecazione, e separazione
- 9. Conservativi ៚ Fisiokinesiterapia ៚ Idrokinesiterapia ៚ Condroprotettori orali ៚ Infiltrazioni ៚ Cortisonici ៚ Ialuronati ៚ PrP
- 10. Chirurgici ៚ Osteotomie ៚ Debridement ៚ Micro/Nanofratture ៚ OATS/Mosaicoplastica ៚ ACI ៚ MACI ៚ AMIC
- 11. LESIONI DI PICCOLE DIMENSIONI ETA’ Adolescenti <45anni >45anni ATTIVITA’ Bassa Alta Bassa/alta SPALLA Si No Si No Si No TRATTAMENTO PRIMARIO OCD: fissare Altre lesioni: attesa MicroFX OATS MSCs OATS MicroFX OATS TRATTAMENTO SECONDARIO MSCs MSCs 2-3 gen ACI MSCs 2-3 gen ACI Allografts DIMENSIONI PROCEDURA 2 – 4 cm2 Mosaicoplastica ACI MACI AMIC AMIC su scaffold > 4cm2 Pediatrica -Sintesi -Stimolazione midollare 20-60aa -ACI & Co -MegaOATS > 60aa -Tp conservativa OA -Sostituzione protesica
- 13. MACI – biopsie e 2nd look Gigante et al. KSSTA 2012;20(5):862-9Gigante et al. Knee 2015;22(1):30-35. AMIC– biopsie
- 14. 1. Cellule: condrociti o condroprogenitori 2. Supporto meccanico 3. Fattori di crescita One-step ORGANO OSTEOCONDRALE
- 15. 1. Nuovi device Mezzi di sintesi Scaffold acellulati e/o multifasici 2. Materiali biologici nelle procedure one-step Multipotenti Differenziati 3. Cellule staminali mesenchimali Midollari Adipose 4. Condrociti Magnetizzazione Vettori di consegna più efficaci per una stimolazione specifica Identificazione dei GF più idonei Identificazione dei bersagli cellulari e articolari più strategici
- 16. ៚ Studio pilota per la valutazione dell’utilita’ e degli esiti a breve termine di viti a compressione in magnesio per la sintesi dei distacchi osteocondrali ៚ Scaffold biomimetico trifasico per il trattamento di lesioni osteocondrali in «Early OsteoArthritis» ៚ Le potenzialita’ della membrana amniotica umana (HAM) nella rigenerazione condrale ៚ Cartilagine microframmentata per la riparazione cartilaginea one-step
- 17. STUDIO SPERIMENTALE STUDIO PILOTA PER LA VALUTAZIONE DELL’UTILITA’ E DEGLI ESITI A BREVE TERMINE DI VITI A COMPRESSIONE IN MAGNESIO PER LA SINTESI DEI DISTACCHI OSTEOCONDRALI
- 18. OBIETTIVO UNICO Riduzione anatomica e sintesi stabile del frammento osteocondrale ៚ Guarire l’osso ៚ Mantenere la congruità ៚ Sintesi artroscopica ៚ Mezzi riassorbibili ៚ Perforazioni ៚ Alternative: ៚ Escissione ៚ Trattamento del difetto Cepero et al, 2005; Makino et al, 2005; Larsen et al, 2005
- 19. Reazioni da corpo estraneo Osteolisi asettica Incapsulazione e arresto del riassorbimento Bassa resistenza a taglio, compressione, tensione
- 20. ៚ Dal 19° secolo ៚ Modulo di Young 45GPa ៚ Tensione di snervamento >260 Mpa ៚ Resistenza alla trazione >290 Mpa ៚ Elongazione >8% ៚ Riassorbibile ៚ Sovrapponibile alla vite di Herbert
- 21. ID SESSO ETA’ BMI LATO SEDE ICRS CF M 17 20.07 Sn CFM IV AA M 20 22 Dx CFM III VC M 15 21.63 Dx CFM III HE M 17 23.5 Dx CFL III LA M 18 21.81 Dx CFM IV SB F 19 18.9 Sn CFM III MS F 14 19.21 Dx CFM III ៚ Mg2+, Ca2+, Na+, K+ ៚ 0-1-15-30gg ៚ RX ៚ 0-30-60gg ៚ RM ៚ 0-3-6mesi ៚ KOOS, Tegner ៚ 0-6mesi
- 22. 0 2 4 6 8 10 12 T0 T1 T2 T3 Trend elettroliti Magnesio Calcio Sodio Potassio
- 25. 75 80 85 90 95 100 105 KOOS Pre Op 6 mesi P=0,005 TEGNER Riduzione di attività 1.9 punti medi A 6 mesi, allenamento specifico
- 27. STUDIO SPERIMENTALE SCAFFOLD BIOMIMETICO TRIFASICO PER IL TRATTAMENTO DELLA «EARLY OSTEOARTHRITIS» NORMALERIPARATO
- 28. ៚ Nanocristalli di AI in fibrille di collagene tipo I ៚ Configurazione tristrato selettiva ៚ Risultati eccellenti ៚ Richiamo di MSC midollari Mantenimento del fenotipo condrocitario Rigenerazione di superficie condrale, tide mark, osso Macroscopici, istologici, e radiografici (in vitro e su modelli animali) Ferruzzi et al, 2008; Kon et al, 2010; Kon et al, 2012
