Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận án tiến sĩ ngành kĩ thuật môi trường với đề tài: Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
PHÙNG KHẮC HUY CHÚ
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM
HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN
CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE
LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
Hà Nội, 2018

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
PHÙNG KHẮC HUY CHÚ
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM
HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN
CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE
Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường
Mã số: 9.52.03.20
LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS Đặng Thị Cẩm Hà
Hà Nội, 2018

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận án tiến sỹ “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính
và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase” là công
trình nghiên cứu do chính tôi tự thực hiện. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là
hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu
nào khác. Các trích dẫn sử dụng trong luận án đã được ghi rõ tên tác giả tài liệu
tham khảo.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
TÁC GIẢ LUẬN ÁN
NCS Phùng Khắc Huy Chú

4. Lời cảm ơn
Để hoàn thành được luận án, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành
nhất đến PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là
người thầy đã tận tâm, tận tình và nhiệt thành đã hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều
kiện thuận lợi và kịp thời trong những lúc khó khăn, vất vả để giúp tôi thực hiện và
hoàn thành luận án này.
Tôi chân thành cảm ơn các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy Binh chủng Hóa học; các
đồng chí lãnh đạo, chỉ huy, các đồng chí, đồng nghiệp công tác tại Phòng Khoa học
quân sự và Viện Hóa học - Môi trường quân sự, Bộ Tư lệnh Hóa học đã hết sức giúp
đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và tối đa về mặt tinh thần và một phần vật chất cho tôi khi
tôi tham gia học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình.
Bên cạnh đó, để có thể hoàn thành được luận án này, tôi chân thành cảm ơn
ThS Đào Thị Ngọc Ánh, ThS Lê Việt Hưng, ThS Nguyễn Hải Vân cùng toàn thể các
đồng nghiệp trong phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường,Viện Công nghệ sinh
học đã giúp đỡ, làm việc nhóm một cách có hiệu quả để thực hiện một số nội dung liên
quan đến luận án.
Để hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh đến được đích cuối cùng, tôi
chân thành cảm ơn lãnh đạo, các thầy, các cô và các anh chị phụ trách đào tạo của
Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là lãnh đạo, các thầy, cô của Viện Công
nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình
truyền đạt, chỉ dạy những kiến thức, kinh nghiệm và chia sẽ những khó khăn của
bản thân tôi trong những năm tháng đã qua.
Hoàn thành được luận án nghiên cứu này, tôi đã liên tục nhận được sự động
viên to lớn của gia đình, dòng họ và đặc biệt là của “đồng chí vợ” đã luôn ở bên,
chủ động khắc phục mọi khó khăn của gia đình nhỏ bé của tôi để động viên và tạo
điểu kiện thuận lợi nhất để tôi yên tâm hoàn thành chương trình đào tạo tiến sỹ này.
Tôi rất cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài
đơn vị đã dành cho tôi.
Luận án được thực hiện với sự tài trợ về kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà
nước: "Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, các enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin",
Mã số DTDLCN.13/14 do PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà làm chủ nhiệm Đề tài.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
NGHIÊN CỨU SINH
Phùng Khắc Huy Chú

5. MỤC LỤC
Mục lục
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ và đồ thị
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 4
1.1.1. Giới thiệu chung về laccase 4
1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase 4
1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase 5
1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase 6
1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase 7
1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ 8
1.1.1.6. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ có clo 12
1.1.2. Giới thiệu về laccase-like 13
1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và công nghệ xử lý 17
1.2.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm 17
1.2.1.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm 17
1.2.1.2. Đặc điểm chủng của nước thải dệt nhuộm 18
1.2.2. Các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm 19
1.2.2.1. Phương pháp hóa lý 19
1.2.2.2. Phương pháp oxy hóa nâng cao 20
1.2.2.3. Phương pháp sinh học 21
1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý 26
1.3.1. Hiện trạng ô nhiễm 26
1.3.2. Công nghệ xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm 28
1.3.3. Phương pháp phân hủy sinh học xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ 30
1.3.3.1. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi laccase 31
1.3.3.2. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi nấm sinh
tổng hợp enzym ngoại bào
33
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
40
2.1. Đối tượng nghiên cứu 40
2.1.1. Vật liệu để phân lập vi sinh vật và các chủng nấm kế thừa 40
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu xử lý 40
2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 41
2.1.4. Thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu 42
2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật 43
2.2.1.1. Phân lập chủng nấm 43
2.2.1.2. Phân lập xạ khuẩn 43
2.2.1.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao 43

6. 2.2.1.4. Nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trên các nguồn chất hữu cơ
vòng thơm khác nhau
43
2.2.2. Phân loại vi sinh vật 44
2.2.2.1. Phân loại VSV theo hình thái khuẩn lạc 44
2.2.2.2. Phân loại VSV theo phương pháp sinh học phân tử 44
2.2.3. Phương pháp hóa - sinh 45
2.2.3.1. Xác định hoạt tính laccase, laccase-like sử dụng ABTS 45
2.2.3.2. Tinh sạch, nhận diện protein của laccase, laccase-like 46
2.2.3.3. Xác định đặc tính protein của laccase, laccase-like tinh sạch 48
2.2.4. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm 49
2.2.4.1. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 49
2.2.4.2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi chủng nấm 51
2.2.5. Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 52
2.2.5.1. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng laccase thô 52
2.2.5.2. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng chủng nấm sinh tổng hợp
laccase
54
2.2.5.3. Phương pháp phân tích để xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 55
2.3. Phương pháp xử lý số liệu 55
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
57
3.1. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm và xạ khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp laccase, laccase-like
57
3.1.1. Phân lập và lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt tính laccase cao 57
3.1.2. Phân lập và phân loại xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trên môi trường
chứa chất diệt cỏ/dioxin và sinh tổng hợp laccase-like
60
3.1.2.1. Phân lập xạ khuẩn 60
3.1.2.2. Phân loại chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929 61
3.1.3. Môi trường để chủng nấm, chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase, laccase-like 64
3.1.3.1. Môi trường thích hợp để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase 64
3.1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp laccase-like của XKBHN1 và XKBiR929 trên môi
trường chứa các chất hữu cơ clo khác nhau
65
3.2. Đặc điểm hóa-lý của laccase, laccase-like tinh sạch 68
3.2.1. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 68
3.2.2. Tinh sạch laccase-like của xạ khuẩn Streptomycese sp. XKBiR929 70
3.2.3. Đặc tính hóa-lý của laccase và laccase-like tinh sạch 71
3.2.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến laccase tinh sạch 71
3.2.3.2. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch 78
3.2.3.3. Đặc tính hóa-lý của laccase thô 79
3.2.3.4. Đặc tính hóa - lý của laccase-like tinh sạch 81
3.3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin 84
3.3.1. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 84
3.3.1.1. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô của chủng nấm FBV40 84
3.3.1.2. Loại màu hoạt tính sử dụng trong quân đội bởi laccase thô 89
3.3.1.3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1 tinh sạch 96
3.3.1.4. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase-like tinh sạch của
chủng xạ khuẩn XKBiR929
97
3.3.2. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi Rigidoporus sp.FBV40 98

7. 3.3.2.1. Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải
may quân trang
98
3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau 101
3.3.2.3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose 102
3.3.2.4. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại đường khác nhau 103
3.3.2.5. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các nguồn nitơ khác nhau 106
3.3.3. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh tổng hợp laccase 108
3.3.3.1. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô 108
3.3.3.2. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase 112
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
123
TÀI LIỆU THAM KHẢO 124
PHỤ LỤC

8. Danh mục các chữ viết tắt
2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid
2,4,5-TCP 2,4,5-trichlorophenol
2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
2,4-DCP 2,4-dichlorophenol
ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
BH Sân bay Biên Hòa
CDD Chất diệt cỏ chứa dioxin
CGK Chất gắn kết
DBF Dibenzofuran
DCĐ Dịch chiết đất
DD Dibenzo-p-dioxin
DBP Dibromophenol
đtg Đồng tác giả
HBT 1-Hydroxybenzotriazole
HCHC Hợp chất hữu cơ
LiP Lignin peroxidase
LMCO Laccase multicopper oxidase
MN.FBN Megafix navy FBN
MnP Mangan peroxidase
MR.EBR Megafix red EBR
MT.BES Megafix turquoise BES
MY.BES Megafix yellow BES
MY.EG Megafix yellow EG
MCDD Mono chlorodibenzo-p-dioxin
NN.SG Nova navy SG
NY.FN2R Nova yellow RN2R
NY.S3R Nova yellow S3R
NY1 acid red 299
NY5 acid blue 281
NY7 acid red 266
PAH Polycyclic Aromatic Hydrocacbon = hydrocacbon đa nhân
PCB Polychlorinatedbiphenyl
PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxin
PCDFs Polychlorinated dibenzofuran
POPs Các hợp chất hữu cơ khó phân hủy
ppm Parts per million (mg/kg)
ppt Parts per trillion (ng/kg)
RBBR Remazol Brilliant Blue R
TBP Tribromophenol
VA Valli anilin
ViO Violuric acid
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật

9. Danh mục bảng
Bảng Tên bảng Trang
Bảng 1.1
Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ
vòng thơm
9
Bảng 1.2
Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy PAH, thuốc
bảo vệ thực vật ở Việt Nam
10
Bảng 1.3 Ứng dụng của laccase trong phân hủy các chất hữu cơ có clo 12
Bảng 1.4 Phân loại màu và tính chất các màu thuốc nhuộm 17
Bảng 1.5 Các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm 20
Bảng 1.6
Ứng dụng của laccase trong phân hủy sinh học thuốc
nhuộm
23
Bảng 1.7 Các công nghệ có thể xử lý đất, trầm tích ô nhiễm dioxin 30
Bảng 1.8 Phân hủy các đồng loại dioxin bởi nấm đảm 36
Bảng 2.1
Tổng hợp các thực nghiệm nghiên cứu loại màu thuốc
nhuộm bởi laccase, laccase-like
49
Bảng 2.2
Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi nấm đảm
sinh tổng hợp laccase
52
Bảng 3.1 Đặc điểm mẫu nấm đã phân lập được 58
Bảng 3.2 Hoạt tính laccase-like của các chủng xạ khuẩn 61
Bảng 3.3
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hai chủng xạ khuẩn XKBHN1
và XKBiR929
61
Bảng 3.4
Ảnh hưởng của chất ức chế lên hoạt tính Lac1, Lac2 của
FBV40
75
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính Lac1 và Lac2 76
Bảng 3.6 Quan hệ giữa nồng độ ABTS với hoạt tính laccase tinh sạch 78
Bảng 3.7
Các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới hoạt tính laccase thô
của FBV40
79
Bảng 3.8
So sánh hiệu suất loại màu thuốc nhuộm sử dụng laccase từ
FBV40 và các chủng nấm đảm khác
87
Bảng 3.9
Hiệu suất loại màu thuốc nhuộm và biến động hoạt tính
laccase theo thời gian (%)
89
Bảng 3.10
Biến động hoạt tính laccase trong quá trình loại màu thuốc
nhuộm MN.FBN bởi FBV40 trong môi trường chứa các
loại đường khác nhau
104
Bảng 3.11
Khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết bằng laccase thô chủng
FBV40
109
Bảng 3.12
Khả năng phân hủy chất diệt cỏ và các chất ô nhiễm khác
bằng laccase thô
110
Bảng 3.13
Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất ô nhiễm bởi chủng
FBV40
112
Bảng 3.14
Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất bởi đơn chủng
FBV40 và hỗn hợp chủng FBV40, FBD154 và FNBLa1
113
Bảng 3.15
Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi đơn chủng và hỗn hợp
chủng
117

