Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

Thuốc bảo vệ thực vật

7,012 views

Published on

thuốc bảo vệ thực vật

Published in: Environment
  • Sex in your area is here: ❤❤❤ http://bit.ly/36cXjBY ❤❤❤
       Reply 
    Are you sure you want to  Yes  No
    Your message goes here

Thuốc bảo vệ thực vật

  1. 1. BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU -----------***---------- BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ ĐỂ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG DÙNG CHỦ NHIỆM : TS. NGUYỄN THỊ BÍCH THU CƠ QUAN CHỦ TRÌ : VIỆN DƯỢC LIỆU CẤP QUẢN LÝ : BỘ Y TẾ 8079 Hà Nội – 12/2009
  2. 2. 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG ĐỀ TÀI AOAC : Association of analytical communities BP : Dược điển Anh NN&PTNT : Nông nghiệp và phát triển nông thôn CI : Chemical ionization, ion hóa hóa học CTSK : Chương trình sắc ký DDD : 1,1-dicloro-2,2-bis(4-clorophenyl) ethan, đồng nghĩa với TDE DDE : 1,1 Diclo 2,2 bis (clophenyl) ethylen, chất chuyển hóa của DDT. DDT : Diclo – diphenyl – triclor ethan DĐVN (III) : Dược điển Việt Nam (xuất bản lần thứ III) ECD : Electron captured detector – Detector cộng kết điện tử EI : Electron impact – Va chạm ion ESI : Electron spray ionizaton, sự ion hóa bằng phun dòng electron EUP : The European Union Pharmacopoeia – Dược điển Châu Âu FAO : Food and agricultural organization of united nation - Tổ chức lương thực và nông nghiệp liên hợp quốc FPD : Flame photometry detector, Detector quang hóa ngọn lửa GAP : Good agriculture practice – Thực hành nông nghiệp tốt GC : Gas chromatography – Sắc ký khí GC-MS : Gas chromatography-mass spectrometry, Sắc ký khí – khối phổ HCB : Hexachlorobenzen HCC : Hexachlorocyclohexan, đồng nghĩa với HCH và BHC HPLC : High performance liquid chromatography, Sắc ký lỏng hiệu năng cao IDL : Instrument detection limit – Giới hạn phát hiện của thiết bị LC : Liquid chromatography, Sắc ký lỏng LC-MS : Liquid chromatography – mass spectrometry, Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS : Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần liên tiếp LOD : Limit of detection – Giới hạn phát hiện LOQ : Limit of quantitation – Giới hạn định lượng MDL : Method detection limit – Giới hạn phát hiện của phương pháp MRL : Maximum residue limit – Dư lượng tối đa cho phép MS : Mass spectrometry, phép đo phổ khối MS/MS : Phép đo khối phổ hai lần liên tiếp
  3. 3. 2 MSD : Mass seclective detector – detector chọn lọc khối, Mass spectrum detector (detector khối phổ) NCI : Negative chemical ionization, ion hóa hóa học âm NPD : Nitrogen-Phosphorous detector – detector nitơ phosphor (AFID) OC : Organo chlorine pesticides – HCBVTV nhóm cơ clor OP : Organo phosphorous pesticides – HCBVTV nhóm cơ phosphor ppm : Part per million – phần triệu ppb : Part per billion – phần tỷ PY : Pyrethroid pesticides – HCBVTV nhóm pyrethroid % R : Tỷ lệ thu hồi (%) RA : Relative area – Diện tích tương đối của pic RtR : Relative retention time – Thời gian lưu tương đối RSD : Relative standard deviation – Độ lệch chuẩn tương đối SCAN : Chế độ chạy quét mảnh ion trong sàng lọc HCBVTV SD : Standard deviation – Độ lệch chuẩn S/N : Signal to noise ratio – Tỷ số tín hiệu so với nhiễu SIM : Selected ion monitoring – Chế độ quét ion chọn lọc SPE : Solid phase extraction – Chiết pha rắn SRM : Selected reaction monitoring – Chế độ chọn lọc tương tác tR : Retention time - Thời gian lưu TIC : Total ion chromatogram – Chế độ quét toàn bộ ion TOF : Time of flight – Phép phân tích khố phổ dựa theo thời gian bay khác nhau của các mảnh ion trong từ trường USP : The United States Pharmacopoeia –Dược điển Mỹ WHO : Worl health organisation – Tổ chức Y tế thế giới
  4. 4. 3 DANH MỤC CÁC BẢNG - BIỂU ĐỒ Trang Bảng 1.1 : Thống kê số lượng HCBVTV được phép sử dụng ở Việt Nam 21 Bảng 1.2 : Danh mục hoạt chất hạn chế và cấm sử dụng tại Việt Nam (năm 2009) 22 Bảng 1.3 : MRL của các HCBVTV trong dược liệu (theo một số Dược điển Anh, Châu Âu, Mỹ) 26 Bảng 2.4 : Các kỹ thuật xử lý mẫu được lựa chọn áp dụng 40 Bảng 2.5 : Dược liệu được sử dụng làm mẫu nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích 43 Bảng 2.6 : Đối tượng xây dựng phương pháp phân tích 44 Bảng 2.7 : Độ lặp lại kết quả phân tích được chấp nhận (Theo USP 30) 47 Bảng 2.8 : Danh mục dược liệu và nông sản khảo sát tồn dư HCBVTV 47 Bảng 3.9 : Danh mục cây thuốc được trồng tại một số địa phương khảo sát 54 Bảng 3.10 : Danh mục HCBVTV dùng tại 5 địa phương khảo sát 57 Bảng 3.11 : Một số HCBVTV (có tên trong Danh mục hạn chế và cấm sử dụng ở Việt Nam - 2009) đã sử dụng tại một số địa phương 66 Bảng 3.12 : Các HCBVTV được sử dụng tại một số địa phương nhưng không có tên trong Danh mục HCBVTV được phép sử dụng ở Việt Nam 67 Bảng 3.13 : Chương trình nhiệt độ cột tách để phân tích các OC bằng phương pháp GC-MS 76 Bảng 3.14 : Điều kiện áp suất và tốc độ dòng thích hợp đối với phân tích HCBVTV 77 Bảng 3.15 : Điều kiện thích hợp xác định HCBVTV trên thiết bị GC-MS 78 Bảng 3.16 : Thời gian lưu của các chất trong hỗn hợp 20 chất chuẩn nhóm OC (Nội chuẩn: HCB) 79 Bảng 3.17 : Các mảnh phổ đặc trưng và mảnh chính sử dụng trong phân tích nhóm OC theo GC-MS/SIM 81 Bảng 3.18 : Độ lặp lại của 20 chất chuẩn OC (0,05 µg.ml-1 ), NC1 83 Bảng 3.19 : Độ tuyến tính và LOD của 20 chất OC (Nồng độ 50-1000ng.g- 1 ) trong Sắn dây, Ngưu tất và Bạch chỉ 84 Bảng 3.20 : Chương trình nhiệt độ lò cột cho phân tích OP 85 Bảng 3.21 : Các mảnh ion dùng để xác minh và định lượng của các OP 86 Bảng 3.22 : Chương trình nhiệt độ cột tách trên GC-MS phân tích đồng thời OC-OP-PY 88 Bảng 3.23 : Điều kiện thích hợp xác định HCBVTV nhóm OC, OP, PY và các HCBVTV khác trên thiết bị GC/MS 89 Bảng 3.24 : Thời gian lưu và thứ tự các chất của hỗn hợp chuẩn OC, OP, PY số HCBVTV nhóm khác. 90 Bảng 3.25 : Các mảnh phổ đặc trưng và mảnh chính sử dụng trong phân tích HCBVTV nhóm OP, PY và một số chất khác 91 Bảng 3.26 : Độ lặp lại của các HCBVTV (0,05 µg.ml-1 ), NC1 93 Bảng 3.27 : Độ tuyến tính và LOD của 15 chất OP (0,05 µg.g-1 – 5 µg.g-1 ) trong Cúc hoa, Khổ sâm và Bạc hà 95 Bảng 3.28 : Độ tuyến tính và LOD của một số chất PY (0,01 µg.g-1 - 5,0 µg.g-1 ) trong Cúc hoa và Khổ sâm 96
  5. 5. 4 Bảng 3.29 : Điều kiện tối ưu xác định HCBVTV trên thiết bị GC-MS/NCI 97 Bảng 3.30 : Chương trình nhiệt độ cột tách trên GC-MS/NCI 97 Bảng 3.31 : Các ion chọn lọc đối với chế độ SIM 99 Bảng 3.32 : Độ chính xác, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp GC-MS/NCI xác định các OC 100 Bảng 3.33 : Hiệu suất rửa giải từng phân đoạn OC khi giảm hoạt hoá florisil với các tỉ lệ nước khác nhau 105 Bảng 3.34 : Kết quả khảo sát khả năng loại màu của 1 g Silica gel +3% than hoạt đối với nhóm PY 106 Bảng 3.35 : Kết quả khảo sát khả năng loại màu của 1 g Silica gel +3% than hoạt đối với nhóm OP 107 Bảng 3.36 : Danh sách dược liệu phân tích sàng lọc HCBVTV 108 Bảng 3.37 : Danh sách nông sản phân tích sàng lọc HCBVTV 111 Bảng 3.38 : Kết quả phân tích HCBVTV trong một số mẫu dược liệu 115 Bảng 3.39 : Kết quả phân tích sàng lọc HCBVTV trong một số mẫu nông sản phân tích 118 Bảng 3.40 : Kết quả định lượng HCBVTV trong một số mẫu dược liệu 123 Bảng 3.41 : Kết quả phân tích định lượng HCBVTV trong một số mẫu nông sản phân tích. 125 Bảng 4.42 : Đối tượng xây dựng phương pháp phân tích 130 Biểu đồ 3.1 : Phân loại HCBVTV theo công dụng 63 Biểu đồ 3.2 : Phân loại HCBVTV theo cấu tạo hoá học 64