- 29. STUDIO SPERIMENTALE Analizzare i risultati clinico-radiografici di uno scaffold biomimetico trifasico per il trattamento di lesioni osteocondrali in ginocchia di pazienti affetti da «Early OsteoArthritis» Indicazioni oEtà < 50 y oDolore di ginocciho: 2 episodi di almeno 10gg nell’ultimo anno oKellgren-Lawrence </= 2 oEvidenza artroscopica di lesioni condrali tipo III e IV sec. ICRS contornati da cartilagine rammollita e fibrillare Controindicazioni • Lesioni del piatto tibiale • OCD • Malallineamenti non trattati • Instabilità • Malattie infettive, metaboliche, neoplastiche, infiammatorie • Bassa compliance del pz
- 30. Fattori di rischio Età 30-50aa Alterazione biomeccanica Infiammazione sinoviale Iperlassità Malallineamento AAII Carichi eccessivi Genetica Dolore Intermittente e diffuso Peggiora con attività moderate; scatena gonfiore e crepitazione ROM dipendente, in base alla distribuzione del carico Esita in atrofia muscolare KSSTA 2016 – Early osteoarthritis of the knee Madry, Kon, Condello, Peretti, Steinwatchs, Seil, Berruto, Engebretsen, Filardo, Angele Macroscopia (artroscopia) Estensione della classificazione -Lesioni definite e focali -1: classificazione delle condizioni condrali perilesionali -2: EOA diffusa Clinica Dolore cronico isolato O associato con riduzione del PROM O associato con segni in RM Precede i segni radiografici di circa 3-4aa Imaging E’ necessaria una nuova classificazione RX che sia più obiettiva (Ahlbäck?) RM può valutare alterazioni biologiche precoci tramite pesate specifiche (DWO - dGEMRIC) Laboratoristia Nonostante alcune deboli associazioni con i biomarker infiammatori e genetici siano stati evidenziati, allo stato attuale non è stato ancora individuato un golden standard ៚ Pazienti giovani ៚ Più alto livello di attività ៚ Maggiori aspettative ៚ Non proni alla sostituzione protesica ៚ Degenerazione articolare certa ៚ Coinvolgimento condrale e subcondrale
- 32. 0 2 4 6 8 VAS Pre Op Post Op P=0,0001 Riduzione del dolore significativa
- 33. 0 10 20 30 40 50 60 70 IKDC Pre Op Post Op P<0,0001 Marcato miglioramento funzionale 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 LYSHOLM Pre Op Post Op P<0,0001
- 34. KOOS P<0,0001 Punteggio pre-op medio: 46,7 Punteggio post-op medio: 35,1 Marcato miglioramento funzionale
- 35. Complicanze 11% 9 2 3 2 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tibial/femoral Osteotomy Lateral release/ Patellar realignment Meniscectomy/meniscal transplantation Complex case Other Chirurgia associata 2 rigidità 1 riassorbimento
- 36. VALUTAZIONE RM Integrazione completa - 73,6% Segnali isointensi - 66,8% Anomalie subcondrali - 51,0%
- 37. Hollander et al, 2006; Kreutz et al, 2009; Cavallo et al, 2010; Kon et al, 2011; Di Martino et al, 2012
- 38. I NOSTRI RISULTATI ៚ Contributo strutturale, immunomodulatorio, e antinfiammatorio delle MSC ៚ Rimozione meccanica dell’osso sottostante la lesione ៚ Chirurgia precoce ៚ Trattamento delle patologie associate APPROCCIO COMBINATO MECCANICO E BIOLOGICO
- 39. STUDIO SPERIMENTALE: LE POTENZIALITA’ DELLA MEMBRANA AMNIOTICA UMANA (HAM) NELLA RIGENERAZIONE CONDRALE