10. Danh mục hình
Hình Tên hình Trang
Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc không gian ba chiều của laccase 5
Hình 1.2
Cơ chế giả định sự phân hủy 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo)
benzenesulfonic Acid bởi laccase
22
Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện nghiên cứu 42
Hình 3.1
Hỉnh ảnh sợi, bào tử dưới kính hiển vị điện tử và ảnh phân lập
mặt trước, mặt sau của chủng FBV40
58
Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loài chủng nấm FBV40 60
Hình 3.3.
Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử chủng XKBHN1
(A, C) và chủng XKBiR929 (B, D)
62
Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loài 2 chủng XKBHN1 và XKBiR929 63
Hình 3.5 Hoạt tính laccase thô chủng FBV40 ở các môi trường nuôi cấy 65
Hình 3.6 Khả năng sinh tổng hợp laccase-like theo thời gian 67
Hình 3.7 Hoạt tính laccase tinh sạch của chủng FBV40 69
Hình 3.8 Diện di protein chủng FBV40 69
Hình 3.9 Hoạt tính laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929 70
Hình 3.10 Phản ứng oxy hóa của laccase-like tinh sạch với ABTS 71
Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH lên Lac 1, Lac 2/FBV40 72
Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ bền nhiệt lên hoạt tính 73
Hình 3.13 Cơ chất đặc hiệu đối với Lac1 (A) và Lac 2 (B) 74
Hình 3.14
Ảnh hưởng của chất ức chế lên Lac 1 (A), Lac 2 (B) của
chủng FBV40
76
Hình 3.15 Ảnh hưởng của ion kim loại lên Lac 1, Lac 2/FBV40 77
Hình 3.16
Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất với hoạt tính Lac1 (A) và
Lac2 (B)
78
Hình 3.17
Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền pH (B); ảnh
hưởng của nhiệt độ (C, D); động học xúc tác (E, G) và ảnh
hưởng của chất ức chế và ion kim loại (H, K) lên hoạt tính
laccase thô của chủng FBV40
81
Hình 3.18
Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính (A) và độ bền (B); động học
xúc tác (C, D) và ảnh hưởng của chất ức chế (E) và ion kim
loại (G) lên laccase-like tinh sạch của XKBiR929
82
Hình 3.19
Khả năng loại màu NY1 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase
theo thời gian (B)
85
Hình 3.20
Khả năng loại màu NY5 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase
theo thời gian (B)
85
Hình 3.21
Khả năng loại màu NY7 (A) và sự thay đổi hoạt tính laccase
theo thời gian (B)
86
Hình 3.22
Phổ UV-Vis và hình ảnh loại màu một số thuốc nhuộm hoạt
tính thương mại của Nhà máy X20/TCHC
91
Hình 3.23
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt ViO ở
các nồng độ khác nhau
93
Hình 3.24
Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với
thuốc nhuộm MN.FBN
95
Hình 3.25 Khả năng loại màu và hoạt tính laccase theo thời gian đối với 95

11. Hình Tên hình Trang
thuốc nhuộm NN.SG
Hình 3.26
Khả năng loại màu và thay đổi hoạt tính laccase theo thời gian
loại màu MN.FBN khi có mặt D-glucose
96
Hình 3.27 Loại màu MN.FBN bởi Lac1 97
Hình 3.28
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng laccase-like
của chủng XKBiR929
97
Hình 3.29
Khả năng loại màu và sự biến động hoạt tính laccase theo thời
gian trong loại màu thuốc nhuộm MY.EG, MY. BES,
MN.FBN
99
Hình 3.30
Phổ UV-Vis của thuốc nhuộm MN.FBN sau khi nuôi cấy
bằng FBV40 sau 1 ngày (A) và sau 4 ngày (B)
100
Hình 3.31
Khả năng loại màu MN.FBN bằng chủng FBV40 sau 1 ngày
(A) và sau 4 ngày nuôi cấy (B)
100
Hình 3.32
Khả năng loại màu MN.FBN và hoạt tính laccase của chủng
FBV40
101
Hình 3.33
Sự thay đổi màu MN.FBN bằng chủng FBV40 ở các nồng độ
thuốc nhuộm 50, 100 và 200 mg/L sau 1 ngày (A), 2 ngày (B)
và sau 3 ngày (C)
102
Hình 3.34
Khả năng loại màu bằng chủng FBV40 với nồng độ D-glucose
khác nhau
102
Hình 3.35
Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng chủng FBV 40 (A) và
hoạt tính laccase (B) theo thời gian trong môi trường nuôi
cấy chứa các loại đường khác nhau
104
Hình 3.36
Phổ UV-Vis của màu thuốc nhuộm MN.FBN được loại bằng
chủng FBV40 trong môi trường chứa các loại đường sau 4
ngày nuôi cấy
104
Hình 3.37
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV40
trong môi trường chứa các loại đường khác nhau sau 2 ngày
(A), 3 ngày (B) và sau 7 ngày (C)
105
Hình 3.38
Khả năng loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV
40 (A) và hoạt tính laccase (B) theo thời gian khi sử dụng các
hợp chất chứa nitơ
106
Hình 3.39 Hoạt tính laccase theo thời gian xử lý DCĐ 109
Hình 3.40
Hàm lượng và hiệu suất phân hủy 2,4,5-T (A), hoạt tính laccase
thô theo thời gian (B)
110
Hình 3.41
Hiệu suất phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động hoạt
tính laccase thô theo thời gian (B)
111
Hình 3.42
Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự thay đổi hoạt
tính laccase thô theo thời gian (B)
113
Hình 3.43
Khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến
động hoạt tính laccase thô theo thời gian (B)
114
Hình 3.44
Khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD (A) và quá trinh sinh tổng
hợp laccase theo thời gian (B)
116

12. 1
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, ô nhiễm bởi các loại hóa chất trong đó có các chất
hữu cơ khó phân hủy (POPs) do con người tạo ra ngày càng được phát hiện nhiều, mức
độ ngày càng nghiêm trọng và hậu quả gây nên rất nhiều hệ lụy cho sức khỏe con
người, môi trường và hệ sinh thái. Các chất gây ô nhiễm môi trường phổ biến trong
nước thải công nghiệp hiện nay ở Việt Nam gồm các hợp chất của phenol, các hợp chất
đa vòng thơm chứa halogen và thuốc nhuộm, v.v. Ở các nước đang phát triển như Việt
Nam, việc sử dụng và xả thải hóa chất trong nông nghiệp, công nghiệp, y dược và các
ngành sản xuất khác không có khả năng kiểm soát đã gây nên những hậu quả nghiêm
trọng với môi trường và con người. Nhiều chất ô nhiễm được thải ra môi trường có độc
tính cao, thời gian bán hủy dài, khả năng tích lũy cao ở các dạng khác nhau trong hệ
sinh thái dẫn đến giảm đa dạng sinh học và xuất hiện nhiều loại bệnh hiểm nghèo.
Ngoài ra, ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật, các chất diệt cỏ chứa dioxin có nguồn gốc từ
chiến tranh hoặc nước thải ngành dệt nhuộm vẫn hàng ngày âm thầm gây tác động lớn
tới môi trường và sức khỏe con người. Những chất ô nhiễm này đều là những chất rất
bền vững và khó bị phân hủy bằng các công nghệ, giải pháp đơn giản nên để tiến tới xử
lý triệt để ô nhiễm cần tính tới các giải pháp tích hợp các công nghệ, giải pháp để xử lý
và quản lý bền vững. Với các thành tựu khoa học công nghệ ngày càng được nâng cao
và hướng tiếp cận sử dụng tổ hợp các chuỗi công nghệ, giải pháp thì khả năng xử lý
triệt để hoàn toàn các chất ô nhiễm trên ngày càng có tính khả thi cao hơn.
Đến nay, di chứng của dioxin tới nạn nhân chất độc màu da cam đã đến thế hệ
thứ 4. Trong hai thập kỷ qua các nghiên cứu ở quy mô khác nhau đều nhằm tìm kiếm
các công nghệ khả thi để xử lý khử độc ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong môi trường
phù hợp với điều kiện Việt Nam. Nhiều nghiên cứu từ năm 1999 trong phòng thí
nghiệm, quy mô pilot và hiện trường sử dụng công nghệ phân hủy sinh học
(bioremediation) đã chứng minh là một trong các giải pháp có hiệu quả cao về công
nghệ, kinh tế và môi trường. Ở quy mô hiện trường, sử dụng công nghệ phân hủy sinh
học đã xử lý hoàn toàn 3.384m3
đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, kết quả đã được Hội
đồng khoa học độc lập cấp Nhà nước của Bộ Khoa học và Công nghệ đánh giá, sau 40
tháng xử lý tổng độ độc trung bình trong các lô xử lý sinh học tại sân bay Biên Hòa chỉ
còn 14,12 ngTEQ/kg đất khô (99,6% độ độc đã bị loại bỏ), thấp dưới ngưỡng quy định
cho đất sử dụng trồng cây hàng năm theo QCVN45:2012 (40 ng TEQ/kg) [29].

13. 2
Cho đến thời điểm này, chưa có thông báo nào liên quan đến xử lý chất diệt
cỏ/dioxin ở các quy mô khác nhau bằng các vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào,
enzyme thô do chúng sinh ra nói chung và laccase nói riêng. Trong khi đó, Việt Nam
là một nước nhiệt đới có đa dạng sinh học cao nằm trong top 10 của thế giới, đặc biệt
là đa dạng vi sinh vật. Có nhiều loài vi sinh vật sinh tổng hợp các loại enzyme khác
nhau, trong đó có hai họ oxidoreductase và peroxidase với nhiều ứng dụng mang hiệu
quả cao trong các lĩnh vực kinh tế, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.
Laccase thuộc nhóm oxidoreductase có khả năng hoạt động mạnh chỉ cần oxy tự do
để oxy hóa nhiều loại hợp chất hữu cơ vòng thơm trong thời gian ngắn. Chúng đã trở
thành tâm điểm của nhiều nghiên cứu sàng lọc, sản xuất công nghiệp của hàng trăm
phòng thí nghiệm và công ty trên toàn thế giới.
Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu của nghiên cứu sinh với tên “Nghiên cứu khả
năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh
vật sinh enzyme laccase” đã được tiến hành với mục đích tìm kiếm các chủng vi sinh
vật có khả năng sinh tổng hợp laccase, laccase-like để có thể sử dụng trong phân hủy
các chất ô nhiễm đa vòng thơm chứa và không chứa clo, cụ thể là hỗn hợp chất diệt
cỏ/dioxin và thuốc nhuộm hoạt tính. Kết quả thu được sẽ giúp chúng ta hiểu sâu sắc
thêm về tiềm năng của laccase, laccase-like và bản thân chủng vi sinh vật sinh tổng
hợp chúng nhằm hướng tới nghiên cứu tạo công nghệ khả thi để xử lý các chất ô
nhiễm hữu cơ tồn tại trong môi trường.
Mục tiêu:
- Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh laccase, laccase-like từ khu vực
rừng Quốc gia Ba Vì, trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa;
- Đánh giá khả năng phân hủy các chất diệt cỏ chứa dioxin và loại màu thuốc
nhuộm hoạt tính bởi laccase, laccase-like và chủng VSV được lựa chọn nhằm định
hướng áp dụng trong hoạt động quốc phòng.
Nội dung chính của luận án cần thực hiện:
 Phân lập, phân loại nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh laccase và laccase-like có tiềm
năng cao từ khu vực rừng Quốc gia Ba Vì và đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin
khu vực Z1 và khu vực mới Tây Nam (Pacer Ivy) sân bay Biên Hòa, Đồng Nai;
 Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm, xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp laccase, laccase-like cao;

14. 3
 Chiết tách và tinh sạch laccase, laccase-like từ đại diện nấm, xạ khuẩn có hoạt
tính enzyme cao đã được phân lập;
 Nghiên cứu đặc tính hóa-lý, hóa-sinh cơ bản của laccase, laccase-like tinh sạch;
 Đánh giá hiệu suất loại màu thuốc nhuộm tổng hợp, thuốc nhuộm hoạt tính bởi
laccase, laccase-like và bản thân chủng VSV sinh tổng hợp laccase, laccase-like;
 Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T tinh khiết và có
trong đất ô nhiễm (dịch chiết đất -DCĐ) tại sân bay Biên Hòa bởi laccase,
đơn chủng và hỗn hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;
 Đánh giá hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng và hỗn
hợp chủng nấm sinh tổng hợp laccase;
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Công trình đầu tiên nghiên cứu tinh sạch và đặc tính laccase-like được sinh
tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBiR929 và khả năng của laccase-like
trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại MN.FBN;
2. Chứng minh được nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 có hoạt tính laccase
thô lên tới 107.708 U/L và tiềm năng cao trong loại màu thuốc nhuộm tổng hợp gốc
azo, anthraquinone và đặc biệt là màu thuốc nhuộm thương mại được sử dụng trong
quân đội;
3. Khẳng định nấm đảm Rigidoporus sp. FBV40 đồng thời có khả năng phân
hủy được các chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T và đồng loại độc nhất của dioxin là
2,3,7,8-TCDD. Bên cạnh đó, đã làm sáng tỏ hỗn hợp các loài nấm khác nhau (nấm
đảm và nấm sợi) có khả năng sinh tổng hợp laccase phân lập từ thiên nhiên Việt Nam
không chỉ phân hủy được 2,4-D, 2,4,5-T mà còn phân hủy được cả đồng loại 2,3,7,8-
TCDD đạt hiệu suất cao hơn gấp 2 lần khi chỉ sử dụng đơn chủng với tổng độ độc ban
đầu tới 2000 ng TEQ/L;
Hy vọng với kết quả ban đầu của công trình nghiên cứu này sẽ góp phần định
hướng tiếp cận trong triển khai các nghiên cứu tiếp theo, để sáng tạo nên các chuỗi
công nghệ mang tính đột phá trong sử dụng hỗn hợp vi sinh vật và các chất có hoạt tính
sinh học do chúng sinh tổng hợp như laccase, laccase-like đều có tiềm năng cao để giải
quyết vấn đề ô nhiễm màu thuốc nhuộm trong hoạt động quốc phòng và xử lý các chất
ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy (POPs) trong đó có chất diệt cỏ chứa dioxin.