  6. 6. 5 DANH MỤC HÌNH VẼ - SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1 : Công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm OC 16 Hình 1.2 : Công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm OP 17 Hình 1.3 : Công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm PY 19 Hình 1.4 : Công thức cấu tạo của một số HCBVTV thuộc nhóm khác 19 Hình 3.5 : Phỏng vấn hộ nông dân trồng Địa liền (xã Bình Minh, Huyện Khoái Châu, Hưng Yên) 69 Hình 3.6 : Trồng Địa liền tại xã Bình Minh – Khoái Châu – Hưng Yên 69 Hình 3.7 : Bao bì HCBVTV tại ruộng Cúc hoa xã Bình Minh, Huyện Khoái Châu, Hưng Yên (Tháng 4 năm 2008). 70 Hình 3.8 : Bao bì các thuốc trừ sâu Abatimec, Saromite và Aweijunsu 70 Hình 3.9 : Ruộng trồng Ngưu tất tại xã Duyên Hà - huyện Thanh Trì - Hà Nội 71 Hình 3.10 : Bao bì thuốc trừ bệnh Anvil và thuốc trừ cỏ Mizin tại xã Duyên Hà – huyện Thanh Trì - Hà Nội 71 Hình 3.11 : Phỏng vấn hộ nông dân trồng cây thuốc tại xã Hòa Bình, huyện Hà Trung–Thanh Hóa 72 Hình 3.12 : Trồng Ích mẫu, Bạch chỉ tại xã Vạn phúc-Thanh trì-Hà nội (Tháng 4 năm 2009) 72 Hình 3.13 : Bao bì thuốc trừ cỏ GROSATE 480SC tại Vạn phúc Thanh trì (Tháng 7 năm 2009) 73 Hình 3.14 : Bao bì các thuốc trừ sâu Peran và Gà nòi tại xã Vạn Phúc – Thanh Trì – Hà Nội (Tháng 4 năm 2009) 73 Hình 3.15 : Bao bì thuốc trừ bệnh AryGreen và Thuốc trừ sâu SuperTOX tìm thấy tại Vạn Phúc – Thanh trì (Tháng 7 năm 2009) 74 Hình 3.16 : Các dược liệu Cúc hoa và Mã đề trồng tại xã Tự nhiên – Thường tín – Hà Tây (tháng 4 năm 2008) 74 Hình 3.17 : Chai đựng thuốc Lannate và Marshal tại xã Tự nhiên - Thường Tín – Hà Tây (tháng 4 năm 2008) 75 Hình 3.18 : Đồ thị biểu diễn chương trình nhiệt độ lò cột theo thời gian để tách tốt các HCBVTV nhóm OC 77 Hình 3.19 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 20 chất chuẩn OC đo trên GC-MS theo chế 79
  7. 7. 6 độ SCAN (nồng độ 50ng.ml-1 ) Hình 3.20 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 20 chất chuẩn OC (50 ng.ml-1 ) đo trên GC-MS theo dạng SCAN (chương trình GC-MS 54,7 phút) 80 Hình 3.21 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 20 chất chuẩn OC đo trên GC-MS theo dạng SIM (Nồng độ 50ng.ml-1) 82 Hình 3.22 : Đường chuẩn của α-HCH bằng phương pháp GC-MS 82 Hình 3.23 : Chương trình nhiệt độ sử dụng phân tích các mẫu OP 85 Hình 3.24 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 9 chất chuẩn OP (50 ng.g-1 ) đo trên GC - MS theo dạng SCAN 86 Hình 3.25 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 9 chất chuẩn OP (50 ng.g-1 ) đo trên GC - MS theo dạng SIM 87 Hình 3.26 : Chương trình nhiệt độ cột phân tích các mẫu OP-OC-PY 88 Hình 3.27 : Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn OC và OP đo trên GC-MS theo dạng SCAN 89 Hình 3.28 : Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn OC, OP và PY và một số HCBVTV nhóm khác đo trên GC-MS theo dạng SCAN 90 Hình 3.29 : Đường chuẩn của Disulfoton bằng phương pháp GC-MS 92 Hình 3.30 : Chương trình nhiệt độ tách các BHC trên GC-MS/NCI 98 Hình 3.31 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 4 chuẩn HCH (nồng độ 10ppb) đo trên GC- MS/NCI theo dạng SCAN 98 Hình 3.32 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 4 chuẩn HCH (nồng độ 10 ppb) đo trên GC-MS/EI theo dạng SCAN 98 Hình 3.33 : Sắc ký đồ của hỗn hợp 4 chuẩn HCH đo trên GC-MS/NCI theo dạng SCAN 99 Hình 3.34 : Đường chuẩn của 4 chất chuẩn HCH (Xem phụ lục) (5 điểm, nồng độ: 50ng.ml-1 ; 100ng.ml-1 ; 200ng.ml-1 ; 400ng.ml-1 và 1000ng.g-1 ) 100 Sơ đồ 3.1 : Quy trình chuẩn bị mẫu theo phương pháp siêu âm 109 Sơ đồ 3.2 Quy trình chuẩn bị mẫu theo phương pháp Soxhlet 111 Sơ đồ 3.3 : Quy trình phân tích định tính HCBVTV trong dược liệu 118 Sơ đồ 3.4 : Quy trình phân tích dư lượng HCBVTV trong dược liệu 119
  8. 8. 7 PHẦN A - TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 1. Kết quả nổi bật của đề tài a) Đóng góp mới của đề tài: 1/ Đề tài đã tiến hành khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây dược liệu ở một số xã quanh khu vực Hà Nội từ 01/2008 đến 07/2009 và đã bổ sung danh mục các HCBVTV thường sử dụng trong trồng cây thuốc, cũng như những vi phạm về HCBVTV hạn chế hoặc cấm sử dụng, hoặc không được phép sử dụng ở Việt Nam. 2/ Xây dựng được qui trình ổn định, hợp lý để định tính, định lượng 44 hóa chất bảo vệ thực vật thường dùng chính xác và nhanh chóng bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS). 3/ Áp dụng qui trình đã xây dựng để phân tích sàng lọc định tính, định lượng dư lượng HCBVTV bằng phương pháp GC-MS trong 110 mẫu dược liệu và 17 mẫu nông sản, so sánh kết quả với mức dư lượng tối đa cho phép được qui định trong dược điển một số nước tiên tiến. 4/ Đề xuất 4 qui trình phân tích dư lượng HCBVTV trong dược liệu bằng phương pháp GC-MS. 5/ Đề xuất quy định mức dư lượng tối đa cho phép của một số HCBVTV trong dược liệu. b) Kết quả cụ thể: 1/ Đề tài đã tiến hành khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây dược liệu ở một số xã gần khu vực Hà Nội: xã Duyên Hà, xã Vạn Phúc (Thanh Trì – Hà Nội ), xã Tự Nhiên ( Thường Tín –Hà Tây), xã Bình Minh (Khoái Châu – Hưng Yên) và Xã Hoà Bình - Hà Trung - Thanh Hoá trong thời gian từ 01/2008 đến 07/2009. Kết quả đã thống kê được 24 loài cây thuốc đang được trồng tại 5 xã khảo sát. Số thương phẩm HCBVTV dùng trong trồng cây thuốc thống kê được là 102 thương phẩm, tương ứng với 50 hoạt chất (bao gồm dạng dùng đơn chất và dùng phối hợp). Trong đó, phân loại theo tác dụng có 79 chế phẩm là thuốc trừ sâu (chiếm 77,45%). Phân loại theo bản chất cấu
  9. 9. 8 tạo hóa học, các HCBVTV nhóm OP có 28 thương phẩm (dạng đơn và phối hợp), chiếm 27,45% và nhóm PY có 23 thương phẩm (dạng đơn và phối hợp), chiếm 22,55%. OP và PY là hai nhóm hoạt chất được sử dụng nhiều hơn cả. Kế đến là nhóm Neireistoxin có 10 chế phẩm, chiếm 9,81%; Avermectin có 8 chế phẩm (7,84%); Carbamat có 5 chế phẩm, chiếm 4,90%; OC có 3 chế phẩm, chiếm 2,94%. Còn lại là các hoạt chất thuộc các nhóm HCBVTV khác hoặc chưa được phân loại (24,51%). 2/ Xây dựng được quy trình ổn định, hợp lý để định tính, định lượng 44 HCBVTV thường dùng một cách chính xác và nhanh chóng bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam, gồm: Các quy trình xử lý mẫu thích hợp với các đối tượng dược liệu và 4 chương trình sắc ký trên GC-MS để định tính và định lượng HCBVTV ở mức độ vết. 3/ Áp dụng qui trình đã xây dựng để phân tích sàng lọc định tính, định lượng dư lượng HCBVTV bằng phương pháp GC-MS trong 110 mẫu dược liệu, bao gồm dược liệu thu mua ở địa phương trồng, dược liệu nhập từ Trung Quốc. Kết quả định tính cho thấy 14/110 mẫu dược liệu và 4/17 mẫu nông sản nhiễm HCBVTV. Kết quả định lượng HCBVTVtrên 53 mẫu khảo sát cho thấy có 6/53 mẫu nhiễm dư lượng Cypermethrin, trong đó có 2 mẫu Cúc hoa và Khổ sâm cho kết quả dư lượng (tương ứng là 2,7 và 2,9 ppm) vượt mức giới hạn cho phép (Theo BP2005-2009; USP 26-31 quy định dư lượng tối đa cho phép tổng Cypermethrin và các đồng phân là 1,0 ppm). Ngoài ra 2 mẫu dược liệu nhiễm OC nhưng đều dưới ngưỡng cho phép là Khổ sâm (nhiễm alpha- HCH và beta-HCH với hàm lượng mỗi chất = 0,003ppm < MRL = 0,3ppm) và Kinh giới (nhiễm delta-HCH 0,01ppm < MRL = 0,3ppm; Endrin 0,002ppm < MRL = 0,05ppm). Từ các kết quả thu được có thể đánh giá chất lượng dược liệu được trồng và sử dụng ở Việt Nam về mặt tồn dư HCBVTV ở mức độ không nghiêm trọng nhưng vẫn cần được kiểm soát.