- 40. ៚ Già nella pratica clinica oftalmologica e plastica ៚ Abbondante quota staminale (epiteliale e stromale) ៚ La semina su HAM ៚ > ECM ៚ > crescita cellulare senza inficiarne il fenotipo ៚ Sviluppo di un network collagenico ៚ Espressione di numerosi fattori di crescita ៚ Immunomodulante, antimicrobica, resistente ៚ NO teratogenicità, NO rigetto Capacità condrogeniche ៚ Presenza di GAG, HA, perlecano ៚ hADSC possono differenziare lungo la linea condrocitaria ៚ hADSC positive per SOX9, SOX5, BMP2, BMP4, BMPr, osteocalcina, aggregano ៚ Può integrarsi con la cartilagine, ripristinare densità cellulare, stimolare l’architettura strutturale Visvhwakarma et al, 1890/1986; Lindenmair 2014; Zelen 2013; Hanselman 2015 Applicazioni ortopediche ៚ Primi anni ‘80 ៚ Sospensioni di HAM per terapia infiltrativa nella fascite plantare ៚ Formulazione liquida per i difetti osteocondrali di astragalo ៚ 5 studi totali, empirici
- 41. ៚ Cartilagine sana, adulta ៚ Digestione enzimatica (collagenasi + DNA-asi) ៚ Semina condrocitaria e incubazione 3 settimane ៚ Alcian Blu, S100, Collagene 1-2 ៚ Valutazione a 14 e 21 giorni CONSIDERAZIONI INDIRETTE ៚ La manipolazione e la semina su HAM necessitano di standardizzazione ៚ Esperienza specifica ៚ 05/07/2017 Sconsigliata ៚ Assenza di dati sperimentali ៚ Scaffold o fonte cellulare? ៚ Artrotomia ៚ Lesioni molto ampie ៚ Allungamento dei tempi operatori
- 42. STUDIO SPERIMENTALE CARTILAGINE MICROFRAMMENTATA PER IL TRATTAMENTO CARTILAGINEO ONE-STEP
- 43. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS) Particulated Juvanile Allograft Cartilage (PJAC) ៚ Liberazione cellulare ៚ Produzione di collagene II ៚ Produzione di proteoglicani ៚ Espressione di SOX9, CD151, CD49c, G-CSF-r, TGF-β ៚ Su animale: CAIS > PJAC > AMIC/MACI Use of chondral fragments for one stage cartilage repair: a systematic review. Bonasia et al, WJO 2015 RISVOLTI CLINICI ៚ NO digestione enzimatica = costi minimi ៚ Camera biologica ៚ Applicazione one-step ៚ Risultati pre-clinici superiori (istologici, immunoistochimici, radiologici, artroscopici)
- 44. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS) Use of chondral fragments for one stage cartilage repair: a systematic review. Bonasia et al, WJO 2015 OBIETTIVI: ៚ Frammentazione manuale VS motorizzata ៚ Semina libera VS su scaffold VALUTAZIONI: ៚ Quantità di materiale dopo 2-4-6 minuti di frammentazione motorizzata ៚ Vitalità (MTT) e residuo fisso ៚ Istologia: Alcian Blu ៚ Immunoistochimica: S100-Collagene I e II ៚ Controllo: cartilagine umana digerita enzimaticamente
- 45. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS) Frammentazione motorizzata
- 46. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS) Frammentazione manuale
- 47. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS) Semina su piastra di Petri Alcian BluCollagene ICollagene IIS-100
- 48. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS) Semina su scaffold (HA+Coll II) Alcian Blu Collagene II S-100
- 49. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS) ៚ Frammentazione manuale: ៚ maggiore vitalità ៚ favorisce liberazione cellulare ៚ mantenimento del fenotipo ៚ Semina libera: ៚ favorisce liberazione cellulare ៚ organizzazione in nuovi clusters ៚ favorisce l’attività cellulare ៚ Semina su scaffold: ៚ Integrazione dei frammenti ៚ Minore attività
- 50. Cartilage Autograft Implantation System (CAIS)
Editor's Notes
- Buongiorno a tutti, sono Luca Dei Giudici, e vi parlerò di nuovi trattamenti per le lesioni condrali e osteocondrali. Tematica che ho a cuore e che mi ha caratterizzato in questi cinque anni.
- L’interesse origina dalle minime potenzialità rigenerative della cartilagine