15. 4
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like
1.1.1. Giới thiệu chung về laccase
Laccase ngày càng được quan tâm nhiều hơn trong những năm gần đây do
tiềm năng của chúng trong việc phân hủy, khử độc các chất ô nhiễm là các hợp chất
của phenol và các chất đa vòng thơm [142]. Laccase thuộc nhóm oxidoreductase là
một trong số ít các enzyme đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19. Năm 1883,
Yoshida là người đầu tiên mô tả laccase từ dịch chiết thân cây Rhus vernicifera ở
Nhật Bản [52]. Laccase có hiệu quả oxy hóa với phổ cơ chất rộng và do chỉ sử dụng
oxy là tác nhân nhận điện tử cuối cùng nên nó được áp dụng trong nhiều ngành
công nghiệp với những mục đích khác nhau như dệt nhuộm, chế biến thức ăn, nhiên
liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ, xử lý môi trường, giấy và nước thải, dược phẩm và
công nghiệp mỹ phẩm. Thực tế, đã có một số sản phẩm laccase thương mại để ứng
dụng trong các lĩnh vực chế biến thức ăn, giấy, dệt nhuộm và các ngành công
nghiệp khác [89, 155].
1.1.1.1. Cấu trúc phân tử của laccase
Một loài sinh vật có thể sinh tổng hợp có nhiều loại laccase khác nhau (các
isozyme) và các isozyme thường khác nhau về trình tự axit amin và tính chất động
học xúc tác. Isozyme laccase khác nhau ở mức độ glycosyl hóa và thành phần các
gốc carbonhydrat. Loài nấm đảm Trametes versicolor có 5 loại isozyme chỉ khác
nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrat của chúng thay đổi từ
10-45% so với khối lượng của protein. Phân tử laccase có khối lượng phân tử dao
động trong khoảng 60-100 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là
glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10-25% [72].
Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4
nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: loại 1 (T1),
loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế
điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ
điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện
tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh.

16. 5
Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc 3 chiều của laccase (A) của chủng Bacillus subtilis 168.
Ion màu xanh là 4 nguyên tử đồng. (B) số lượng nghiên cứu công bố về các loại
enzyme trong giai đoạn 1940 - 2013 [9]
Cấu trúc 3 chiều của laccase bao gồm 3 tiểu phần (vùng A: màu đỏ, vùng B:
màu vàng và vùng C: màu xanh lá cây) có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần
đều đóng vai trò trong quá trình xúc tác. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng
B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử
đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [147]. Trung tâm đồng một chỉ chứa
một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc
cystein. Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng
hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh
nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp
nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi
các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.1) [99].
1.1.1.2. Cơ chế xúc tác của laccase
Cơ chất khi bị oxy hóa bởi laccase sẽ nhường một electron cho nguyên tử
đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 trở thành dạng Cu+
, hình thành phân tử laccase có
cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+
). Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase
dạng khử, thông qua hợp chất trung gian peroxy và peroxy bị khử thành nước. Một số
nhà nghiên cứu cho rằng, sự oxy hóa hợp chất peroxy trung gian hình thành laccase ở
trạng thái bị oxy hoạt hóa, trong đó cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái oxy hóa.
Sau đó, enzyme nhanh chóng tham gia vào chu trình xúc tác mới [99].
Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể diễn ra theo cách khác đó là khi các cơ chất bị
oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm. Các phân

17. 6
tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế oxi hóa khử quá lớn, vì vậy
chúng không thể tiếp cận được trung tâm xúc tác của laccase. Trong trường hợp này
cần một chất gắn kết (mediator) hoặc hệ chất gắn kết để tiếp xúc với trung tâm phản
ứng của laccase để bị laccase oxy hóa, sau đó mediator ở dạng oxy hóa nhận một điện
tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác [117]. Ngược
lại, laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy
hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục tham gia vào chu trình xúc tác tiếp theo. Các
mediator thường phù hợp cho laccase là 3-hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2’
-
azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic axit) (ABTS), N-hydroxybenzo-
trialzone (HOBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (ViO) v.v. Sự có mặt của
mediator đã góp phần làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất
của laccase.
1.1.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của laccase
Đến nay, đã có khoảng 100 loại laccase khác nhau đã được tinh sạch và xác
định đặc điểm sinh hóa với các cơ chất là ABTS, 2,6-DMP và SGZ. Gene laccase
đặc biệt mã hoá cho một protein khoảng 500 - 600 amino acid và trọng lượng phân
tử trong khoảng 60 đến 90 kDa khi được xác định bằng SDS-PAGE [156]. Đến
tháng 9 năm 2017, có khoảng 112.000 kết quả tra cứu các tiêu đề bài báo khoa học
có từ khóa laccase (https://scholar.google.com.vn).
Đã có một vài hệ gene của các chủng nấm có chứa hơn một gene laccase [36].
Mức độ biểu hiện của các gene điển hình khác nhau phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy
[145]. Với hàm lượng nitơ cao trong môi trường đã giảm sự dịch mã của gene laccase
trong chủng Basidiomycete sp. I-62 (CECT 20197) và loài Pleurotus sajorcaju [18].
Có nhiều bước được sử dụng trong quá trình tinh sạch protein laccase như siêu lọc
(lọc thẩm thấu màng), kết tủa với amoni sulfat hoặc với dung môi hữu cơ và trao đổi ion
cũng như sắc ký khối lượng. Laccase đại diện của nấm là các protein có khối lượng trong
khoảng 50 đến 90 kDa, điểm đẳng điện xung quanh giá trị 4.0. Một số loài nấm sinh tổng
hợp laccase đã được nghiên cứu bao gồm Coprinus plicatilis, Fomes fomentarius,
Heterobasidion annosum, Hypholoma fasciculare, Kuehneromyces mutabilis, Leptoporus
litschaueri, Panus stipticus, Phellinus igniarius, Pleurotus corticatus, P. ostreatus,
Polyporus brumalis, Stereum hirsutum, Trametes gibbosa, T. hirsuta, và T. versicolor có
hơn một isozyme và điểm đẳng điện (pI) trong khoảng từ 3 đến 5 [4].

18. 7
Khả năng xúc tác của enzyme đã được mô tả thông qua định lượng bằng hằng
số Michaelics Km và hằng số hiệu quả xúc tác Kcat. Những hằng số này đã được công
bố với một lượng lớn laccase và có sự khác biệt trong số chúng. Hằng số Km của
laccase nhìn chung dao động xung quanh giá trị 2,5 𝜇M phụ thuộc vào nguồn gốc
enzyme và cơ chất. Giá trị Km của laccase được xác định với cơ chất là 2,6-
dimethoxyphenol nhìn chung là cao hơn khi xác định với syringadazine (sự trùng hợp
của hai phân tử là 2,6-dimethoxyphenol được liên kết với nhau bằng cầu azide) [117].
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và các điều kiện nhiệt độ lên hoạt tính
laccase đã được thực hiện. Theo đó, sự biến động hoạt tính của laccase theo pH
thường có hình chuông và khoảng tối ưu xung quanh giá trị 4,6 khi sử dụng cơ
chất có nguồn gốc phenol [139]. Hoạt tính laccase giảm trong điều kiện pH trung
tính hoặc kiềm là do tăng anion - OH, anion này có kích thước nhỏ nên là tác
nhân gây ức chế hoạt tính của laccase. Khi pH tăng thế khử của cơ chất có bản
chất phenol giảm dẫn đến cơ chất này nhạy cảm hơn với quá trình oxy hoá bởi
laccase [47, 48]. Sự ổn định hoạt tính laccase đối với pH nhìn chung trong
khoảng từ 8-9 [175] và sự ổn định hoạt tính của laccase theo nhiệt độ thay đổi
phụ thuộc lớn vào nguồn gốc vi sinh vật, nhìn chung nằm trong khoảng từ 30 đến
50o
C và hoạt tính giảm nhanh chóng ở nhiệt độ trên 60o
C [114, 94].
1.1.1.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase
Laccase từ thực vật được tìm thấy trong xylem nơi chúng có thể oxy hóa các
monoligno ở trạng thái ban đầu của quá trình lignin hóa và cũng tham gia trong các
cơ chế gốc cơ bản của sự hình thành lignin cao phân tử [79]. Thêm vào đó laccase
đã được nghiên cứu về khả năng tham gia vào bước đầu tiên của quá trình hàn gắn
vết thương trên lá [133]. Hiện tại, nghiên cứu về laccase thực vật bậc cao còn rất
hạn chế so với laccase từ các chủng nấm [113, 147].
Thực tế, một số nghiên cứu về hoạt tính laccase ở vi khuẩn không giống
laccase ở các nhóm nhân sơ [24]. Protein laccase của vi khuẩn là protein nội bào
hoặc ở khoang chu chất [4]. Chủng Bacillus subtilis đã sinh ra loại laccase CotA ổn
định nhiệt tham gia vào sự hình thành màu ở màng nội bào [88].
Laccase cũng đã được tìm thấy từ loài Streptomyces cyaneus [3] và S.
lavendulae. Laccase đã được nghiên cứu khá chi tiết ở nhiều chủng nấm thuộc nấm sợi
(Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes) và chúng đã được tinh sạch từ nhiều

19. 8
chủng khác nhau. Có nhiều nghiên cứu về sản phẩm laccase tinh sạch của các loài nấm
Ascomycetes như loài Melanocarpus albomyces [69], Cerrena unicolor [70],
Magnaporthe grisea [19], Trametes versicolor, Trichoderma reesei [81] và Xylaria
polymorpha [102].
Nấm men là nhóm riêng biệt có thể thuộc cả Ascomycetes và Basidiomycetes.
Hiện nay, laccase được tinh sạch từ chủng Cryptococcus (Filobasidiella)
neoformans gây bệnh cho người, chủng nấm men này sinh ra laccase thật có khả
năng oxy hóa phenol và aminophenol và cũng có thể oxy hóa tyrosine [34]. Ngoài
ra, laccase còn có thể tìm thấy trong một số côn trùng nơi mà chúng được cho là thể
kích hoạt quá trình hình thành biểu bì [35].
Ngày này, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu sàng lọc từ tự
nhiên các chủng nấm sinh tổng hợp laccase với mong muốn tìm được chủng có
hoạt tính cao và có đặc tính mới. Hoạt tính laccase thay đổi phụ thuộc vào các
loài, các chủng vi sinh vật, vì ở điều kiện tự nhiên hoạt tính laccase rất thấp.
Việc lựa chọn, sàng lọc các chủng có khả năng sinh tổng hợp laccase từ tự nhiên
là bước rất quan trọng sau đó là tối ưu các điều kiện môi trường nuôi cấy để
chúng sinh tổng hợp laccase cao hơn với các đặc tính vượt trội hơn [112].
1.1.1.5. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm
Ứng dụng của chủng nấm và enzyme trong xử lý các chất ô nhiễm môi trường
đã được nghiên cứu. Trong đó, laccase có khả năng phân hủy và khử độc có hiệu quả
các hợp chất hữu cơ khó phân hủy đã nhận được nhiều sự quan tâm trong lĩnh vực công
nghệ sinh học [16] và chúng cũng đã được sử dụng như các sensor sinh học trong quan
trắc, xử lý ô nhiễm môi trường trong các lĩnh vực công nghiệp dệt, thức ăn, xử lý gỗ,
dược và hoá chất [125].
Laccase có khoảng cơ chất đặc hiệu rộng nên có thể oxy hoá với phạm vi lớn
các chất độc sinh học ngoại lai bao gồm các hợp chất phenol có clo [151], thuốc trừ
sâu [120], các hợp chất hữu cơ đơn và đa vòng thơm được khai thác từ các nhiên
liệu hoá thạch [10].
Laccase tinh sạch từ loài Coriolopsis gallica oxy hoá carbozole, N-
ethylcarbozole, fluorine và dibenzothiophene khi có mặt 1-hydroxybenzotriazole và
2.2-azinobis (3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid như là một chất gắn kết [8].