  10. 10. 9 4/ Đề xuất qui trình phân tích dư lượng HCBVTV trong dược liệu bằng phương pháp GC-MS: qui trình định tính sàng lọc đồng thời các HCBVTV trong dược liệu, qui trình định lượng bằng phương pháp GC-MS. 5/ Đề xuất qui định mức dư lượng tối đa cho phép của một số HCBVTV trong dược liệu. c) Hiệu quả về đào tạo: - Hướng dẫn 01 dược sĩ đại học đã bảo vệ thành công khóa luận tốt nghiệp: Phân tích dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm cơ phospho và pyrethroid trong một số dược liệu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ” (Đỗ Thị Kim Tuyến - Tháng 6 năm 2008) - Tham gia giảng dạy chuyên đề “Kiểm nghiệm dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu bằng phương pháp GC-MS” cho lớp tập huấn cán bộ kiểm nghiệm dược liệu của trường đại học Dược Hà Nội và vụ Y học cổ truyền (Bộ Y tế) tổ chức. - Bồi dưỡng kiến thức cho một số cán bộ mới ra trường thông qua một số nội dung nghiên cứu của đề tài: kỹ thuật chiết tách - làm giàu, kỹ thuật phân tích,.. d) Hiệu quả về kinh tế: Đề tài đã khai thác triệt để và hiệu quả những phương tiện sẵn có tại cơ quan chủ trì đề tài là Viện Dược liệu (máy sắc ký khí, máy sắc ký khí khối phổ,…) để triển khai và nghiên cứu theo các nội dung của đề tài được phê duyệt. e) Hiệu quả về xã hội: - 01 công trình khoa học có liên quan đã công bố trên Tạp chí Dược liệu, Tập 14, Số 6 (2009): ”Kết quả điều tra sơ bộ tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại một số địa phương”. - Việt Nam là một trong những quốc gia sử dụng nhiều HCBVTV trong nông nghiệp nói chung và trong trồng dược liệu nói riêng. Qua khảo sát đã đánh giá được tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng dược liệu, sẽ kiến nghị với các cấp quản lý có thẩm quyền nhằm mục đích hạn chế việc sử dụng
  11. 11. 10 HCBVTV trong trồng dược liệu, áp dụng việc quản lý dịch hại tổng hợp trong trồng dược liệu và áp dụng các quy trình dược liệu sạch, qua đó sẽ tiết kiệm được tiền mua HCBVTV. - Kết quả phân tích các mẫu dược liệu trồng trong nước đã cho thấy dư lượng thực tế trong các mẫu dược liệu, qua đó đã sơ bộ kết luận phần lớn các mẫu dược liệu trên thị trường không có dư lượng vượt quá quy định đối chiếu theo Dược điển của các nước tiên tiến (Châu Âu, Mỹ…), tình hình chất lượng dược liệu về dư lượng HCBVTV không đến mức trầm trọng như các phương tiện thông tin đại chúng đã đưa tin. f) Các hiệu quả khác. Đề tài đã chứng minh khả năng áp dụng thiết bị GC-MS trong phân tích sàng lọc, định tính và định lượng dư lượng HCBVTV trong dược liệu và nông sản nhanh chóng và tiện lợi, tăng cường hiệu quả sử dụng của trang thiết bị. 2. Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội. - Đã áp dụng kết quả nghiên cứu vào kiểm nghiệm dư lượng HCBVTV trong dược liệu nhằm đảm bảo và nâng cao chất lượng thuốc có nguồn gốc thực vật. - Trong quá trình điều tra tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc và nông sản, chúng tôi thấy rằng hiện nay, trên thị trường có nhiều loại HCBVTV ngoài danh mục được phép lưu hành (mặc dù có cùng hoạt chất trong Danh mục hóa chất bảo vệ được phép sử dụng ở Việt Nam). Qua đây kiến nghị Bộ Y tế phối hợp với Bộ NN & PTNT có biện pháp thích hợp và khẩn trương rà soát lại Danh mục hoá chất bảo vệ thực vật được phép sử dụng, hạn chế và cấm sử dụng ở Việt Nam theo hướng kiên quyết loại bỏ khỏi danh mục những thuốc có nguy cơ ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ con người, sinh vật và môi trường. Đồng thời cần điều tra thống kê các HCBVTV hiện đang được bán trên thị trường và được sử dụng trong nông nghiệp mà chưa được đăng ký. 3. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt.
  12. 12. 11 a/ Tiến độ: Hoàn thành theo đúng dự kiến (26 tháng- từ tháng 11 năm 2007- 12 năm 2009). b/ Thực hiện các mục tiêu nghiên cứu: Đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu nghiên cứu của đề tài. c/ Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương: Các sản phẩm thu được hoàn toàn trùng khớp và phù hợp với dự kiến. d/ Đánh giá việc sử dụng kinh phí: Sử dụng kinh phí đúng mục đích, hiệu quả và theo đúng quy định. 4. Các ý kiến đề xuất: - Bộ Y tế cần có những văn bản quản lý và hướng dẫn sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu; cảnh báo người dân về tình trạng lạm dụng sử dụng HCBVTV trong trồng dược liệu, cũng như khuyến cáo người dân thực hiện đúng qui định về sử dụng an toàn HCBVTV. - Nhằm đảm bảo nâng cao chất lượng dược liệu, Bộ Y tế đã bổ sung kịp thời chuyên luận phân tích dư lượng HCBVTV trong dược liệu và qui định mức dư lượng cho phép đối với một số HCBVTV có độc tính cao vào Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ tư. Tuy nhiên, cần kết hợp việc quy định mức dư lượng tối đa cho phép của các HCBVTV với Danh mục hóa chất bảo vệ thực vật cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng tại Việt Nam Ban hành theo quyết định của Bộ NN & PTNT năm 2009 (Thông tư Số: 09 /2009/TT-BNN). - Bộ Y tế nên phối hợp với Bộ Nông NN & PTNT rà soát lại Danh mục hoá chất bảo vệ thực vật được phép sử dụng và hạn chế sử dụng ở nước ta nhằm đưa ra những biện pháp thích hợp và kịp thời đảm bảo chất lượng nông sản và dược liệu, cũng như an toàn sử dụng cho người dân.
  13. 13. 12 PHẦN B. NỘI DUNG ĐỀ TÀI ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phá hoại của sâu bệnh là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn tới năng suất, chất lượng của cây thuốc nói riêng và cây nông nghiệp nói chung. Hiện nay, phương pháp dùng hoá chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) là một phương pháp phòng trừ sâu bệnh hại hiệu quả nhất. Tuy nhiên, hiệu quả của việc sử dụng HCBVTV ra sao, ảnh hưởng của chúng đến sức khỏe con người và môi trường như thế nào là vấn đề đang được quan tâm. Hiện nay, ước tính trên thế giới có trên 5000 loại HCBVTV khác nhau, trong đó khoảng 200 loại HCBVTV ảnh hưởng mạnh tới sức khoẻ con người và độc hại với môi trường, trong số đó có nhiều chất có khả năng gây ung thư. Theo thống kê, Việt Nam là một trong những nước sử dụng HCBVTV nhiều nhất trên thế giới. Theo Báo cáo thống kê của Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường năm 2007, lượng HCBVTV nhập vào Việt Nam khoảng 77 nghìn tấn. Thực tế hiện nay, chúng ta vẫn chưa thực sự kiểm soát chặt chẽ được việc sử dụng HCBVTV đúng cách. Trên thị trường có nhiều HCBVTV chưa được kiểm tra cũng như đánh giá mức độ nguy hại nhưng vẫn công khai mua bán và sử dụng. Các HCBVTV loại này xuất phát chủ yếu từ Trung Quốc, do người dân mua bán không chính ngạch qua biên giới các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh,.. Tuy các cơ quan chức năng đã có các hướng dẫn cụ thể cho người dân về vấn đề sử dụng HCBVTV an toàn, hiệu quả trên cây nông nghiệp và một số cây ăn quả nhưng chưa có hướng dẫn cụ thể đối với cây thuốc. Bên cạnh đó, sử dụng các chất bảo quản chống nấm mốc, mối mọt cho một số nông sản và dược liệu cũng là vấn đề đáng được lưu tâm. Việc sử dụng HCBVTV đúng cách còn phụ thuộc rất nhiều vào trình độ dân trí và ý thức của người dân ở từng vùng miền. Tuy nhiên nếu kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng HCBVTV an toàn và hiệu quả sẽ giảm tối đa các tác
  14. 14. 13 động nguy hại đến sức khỏe con người cũng như môi trường sinh thái. Kiểm soát mức dư lượng HCBVTV trong thực phẩm nói chung và dược liệu nói riêng là việc làm cần thiết và cấp bách. Dược điển nhiều nước (Mỹ, Châu Âu, Anh, Nhật Bản...) đã quy định mức dư lượng cho phép của HCBVTV trong thực phẩm và dược liệu. Điều này giúp họ kiểm soát được chất lượng nguồn thực phẩm, dược liệu trong nước cũng như nhập khẩu từ nước ngoài. Mặc dù Việt Nam đã có một số nghiên cứu khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc và xây dựng qui trình phân tích tồn dư của chúng, nhưng cho tới nay vẫn chưa có các quy định về mức dư lượng cho phép của HCBVTV trong dược liệu cũng như các qui trình thường qui về phương pháp kiểm tra, đánh giá HCBVTV trong dược liệu. Nhằm góp phần nâng cao chất lượng dược liệu và nông sản, kết hợp khai thác sử dụng hiệu quả một số kỹ thuật hiện đại và các thiết bị phân tích tiên tiến, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng sắc ký khí khối phổ để phân tích dư lượng một số hóa chất bảo vệ thực vật thường dùng” với mục tiêu: 1. Xây dựng quy trình định tính, định lượng một số HCBVTV thường dùng một cách chính xác và nhanh chóng bằng sắc ký khí khối phổ (GC-MS). 2. Áp dụng qui trình phân tích một số HCBVTV bằng phương pháp GC- MS trên những mẫu nông phẩm và cây thuốc.