- Poiché è un tessuto avascolare, ad alta differenziazione, in cui è assente la componente multipotente, e la cui attività declina inesorabilmente
- Di conseguenza una sofferenza condrale progredirà verso lo sviluppo di fissurazioni, di difetti, e in ultimo di artrosi
- Progressione alla base della storica classificazione di Outerbridge, e della recente classificazione ICRS
- Le lesioni condrali e osteocondrali sono, inoltre, frequenti, presentandosi in circa il 60% degli infortuni al ginocchio; per il 58% dei casi hanno origine traumatica.
- Quindi nella maggior parte dei casi sono associate a lesioni meniscali, legamentose, o a fattori predisponenti
- Nei restanti casi, invece, si possono presentare come morbo di Konig, condizione rara, descritta nel 1888, che coinvolge principalmente i maschi tra i 12 e i 19 anni, solitamente localizzata al condilo mediale. Per questa patologia, se inizialmente si sono alternate diverse teorie, oggi si ritiene il microtraumatismo essere la causa principale. Lo sviluppo di fratture subcondrali prevarica sulle potenzialità di guarigione, e si sviluppa necrosi, con dissecazione e separazione
- I trattamenti attuali possono essere di tipo conservativo, più o meno invasivi
- O chirurgici. Sono numerose le tecniche descritte
- Tuttavia le indicazioni rimangono poco chiare, anche secondo le linee guida più accreditate
- In ogni caso gli esiti sono, istologicamente, molto inferiori rispetto al tessuto originario
- Uniche eccezioni si sono dimostrate essere la tecnica MACI, e la tecnica AMIC, sua evoluzione one step che non prevede l’uso di cellule differenziate
- Questo perché il trattamento ideale dovrebbe rispettare quella che possiamo definire come triade rigenerativa, possibilmente in un unico tempo chirurgico, e centrata al trattamento di tutta l’unità osteocondrale e non solamente della superficie
- Verso questa direzione si sono proiettate le nuove strategie. Nello specifico, in questi anni di specializzazione mi sono interessato verso i nuovi device, e verso l’identificazione di materiali biologici che possano essere utilizzati in one step, e oggi ne presento i risultati
- Presso la clinica ortopedica, l’ospedale di Negrar dove sono stato 9 mesi, e con l’importante aiuto del nostro laboratorio, abbiamo portato avanti 4 studi a riguardo
- Il primo studio che vi presento valuta l’uso di viti in magnesio per la sintesi dei distacchi osteocondrali
- Nei casi in cui vi sia un distacco, l’obiettivo principale è unico. Ridurre anatomicamente e sintetizzare, portando a guarigione l’osso e ripristinando la congruità. Per farlo sono indicati la sintesi artroscopica e materiali riassorbibili, mentre le classiche perforazioni sono ormai sconsigliate. In alternativa si può pensare all’escissione del frammento < di 2 cm e/o al trattamento del difetto residuo
- Tuttavia, i mezzi di sintesi attuali, principalmente in polilattato, sono gravati da complicanze quali reazioni da corpo estraneo, osteolisi asettica, incapsulazione con arresto del riassorbimento, e presentano una bassa resistenza alle forze di taglio, compressione, e tensione
- Il magnesio invece, elemento presente nel nostro organismo e applicato in ortopedia dal 19° secolo, è stato proposto per la produzione di viti che presentassero le caratteristiche meccaniche dell’osso in termini di elasticità, snervamento, resistenza alla trazione ed elongazione; che fosse riassorbibile, e con un design tipo vite di Herbert permettendo la compressione del frammento