20. 9
Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đã chứng minh rằng phenol và các
amin thơm có thể bị loại bỏ khỏi nước khi sử dụng laccase. Cơ chế của quá trình
này là sự oxy hoá của enzyme với các chất ô nhiễm thành các cấu tử tự do hoặc
quinone và sau đó là quá trình kết tủa từng phần [164].
Bảng 1.1. Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm
Hợp chất Nguồn gốc laccase Cơ chất Hình thức
Phenols
Chlorophenols,
cresols, nitrophenols
Laccase tái tổ hợp
Trametes sanguineus biểu
hiện trong
Trichoderma atroviride
- Nuôi cấy
Technical nonylphenol Phoma sp. UHH 5-1-03 SA Tự do
Oxybenzone,
pentachlorophenol
P. ostreatus
ABTS, HBT,
HPI,
TEMPO, SA,
Tự do
4-tert-butylphenol, 4-
tert-octylphenol
Laccase tái tổ hợp
Myceliophthora biểu hiện
trong Aspergillus oryzae
SA Nuôi cấy
2,4-dichlorophenol
Pycnoporus sanguineus
CS43
- Tự do
Các chất làm hỏng hệ miễn dịch
Bisphenol A (BPA)
Coriolopsis gallica,
Bjerkandera
adusta, T. versicolor
HBT Tự do
BPA
Laccase tái tổ hợp T.
sanguineus biểu hiện
trong T.atroviride
- Nuôi cấy
BPA
Laccase tái tổ hợp T.
versicolor biểu hiện trong
S.cerevisiae
ABTS Nuôi cấy
Các hợp chất hydrocarbon (PAHs)
15 loại PAHs (theo US
EPA)
Laccase tái tổ hợp B.
subtilis CotA biểu hiện
trong E. coli
ABTS Tự do
Naphthalene,
phenanthrene
T. versicolor (Sigma-
Aldrich)
-
Cố định lên
đất sét hoạt
tính
Benzo[a]pyrene,
phenanthrene
Laccase tái tổ hợp T.
sanguineus biểu hiện
trong T.atroviride
- Tự do
Laccase được tinh sạch từ chủng nấm đảm trắng Basidiomycete, Trametes
villosa có khả năng phân huỷ bisphenol A, đây là một chất gây biến đổi hệ nội tiết
[123]. Các chất phenol đang thu hút nhiều sự quan tâm vì khả năng gây tác động tới

21. 10
các hormon tự nhiên ở các động vật có xương sống. Chúng là sản phẩm từ sự phân
huỷ sinh học không triệt để của các nonylphenol polyethoxylates (NPEOs) được sử
dụng rộng rãi trong các chất hoạt động bề mặt không ion trong các quá trình công
nghiệp. Cả nonyphenol và NPEOs được thải vào môi trường chủ yếu từ quá trình xử
lý nước thải không triệt để [85]. Laccase từ các thực vật thuỷ sinh Clavariopsis
aquatica đã được chứng minh là có khả năng phân huỷ các chất nonylphenol gây
các triệu trứng thay đổi nội tiết tố [12]. Một số ứng dụng của laccase trong phân hủy
các hợp chất hữu cơ trên thế giới được trình bày ở Bảng 1.1 [173].
Như vậy có thể thấy có rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh về khả năng của
laccase được sinh tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật hay tái tổ hợp trong phân hủy
các hợp chất hữu cơ khác nhau với sự có mặt hay không có mặt của các chất gắn kết
và ở các dạng tồn tại tự do hoặc được cố định lên các loại vật liệu khác nhau. Qua
đó cho thấy sự đa dạng của chủng loại, cách thức sử dụng của laccase trong xử lý
các hợp chất hữu cơ.
Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về laccase và ứng dụng của nó
trong loại màu thuốc nhuộm và xử lý các hợp chất hữu cơ, các hợp chất của phenols.
Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy dịch chiết đất (DCĐ) ô nhiễm chất diệt
cỏ chứa chủ yếu đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD, PAH, thuốc bảo vệ thực vật thuộc
POPs từ một số công trình có liên quan được trình bày ở Bảng 1.2. Loại laccase được
sinh bởi các chủng liệt kê ở Bảng 1.2 đã thể hiện sự khác biệt so với laccase thật bởi
khi đun vài giờ chúng vẫn phân hủy được các chất hữu cơ đa vòng thơm. Những kết
quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng và khả năng rất cao của chủng vi sinh vật sinh tổng
hợp laccase từ thiên nhiên của Việt Nam trong việc xử lý các chất ô nhiễm có vòng
thơm.
Bảng 1.2. Khả năng sinh laccase và hiệu suất phân hủy PAH, thuốc bảo
vệ thực vật ở Việt Nam
STT Nghiên cứu Tham khảo
1
Vi khuẩn Achromobacter sp. BQNT2 được phân lập từ
nước thải chứa 1600 mg/L TNT. Chủng BQNT2 sinh
laccase với hoạt tính 15 U/L trên môi trường muối khoáng
chứa 100 mg/L TNT
Đặng Thị Cẩm
Hà et al., 2009
[30]
2
Nấm sợi Aspergillus sp. FNA33 phân lập từ đất đang xử
lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp các thuốc trừ sâu trong
bioreactor hiếu khí. Chủng nấm sợi này có khả năng sinh
Đặng Thị Cẩm
Hà et al., 2009
[31]

22. 11
STT Nghiên cứu Tham khảo
tổng hợp mangan peroxidase với hoạt tính 434,5 U/L và
laccase với hoạt tính 4,3 U/L trên môi trường muối
khoáng bổ sung 0,5% glucose và chứa 300 ppm HCH.
3
Nấm sợi Aspergillus sp. FNA1 được phân lập từ đất ô
nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu. Ngoài khả năng phân hủy
DDT, FNA1 còn sinh enzyme laccase với hoạt tính cao
nhất sau 1 ngày nuôi cấy là 1.608 U/L trên môi trường
Czapek nghèo bổ sung 0,2% Tween 80, ở pH 5, nhiệt độ
30°C, 0,1% NaCl và trên nguồn chất độc là DDT.
Đào Thị Ngọc
Ánh et al.,
2011
[32]
4
Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKDNP22 được phân lập
trong lô xử lý đất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Đà Nẵng.
Chủng XKDNP22 được nuôi trên môi trường GauseM 1/5
bổ sung 4g dịch chiết malt, DCĐ và 6 g/L KNO3 cho hoạt
tính laccase là 4.688 U/L
Nguyễn Thị
Lan Anh et al.,
2011
[109]
5
Nấm sợi Myrothecium sp. FNBLa1 phân lập từ rơm mục ở
Ninh Bình. Chủng FNBLa1 có khả năng sinh laccase cao
với hoạt tính là 30.016 U/L sau 96h ở pH 6,5, chất cảm ứng
là 0,1 mM CuSO4, 12 g/L glucose, hỗn hợp1 g/L casein và 3
g/L NaNO3. Hoạt tính laccase cao nhất khi nuôi cấy bằng
bioreactor có dung tích 15 lít là 10.410 U/L sau 57 giờ.
Trần Thị Thu
Hiền et al.,
2013
[152]
6
Nấm sợi Trichoderma sp. FCP3 phân lập từ rừng Quốc
gia Cúc Phương, sinh laccase hoạt tính là 2.000 U/L ở pH
5,5; chất cảm ứng là CuSO4, glucose, nguồn nitơ là hỗn
hợp KNO3 và NaNO3. Tế bào sống và dịch enzyme thô
của chủng FCP3 loại bỏ pyrene với hiệu suất 33% và
41%; anthracene với hiệu suất 41% và 54% (nồng độ ban
đầu mỗi chất là 100 mg/L).
Hoàng Thị
Nhung et al.,
2012
[58]
7
Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBH1 đã được phân lập từ đất
nhiễm chất diệt cỏ tại sân bay Biên Hòa. Sau 7 ngày nuôi
lắc, chủng này có khả năng phân hủy 72 % pyren; 48,3 %
anthracen trên môi trường KG và 63,3 % pyren; 55,8 %
anthracen trên môi trường SH1 với nồng độ ban đầu của
mỗi chất là 100 mg/L. Chủng này cũng sinh tổng hợp
laccase hoạt tính laccase cao nhất (1.073 U/L) trong môi
trường KG chứa veratryl alcohol nồng độ ban đầu 0,5 mM.
Nguyễn Quang
Huy et al.,
2012
[108]
8
Xạ khuẩn Streptomyces sp. XKBH13 phân lập từ đất nhiễm
chất diệt cỏ/dioxyn tại sân bay Biên Hòa. Trong môi trường
nuôi cấy chứa dịch chiết malt, 1 mM catechol và sử dụng
DCĐ ô nhiễm chứa dioxyn và các chất chứa clo khác làm
nguồn cacbon, XKBH13 sinh laccase cao nhất sau 24 giờ
với hoạt tính 3.747 U/L. Sau 7 ngày nuôi cấy, chủng
XKBH913 loại bỏ được 67,07% pyrene với nồng độ ban
Đàm Thúy
Hằng et al.,
2012
[28]

23. 12
STT Nghiên cứu Tham khảo
đầu lớn hơn 76 mg/L.
1.1.1.6. Khả năng của laccase phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm có clo
Độc tính, độ bền và khả năng bị phân hủy sinh học của các hợp chất clophenol
phụ thuộc vào số lượng và vị trí của nguyên tố clo trên vòng thơm. Các hợp chất clo
vòng thơm khó bị phân hủy hơn các hợp chất clo mạch thẳng và khả năng phân hủy
sinh học giảm khi số lượng nhóm clo tăng. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng loại
clo của enzyme là pH, nồng độ cơ chất ban đầu, lượng enzyme, thời gian phản ứng và
nhiệt độ. Laccase đã loại được 79,74% clo của 2,4,5-TCP ở các điều kiện tối ưu như
pH 5, nồng độ cơ chất là 400 µM, thời gian phản ứng là 30 phút, với lượng enzyme là
4ml và nhiệt độ phản ứng là 50ºC. Laccase của loài nấm Rhizoctonia praticola đã
được sử dụng để phân hủy các chất ô nhiễm phenolic như o-chlorophenol, p-
chlorophenol, 2,4-DCP, 2,4,5-TCP, 4-chloro-2-methylphenol. Tuy nhiên, độc tính
của p-chlorophenol và 2,4,5-TCP không giảm. Xử lý chất đa vòng thơm chứa clo
bằng laccase có thể không phải lúc nào cũng đạt hiệu quả triệt để, có thể laccase nên
được sử dụng để xử lý sau quá trình loại clo các hợp chất trên [73]. Khả năng phân
hủy các hợp chất vòng thơm chứa clo bởi laccase được trình bày ở Bảng 1.3 [173].
Bảng 1.3. Ứng dụng của laccase trong phân hủy các chất hữu cơ có clo
Hợp chất Nguồn gốc laccase Cơ chất Ở dạng
Thuốc trừ sâu
Atrazine P. ostreatus
ABTS, HBT,
HPI, TEMPO,
SA,VA, VAN
Tự do
Chlorpyrifos
Laccase tái tổ hợp từ
chủng vi khuẩn WD
biểu hiện trong
Pseudomonas putida
- Nuôi cấy
Atrazine, chlorothalonil,
chlorpyrifos,
isoproturon, pyrimethani
T. versicolor
ABTS, AS,
guaiacol,
HBT, SA,
VA, VAN
Tự do
Atrazine, isoproturon
Laccase tái tổ hợp từ
chủng O. sativa biểu
hiện trong P.pastoris
-
Trong quá
trình nuôi
cấy
Ametryn, atrazine,
clofibric acid, fenoprop,
pentachlorophenol,
propoxur
Laccase tái tổ hợp từ
chủng M. thermophila
biểu hiện trong
Aspergillus oryzae
SA
Cố định
lên màng