  15. 15. 14 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. HCBVTV VÀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HCBVTV 1.1.1. Đại cương về HCBVTV 1.1.1.1. Khái niệm HCBVTV Từ những năm 20 trước Công nguyên, con người đã biết sử dụng chất bảo vệ thực vật để bảo vệ mùa màng. Số lượng, chủng loại HCBVTV ngày càng tăng. Từ những năm 1940 trở đi HCBVTV dạng tổng hợp được sản xuất với số lượng lớn dần. Theo Uỷ ban bảo vệ môi trường Mỹ, HCBVTV là khái niệm chỉ những chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên, hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học dùng để phòng, trừ (diệt) các sinh vật gây hại tài nguyên thực vật, các chế phẩm có tác dụng điều hòa sinh trưởng thực vật, các chế phẩm có tác dụng xua đuổi hoặc thu hút các sinh vật gây hại đến để diệt trừ chúng. Các HCBVTV cũng bao gồm các hóa chất được sử dụng trong việc bảo quản, lưu trữ và vận chuyển nông sản sau khi thu hoạch [78]. 1.1.1.2. Phân loại HCBVTV HCBVTV được sử dụng rộng rãi trên thế giới từ giữa thế kỷ 20. Theo tài liệu biên soạn năm 2003 của Hội Bảo vệ thực vật Anh, có khoảng 860 hoạt chất được sử dụng trong các thương phẩm HCBVTV [76]. Để thuận tiện trong quá trình sử dụng cũng như công tác quản lý HCBVTV, người ta thường phân loại chúng thành các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, sự phân loại HCBVTV cũng rất đa dạng, tùy thuộc mục đích. HCBVTV có thể phân loại theo tác dụng, theo nhóm hoạt chất, theo thành phần nguyên tố hay theo độc tính…Thông thường, ta chỉ quan tâm đến tác dụng và thành phần nguyên tố hay nhóm hoạt chất trong thuốc trừ sâu [2], [82]. a/ Theo tác dụng:
  16. 16. 15 Các HCBVTV được chia thành 3 nhóm chính [2]: - Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại: diệt côn trùng, như thuốc trừ sâu, trừ nấm, diệt cỏ, diệt chuột, trừ ốc sên, trừ nhện, thuốc trừ các loài ve, rệp, muỗi, thuốc trừ côn trùng. - Hóa chất điều hoà sinh trưởng thực vật, thường gọi là thuốc kích thích thực vật, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hoá học hay vi sinh. - Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hoạch. b/ Theo thành phần hóa học hay nhóm hoạt chất: Các thuốc HCBVTV được chia nhóm theo thành phần hóa học hoặc cấu trúc hóa học của các hoạt chất có trong thành phần [82]: - Nhóm các HCBVTV clo hữu cơ (cơ clor hay OC): Trong thành phần hóa học chứa clo và clo có tác dụng chính. Ví dụ: DDT, HCH, Aldrin, Dieldrin, 2,4-D, 2,4,5-T (Hình 1.1). Hiện nay, các hợp chất OC đã bị cấm sử dụng nhưng do tính bền vững, chúng vẫn tồn tại trong môi trường, đất canh tác hay nguồn nước. Do vậy chúng có thể nhiễm vào dược liệu, nông phẩm. DDT HCH Aldrin Endosulfan Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm OC
  17. 17. 16 Nhóm OC độc với tế bào thần kinh côn trùng do liên kết với một số thành phần sợi trục thần kinh làm cản trở vận chuyển các ion Na+ , K+ qua màng tế bào chất, làm mất sự cân bằng điện tích tạo nên sự dẫn truyền xung động thần kinh dẫn đến thần kinh bị tê liệt [2]. - Nhóm phosphor hữu cơ (cơ phosphor hay OP): Điển hình như triclorfon (Ophatox), methamidophos, methyl parathion (methaphos), phosphamidon, melathion (Hình 1.2). Acephat Triclorfon Methyl parathion Methamidophos Diazinon Dimethoat Hình 1.2. Công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm OP Nhóm OP là các chất độc đối với hệ thần kinh, tác động lên enzym acetylcholinesterase (nhóm carbamat cũng tác động lên enzym này nhưng theo cơ chế khác). Các OP làm ức chế không thuận nghịch enzym acetylcholinesterase (một enzym quan trọng đối với các chức năng thần kinh
  18. 18. 17 của côn trùng, người và rất nhiều động vật) và tác động theo nhiều cách khác nhau, do vậy OP rất độc [2], [82]. OP nhanh chóng bị phân hủy bởi phản ứng thủy phân khi để dưới ánh sáng, trong không khí và trong đất trồng. Mặc dù một lượng nhỏ đôi khi vẫn được phát hiện thấy trong thực phẩm và trong nước uống. OP phân hủy nhanh hơn OC, tuy nhiên độc tính của OP lại cao hơn và rủi ro đối với sức khoẻ con người sẽ rất cao khi hấp thụ một lượng lớn vào cơ thể [55]. Các OP được sử dụng phổ biến ở Việt Nam. Một số hợp chất như Methamidophos (Monitor), Methyl parathion (Wophatox) tuy đã bị cấm nhưng một số điều tra cho thấy vẫn được sử dụng trái phép [7], [13]. Pyrethroid (PY): là nhóm các hợp chất hóa học được tổng hợp tương tự các hợp chất Pyrethrin tự nhiên có trong các loài cúc trừ sâu pyrethrum (Chrysanthemum cinerariaefolium và C. coccineum). Hiện nay, PY là nhóm hợp chất tổng hợp được sử dụng rộng rãi nhất ở Việt Nam và trên thế giới. PY nhanh chóng bị phân hủy bởi ánh sáng và trong điều kiện khí quyển bình thường sau từ 1-2 ngày và gần như không ảnh hưởng đến chất lượng nước mặt [82]. PY là thuốc trừ sâu thuộc nhóm chất độc thần kinh do chúng có khả năng giữ các kênh vận chuyển Na+ trên màng tế bào thần kinh luôn mở khiến cho các ion Na+ vận chuyển tự do đến các sợi trục thần kinh và gây ra các phản ứng tại đó. Khi bị nhiễm PY, hệ thần kinh bị giảm khả năng nhạy cảm và côn trùng bị tê liệt. Cypermethrin Deltamethrin
  19. 19. 18 Fenvalerat Permethrin Hình 1.3. Công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm PY Cả 3 nhóm OC, OP và PY đều là các chất diệt côn trùng. Ngoài ra, còn có một số nhóm khác, như thuốc diệt nấm dẫn xuất Carbamat, thuốc trừ sâu Carbamat (carbaryl, cartap, methiocarb), trừ nấm Carbendazim, Dithiocarbamat (ferbam, maneb, thiram) ,... [82]. Hình 1.4 Cartap Nereistoxin Hình 1.4. Công thức cấu tạo của một số HCBVTV thuộc nhóm khác Tính chất hoá học và vật lý của các HCBVTV cũng khác nhau đáng kể. Có một số HCBVTV mang tính acid, số khác trung tính hoặc base. Một số hợp chất chứa các halogen, số khác chứa phospho, lưu huỳnh hoặc nitơ. Các dị tố này có thể có mối liên quan đến việc phát hiện ra HCBVTV. Một số hợp chất rất dễ bay hơi, nhưng số khác lại gần như không bay hơi. Sự khác nhau đa dạng này là nguyên nhân của các vấn đề cơ bản trong việc xây dựng và phát triển các phương pháp phân tích đa dư lượng (phân tích dư lượng nhiều chất đồng thời) nhằm tăng khả năng phát hiện các HCBVTV [76]. 1.1.2. Tình hình sử dụng HCBVTV 1.1.2.1. Tình hình sử dụng HCBVTV trên thế giới:
  20. 20. 19 Ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng trên 5000 loại HCBVTV độc hại (khoảng 860 hoạt chất ), trong đó có từ 150 đến 200 loại HCBVTV có ảnh hưởng mạnh tới sức khoẻ của con người thậm chí có khả năng gây ung thư. Các chất này thuộc về hơn 100 nhóm chất. Trong đó, các nhóm quan trọng nhất là benzoylureas, carbamates, các hợp chất OP, PY, sulfonylurea hoặc triazine,…[76] Theo con số thống kê, lượng HCBVTV được sử dụng ở Việt Nam từ năm 1986 - 1990 khoảng 13 -15 nghìn tấn [8]. Nhưng từ năm 1991 - 1999, tỷ lệ sử dụng HCBVTV có giảm đi do Việt Nam áp dụng chương trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) do FAO và chính phủ của một số nước tài trợ. Tuy nhiên, Việt Nam vẫn là một trong những nước sử dụng nhiều HCBVTV nhất thế giới. Một thực tế là hiện nay trên thị trường HCBVTV ở nước ta có rất nhiều HCBVTV không rõ nguồn gốc xuất xứ, chưa được kiểm tra đánh giá về mức độ độc hại,... nhưng vẫn được bày bán công khai và người dân thường xuyên sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. Điều này tiềm ẩn một nguy cơ lớn ảnh hưởng đến sức khoẻ con người và môi trường xung quanh [8], [13], [16]. Theo thống kê của WHO, năm 1998 toàn thế giới sử dụng 6 triệu tấn hoạt chất trong các thương phẩm HCBVTV, trị giá trên 40 tỷ USD. Mỗi năm tăng bình quân 5 - 7%, tổng giá trị HCBVTV sử dụng trên toàn thế giới hiện nay ước tính khoảng 60 tỷ USD, trong đó hóa chất diệt côn trùng được sử dụng nhiều nhất [12]. Đánh giá của WHO và chương trình bảo vệ môi trường của Liên hợp quốc (năm 2004) cho biết: mỗi năm 3 triệu nông dân ở các nước đang phát triển bị nhiễm độc từ HCBVTV và trong số đó, khoảng 18000 người chết [58]. 1.1.2.2. Tình hình sử dụng HCBVTV ở Việt Nam: Việt Nam là quốc gia sử dụng nhiều HCBVTV, xu hướng này ngày càng tăng, cả về số lượng và chủng loại [8]. Trong quá trình phát triển, cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng thường bị hại bởi nấm, vi khuẩn, côn trùng ... ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây [20], [21] (ví dụ nấm gây bệnh phấn
  21. 21. 20 trắng, nấm Phoma sp. gây bệnh thối nâu trên cây Thanh cao hoa vàng và thối đen do nấm Alternaria sp. hoặc Nigrospora pallida Matz. gây ra; rệp gây hại, virus hoa lá đốm trên cây Địa hoàng). Biện pháp phòng trừ sâu bệnh hại rất đa dạng, tuy nhiên sử dụng HCBVTV là biện pháp phổ biến nhất [15], [11] Theo các nghiên cứu của Viện Dược Liệu [20],[21], thiệt hại do sâu bệnh gây ra tại Trung tâm nghiên cứu trồng cây thuốc Hà Nội làm giảm 20 – 25% sản lượng. Trong vụ đông xuân 1995 – 1996, nấm gây bệnh phấn trắng (do Oidium sp.) đã phát triển thành dịch trên cây Mã đề gây tổn thất nặng trên hầu hết các vùng sản xuất: Hà Nội, Hưng Yên…Điều tra tình hình sâu bệnh hại cây Thanh cao hoa vàng năm 1991 - 1992 đã xác định bệnh thối nâu do nấm Phoma sp., và thối đen do nấm Alternaria sp. hoặc Nigrospora pallida Matz gây ra. Ngoài ra còn có rệp gây hại. Các bệnh do nấm làm giảm 47% hàm lượng artemisinin, bệnh do rệp làm giảm khoảng 18% năng suất dược liệu. Nghiên cứu về bệnh virus hoa lá đốm trên cây Địa hoàng ở Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nội và Hải Phòng từ 1988 - 1995 cho thấy tỷ lệ bệnh ở vụ Xuân Hè là 20%. Từ năm 1998, Thủ tướng chính phủ đã có Chỉ thị số 29/2000/CT-TTg về tăng cường công tác quản lý việc sử dụng HCBVTV và các chất hữu cơ gây ô nhiễm khó phân huỷ (ví dụ như các Polyclobiphenyl hay PCBs). Theo đó, bắt đầu từ năm 2001 đến nay, hàng năm Bộ NN & PTNT ban hành Danh mục HCBVTV được phép, hạn chế và cấm sử dụng ở Việt Nam [3], [4], [5], [6] .Số lượng HCBVTV được phép sử dụng trong các danh mục trên được thống kê trong Bảng 1.1. Bảng 1.1: Thống kê số lượng HCBVTV được phép sử dụng ở Việt Nam Số lượng TT Khoản mục Năm 2001 Năm 2004 Năm 2008 Năm 2009 1 Tổng HCBVTV 278 418 744 886 2 Số thương phẩm 808 1212 2242 3795