- Tra novembre 2015 e gennaio 2017 abbiamo, quindi, screenato le lesioni afferite al PS ed escluso possibili fattori di confondimento. Siamo andati a valutare i livelli plasmatici del magnesio e dei principali elettroliti, a 0-1-15-30gg, le rx a 0-30-60gg, le risonanze a 0-3-6 mesi, e la funzionalità preoperatoria e finale. Su un campione di 7 pazienti
- Per quanto riguarda gli elettroliti, il trend è stato costante e nei limiti di riferimento a tutte le osservazioni
- Alle radiografie abbiamo osservato la comparsa, a 30giorni, di aree ipodiafane in corrispondenza della punta delle viti; non più presenti ai controlli a 60gg
- Anche in RM, oltre alla valida guarigione della lesione, si è osservata la presenza di un processo attivo in corrispondenza della porzione terminale delle viti, poi non più presente all’imaging eseguito a 6 mesi, e interpretato come il normale processo di adsorbimento del mezzo di sintesi
- La funzionalità è migliorata in maniera significativa, tuttavia il livello di attività sportiva a 6 mesi era ridotto di circa 2 livelli. Tutti i pazienti avevano ripreso il condizionamento sportivo specifico pur non partecipando a competizioni o simulazioni di gara
- In conclusioni le viti in magnesio si sono dimostrate un mezzo sicuro che non crea interferenze metaboliche, non richiede accorgimenti particolari, non causa eventi avversi specifici, incapsulazione, o igromi. Inoltre è efficace, avendo portato a guarigione tutti i pazienti, essendo agevole da applicare e quindi sovrapponibile alle viti metalliche comunemente usate
- Qualora il frammento non osteocondrale distaccato non fosse più presente bisogna ricorrere a tecniche diverse. Nell’ultimo periodo ha suscitato notevole interesse l’uso di scaffold acellulati multifasici, da applicarsi come riempimento del difetto, e che verrebbero abitati dalle cellule ospiti risultando in un tessuto quasi sovrapponibile al natio
- Questi si costituisce di nanocristalli di ialuronato in fibrille di collagene I per il mantenimento del fenotipo, è costituito in 3 strati così da trattate superficie, tide mark e osso, e si i primi risultati, peraltro eccellenti sono imputati al richiamo di staminali mesenchimali midollari
- Nel nostro studio, in collaborazione con l’ospedale sacrocuore di negrar, abbiamo provato a stressare ulteriormente questa tecnica, applicandola per il trattamento di quei difetti condrali che si svilluppano nei pazienti affetti da Early OsteoArthrithis così selezionati
- Per tale condizione, originariamente descritta nel 2012, si sono definiti recentemente i criteri diagnostici. Sono stati individuati fattori di rischio come l’età, alterazioni meccaniche, infiammazioni croniche; si è caratterizzato il dolore e la presentazione clinica che vede… Si è aggiunta alla classificazione artroscopica la descrizione delle condizioni perilesionali o di una EOA diffusa. Rimangono attuali, però le perplessità circa l’imaging diagnostico e le valutazioni laboratoristiche. Le criticità maggiori, per questi pazienti, sono la giovane età, le elevate aspettative, e la certezza della degenerazione articolare con coinvolgimento condrale e subcondrale
- Sono stati rivalutati 26 pazienti di età media 44 anni e bmi medio 27, a un follow up di 5 anni, operati a circa 20 mesi dall’esordio dei sintomi. Questi presentavano 17 lesioni al condilo mediale, 6 alla troclea, 3 alla rotula, in 16 casi di tipo 2 secondo l’ICRS.