24. 13
Chú thích: (Tự do) - Là hình thức enzyme được sử dụng ở trạng thái dung dịch;
(Cố định) - Là hình thức enzyme được cố định lên các loại vật liệu; (Trong quá trình nuôi
cấy) - Enzyme được hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.
Kết quả từ các nghiên cứu trong và ngoài nước được trình bày ở trên cho
thấy khả năng phân hủy các chất vòng thơm có clo (các thuốc trừ sâu) bởi laccase
tái tổ hợp, laccase tự nhiên từ chủng nấm, vi khuẩn và ở các dạng tồn tại khác nhau,
bên cạnh đó là vai trò của chất gắn kết phù hợp với từng loại laccase.
Nhận xét:
Tổng quan tài liệu liên quan đến laccase và các ứng dụng cho thấy, laccase là
đối tượng đã được nghiên cứu khá chi tiết trên các phương diện: vi sinh vật sinh
tổng hợp laccase, cấu tạo phân tử, cơ chế hoạt động xúc tác, nghiên cứu phân tử về
gene, protein và đặc điểm hóa - lý của laccase.
Đến thời điểm hiện nay, có ít công trình sử dụng tổ hợp của nhiều chủng vi
sinh vật sinh tổng hợp laccase trong xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy vì
việc lựa chọn được tổ hợp của nhiều vi sinh vật sinh tổng hợp laccase có khả năng
cao không đơn giản và nghiên cứu đòi hỏi nhiều công sức. Đây là cơ hội cho các
nghiên cứu nhằm tìm kiếm công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường do nước thải dệt
nhuộm và chất diệt cỏ/dioxin gây ra. Các nghiên cứu về khả năng của laccase cần tiếp
tục thực hiện để bổ sung cơ sở khoa học, cơ sở dữ liệu về mức độ đa dạng của chủng
vi sinh vật sinh tổng hợp laccase và tiềm năng ứng dụng theo phân bố của Việt Nam.
1.1.2. Giới thiệu về laccase-like
Laccase là các enzyme oxy hóa 3 thành phần có chứa đồng, enzyme này có
thể lấy một điện tử của 4 phân tử cơ chất và khử oxy nguyên tử thành nước. Ngày
nay, có nhiều enzyme đã được xác định có cấu tạo và cơ chế hoạt động sử dụng oxy
giống laccase nhưng nó không thể hiện cơ chất đặc hiệu hướng tới quá trình
benzendiol (quá trình gắn gốc OH vào vòng benzen). Những enzyme này thường có
hoạt tính không ổn định và không dễ để phân loại vì việc phân loại laccase thường
dựa trên loại phản ứng hóa học và tính chất vật lý của cơ chất, nên thuật ngữ oxy
hóa laccase-like đa nhân chứa đồng đã được đề xuất (laccase multicopper oxidase-
LMCO) [128].
Cấu trúc phân tử của laccase-like (LMCO) đã được nghiên cứu bởi
Messerschmidt và cộng sự trong rất nhiều công bố từ năm 1989 đến 1993 [91]. Tới
tháng 7 năm 2014 đã có khoảng 30 cấu trúc tinh thể laccase-like khác nhau đã được

25. 14
đăng ký trong ngân hàng protein trong đó có cấu trúc laccase của loài B. subtills CotA.
Tuy nhiên, cấu trúc phân tử laccase-like này vẫn có bản chất là protein. Laccase-like
thường ổn định nhiệt độ với nhiệt độ phản ứng tối ưu trên 450
C, có thể kể đến laccase-
like được sinh tổng hợp từ Pycnoporus cinnabarinus khi ủ ở 2h ở nhiệt độ 800
C thì
hoạt tính giảm đi một nửa và khi ủ ở 370
C sau 245 ngày vẫn còn hoạt tính [9].
Gần đây việc nghiên cứu ứng dụng các hoạt chất sinh học được sinh tổng
hợp bởi chủng nấm trên toàn thế giới để ứng dụng trong công nghiệp chế biến thức
ăn và dược phẩm ngày càng được tăng lên, các sản phẩm này đã trở thành lĩnh vực
quan trọng của công nghệ sinh học hiện nay. Các hoạt chất này là các protein,
polysacharide hoặc hỗn hợp polysacharide và protein có nguồn gốc nội và ngoại
bào có khối lượng phân tử thấp (LMS Low Molecular Weight). Khi phân tích thành
phần hóa học của các chất này thì thấy có sự xuất hiện của các loại đường và các
hợp chất phenolic. Trong quá trình nuôi cấy chủng Cerena unicolor trên môi trường
lỏng phát hiện thấy hoạt chất có khối lượng phân tử thấp khoảng 10kDa, chất này có
tính oxy hóa mạnh, bằng hoặc cao hơn khi so sánh với trolox và ascorbic acid.
Một số nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả quá trình phân hủy sinh học
lignin không cao nếu chỉ có vai trò enzyme thuộc họ lignin, mà ở đó có sự tham gia
của một số hoạt chất có kích thước nhỏ có khả năng thể khuếch và đóng vai trò khởi
động quá trình phân hủy lignin. Glycopeptides có khối lượng 1 đến 5 kDa được sinh
tổng hợp từ chủng Phanerochaete chrysosporium, gọi là tác nhân Pc, chất này có
thể xúc tác phản ứng khử để tạo thành gốc OH*
và khử Fe3+
thành Fe2+
. Hiện nay,
những nghiên cứu về mối quan hệ giữa tác nhân Pc với các enzyme ligninolytic và
vai trò trong quá trình phân hủy lignin đang được tiếp tục nghiên cứu [93]. Quá
trình tinh sạch tác nhân Pc được thực hiện như sau: dịch enzyme ngoại bào thô của
chủng P. Chrysosporium ME-446 ATCC 34541 được siêu lọc qua màng 5 kDa, các
thành phần sau quá trình lọc được tinh sạch qua cột Sephadex G-10, sau đó được
tinh sạch tiếp theo qua thiết bị HPLC TSK với cột GEL G2500PW. Sau đó tác nhân
Pc tinh sạch được xác định cấu trúc với hàng loạt peptides bằng phương pháp
MALDI-TOF cũng như phân tích acid amin. Qua đó khối lượng phân tử của tác
nhân Pc được xác định trong khoảng 0,5 đến 1,0 kDa [93].
Tác nhân Pc của loài P. Chrysosporium có thể oxy hóa chất 2,6-DMP mà
không có sự tham gia của Mn2+
và H2O2 trong khi MnP được sinh tổng hợp bởi

26. 15
chủng này thì không thể oxy hóa được 2,6-DMP nếu không có Mn2+
và H2O2. Phần
hoạt tính này của chủng P. Chrysosporium có khối lượng phân tử dưới 5 kDa,
chứng tỏ vai trò trong phản ứng oxy hóa của các chất trao đổi chất từ loài P.
Chrysosporium không chỉ là MnP hoặc laccase [59].
Tác nhân Pc có thể oxy hóa 2,6-DMP ở nhiệt độ trong khoảng từ 30 đến
800
C và nó rất bền nhiệt, nó có thể không mất hoạt tính nếu đun ở 1000
C trong 30
phút, tính chất này là rất khác so với enzyme. Tác nhân Pc có hoạt tính oxy hóa
trong môi trường pH khoảng từ 3-9 và hoạt tính vẫn duy trì ổn định trong khoảng
pH kiềm yếu. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại, theo đó hoạt tính oxy
hóa của tác nhân Pc được tăng lên khi có mặt các ion Cu2+
, Mn2+
, Co2+
và Fe2+
và
nồng độ của các cation này ảnh hưởng lên hoạt tính của tác nhân Pc là khác nhau.
Theo đó ở nồng độ rất thấp ion Cu2+
và Fe2+
thì làm tăng hoạt tính của tác nhân Pc,
nhưng khi nồng độ tăng lên thì gây ức chế hoạt tính của nó [59].
Theo một nghiên cứu khác, một loại peptide đặc biệt có khối lượng phân tử
thấp được đặt tên là tác nhân Gt được phân lập và tinh sạch từ dịch chiết nuôi cấy
loài nấm nâu Gloeophyllum trabeum trên thiết bị HPLC. Tác nhân này có ái lực cao
và khả năng tạo phức với Fe3+
và khử Fe2+
. Khi có oxy phân tử nó có thể tạo thành
OH*
. Tác nhân Gt có thể bẻ gãy liên kết hydro bên trong và bên ngoài chuỗi
cellulose bằng cơ chế liên kết của gốc OH*
, kết quả tạo thành các sản phẩm khử,
không khử và làm cho cellulose dễ bị phân hủy hơn ở các giai đoạn tiếp theo. Quá
trình này tương đối khác với quá trình thủy phân bởi các enzyme cellulase và tác
nhân Gt này đóng vai trò Như vậy, các tác nhân Gt, Pc được đặt tên xuất phát từ tên
của loài nấm sinh tổng hợp ra nó. Ngoài ra, còn có tác nhân SFGF được sinh tổng
hợp trong quá trình hình thành sợi nấm, tác nhân này có một số tính chất giống tác
nhân Pc và Gt như khả năng oxy hóa tăng lên khi có mặt của các ion Fe2+
, Cu2+
và
bị ức chế bởi EDTA và N2, tuy nhiên nó cũng có sự khác biệt khi nào cần H2O2 để
tạo ra gốc OH* trong quá trình oxy hóa trong khi tác nhân Pc không tạo ra gốc
OH*. Khả năng oxy hóa của tác nhân Pc vẫn được duy trì ở các pH kiềm yếu trong
khi tác nhân SFGF và Gt thì không có khả năng oxy hóa này [59].
Một số nghiên cứu ở Việt Nam cũng đã chỉ ra sự tồn tại của hoạt chất sinh học
có tính chất giống laccase, chúng không có bản chất protein được thể hiện ở khả năng
bền nhiệt cao, oxy hóa ABTS chuyển thành màu xanh, oxy hóa guaniancol sang màu

27. 16
đỏ giống laccase thật, chúng được sinh tổng hợp từ các chủng xạ khuẩn được phân
lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa [28, 108, 109]. Tuy nhiên,
chưa có nghiên cứu chi tiết về bản chất hóa học như chiết tách, làm sạch, xác định
hoạt tính và các đặc điểm sinh học khác của nhóm chất mới rất lý thú này.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng có khoảng 57 loài nấm phân hủy lignin
thuộc 34 chủng nấm trắng, nâu và nấm mềm có thể sinh tổng hợp các peptides có
khối lượng phân tử thấp (<5kDa) có hoạt tính oxy hóa. Tuy nhiên các công bố về cơ
chế hoạt động của những peptides này còn ở mức rất hạn chế do rất khó để tinh sạch
và hoạt tính oxy hóa không ổn định [59].
Nhiều nghiên cứu đã không triển khai tiếp được bởi tính không ổn định của
các chất có khối lượng phân tử thấp từ nấm phân hủy lignin [70]. Các chất có hoạt
tính sinh học với khối lượng phân tử thấp như mô tả ở trên được gọi là các tác nhân
Pc, Gt, SFGF. Hiện nay, chưa có thêm thông tin liên đến đặc tính cũng như cấu trúc
phân tử và thành phần cấu tạo của chúng [86].
Nhận xét:
Trong quá trình sinh trưởng, các chủng nấm nói riêng và các chủng VSV nói
chung ngoài khả năng sinh tổng hợp các enzyme có bản chất protein thì chúng còn có
khả năng khác nữa là sinh tổng hợp một số tác nhân sinh học (chất xúc tác sinh học)
có khối lượng phân tử thấp, tên gọi các chất này phụ thuộc vào nguồn gốc nó được
sinh ra. Các tác nhân này có khả năng oxy hóa giống laccase nhưng đặc điểm hóa-
sinh khác xa với laccase thật. Các hợp chất này không có cấu tạo protein mà chỉ là
các đoạn peptides có hoạt tính oxy hóa cao. Một số nghiên cứu ở Việt Nam đã chỉ ra
sự tồn tại của chất có hoạt tính sinh học như trên được sinh tổng hợp bởi các chủng xạ
khuẩn, nấm sợi được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên
Hòa, Đà Nẵng. Tuy nhiên, nghiên cứu chi tiết để tìm hiểu đặc tính hóa-sinh cũng như
khả năng ứng dụng của chúng trong loại màu thuốc nhuộm, phân hủy các hợp chất
hữu cơ mạch vòng còn rất hạn chế. Vì vậy, để phân biệt với những tên gọi và thuật
ngữ của các nghiên cứu trước đây và thuận tiện trong việc gọi tên trong nghiên cứu
của Luận án, hoạt chất này sẽ được gọi là laccase-like. Cũng có thể sau này khi có đủ
minh chứng thì sẽ được đặt tên mới. Ví dụ: là SDL (từ Streptomyces, phân lập từ đất
nhiễm Dioxin và sinh chất giống Laccase).