  22. 22. 21 3 Thuốc trừ sâu (Hoạt chất/Thương phẩm) 108/337 160/499 292/959 365/1837 4 Thuốc trừ bệnh (Hoạt chất/Thương phẩm) 78/252 125/364 221/654 264/1063 5 Thuốc diệt cỏ (Hoạt chất/Thương phẩm) 74/191 96/266 130/400 151/549 6 Thuốc điều hoà sinh trưởng (Hoạt chất/Thương phẩm) 18/28 22/51 44/102 47/188 Số liệu thống kê từ Bảng 1.1 cho thấy số lượng HCBVTV được phép sử dụng ở Việt Nam được Bộ NN & PTNT ban hành tăng dần theo các năm. Cụ thể, năm 2004 có 418 HCBVTV / 1212 thương phẩm, năm 2008 có 744 HCBVTV / 2242 thương phẩm và năm 2009 (được bổ sung từ danh mục năm 2008) là 886 HCBVTV / 3795 thương phẩm. Trong danh mục này, thuốc trừ sâu chiếm nhiều nhất và tăng nhanh theo các năm. Danh mục hoạt chất hạn chế và cấm sử dụng tại Việt Nam năm 2009 được liệt kê trong Bảng 1.2 Bảng 1.2. Danh mục hoạt chất hạn chế và cấm sử dụng tại Việt Nam (năm 2009) TT Hoạt chất TT Hoạt chất Danh mục các hoạt chất hạn chế sử dụng 1 Carbofuran 7 Zinc phosphid 2 Dichlorvos (DDVP) 8 Na2SiF6 50% + HBO3 10% + CuSO4 30% 3 Dicofol 9 Na2SiF6 80% + ZnCl2 20% 4 Dicrotophos 10 Aluminium phosphid
  23. 23. 22 5 Diclorvos 13% + Deltamethrin2% 11 Magnesium phosphid 6 Methomyl 12 Methyl bromid Danh mục hoạt chất cấm sử dụng 1 Aldrin 13 Monocrotophos 2 BHC, Lindane (γ-BHC, γ-HCH) 14 Parathion – ethyl 3 Chlordane 15 Pentachlorophenol 4 DDT 16 Pentachlorophenat Sodium 5 Dieldrin 17 Phosphamidon 6 Endosulfan 18 Polychlorocamphen 7 Endrin 19 Chlordimeform 8 Heptachlor 20 Captan 9 Isobenzen 21 Captafol 10 Isodrin 22 Hexachlorobenzen 11 Methamidophos 23 2,4,5 - T 12 Parathion - methyl 24- 29 Các hợp chất của As, Tl, Cd, Hg, Se, Pb Thực tế trên thị trường còn có rất nhiều hoạt chất lưu hành nhưng không có trong danh mục được phép sử dụng, một số HCBVTV đã bị cấm như Parathion-methyl (Wofatox), Methamidophos (Monitor) vẫn được người dân sử dụng trái phép trong trồng trọt [6]. Về tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc, các tác giả Trịnh Văn Quỳ [16], và Trần Việt Hùng [13] đã tiến hành nghiên cứu khảo sát ở 3 địa phương có truyền thống trồng cây thuốc: Thiết Trụ, Nghĩa Trai (Hưng Yên) và Sapa (Lào Cai) từ năm 2002-2004. Kết quả cho thấy hầu hết các hộ dân cả 3 nơi đều sử dụng HCBVTV, đã thống kê được 99 tên HCBVTV được sử dụng, trong đó có 64 thuốc diệt côn trùng, 19 thuốc trừ bệnh, 8 thuốc điều hòa sinh trưởng, 7 thuốc diệt cỏ, 1 thuốc diệt chuột.
  24. 24. 23 Trong số các HCBVTV đã thống kê được ở trên, ngoài các thuốc nằm trong danh mục HCBVTV cho phép sử dụng ở Việt Nam, còn có các thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc chứa Methamidophos và Endosulfan là thuốc cấm sử dụng, các thuốc khác như Kẽm phosphid thuộc danh mục hạn chế sử dụng [6]. Do việc hướng dẫn sử dụng HCBVTV chủ yếu cho cây nông nghiệp và cây ăn quả, chưa có sự hướng dẫn cụ thể đối với cây thuốc, vấn đề sử dụng HCBVTV đối với cây thuốc chủ yếu người dân vận dụng theo công dụng của thuốc [6], [14]. Năm 2001, nhà nước đã phê duyệt đề tài nghiên cứu cấp nhà nước KC 10-02 "Xây dựng một số qui trình sản xuất dược liệu sạch và chế biến sạch để bào chế một số chế phẩm chất lượng cao" do Viện Dược liệu chủ trì. Kết quả đạt được của đề tài là đã nghiên cứu, kết hợp với doanh nghiệp và nông dân trồng và phát triển một số dược liệu an toàn như: Actiso (Sa Pa, Lào Cai), Bạch chỉ, Ngưu tất (Thanh trì, Hà Nội), Cúc hoa (Nghĩa Trai, Hưng Yên)…Mặc dù vậy, trồng cây thuốc ở nước ta trong giai đoạn này vẫn mang tính chất trồng ở quy mô nhỏ lẻ, chưa có sự tập trung đầu tư lớn, chưa mang tính ổn định và lâu dài, áp dụng tiêu chuẩn GAP mới bắt đầu, chưa rộng rãi [19]. Trong định hướng chiến lược về công tác dược liệu đến 2010 và tầm nhìn 2015, Bộ Y tế đã xác định mục tiêu cụ thể trong công tác phát triển dược liệu, trong đó vấn đề quy hoạch và xây dựng các vùng trồng cây thuốc theo tiêu chuẩn GAP (Good Agricultural Practice - Thực hành tốt nông nghiệp) là một nhiệm vụ cấp bách. Đối với sử dụng HCBVTV, tiêu chuẩn GAP yêu cầu: Các HCBVTV sử dụng phải thuộc danh mục nhà nước cho phép; HCBVTV phải được nhà nước đánh giá chất lượng, phải có nhãn mác đầy đủ; Việc sử dụng HCBVTV phải tuân thủ nghiêm ngặt quy phạm. Sử dụng hóa chất gì phải ghi trong hồ sơ và phải kiểm tra dư lượng của chất đó… [81] Khái niệm dược liệu sạch đòi hỏi sự vận dụng sáng tạo những nguyên tắc nhất định và cần triển khai từng bước theo những tiêu chí cụ thể [1], [14].
  25. 25. 24 Ngày nay, sử dụng HCBVTV phải tuân theo yêu cầu nhất định (Tiêu chuẩn GAP) nhằm đạt hiệu quả phòng trừ dịch hại và phải khống chế tối đa mức tồn dư HCBVTV trong dược liệu. Đối với các HCBVTV có khả năng tích lũy trong cơ thể, gây đột biến tế bào hoặc có độc tính cấp cao, được nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam có quy định cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng [82]. Đời sống người dân ngày càng được nâng cao, theo đó các vấn đề liên quan đến sức khỏe và môi trường được quan tâm hàng đầu. Cùng với mặt tích cực của nền kinh tế thị trường, mặt trái của nó luôn cùng tồn tại. Do vậy, các hàng rào về chất lượng và độ an toàn các sản phẩm nông nghiệp ngày càng được quan tâm thắt chặt hơn. Tất yếu của hội nhập hiện đại gắn liền với chất lượng sản phẩm lưu thông. Điều đó ép buộc đồng thời thôi thúc chúng ta cần xây dựng một quy trình đánh giá chất lượng các mặt hàng sản phẩm nông nghiệp một cách có hiệu quả. Các mô hình trồng cây lương thực và cây thuốc theo tiêu chuẩn GAP hay GACP dần được thiết lập và hoàn thiện. Dư lượng HCBVTV là một trong các tiêu chí quan trọng phản ánh độ an toàn và chất lượng sản phẩm. Do đó việc kiểm soát mức dư lượng cho phép đánh giá mức hiệu quả của quy trình sản xuất. Các thiết bị phân tích công cụ hiện đại như GC, GC-MS, LC-MS,.. sẽ có những trợ giúp quan trọng trong việc xây dựng và đánh giá các tiêu chí về dư lượng cho phép của HCBVTV trên cây lương thực nói chung và cây thuốc nói riêng. 1.2. DƯ LƯỢNG HCBVTV – KHÁI NIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH. 1.2.1. Khái niệm dư lượng Dư lượng HCBVTV là lượng HCBVTV sử dụng trong nuôi trồng thực vật còn tồn dư lại trên nông sản hoặc dược liệu sau khi thu hoạch, chế biến.
  26. 26. 25 Đôi khi bao gồm cả các hóa chất sử dụng trong bảo quản và lưu giữ các sản phẩm nông nghiệp [2], [78]. Dư lượng HCBVTV thường được tính bằng miligam HCBVTV trên 1 kilogam (mg/kg) nông sản hoặc dược liệu. 1.2.2. Dư lượng tối đa cho phép - MRL (Maximum Residue Limit) Dư lượng HCBVTV tối đa cho phép là lượng HCBVTV lớn nhất được phép tồn dư trong nông sản hay dược liệu mà không gây ảnh hưởng đến cơ thể người và vật nuôi khi sử dụng [2], [70], [73]. Dư lượng tối đa được viết tắt là MRL. Tùy thuộc từng loại HCBVTV và nông sản khác nhau mà MRL cho phép khác nhau. Để đảm bảo sự an toàn đối với sức khỏe con người về chất lượng nông sản cũng như thuốc và nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc từ thực vật, các phương pháp phân tích AOAC Quốc tế và các Dược Điển tiên tiến như: BP 2007, BP 2009, Dược điển Châu âu V – EUP V (2006) và USP 30 (2007), USP 31 (2008) đều qui định mức dư lượng tối đa cho phép của nhiều HCBVTV thuộc 3 nhóm OC, OP và PY trong nông sản, thực phẩm, dược liệu hoặc thuốc có nguồn gốc thực vật [23], [70], [71], [73]. Tuỳ theo độ độc hại của mỗi HCBVTV mà mức dư lượng tối đa cho phép cụ thể được quy định khác nhau [70], [71], [73]. Bảng 1.3: MRL của các HCBVTV trong dược liệu (theo một số Dược điển) Giới hạn (mg/kg) TT Hóa chất bảo vệ thực vật BP (2009) EUP V (2006) USP 26 (2003) USP 31 (2008) 1 Alachlor 0,02 0,02 0,02 0,02
  27. 27. 26 2 Aldrin and Dieldrin (tổng cộng) 0,05 0,05 0,05 0,05 3 Azinphos – methyl 1,0 1,0 1,0 1,0 4 Bromopropylat 3,0 3,0 3,0 3,0 5 Chlordan (tổng các đồng phân) 0,05 0,05 0,05 0,05 6 Chlorfenvinphos 0,5 0,5 0,5 0,5 7 Chlorpyriphos 0,2 0,2 - 0,2 8 Chlorpyriphos – methyl 0,1 0,1 - 0,1 9 Cypermethrin (tổng các đồng phân) 1,0 1,0 1,0 1,0 10 DDT (tổng các đồng phân) 1,0 1,0 1,0 1,0 11 Deltamethrin 0,5 0,5 0,5 0,5 12 Diazinon 0,5 0,5 0,5 0,5 13 Dichlorvos 1,0 1,0 1,0 1,0 14 Dithiocarbamates (như CS2) 2,0 2,0 2,0 2,0 15 Endosulfan (tổng các đồng phân) 3,0 3,0 3,0 3,0 16 Endrin 0,05 0,05 0,05 0,05 17 Ethion 2,0 2,0 2,0 2,0 18 Fenitrothion 0,5 0,5 0,5 0,5 19 Fenvalerat 1,5 1,5 1,5 1,5 20 Fonofos 0,05 0,05 0,05 0,05
  28. 28. 27 21 Heptachlor (tổng các đồng phân) 0,05 0,05 0,05 0,05 22 Hexachlorobenzen 0,1 0,1 0,1 0,1 23 Hexachlorocyclohexan (tổng các đồng phân) 0,3 0,3 0,3 0,3 24 Lindan (γ - Hexachlorocyclohexan) 0,6 0,6 0,6 0,6 25 Malathion 1,0 1,0 1,0 1,0 26 Methidathion 0,2 0,2 0,2 0,2 27 Parathion 0,5 0,5 0,5 0,5 28 Parathion - methyl 0,2 0,2 0,2 0,2 29 Permethrin 1,0 1,0 1,0 1,0 30 Phosalon 0,1 0,1 0,1 0,1 31 Piperonyl butoxid 3,0 3,0 - 3,0 32 Pirimiphos - methyl 4,0 4,0 4,0 4,0 33 Pyrethrins (tổng các đồng phân) 3,0 3,0 3,0 3,0 34 Quintozen (tổng các đồng phân) 1,0 1,0 1,0 1,0 Các Dược điển tiên tiến trên thế giới đều có quy định về MRL của HCBVTV. Số hoạt chất có quy định MRL cũng có tăng dần theo thời gian. Ví dụ USP 26 có 31 hoạt chất, đến USP 31 có thêm 3 hoạt chất mới là chlorpyriphos, chlorpyriphos-methyl và piperonyl-butoxid.