- Alla rivalutazione si è osservato una riduzione significativa del dolore
- Così come una valida ripresa funzionale, sia con le schede IKDC e Lysholm
- Che con la scheda KOOS, la più specifica per le patologie degenerative del ginocchio e la valutazione del loro trattamento
- Il gesto chirurgico maggiormente associato è stata l’HTO in plus, e si sono sviluppate 3 complicanze totali: 2 rigidità che hanno richiesto l’artrolisi artroscopica, e 1 riassorbimento dello scaffold
- L’imaging ha, invece, dimostrato l’integrazione completa a 5 anni nel 73% dei casi, una segnale isointenso nella sede di riparazione nel 66% dei casi, e la presenza di anomalie subcondrali residue in metà dei pazienti. Quindi una correlazione clinico radiografica quantomeno debole
- I risultati ottenuti sono comparabili con la letteratura recente, che descrive ottimi risultati a 2 anni, condizioni stabili fino a 4 anni, e confermano quanto osservato in vitro e su animale che la rigenerazione è possibile anche in condizioni di degenerazione articolare. Allo stesso modo, anche altri gruppi di studio che hanno applicato il device sull’uomo non hanno riscontrato correlazione radiologica. Questo potrebbe imputarsi al lento e graduale processo di assorbimento dello scaffold stesso
- Possiamo concludere che i nostri risultati siano dovuti al contributo strutturale, immunomodulatorio, e antinfiammatorio delle MSC, alla rimozione meccanica dell’osso subcondrale, alla chirurgia precoce, e all’approccio globale al trattamento del ginocchio e non solo del difetto, che in queste condizioni dovrebbe essere l’obiettivo principale
- Oltre a tecniche innovative nella fase finale di sperimentazione, nel mio percorso ho anche cercato di percorrere strade nuove. Con la nostra tecnica di laboratorio, Sandra, che ringrazio, abbiamo cercato di capire le potenzialità della membrana amniotica in questo campo di patologie
- Perché questo tessuto è già in uso in altre branche, presenta un’abbondante quota staminale, può potenziare la produzione di ECM e la crescita cellulare senza inficiare il fenotipo, sviluppando un network collaginico ed esprimendo numerosi fattori di crescita; e perché notoriamente è immunomodulante, resistente, antimicrobica, non sviluppa rigetto o teratomi Inoltre sono state descritte proprietà condrogeniche interessanti per le cellule staminali che possiede L’uso in ortopedia è stato descritto solo 5 volte dal 1980 ad oggi, in formulazioni liquide per il trattamento della fascite plantare e dei difetti astragalici
- Così, in laboratorio, abbiamo digerito enzimaticamente con collagenasi e dna-asi della cartilagine umana sana prelevata artroscopicamente da zone non di carico, in un paziente giovane, e l’abbiamo posta in coltura per 2 settimane. Successivamente abbiamo seminato la coltura condrocitaria ottenuta su frammenti di membrana amniotica per la valutazione istologica con alcian blu, e immunoistochimica con collagene 1 e 2, dopo 2 e dopo 3 settimane di incubazione. Al termine dei periodi di osservazione, tuttavia, non si è notata alcuna crescita. E’ comunque possibile trarre delle conclusioni, per quanto indirette, dalla nostra esperienza. Innanzitutto è necessaria la standardizzazione delle procedure di manipolazione e semina. Ad oggi non sembra promettente per l’uso come scaffold, e pertanto sconsigliata. In primis perché non sono presenti ulteriori studi specifici, poi perché ne va definita l’applicazione più appropriata, se come supporto o se come fonte cellulare. In ultimo, traslando quanto osservato durante la manipolazione, l’applicazione chirurgica richiederebbe l’artrotomia, sarebbe limitata a lesioni molto ampie, e allungherebbe notevolmente i tempi operatori