28. 17
1.2. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và công nghệ xử lý
1.2.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm
1.2.1.1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm dùng trong công nghiệp dệt thường có nguồn gốc từ tự nhiên
hoặc tổng hợp. Tuy nhiên, ngày nay trong công nghiệp dệt hầu như chỉ sử dụng các
loại thuốc nhuộm tổng hợp. Đặc điểm nổi bật của loại thuốc nhuộm này là độ bền
màu cao và khó bị phân hủy. Màu của thuốc nhuộm phụ thuộc vào cấu trúc hóa học
của nó bao gồm nhóm mang màu và nhóm trợ màu. Nhóm mang màu là nhóm có
chứa các nối đôi liên hợp với điện tử π không cố định như: >C = C<; >C = N-; -N =
N-; -NO2. Nhóm trợ màu là những nhóm thế cho hoặc nhận điện tử như -NH2, -
COOH, -SO3H, -OH v.v, Thuốc nhuộm được phân loại dựa trên cấu tạo của nhóm
mang màu, theo đó thuốc nhuộm được phân thành 20-30 họ khác nhau. Trong đó,
các màu thuốc nhuộm azo (monoazo, disazo, triazo, polyazo), anthraquinone,
phthalocyanine và triarylmethane là các chất màu quan trọng nhất [21]. Ngoài ra,
còn các họ thuốc nhuộm khác ít phổ biến, ít quan trọng hơn như thuốc nhuộm nitrozo,
nitro, polymetyl, arylamin, azometyn, thuốc nhuộm lưu huỳnh v.v.
Màu thương mại được phân loại theo thuật ngữ màu, cấu trúc hoặc phương
pháp ứng dụng màu vào trong các lĩnh vực khác nhau. Việc phân loại màu phụ
thuộc vào chỉ số màu (Color Index) và mỗi màu đều có một chỉ số màu khác nhau
(C.I). Sự phân loại màu và tính chất mỗi thuốc nhuộm được liệt kê trong Bảng 1.4.
Bảng 1.4. Phân loại màu và tính chất các màu thuốc nhuộm
Màu Tính chất của thuốc nhuộm
Màu thuốc nhuộm
axít (acid dye)
Tan tốt trong nước do sự có mặt của nhóm chức sulphonic axit.
Tạo tương tác giữa các nhóm chức mang điện tích dương của sợi
(-NH3
+
) và điện tích âm của màu nhuộm. Ngoài ra, chúng cũng
liên kết với vật liệu bằng lực Van-der-Waals, liên kết hydro và
liên kết phối trí. Theo cấu trúc hóa học, đa số thuốc nhuộm này
thuộc nhóm azo, anthraquinone và triarylmetan.
Màu thuốc nhuộm
hoạt tính
(reactive dye)
Tạo mối liên kết cộng hóa trị với các nhóm -OH, -NH và –SH
trong vật liệu cotton, len, tơ tằm và nylon. Các vấn đề về nước
thải có màu liên quan đến việc sử dụng thuốc nhuộm hoạt tính là
do sự thủy phân của các nhóm chức hoạt tính xảy ra trong quá
trình nhuộm. Các cấu trúc màu phổ biến của thuốc nhuộm này là
azo, azo phức kim loại, anthraquinone và phthalocyanine.
Màu thuốc nhuộm
trực tiếp
(direct dye)
Hình dạng phẳng và dài cho phép chúng liên kết các sợi cellulose
theo một chiều và tối đa hóa các liên kết Van-der-Waals, liên kết
phối trí và liên kết hydro. Chỉ có 30% trong tổng số 1600 cấu trúc

29. 18
Màu Tính chất của thuốc nhuộm
vẫn được sản xuất do màu này thiếu độ bền trong quá trình giặt.
Các cấu trúc phổ biến nhất là thuốc nhuộm azo được lưu hóa.
Màu thuốc
nhuộm phân tán
(disperse dye)
Cấu trúc không ion với nhóm chức phân cực như –NO2 và –CN
làm tăng khả năng tan trong nước thông qua các lực Van-der-
Waals, lực phối trí và màu. Màu nhuộm này được sử dụng cho
sợi polyester. Cấu trúc phổ biến là azo, nitro, anthraquinone, và
azo phức kim loại.
Màu thuốc nhuộm
hoàn nguyên
(vat dye)
Màu nhuộm hoàn nguyên không tan trong nước nhưng có thể trở
nên tan được khi khử kiềm (natri dithionite trong sự có mặt của
NaOH). Dạng LEUCO tạo thành được hấp phụ bởi cellulose (lực
Van-der-Waals) và có thể bị oxy hóa trở lại thành sạng không tan
khi sử dụng H2O2. Cấu trúc phổ biến là anthraquinone và indigoids.
1.2.1.2. Đặc điểm chung của nước thải dệt nhuộm
Nước thải dệt nhuộm là tổng hợp nước thải phát sinh từ tất cả các công đoạn
hồ sợi, nấu tẩy, tẩy trắng, làm bóng sợi, nhuộm in và hoàn tất. Theo phân tích của các
chuyên gia, trung bình, một nhà máy dệt nhuộm sử dụng một lượng nước đáng kể,
trong đó, lượng nước được sử dụng trong các công đoạn sản xuất chiếm 72,3%, chủ
yếu là trong công đoạn nhuộm và hoàn tất sản phẩm (khoảng 50 đến 300 m3
nước cho
1 tấn hàng dệt) [132]. Xét hai yếu tố là lượng nước thải và thành phần các chất ô
nhiễm trong nước thải, ngành dệt nhuộm được đánh giá là ô nhiễm nhất trong số các
ngành công nghiệp [140]. Các chất ô nhiễm chủ yếu có trong nước thải dệt nhuộm là
các hợp chất hữu cơ khó phân hủy, thuốc nhuộm, các chất hoạt động bề mặt, các hợp
chất halogen hữu cơ (AOX- Adsorbable Organohalogens), muối trung tính làm tăng
tổng hàm lượng chất rắn, nhiệt độ cao (thấp nhất là 40°C) và pH của nước thải cao do
lượng kiềm trong nước thải lớn. Trong số các chất ô nhiễm có trong nước thải dệt
nhuộm, thuốc nhuộm là thành phần khó xử lý nhất, đặc biệt là thuốc nhuộm azo
không tan - loại thuốc nhuộm được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, chiếm 60-70%
thị phần. Lượng thuốc nhuộm dư sau công đoạn nhuộm có thể lên đến 50% tổng
lượng thuốc nhuộm được sử dụng ban đầu [140]. Đây chính là nguyên nhân làm cho
nước thải dệt nhuộm có độ màu cao và nồng độ chất ô nhiễm lớn.
Nước thải dệt nhuộm sẽ khác nhau khi sử dụng các loại nguyên liệu để
nhuộm khác nhau. Chẳng hạn như len và cotton thô sẽ thải ra chất bẩn tự nhiên của
sợi và nước thải ra có độ màu, độ kiềm, BOD và chất lơ lửng (SS) cao. Ở loại
nguyên liệu sợi tổng hợp, nước thải ra có thành phần chính là các hợp chất hóa học
do các loại hóa chất sử dụng trong giai đoạn tẩy và nhuộm như: hồ tinh bột, H2SO4,

30. 19
CH3COOH, NaOH, NaOCl, H2O2, Na2CO3, Na2SO3 v.v. các loại thuốc nhuộm, các
chất trơ, chất ngấm, chất cầm màu, chất tẩy giặt.
Nước thải dệt nhuộm nhìn chung rất phức tạp và đa dạng, đã có hàng trăm
loại hóa chất đặc trưng như phẩm nhuộm, chất hoạt động bề mặt, chất điện ly, chất
tạo môi trường, tinh bột men, chất oxy hóa…được đưa vào sử dụng. Nước thải dệt
nhuộm ô nhiễm nặng cho môi trường sống bởi các yếu tố như độ màu, pH, độ đục,
chất lơ lửng, chất hữu cơ, chất hoạt động bề mặt, BOD, COD, nhiệt độ v.v. trong đó
pH dao động trong khoảng từ 9 đến 12, hàm lượng chất hữu cơ (COD thay đổi từ 80
đến 18.000 mg/l). Ðộ màu của nước thải khá lớn có thể lên tới 10.000 Pt-Co, hàm
lượng cặn lơ lửng đạt giá trị khoảng 2.000 mg/l.
Các thông số thường được sử dụng để đánh giá chất lượng nước thải dệt
nhuộm: Nhiệt độ; pH; BOD5; COD; hàm lượng cặn lơ lửng; oxi hòa tan; độ đục;
tổng N; tổng P; kim loại nặng; coliform
1.2.2. Các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm
Một vài kỹ thuật để xử lý màu thuốc nhuộm bằng hóa học, vật lý và sinh học
như hấp phụ, keo tụ, kết bông, lọc qua vách ngăn, ozon hóa, điện hóa, phân giải
bằng chiếu xạ, vi khuẩn, tảo, nấm và các quá trình oxy hóa bậc cao đã được biết đến
để loại màu nước thải dệt nhuộm [180]. Các phương pháp xử lý nước thải dệt
nhuộm được trình bày ở Bảng 1.5.
1.2.2.1. Phương pháp hóa lý
Các phương pháp hóa lý được biết đến là có hiệu quả trong loại màu nước thải
dệt nhuộm, trong đó phương pháp hấp phụ được quan tâm nhất do nó đơn giản và ít
nhạy cảm với các chất ô nhiễm độc hại. Mặc dù phương pháp này tạo ra nước thải sau
xử lý có chất lượng cao nhưng vấn đề là phải lựa chọn được chất hấp phụ phù hợp. Một
số chất hấp phụ được sử dụng phổ biến để xử lý màu thuốc nhuộm đó là: Chất hấp phụ
hóa học (Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) - nano TiO2; Nano-γ-alumina;
Poly vinyl alcohol (PVA) [180].
Các phương pháp hóa lý khác để loại màu thuốc nhuộm như kết tủa bông,
keo tụ. Sự keo tụ bằng điện hóa được áp dụng để loại màu từ dung dịch có chứa
hỗn hợp các màu bazơ và phân tán. pH tối ưu cho quá trình loại màu thuốc nhuộm
thường là 7, các thông số ảnh hưởng tới khả năng loại màu thuốc nhuộm cũng đã
được khảo sát [163].