  29. 29. 28 1.2.3. Phương pháp phân tích xác định dư lượng HCBVTV. Có lẽ không có hoá chất nào lại được quy định việc sử dụng một cách tầm cỡ như các HCBVTV. Các mức dư lượng cho phép được xây dựng cho các HCBVTV trong thực phẩm hay nước uống tại hầu hết các quốc gia nhằm ngăn chặn các tác động có hại đến sức khoẻ cộng đồng và để đảm bảo việc thực hiện tốt trong sản xuất nông nghiệp. Dư lượng các thuốc diệt cỏ trong đất do được sử dụng trong vụ mùa trước đó có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng trong mùa vụ tiếp theo. Dư lượng của thuốc trừ sâu trong nước mặn có thể gây hại đến các sinh vật thuỷ sinh. Do vậ, có một lượng lớn các phòng thí nghiệm trên thế giới đã tham gia vào công tác giám sát dư lượng lớn nhất cho phép của HCBVTV trong thực phẩm hay môi trường. Việc sử dụng nhiều phương pháp phân tích dư lượng đơn lẻ (phương pháp riêng biệt được sử dụng phát hiện các chất hay nhóm chất đặc trưng) thường là quá đắt. Tuỳ thuộc vào yêu cầu đặt ra, việc xác định dư lượng HCBVTV có thể có chủ định hoặc ngẫu nhiên. Phân tích có chủ định là việc khảo sát kỹ lưỡng các mức dư lượng lớn nhất cho phép (MRL - maximum residue level) của HCBVTV đã biết trong các sản phẩm nông nghiệp. Tuy nhiên, sự chuyển hoá hay phân huỷ các HCBVTV này có thể không được biết đến và sự phát hiện cũng như nhận dạng chúng khi đó được gọi là phân tích ngẫu nhiên. Cả hai phương pháp trên đều cần có các thiết bị và phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, các thiết bị liên kết với bộ phận khối phổ (MS – mass spectrum) được sử dụng nhiều nhất trong các phân tích có chủ định. Trong một vài thập niên gần đây, phương pháp xác định mức vi lượng (dạng vết) các HCBVTV đã có những thay đổi đáng kể. Từ những năm đầu thập niên 70, hầu hết các phân tích dư lượng thuốc trừ sâu đều được tiến hành bởi hệ sắc ký khí (GC - gas chromatography) liên kết với các detector cộng kết điện tử (ECD – electron capture detector), detector Nitơ-Photpho (NPD – nitrogen-phosphorous detector) và detector quang hoá ngọn lửa (FPD - flame photometric detector). Xuất phát từ yêu cầu về tính chính xác trong kết quả
  30. 30. 29 phân tích, việc sử dụng sắc ký khí ngày càng được sử dụng ở mức độ sâu hơn với sự đa dạng hoá các loại cột phân tích sắc ký và các detector phát hiện. Ngày nay việc sử dụng GC liên kết với MS có thể xác định được đồng thời và chính xác dư lượng của nhiều thuốc trừ sâu chỉ trong một lần chạy và chỉ với một thiết bị. Trong hầu hết các trường hợp, độ nhạy thu được với GC- MS là tương đương với hệ GC cùng với các detector cổ điển. Độ chọn lọc của GC-MS có thể điều chỉnh bởi sự lựa chọn các phân mảnh ion hay ion phân tử thích hợp, nhằm tránh sự ảnh hưởng của các dung môi được dùng khi chiết tách HCBVTV. Detector ECD có thể được sử dụng trước để nhận dạng các hợp chất thông qua việc so sánh thời gian lưu các pic mẫu với pic chuẩn, tuy nhiên để xác minh rằng pic đó không lẫn các tạp chất trong mẫu thực hay chất do sự rửa giải nội sinh gây nên cần sự hỗ trợ của MS trong chế độ SIM. Do vậy, vai trò và tầm quan trọng của các hệ GC với các detector ECD, NPD, hoặc FPD giảm dần trong các phòng thí nghiệm hiện đại [54], [65]. Các phương pháp phân tích dựa trên LC được áp dụng trước đó hiếm hoi hơn. Vì các detector truyền thống như UV, diode array và huỳnh quang thường có độ nhạy và độ chọn lọc kém hơn so với thiết bị GC. Nhưng trong vài năm gần đây, nhờ khả năng sự ion hoá trong điều kiện áp suất thường đã cho sự thay đổi lớn so với các detector truyền thống. Ion hoá phun dòng electron (ESI-electron spray ionization) hoặc ion hoá hoá học (CI-chemical ionization) ở áp suất thấp và trong điều kiện kết hợp với MS đã tăng độ nhạy khi phát hiện bằng LC, đặc biệt khi hoạt động trong chế độ lựa chọn tương tác (SRM- selected reaction modul) [67], [45]. Do khả năng hạn chế hầu hết các ảnh hưởng của tín hiệu nền trong LC-MS/MS khi chạy trong điều kiện SRM nên tỷ số S/N tăng một cách rõ ràng và thang độ nhạy của thiết bị LC-MS có thể được tối ưu hoá đầy đủ [54]. Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định dư lượng HCBVTV với các kỹ thuật đa dạng và đặc trưng cho từng phương pháp, tuy nhiên phương pháp sắc ký được sử dụng nhiều hơn [30].
  31. 31. 30 Trong các phương pháp sắc ký như TLC, GC, GC-MS, LC, LC-MS và CE-MS thì hai kỹ thuật GC-MS và LC-MS được ứng dụng nhiều hơn cả do tính ưu việt của nó trong việc xác định các HCBVTV [54], [68], [69], [74], [79] [86]. 1.2.3.1. Kỹ thuật GC – MS. Sự ion hoá HCBVTV có nhiều kỹ thuật ion hóa, như kỹ thuật ion hóa bằng va chạm điện tử EI, ion hóa hóa học (NCI hoặc PCI) cùng với thiết bị tứ cực đơn (single quadrupole) được sử dụng phổ biến nhất để tách các ion. Ngoài ra có thể kết hợp hệ thống GC-MS với bẫy ion tứ cực (quadrupole ion traps), thời gian bay (time - of – flight - TOF) hoặc MS khác đều sử dụng được [54]. Hầu hết các kết quả nghiên cứu phân tích dư lượng HCBVTV bằng GC-MS đều thực hiện trên thiết bị tứ cực đơn (single quadrupole) và ion hoá bởi EI. Lợi thế của ion hoá bằng EI là ít bị ảnh hưởng cấu trúc phân tử lên các đáp ứng, đồng thời luôn có một số lượng lớn các phân mảnh ion đặc trưng. Có nhiều nghiên cứu đã mô tả bao quát việc xác định đồng thời 245 - 400 thuốc trừ sâu bằng GC - EI - MS với bộ lọc khối tứ cực đơn (single quadrupole mass filters) [28], [30], [37], [66]. Việc sử dụng các bẫy ion (ion traps-IT) trong chương trình chạy quét (SCAN) đơn giản hơn vì không cần sự lựa chọn các ion đặc trưng cần thiết trong suốt quá trình thu thập dữ liệu. Trong kỹ thuật IT, sự chuyển đổi giữa chế độ SCAN toàn diện các ion do bắn phá (EI) sang các ion do ion hóa hóa học (CI) theo một cách đơn giản cung cấp đầy đủ thông tin cho việc nhận dạng và định lượng các HCBVTV và các chất chuyển hóa một cách nhanh chóng [35]. Trong chế độ chạy SCAN đầy đủ, ở nồng độ thấp hơn thiết bị này tỏ ra tương đối nhạy và chứng minh bằng việc tra thư viện phổ. Nhưng khi so sánh với thiết bị đơn tứ cực chạy trong chế độ kiểm soát việc lựa chọn ion (selected ion monitoring - SIM) các HCBVTV giống hệt nhau bị che phủ lẫn nhau và độ nhạy khi đó khác nhau không nhiều [28]. Ion hoá hóa học (chemical ionization - CI) ít được sử dụng hơn. Ion hóa hóa học (PCI hoặc NCI) khi liên kết với MS cho độ chọn lọc tốt hơn so với EI
  32. 32. 31 đối với một số thuốc trừ sâu nhất định. Kết quả trong sắc ký đồ cho thấy giảm sự tương tác của tín hiệu với đường nền [47] nhưng cường độ tín hiệu của các thuốc trừ sâu khác (khi tiêm mẫu với lượng giống nhau) cho thấy sự biến thiên nhiều hơn khi ion hóa bằng EI. Đặc biệt, GC - MS với sự ion hoá hoá học chỉ được chú ý đến một vài loại hoạt chất đặc biệt như thuốc trừ sâu cơ Clo [24], [29], Pyrethroid [63] và cơ Phospho [64]. Người ta hiếm khi sử dụng các phương pháp này trong phân tích dư lượng nhiều chất đồng thời bởi vì chúng không phải là kỹ thuật ion hoá phổ biến. Thêm nữa, khối phổ sinh ra bởi sự ion hoá hoá học thường cho số lượng phân mảnh ít hơn, do vậy lượng thông tin thu được ít hơn. Thiết bị GC - TOF có thể hoạt động theo hai chương trình. Một loại cho tốc độ quét rất lớn, cho phép việc tách các peak trùng lặp về tín hiệu [33], [61]. Điều này có thể chứng minh từ kết quả thu được 30000 peak từ khói thuốc lá [31], [32]. Một loại thiết bị GC – TOF khác cho độ phân giải khối rất cao và cho phép đánh giá dữ liệu với sự sai khác về khối hẹp ( khoảng 0.02 Da) [28]. Tuy nhiên, hầu hết các thiết bị TOF đều mắc phải nhược điểm là khoảng động học hẹp [32]. Trong các thảo luận về CI - MS và GC - TOF, điểm nổi bật của hệ thống GC - MS/MS là triệt đường nền khá tốt, độ chọn lọc và độ nhạy cao [27], [40]. Các thao tác với MS/MS có thể thực hiện cùng với bẫy ion [23], [38], [41] và các phân tích khối phổ bộ ba tứ cực (triple quadrupole) [57]. Một vài hạn chế trong GC-MS/MS là do sự thiếu vắng một chương trình ion hoá mẫu phổ biến áp dụng cho các ion sản phẩm tương ứng với các ion phân tử của hầu hết các loại HCBVTV. Ion hoá bằng EI phổ biến hơn, nhưng thông thường dòng ion được phun lên rất nhiều mảnh, kết quả thu được các cặp ion cha mẹ có cường độ thấp khi phân tích bằng MS/MS. Cho đến giờ, triển vọng của GC - MS/MS vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng. Tỷ lệ % các thuốc trừ sâu phân tích bằng GC - MS/MS từng được công bố chiếm một tỉ lệ rất nhỏ. Vì vậy sẽ là quá sớm để có thể chọn GC - MS/MS thay thế cho GC - MS trong phân tích dư lượng HCBVTV.