- Anche l’ultimo studio che vi presento riguarda l’uso di tessuti differenziati, frammenti di cartilagine umana non trattati chimicamente, una procedura innovativa la cui prima ipotesi di utilizzo risale al 1980 con Albrecht, che ottenne a 6 settimane la formazione di un tessuto ialino su difetti creati in conigli
- Pur datata, questa non è mai stata ripresa, e lo studio di albrecth rimane unico fino ai giorni nostri, con un solo gruppo di studio capeggiato da Jack Farr che ho avuto il piacere di conoscere, che l’ha ripresa circa 3 anni fa, proponendola come CAIS e PJAC per un totale di 16 studi tra laboratorio e animale. Da questi si evince la possibilità di liberazione cellulare con produzione di collagene tipo 2, l’espressione di geni specifici, e risultati favorevoli. Che all’atto pratico eliminerebbero la necessità della digestione enzimatica, la formazione di una camera biologica, quindi l’applicazione one step e risultati superiori
- Ritenendo maggiormente interessante e sicura la CAIS, ci siamo posti l’obiettivo di definire quale fosse il miglio modo di preparazione e di applicazione. Valutando la quantità di materiale a diverse tempistiche di lavorazione, la vitalità e il residuo fisso, e le evidenze istologiche e immunoistochimiche. Il braccio di controllo con cui abbiamo paragonato i risultati ottenuti è stato, invece, costituito da cartilagine umana digerita, ovvero il metodo di preparazione attualmente migliore
- Per quanto riguarda la frammentazione motorizzata abbiamo notato una sospensione simile dopo 4 e 6 minuti di lavorazione, insufficiente invece dopo 2. Abbiamo quindi scelto di lavorare i campioni successivi per 4 minuti. Inizialmente si è osservata una buona vitalità, come si nota dalla colorazione blu nella foto centrale, tuttavia in sospensione erano presenti numerosi detriti metallici. Al controllo dopo incubazione, però, la vitalità cellulare residua era bassissima, quasi assente, pertanto questo gruppo di studio è stato escluso. Nella foto a destra si nota il gruppo di controllo, dove le cellule blu sono quelle vitali
- Di contro, la frammentazione manuale con lama fredda ha dimostrato conservare un’ottima vitalità, nella foto di destra, sovrapponibile al gruppo di controllo, al centro
- La semina su piastra, dopo 30gg di incubazione, ha dimostrato un’iniziale positività per la colorazione Alcian Blu, a dimostrazione che le cellule che si sono liberate dai frammenti si sono organizzate in clusters producendo glicosamminoglicani. L’immunoistochimica per il collagene tipo I è stata pressochè negativa, similmente ai controlli, mentre ha dimostrato la produzione di collagene tipo II e della proteina S100, in misura comparabile a quanto osservato nei pozzetti di controllo
- La semina su scaffold, invece, pur dimostrando l’attività cellulare e la produzione di GAG, collagene II ed S100, non ha dimostrato la fuoriuscita di cellule dai singoli frammenti, che invece si sono adesi fermamente agli scaffold tramite estroflessioni
- Si può quindi concludere a favore della frammentazione manuale, che garantisce maggiore vitalità, liberazione cellulare e mantenimento del fenotipo; e a favore della semina libera cui si associa la formazione di nuovi clusters e maggiore attività; mentre la semina su scaffold permette un’integrazione dei frammenti che, in alcune situazioni, potrebbe essere più conveniente
- Per la CAIS, quindi, si dimostra la possibilità di coltivare cartilagine umana differenziata senza digestione enzimatica, che se usata per riempire un difetto potrebbe creare un effetto camera biologica in cui sono presenti gli elementi della triade rigenerativa. I risultati sono promettenti ma sono necessarie ulteriori conferme sperimentali, che spero di poter continuare a cercare nei prossimi anni collaborando ancora con la clinica ortopedica