31. 20
Bảng 1.5. Các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm
STT Kỹ thuật
1
Phương pháp hóa-lý:
Quá trình lọc qua vách ngăn, thẩm thấu ngược, keo tụ/ kết bông
2
Phương pháp sinh học:
Phân hủy bằng vi khuẩn (hiếu khí và kị khí)
Phân hủy bởi nấm, phân hủy bởi enzyme
3
Quy trình oxy hóa nâng cao:
Ozon hóa, Ozon/ H2O2
Tia tử ngoại/ozon, Xúc tác quang hóa
Quy trình Fenton, Quang hóa-Fenton
Sự oxy hóa điện hóa
Tia tử ngoại/ozone/H2O2, tia tử ngoại/H2O2
1.2.2.2. Phương pháp oxy hóa nâng cao
Quá trình này gồm các kỹ thuật như oxy hóa màu bằng hệ Fenton (dung dịch
có chứa H2O2 và sắt), quang hóa bằng tia tử ngoại (UV) tại nhiệt độ và áp suất
thường. Quá trình oxy hóa nâng cao được sử dụng rộng rãi để loại màu nước thải
dệt nhuộm và các thành phần hữu cơ khó phân hủy có trong nước thải. Tính linh hoạt
của phương pháp oxy hóa nâng cao dựa vào sự tạo ra gốc tự do OH●
. Phương pháp
thể hiện tính ưu việt hơn các phương pháp xử lý thông thường bởi vì chúng có thể
loại bỏ các hợp chất hữu cơ không/khó phân hủy sinh học [53].
a) Ozon hóa
Ozon hóa là phương pháp đã được sử dụng rộng rãi để xử lý nước thải có chứa
màu. Loại màu hoạt tính từ nước thải công nghiệp dệt nhuộm bằng phương pháp ozon
hóa được thực hiện trong thiết bị reactor theo mẻ tại 35o
C với pH khác nhau đã được
nghiên cứu và kết quả cho thấy hiệu suất loại màu thu được khoảng 90% sau 6 giờ
phản ứng [169]. Ozon hóa được thực hiện trong reactor bán liên tục với hỗn hợp 8 màu
hoạt tính mà có nồng độ màu từ 50-500 mg/L. Màu và COD có trong nước thải bị loại
bỏ hoàn toàn khi sử dụng 4,33 mg/L ozon sau 30 phút. Với nồng độ ban đầu thấp thì
tốc độ loại bỏ màu và COD rất nhanh, nhưng khi nồng độ tăng từ 200-500 mg/L thì cần
nhiều thời gian hơn để loại màu. Các sản phẩm như clo, sunfat, nitrat được tạo ra là kết
quả của sự oxy hóa và cắt mạch của các nhóm thể có trong phân tử màu [137].

32. 21
b) Oxy hóa điện hóa
Quá trình oxy hóa điện hóa dung dịch màu thuốc nhuộm tổng hợp và nước
thải dệt nhuộm thực tế là sử dụng các điện cực là titan- tantali- platin- iriđi để tiến
hành thử nghiệm loại màu đối với hỗn hợp của 16 loại thuốc nhuộm có nồng độ 361
mg/L và 281 mg/L COD, xử lý nước thải thực tế có chứa 404 mg/L COD. Quan sát
bằng mắt thường cho thấy màu bị loại trong vòng 10-15 phút. Kết quả nghiên cứu
cho thấy chỉ cần tiêu thụ một lượng nhỏ năng lượng thì mức độ loại màu đã đạt
được là 30-90% sau 180 phút. Độc tính sinh thái bị giảm đi với sự hình thành các
sản phẩm ít độc hại hơn. Hỗn hợp 9 loại thuốc nhuộm hoạt tính thuộc lớp màu azo,
anthraquinone và triazine bị phân hủy bởi sự oxy hóa điện hóa. Màu và COD bị loại
bỏ hoàn toàn sau 120 phút xử lý. Các kết quả trên đã chứng minh phương pháp oxy
hóa điện hóa phù hợp cho loại màu nước thải công nghiệp [20].
c) Xử lý bằng xúc tác quang hóa
Quá trình phân hủy quang hóa hỗn hợp hai màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng
TiO2 có kích thước từ 1µm đến 1000 µm đã được tiến hành và cho hiệu quả tốt.
Điều đó khẳng định nano TiO2 là chất xúc tác tiềm năng trong xử lý nước thải dệt
nhuộm. Tương tự CuO-clinoptilolite cũng được sử dụng trong phản ứng quang hóa
để loại màu đối với hỗn hợp hai màu thuốc nhuộm methylene blue và bromophenol
blue [39].
1.2.2.3. Phương pháp sinh học
Loại màu thuốc nhuộm bằng phương pháp sinh học là giải pháp thân thiện
với môi trường và hứa hẹn sẽ được sử dụng nhiều trong tương lai. Các vi sinh vật
như vi khuẩn, nấm, tảo, nấm men và enzyme có thể được sử dụng thành công để
loại màu thông qua quá trình xử lý hiếu khí, kị khí hoặc kết hợp kị khí-hiếu khí.
a) Phương pháp sử dụng các chất hấp phụ sinh học
Để loại bỏ hỗn hợp các màu thuốc nhuộm bằng chất hấp phụ sinh học
Portulaca grandiflora, chất hấp phụ được cho vào một ống nhựa PVC cho nước
thải và hỗn hợp màu chảy qua, kết quả sau 60 và 96 giờ 87 và 97% màu bị loại [68].
Bên cạnh đó các chất hấp phụ sinh học Saccharomyces cerevisiae, Petunia
grandifloraJuss, Glandularia pulchella cũng đã được chứng minh là những chất
hấp phụ sinh học tốt trong việc loại bỏ hỗn hợp màu và nước thải màu thực tế [50].
Sinh khối nấm sợi Aspergillus niger đã chết là chất hấp phụ sinh học hiệu quả đối

33. 22
với hỗn hợp các màu trong nước thải. Sự hấp phụ tối đa đạt được ở pH tối ưu là 5 và
trong vòng 10 phút, hiệu suất loại màu đạt cực đại ở nồng độ màu là 20 mg/L.
b) Phương pháp sử dụng laccase trong loại màu thuốc nhuộm
Phương pháp sử dụng laccase là giải pháp khá thú vị và có tiềm năng trong
việc loại màu thuốc nhuộm có cấu trúc hoá học đa dạng và phức tạp [129].
Laccase có khả năng loại màu thuốc nhuộm thông qua cơ chế gốc tự do
không đặc hiệu tạo ra các hợp chất phenol [22]. Con đường giả định về sự phân hủy
thuốc nhuộm azo, 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo) benzenesulfonic acid bởi laccase
được trình bày ở Hình 1.2.
Dựa trên mô hình này, laccase oxy hóa nhóm phenol của thuốc nhuộm azo,
với sự tham gia của một điện tử tạo ra một gốc phenoxy, sau đó sẽ được oxy hóa
với ion carbonium. Vòng phenol có chứa carbon mang liên kết azo sẽ bị tấn công
bởi nước tạo ra 3-diazenyl-benzenesulfonic acid (III) và tiếp theo là 1, 2-
naphthoquinone [13]. Các gốc tự do được tạo thành bởi sự oxy hóa thuốc nhuộm do
laccase có xu hướng phản ứng với 1, 2-naphthoquinone. Các gốc tự do có thể trải
qua quá trình oxy hóa để tạo thành hợp chất VIII, sau đó tạo ra hợp chất X, hoặc
trùng hợp lại và oxy hóa tiếp tạo ra hợp chất IX [179].
Hình 1.2. Cơ chế giả định sự phân hủy 3-(2-hydroxy-1-naphthylazo)
benzenesulfonic acid bởi laccase [179]

34. 23
Với phổ cơ chất rộng, laccase có khả năng tham gia vào quá trình loại màu
hoặc phân hủy nhiều loại thuốc nhuộm có cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, một số
màu không dễ bị oxy hóa hoặc chỉ bị oxy hóa một phần do chúng có cấu trúc quá
cồng kềnh hoặc thế oxy hóa khử quá cao để có thể gắn kết với trung tâm hoạt động
của laccase. Trong trường hợp này chất gắn kết là điều kiện cần thiết để laccase thể
hiện vai trò xúc tác. Một vài hợp chất có chứa vòng phenol tự nhiên bao gồm
syringaldehyde và acetosyringone đã được chứng minh là các chất gắn kết phù hợp
để laccase thể hiện khả năng một cách có hiệu quả trong loại màu thuốc nhuộm [7].
Dựa trên kết quả phân tích LC-MS khi sử dụng laccase chủng nấm Polyporus
sp. S133 để phân hủy màu RBBR cho thấy hình thành hai sản phẩm nhỏ là sodium 1-
amino-10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonate và sodium 2-((3-aminophenyl)
sulfonyl) ethyl sulfate. Tuy khối lượng phân tử của những sản phẩm phân hủy nhỏ
hơn nhưng độc tính không giảm đi so với hợp chất ban đầu [54]. Vì vậy, hiệu quả loại
màu có thể cao nhưng quá trình xử lý thuốc nhuộm vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu
cho đến khi loại bỏ được hoàn toàn các sản phẩm trung gian vẫn có khả năng gây
nguy hại tới sức khỏe con người.
Một vài ứng dụng trong phân hủy các chất gồm phenols, polyphenols,
PCBs, PAHs, thuốc nhuộm và thuốc nhuộm azo bởi laccase được thể hiện ở
Bảng 1.6 [173]. Ở Việt Nam, nấm sợi Trichoderma sp. FCP3 đã được phân lập
từ rừng Quốc gia Cúc Phương sinh tổng hợp laccase thô có khả năng loại màu
một số thuốc nhuộm với hiệu suất như sau: NY3: 92%; RBBR: 86%; NY5: 64%;
NY1: 60%, NY7: 6% [58].
Bảng 1.6. Ứng dụng của laccase trong phân hủy sinh học thuốc nhuộm
Hợp chất Nguồn gốc laccase Cơ chất Dạng
Bromophenol Blue, Congo
Red, Coomassie Blue,
Tripan Blue
laccase tái tổ hợp chủng
T. sanguineus biểu hiện
trong T. atroviride
- Tự do
Acid Black 172, Congo Red,
Crystal Violet, Direct Fast
Blue FBL, Indigo Blue,
Naphthol, Green B,
Methylene Blue, Neutral
Red, Reactive Brilliant Blue
X-BR, Remazol Brilliant,
Blue Reactive (RBBR)
T. pubescens - -

35. 24
Hợp chất Nguồn gốc laccase Cơ chất Dạng
Acid Orange 67, Basic Red
18, Basic Yellow 28, Direct
Black 166, Direct Yellow
107, Disperse Yellow 79
Paraconiothyrium
variabile
HBT Tự do
Brilliant Blue G, Brilliant
Blue R, Bromophenol Blue,
Coomassie Blue R250,
Crystal Violet, Malachite
Green, Methylene Blue,
Xylene Cyanol, RBBR
P. sanguineus VA Tự do
RBBR T. versicolor HBT Cố định
RBBR Cerrena sp. HYB07 - Cố định
Coomassie Blue R250 Cerrena sp. HYB07
ABTS,AS,H
BT,SA, SYA
Tự do
c) Phương pháp sử dụng chủng nấm sinh tổng hợp laccase để loại màu thuốc nhuộm
Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và công nghệ sinh học nói
riêng việc sử dụng các vi sinh vật và enzyme từ vi sinh vật để giảm mức độ sử dụng
clo trong xử lý màu thuốc nhuộm đã được nhiều nhóm tác giả nghiên cứu và chứng
minh là giải pháp công nghệ có tính khả thi và mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Trong số các chủng nấm sợi, đảm và nấm men có thể sinh tổng hợp laccase,
các chủng nấm đảm được coi là nhà sản xuất lignin và laccase. Loài nấm Pleurotus
ostreatus và Trametes versicolor được xem như các loài nấm điển hình trong nghiên
cứu sinh tổng hợp và nghiên cứu ứng dụng laccase. Ngoài ra, các loài nấm đảm
khác cũng được biết đến là có khả năng sinh tổng hợp laccase như Agaricus
bisporus, Cerrena unicolor, Coprinopsis cinerea, Coriolopsis gallica, Cryptococcus
neoformans, Cyathus bulleri, Fomes fomentarius, Ganoderma lucidum, Panus
rudis, Phlebia radiata, Polyporus brumalis, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus
sanguineus, Rigidoporus microporus, Schizophyllum commune [46].
Cộng đồng các nhà khoa học nghiên cứu tìm kiếm vi sinh vật sinh laccase
hay laccase-like thường sử dụng màu thuốc nhuộm tổng hợp để đánh giá khả năng
oxy hóa các chất vòng thơm tương đồng ở mức nào với hoạt tính xúc tác để phục vụ
cho các nghiên cứu ứng dụng ở các lĩnh vực khác nhau. Khả năng loại màu của một
số đại diện là nấm đảm đã được thông báo trong vài thập niên gần đây. Loài nấm
Trametes versicolor 2008001 với hoạt tính laccase là 20.000 U/L đã loại 98% màu