  33. 33. 32 Việc sử dụng GC-MS trong phân tích dư lượng thuốc trừ sâu được tóm tắt trong sổ tay phân tích thuốc trừ sâu [77], [79] ứng dụng các quy trình thiết bị [22] hoặc các nghiên cứu khoa học [28], [37], [80] trên một số cơ sở dữ liệu MS riêng biệt bao hàm MS – EI (electron impact) của rất nhiều thuốc trừ sâu [34]. 1.2.3.2. Kỹ thuật LC – MS. Khi một TTS không thể phân tích bằng phương pháp GC, việc sử dụng LC là sự thay thế tốt nhât. Tương tự như vậy, LC có thể kết hợp với thiết bị tứ cực đơn, bẫy ion tứ cực, tứ cực ba - MS hoặc - MS/MS, TOF quang phổ kế hoặc thiết bị hỗn hợp quadrupole – TOF. Ngược lại với GC- MS, MS tứ cực đơn không được dùng trong các nghiên cứu chủ yếu hiện nay khi giải quyết bằng LC - MS. Sự bất lợi của thiết bị tứ cực đơn (và bẫy ion hoạt động trong chế độ SIM) là tín hiệu đường nền cao thu được từ nền mẫu và các dung môi HPLC. Do sự nhiễu về mặt hóa học này, trong định lượng các mẫu thực không thể thu được các giới hạn phát hiện rất nhỏ, thậm chí cả khi các thiết bị có độ nhạy cao [45]. Đường nền hoá học có thể giảm đáng kể khi các thiết bị MS/MS áp dụng kết nối với điều kiện SRM. Thậm chí nếu một thành phần nền có khối lượng phân tử giống một thuốc trừ sâu, thông thường cả hai ion đẳng tích có thể được tách trong thực nghiệm SRM, bởi vì sự phân mảnh của chúng trong tế bào va chạm hầu như cho các ion sản phẩm khác nhau. Vì vậy quang phổ kế -MS/MS cho độ nhạy rất tốt và độ chọn lọc không thể trội hơn. Vì lí do đó, cho tới nay các máy phân tích khối tứ cực ba sử dụng dedector MS nhiều nhất [51]. Bẫy ion tứ cực có thể hoạt động cùng MS/MS mà giảm cường độ đường nền tới một mức như được biết từ quang phổ kế - MS/MS. Tuy nhiên, sự thu thập ion, sự phân mảnh và phân tích khối phổ của các mảnh là quá trình gồm các bước nối tiếp trong các bẫy và yêu cầu nhiều thời gian hơn so với thiết bị tứ cực ba, một thiết bị có thể làm hai việc đó song song. Hơn nữa, bẫy ion vấp phải một nhược điểm là khoảng động học giới hạn, ít khả năng hơn trong phân mảnh các ion rất bền và không
  34. 34. 33 hiệu quả khi bẫy các phân mảnh thấp khối [51]. Quang kế khối phổ TOF khi liên kết với LC được sử dụng nhiều hơn trong chế độ phân giải cao (sai số số khối đặc trưng < 2 mDa), có thể cho thấy sự khác biệt tốt hơn về đường nền [48], [62]. Sự tiện lợi chính của loại thiết bị này là sự phân biệt các pic không biết trong một mẫu, thậm chí khi việc phân tích chất chuẩn là không thể [36],[39]. Nhưng ưu thế này thường không cần thiết khi luật pháp đã quy định bắt buộc về dư lượng lớn nhất. Hơn nữa, sự nhận dạng các thuốc trừ sâu trong mẫu bởi LC-MS-TOF là kém chắc chắn hơn so với bởi GC-EI/MS [75] Việc sử dụng thiết bị tứ cực TOF hỗn hợp (Q-TOF) cho phép xác định hầu như chắc chắn. Sự tin cậy này dựa trên sự kết nối giữa thời gian lưu, khối lượng của các ion phân tử chọn lọc bởi bộ phận lọc khối tứ cực và sự va chạm hoàn toàn dẫn đến phổ khối thu được từ các máy phân tích TOF [56]. Không may, độ nhạy của Q-TOF khi liên kết với máy phân tích tứ cực ba là một loại thiết bị có từ trường thấp hơn [31], [46]. Bên cạnh trở ngại này, khoảng tuyến tính nhỏ hơn khiến cho việc sử dụng Q-TOF trong việc định lượng các dư lượng bị hạn chế. Tất cả thiết bị LC-MS có thể lắp ráp với 3 loại kỹ thuật ion hóa mềm đó là ESI, APCI và photoionization. Cho đến nay, các bài báo về photoionization trong phân tích thuốc trừ sâu rất ít thấy công bố [60]. ESI và APCI được áp dụng nhiều hơn. So sánh về tính thích hợp của ESI và APCI trong việc ion hóa rất nhiều thuốc trừ sâu, electrospray được nhận thấy là một thiết bị phổ biến hơn [26], [49], [50], [69], [74]. Cho đến nay, tổng quan lớn nhất được đưa ra bởi Lehotay năm 2005 [52], người đã sử dụng LC - MS/MS để xác định 144 thuốc trừ sâu. Tuy nhiên, một bản thống kê hoàn chỉnh tất cả các thông tin có thể của LC - MS/MS về thuốc trừ sâu vẫn chưa có. Sự lựa chọn thiết bị thích hợp nhất để vận dụng phân tích được phần lớn các mẫu là một trong những quyết định quan trọng nhất trong việc đầu tư cho các phòng thí nghiệm phân tích dư lượng và hiện tại, GC-MS là một trong các thiết bị đó được lựa chọn và sử dụng.
  35. 35. 34 1.3. XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HCBVTV TRÊN DƯỢC LIỆU. 1.3.1. Các quy trình xử lý mẫu. Gồm các kỹ thuật chiết tách, làm sạch và làm giàu HCBVTV trong mẫu. Quá trình này, thường sử dụng các dung môi hữu cơ không hoặc ít phân cực như n-hexan, ether dầu hoả, aceton, acetonitril [53], [73]. Các kỹ thuật chiết kinh điển có hiệu quả nhưng thường tốn dung môi và thời gian chiết. Gần đây có nhiều kỹ thuật chiết hiện đại, ví dụ chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (sử dụng dioxyd carbon), chiết pha rắn (thường dùng cột C18, Florisil, Silicagel,..), vi chiết pha rắn (chiết và tự làm giàu một cách chọn lọc chất phân tích không phân cực) [22], [30], [42], [79]. Ngoài ra, một số phương pháp khác như vi chiết pha lỏng, sắc ký rây phân tử…cũng được áp dụng tùy đối tượng cụ thể [54]. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu phân tích dư lượng HCBVTV trong dược liệu Đầu thập niên 90 của thế kỷ trước, một số tác giả ở Pháp và Tây Ban Nha đã nghiên cứu phân tích xác định dư lượng các HCBVTV nhóm OC trong 5 dược liệu sử dụng kỹ thuật SPE kết hợp với GC-MS [54]. Năm 2000, các tác giả Bồ Đào Nha đã giới thiệu phương pháp phân tích xác định dư lượng 3 nhóm OC, OP và PY trong dược liệu sử dụng SPE, sắc ký rây phân tử và GC [37]. Ở Trung Quốc, có nhiều công bố liên quan đến kỹ thuật phân tích dư lượng HCBVTV trên dược liệu bằng GC. Tuy nhiên những minh chứng cho thấy việc ứng dụng GC-MS trong phân tích HCBVTV trên dược liệu được sử dụng nhiều hơn cả về khả năng định tính, định lượng và tính xác minh cao với đọ nhạy tốt. Đồng thời, GC-MS là hệ có thể phân tích đồng thời nhiều nhóm HCBVTV như OC, OP, PY, các chất chuyển hóa và phân hóa từ các HCBVTV, [44], [59], [84], [85], [86] .Nhiều cơ sở tại Trung Quốc đã sản xuất dược liệu theo tiêu chuẩn trồng cây thuốc sạch và công bố tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm (ví dụ: Tam thất Châu Vân Sơn ở Vân Nam Trung Quốc
  36. 36. 35 đã qui định giới hạn kim loại nặng độc As, Pb, Hg, Cd và giới hạn DDT không được quá 1 ppm và Lindan không được quá 0,6 ppm) [17]. Dược điển Trung Quốc 2005 đưa phương pháp xác định dư lượng HCBVTV trong dược liệu và thuốc đông dược [72]. Ở Nhật Bản, nhiều HCBVTV được sản xuất và sử dụng, tuy nhiên chúng được quy định và kiểm soát chặt chẽ. Luật vệ sinh thực phẩm Nhật Bản quy định “Danh mục dư lượng HCBVTV trong nông sản và thực phẩm” phải được kiểm tra. Năm 1995, Danh mục này áp dụng quy định đối với 108 HCBVTV, đến năm 2006 Danh mục quy định mức dư lượng tối đa cho phép đối với hơn 400 HCBVTV. Các HCBVTV trong Danh mục có thể được phân tích bằng phương pháp GC-MS ở nồng độ phát hiện là 1ppm đối với tất cả các HCBVTV [83]. Do yêu cầu xác định dư lượng HCBVTV trong các sản phẩm nông nghiệp, nhiều quốc gia như Mỹ, Anh, Đức, Hà Lan,.. đã có những hướng dẫn cụ thể về phân tích HCBVTV trong các sản phẩm nông nghiệp [54]. Từ năm 2000, AOAC Quốc tế cho tái bản sách nhiều tập về phân tích HCBVTV [25]. Đối với dược liệu, năm 1998 WHO đã xuất bản sách “Phương pháp kiểm tra chất lượng dược liệu” trong đó có mô tả phương pháp xác định dư lượng HCBVTV trong dược liệu. Ở Việt Nam, có một số công trình nghiên cứu đã sử dụng GC-MS phân tích đồng thời một số HCBVTV của các nhóm cơ clo. [13], [16]. Các tác giả Trịnh Văn Quỳ [16] và Trần Việt Hùng [13] đã nghiên cứu các phương pháp xác định dư lượng HCBVTV trong dược liệu bằng kỹ thuật GC: - Sử dụng sắc ký khí mao quản với detector cộng kết điện tử (GC-ECD) phân tích HCBVTV nhóm OC và PY; - Sử dụng sắc ký khí mao quản với detector nitơ-phospho (GC-NPD) phân tích HCBVTV nhóm OP; - Sử dụng sắc ký khí với detector khối phổ (GC-MS) phân tích đồng thời một số HCBVTV của các nhóm cơ clo.