36. 25
Reactive Blue 49 ở điều kiện pH 2,95; nồng độ màu ban đầu là 55,6 mg/L sau 46,91
phút [49]; Loài nấm L. polychrous có khả năng sinh laccase với hoạt tính 145 U/mL
sau 12 ngày nuôi cấy có khả năng loại 85% màu Acid Blue 80 tại pH 5 sau 120
phút [126]; Loài nấm đảm Pleurotus ostreatus sinh laccase hoạt tính 32.450 IU/g
loại được trên 80% hỗn hợp của 5 màu methyl orange, trypan blue, ramazol brilliant
red, ramazol brilliant blue và ramazol brilliant yellow [40]; khi sử dụng hỗn hợp 3
loại nấm Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor và Bjerkandera sp
BOL13 để loại màu thuốc nhuộm thuộc nhóm azo thì chủng Bjerkandera sp.BOL13
loại 89% màu Remazol Red RR sau 13 ngày [64].
Quá trình loại màu bởi chủng nấm cần phải phân biệt rõ thêm nguyên nhân là do
hấp phụ? hay phân hủy ? hay do xúc tác bởi enzyme. Hoạt động của các chủng nấm
thường hiếm khi dẫn đến quá trình khoáng hóa thuốc nhuộm vì cơ chế khoáng hóa phụ
thuộc rất nhiều vào cấu trúc hóa học của chúng. Sự khoáng hóa xảy ra mạnh hơn ở các loại
thuốc nhuộm chứa vòng thơm dễ bị thay thế hơn so với các vòng thơm không dễ bị thay
thế. Sự khoáng hóa tốt hơn xảy ra trong các điều kiện nghèo nitơ. Một số nghiên cứu đã
thông báo về khả năng các chủng nấm sử dụng thuốc nhuộm như là nguồn cacbon, khi đó
các liên kết trong phân tử thuốc nhuộm sẽ bị cắt đứt và được VSV sử dụng như nguồn
cacbon, cơ chế này thường xuất hiện ở quần xã vi sinh vật sống [72, 143].
Chủng nấm sợi Aspergillus sp. FBH11 phân lập từ đất nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin cũng có khả năng phân hủy các loại thuốc nhuộm nhóm azo và
anthraquinone như NY1, NY3, NY5, NY7, NY8 và RBBR với nồng độ ban đầu 100
mg/L. Hai màu thuốc nhuộm NY1 và NY5 bị loại màu lần lượt 88,7 và 90,8% bởi
tế bào sống sau 4 ngày. Trong khi đó dịch laccase thô với hoạt tính 550 U/L loại
màu được 36,8% NY1, 51,3% NY5 chỉ trong 6,5 h. Ngoài ra, nhiều loài nấm mục
trắng được chứng minh có khả năng loại bỏ các màu tổng hợp khác nhau, trong đó
nấm đảm Phanerochaete, Coriolus versicolor và Pleurotus là các loài chính được
nghiên cứu khá kỹ [107].
Các nghiên cứu trên cho thấy khả năng cũng như ứng dụng của nấm bậc cao
trong loại màu thuốc nhuộm tổng hợp được công bố rất nhiều. Tuy nhiên cho đến
thời điểm này chưa có nhiều thông tin quốc tế cũng như trong nước chứng minh
bằng thực nghiệm để chỉ ra tiềm năng to lớn của chủng nấm đảm nói chung và vi
khuẩn nói riêng trong loại màu thuốc nhuộm hoạt tính thương mại.

37. 26
1.3. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý
1.3.1. Hiện trạng ô nhiễm
Trong thời gian chiến tranh ở Việt Nam, chất diệt cỏ/dioxin được quân đội Mỹ
sử dụng ở miền Nam Việt Nam bắt đầu từ ngày 10/8/1961 và kết thúc vào ngày
31/10/1971. Theo Young (2009) quân đội Mỹ đã rải tổng cộng 74.175.920 lit chất diệt
cỏ, trong đó: chất da cam là 43.332.640 lít; chất xanh lá mạ, chất hồng, chất tím là
2.944.240 lít; chất trắng là 21.798.400 lít; chất xanh da trời là 6.100.640 lít [160]. Các
chất diệt cỏ trên thùng có màu tím, da cam, v.v. chứa 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-
PeCDD được đánh giá có độ độc tương đương cao nhất với hệ số là 1. Ở Việt Nam có
3 "điểm nóng" được xác định và đánh giá có mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin
là nặng nề nhất đó là sân bay Đà Nẵng, sân bay Phù Cát và sân bay Biên Hòa. Trong
đó, sân bay Đà Nẵng, từ năm 2014 đến 2017 đã được Cơ quan phát triển quốc tế Hoa
kỳ tiến hành xử lý bằng công nghệ giải hấp nhiệt trong mố (IPTD) với khối lượng là
90.000 m3
đất và trầm tích ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Sân bay Phù Cát, đã được Văn
phòng Ban chỉ đạo 33/Bộ TN&MT tiến hành chôn lấp cô lập triệt để điểm ô nhiễm với
khối lượng trên 7.500 m3
để tránh việc phát tán ô nhiễm ra môi trường xung quanh.
Như vậy, về cơ bản hiện trạng ô nhiễm nặng dioxin ở Việt Nam hiện nay tập trung ở
sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai, mặc dù tại sân bay này Bộ Tư lệnh Hóa học đã tiến
hành chôn lấp cô lập triệt để trên 160.000 m3
từ năm 2009 đến 2016. Trong khối lượng
đã được chôn lấp cách ly triệt để thì chôn lấp” tích cực” 3.384 m3
đất ô nhiễm đã được
thực hiện. Đây là sự hợp tác của Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa
học và Công nghệ Việt Nam với Binh chủng Hóa học/Bộ quốc phòng. Ở các lô xử lý
không chỉ chôn lấp mà khối lượng lớn đất trên đã được làm sạch bằng công nghệ kích
thích quần xã vi sinh vật bản địa phân hủy tất cả hỗn hợp chất độc trong đất, để sau 40
tháng tổng độ độc chỉ còn 14,12 ngTEQ/kg đất khô, dưới ngưỡng của qui chuẩn Việt
Nam (40ngTEQ/kg đất khô) cho đất sản xuất nông nghiệp thường xuyên.
Theo Báo cáo của Cơ quan phát triển Quốc tế Hoa Kỳ (USAID) thực hiện
năm 2014/2015 [5]. Sân bay Biên Hòa ước tính tổng lượng đất và trầm tích nhiễm
dioxin khoảng 408.500 - 495.300 m3
. Trong đó có 315.700 - 377.700 m3
đất ô
nhiễm và 92.800 - 117.600 m3
trầm tích ô nhiễm. Diện tích ô nhiễm ước tính là
khoảng 522.400 m2
, trong đó có khoảng 369.600 m2
diện tích đất và 152.800 m2
diện tích trầm tích. Trong số 408.500 m3
khối lượng nhiễm dioxin, có 42 % nằm ở

38. 27
khu Pacer Ivy, 24% ở khu Z1 (bao gồm cả Bãi chôn lấp Z1), và 15% ở khu Tây
Nam. Phần 19% còn lại nằm ở các khu ZT, Tây bắc và Đông bắc. Khoảng 5%
tổng khối lượng nhiễm dioxin nằm ở ngoài khu vực sân bay. Các khu vực hiện bị
ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa bao gồm:
Khu Z1: Nồng độ dioxin tối đa trong đất ghi nhận được tại điểm Z1-16B là
901 ppt.
Khu ZT: Nằm ở phía bắc khu Z1. Nồng độ dioxin báo cáo theo Nghiên cứu
này của khu vực đạt khá thấp (dưới ngưỡng dioxin của BQP), trừ một vị trí tại điểm
ZT-2B (3.440 ppt).
Khu tây nam: Khu vực này có nồng độ dioxin cao nhất 110.000 ppt-TEQ tại
điểm SW-1A, độ sâu 30-60 cm.
Khu Pacer Ivy: Nồng độ dioxin trong đất cao nhất ghi nhận tại điểm PI-2 là
11.400 ppt, độ sâu 30-60 cm. Phạm vi ô nhiễm mở rộng ra cả ngoài sân bay, đặc
biệt là dọc theo kênh thoát nước ở phía tây khu Pacer Ivy (tối đa 3.370 ppt tại điểm
PI-15). Nguồn gây ô nhiễm dioxin là do đất/trầm tích ô nhiễm di chuyển trên tuyến
kênh mương từ khu Pacer Ivy chảy về phía tây qua một loạt các kênh rạch để đổ ra
sông Đồng Nai.
Khu Tây-Bắc: Nồng độ dioxin trong trầm tích cao hơn ngưỡng dioxin tại
điểm NW-4A (là 477 ppt, độ sâu 0-15 cm; 262 ppt, độ sâu 15-30 cm) và điểm NW-
3C (385 ppt, độ sâu 0-15 cm; 587 ppt, độ sâu 15-30 cm).
Khu rừng cây phía Bắc: Nồng độ dioxin đo được tại điểm NF-4A và B cao
nhất 465 ppt).
Khu Đông-Bắc: Mẫu trầm tích tại một số ao hồ tại khu vực này có nồng độ
dioxin trên ngưỡng dioxin. Nồng độ dioxin trong trầm tích cao nhất tại điểm NE-7
(1.300 ppt, độ sâu 0-15 cm; 765 ppt, độ sâu 30-45 cm).
Khu Đông-Nam: Mẫu đất tại khu vực này chỉ đo được nồng độ dioxin thấp
(cao nhất là 64,5 ppt tại điểm SE-2), dưới ngưỡng dioxin theo QCVN45:2012.
Bên ngoài khu vực sân bay (các ao hồ bên ngoài): Trầm tích mặt tại hồ
Cổng 2 (166 ppt) cao hơn tiêu chuẩn về ô nhiễm dioxin của Việt Nam đối với trầm
tích (150 ppt); trầm tích tại hồ Biên Hùng (83 ppt) thấp hơn tiêu chuẩn về ô nhiễm
dioxin của Việt Nam.

39. 28
Nước ăn: Các mẫu lấy từ giếng nước ngầm ở bên ngoài và các nguồn nước
ăn tại chỗ không cho thấy nồng độ dioxin vượt ngưỡng cho phép của Cục Bảo vệ
Môi trường Hoa Kỳ (USEPA) hay của Việt Nam đối với nước ăn uống.
Các nguồn nước ngầm tại chỗ khác: Tiến hành khảo sát 5 giếng nước
ngầm tại độ sâu 3 - 15 m và một giếng tại độ sâu 2 - 6 m. Các mẫu này có nồng
độ dioxin vượt ngưỡng ô nhiễm tối đa (MCL) của USEPA và tiêu chuẩn xả thải
của Việt Nam đối với nước chưa qua lọc, cũng như có lượng kim loại chì vượt
ngưỡng MCL của ESEPA. Trong các mẫu nước giếng có qua lọc, nồng độ dioxin
đạt dưới ngưỡng MCL của USEPA, nhưng vẫn cao hơn tiêu chuẩn xả thải của
Việt Nam là 10 phần triệu tỉ (ppq).
Như vậy cho thấy mức độ ô nhiễm nặng dioxin hiện nay của Việt Nam tập
trung chủ yếu tại sân bay Biên Hòa với mức độ, pham vi và tính chất rất phức tạp và
tiếp tục cần nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm kiếm được các giải pháp công nghệ
phù hợp với điều kiện Việt Nam đảm bảo các yếu tố xử lý triệt để, thân thiện với
môi trường và tiết kiệm chi phí.
1.3.2. Công nghệ xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm
Các công nghệ đã được nghiên cứu và ứng dụng trong xử lý ô nhiễm các chất
ô nhiễm đa vòng thơm, các chất diệt cỏ/dioxin trên thế giới và Việt Nam đã được
tổng hợp, nghiên cứu từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau trên thế giới. Trong các hợp
chất hữu cơ khó phân huỷ (POPs) theo Công ước Stockhom là 21 chất so với trước
là chỉ có 12 chất, dioxin là một trong các chất đó. Để xử lý các chất này thế giới đã
có khoảng 40 loại hình công nghệ được giới thiệu [110].
Chương trình môi trường của Liên hợp quốc đã khuyến cáo các nước đang
phát triển về việc áp dụng các công nghệ không đốt để xử lý các chất hữu cơ ô
nhiễm khó phân huỷ và đề xuất 27 loại hình công nghệ [154].
Báo cáo của Cục bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA) năm 2010 đã đề xuất phát
triển 3 loại hình công nghệ [157].
Tổ chức các nước công nghiệp phát triển của liên hợp quốc (UNIDO) đã
giới thiệu 14 công nghệ không đốt để xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân
huỷ và chúng thuộc 3 loại hình: đã được công nhận và áp dụng; đang được chứng
minh và mới nổi [83].