  37. 37. 36 Tuy nhiên các tác giả này mới chỉ dừng lại ở nhiệm vụ xác định nhóm OC trên GC-MS. Vấn đề liên quan đến dược liệu sạch sản xuất theo các tiêu chí GAP và GACP đang được xây dựng và đẩy mạnh, đi đôi với nó là vấn đề an toàn đối với sức khỏe người dùng và vệ sinh môi trường. Đó là một tiêu chí quan trọng đang rất được quan tâm. Cho đến nay, các công bố về các phương pháp phân tích đồng thời nhiều nhóm HCBVTV trong dược liệu bằng GC-MS chưa được khảo sát thực hiện. Hơn nữa, DĐVN III vẫn chưa có quy định về phương pháp chung cho phân tích dư lượng của HCBVTV trong dược liệu [10]. Nhằm tạo cơ sở cho việc đánh giá tồn dư HCBVTV trong dược liệu một cách có hệ thống và đi vào thường qui như một tiêu chí về độ an toàn của dược liệu đối với sức khỏe nhân dân, gắn với tiêu chí xây dựng quy trình sản xuất dược liệu sạch theo GAP, các phương pháp chung và khái quát xác định dư lượng HCBVTV trong dược liệu cần được xây dựng và đưa vào sử dụng với sự hỗ trợ của các thiết bị công cụ hiện đại và đảm bảo yêu cầu như GC-MS.
  38. 38. 37 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. KHẢO SÁT ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HCBVTV 2.1.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực địa, hồi cứu và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là những hộ nông dân trồng dược liệu, có thể là chủ hộ hoặc người trực tiếp trồng thuốc. 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 1. Xã Duyên Hà - Thanh Trì - Hà Nội 2. Xã Vạn Phúc - Thanh Trì - Hà Nội 3. Xã Tự nhiên - Thường Tín - Hà Nội 4. Xã Bình Minh - Khoái Châu - Hưng Yên 5. Xã Hòa Bình - Hà Trung - Thanh Hóa Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2008 - 7/2009. 2.1.4. Phương pháp nghiên cứu * Sử dụng các phương pháp điều tra tổng hợp hệ thống nông nghiệp: - RRA (phương pháp đánh giá nhanh nông thôn). - KIP (phương pháp thu thập thông tin từ nguồn, nhóm người am hiểu về vấn đề trồng, chăm sóc, phân bón, HCBVTV cây thuốc và dược liệu). * Sử dụng các tài liệu lưu trữ đã nghiên cứu, hồi cứu, tham khảo và sử dụng các số liệu có liên quan. * Sử dụng phiếu điều tra tại thực địa kết hợp với hồi cứu: - Công cụ điều tra: Phiếu điều tra được thiết kế sẵn gồm có bộ câu hỏi.
  39. 39. 38 - Đối tượng phỏng vấn: là những hộ nông dân trồng cây thuốc, có thể là chủ hộ hoặc người trực tiếp trồng cây thuốc. - Thu thập số liệu: tổng hợp số liệu thông qua phiếu điều tra. - Hồi cứu: + Đối chiếu tên dược liệu và xem xét thành phần hóa học theo các tài liệu + Đối chiếu tên HCBVTV theo Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép, hạn chế và cấm sử dụng ở Việt Nam năm 2008, 2009, Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật. + Tên thuốc bảo vệ thực vật được phát âm không rõ hoặc không có trong danh mục sẽ được ghi lại vào sổ tay để đối chiếu với tên trên bao bì thu của hộ nông dân đó hoặc đối chiếu tại cửa hàng vật tư HCBVTV của địa phương. 2.2. XÂY DỰNG CÁC QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC HCBVTV DỰA VÀO BỘ PHẬN DÙNG KHÁC NHAU CỦA DƯỢC LIỆU VÀ NÔNG SẢN - HCBVTV nhóm OC - HCBVTV nhóm OP. - HCBVTV nhóm PY - Một số HCBVTV thuộc các nhóm khác. 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu. Áp dụng USP 30 và tham khảo thêm quy định của Bộ NN & PTNT về phương pháp lấy mẫu . - Cách lấy mẫu: + Lấy mỗi mẫu có cỡ mẫu 300g, lấy ra từ bao ở 3 vị trí trên cùng, giữa bao và cuối bao, mỗi vị trí 100g, sau đó trộn đều. Mẫu được đựng trong túi polyethylen sạch, mã hóa và mang về bảo quản trong tủ lạnh ở dưới 5o C. Đối với các mẫu cùng một loại dược liệu, các mẫu được coi là khác nhau khi mua ở các hiệu thuốc khác nhau hoặc ở các hộ nông dân khác nhau.
  40. 40. 39 + Đối với các mẫu dược liệu, hoặc các mẫu nông sản tươi, lấy trực tiếp tại các vườn trồng địa phương thì lấy mẫu trên hai đường chéo, mỗi đường lấy 2- 3 mẫu. 2.2.2. Chuẩn bị mẫu. Tùy theo bản chất mẫu, kỹ thuật chiết mẫu áp dụng, tiến hành làm thành bột nửa mịn (cỡ rây 355/180 theo DĐVN III, Phụ lục 2.6), bột nửa thô (cỡ rây 710/250) hoặc bột thô (cỡ rây 1400/355). Sử dụng thuyền tán hoặc máy xay dược liệu. - Xác định mất khối lượng do làm khô: Tiến hành theo DĐVN III, Phụ lục 5.16. - Xử lý mẫu: (a) Lựa chọn phương pháp: Tùy theo tính chất của đối tượng nghiên cứu (dược liệu) và của đối tượng phân tích (HCBVTV) mà sử dụng phương pháp xử lý mẫu thích hợp gồm có: Chiết Làm sạch Làm giàu đối tượng phân tích trong mẫu (b) Khảo sát lựa chọn và xây dựng các quy trình xử lý mẫu: 1/ Áp dụng các kỹ thuật xử lý mẫu đã công bố [13], [16], [18]: Các quy trình (viết tắt QT) xử lý mẫu khảo sát áp dụng chiết và làm sạch HCBVTV từ mẫu dược liệu được ghi trong Bảng 2.4. Bảng 2.4. Các kỹ thuật xử lý mẫu được lựa chọn áp dụng Kỹ thuật xử lý mẫu sử dụng dung môi hữu cơ Chiết Làm sạch và làm giàu Ký hiệu Kỹ thuật Dung môi Kỹ thuật bổ trợ Tên kỹ thuật Rửa giải QT1 Chiết lạnh Dung môi ít phân cực Siêu âm SPE pha thuận Dung môi hữu cơ ít
  41. 41. 40 phân cực QT2 Chiết lạnh Dung môi hữu cơ ít phân cực Siêu âm SPE pha đảo như trên QT3 Soxhlet Dung môi hữu cơ ít phân cực Nhiệt độ SPE pha thuận như trên QT4 Soxhlet Nước, dung môi hữu cơ ít phân cực Siêu âm SPE pha đảo như trên QT5 Chiết nóng Nước Nhiệt độ SPE pha đảo như trên 2/ Khảo sát xây dựng các qui trình xử lý mẫu: - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết trên mẫu thử thêm chuẩn. - Khảo sát khả năng làm sạch đối với các chất hấp phụ khác nhau: + Silica gel và than hoạt (6 ml, 1 g) + Florisil (8 ml, 2 g) - Khảo sát và so sánh về khả năng làm sạch dịch chiết mẫu thử bằng cách quan sát đường nền trên sắc ký đồ và R% mẫu chuẩn khi cho qua cột. - Khảo sát, so sánh các hệ dung môi rửa giải về R% mẫu chuẩn khi qua cột. (c) Cách tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi trên mẫu chuẩn khi cho qua cột: - Chuyển 1ml dung dịch chuẩn có chứa các chất phân tích cần khảo sát vào cột. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó rửa giải tiếp tục với các lượng dung môi cần khảo sát. Thu hồi dung môi rửa giải, chia thành từ 2 - 4 phân đoạn và hứng vào các cốc hoặc ống nghiệm khác nhau. Bay hơi dung môi, hòa tan cắn trong 1 ml dung dịch nội chuẩn. Tiến hành phân tích sắc ký theo chương trình sắc ký đã được xây dựng. - Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn khi qua cột: Số ml dung môi rửa giải đủ để rửa hết các chất phân tích và xác định được chất hấp phụ và dung
  42. 42. 41 môi rửa giải thích hợp (cho hiệu suất thu hồi cao ở các phân đoạn đầu đối với phần lớn chất phân tích). (d) Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch: Dựa vào hiệu suất hay tỷ lệ thu hồi (ký hiệu là R%) trên mẫu nhiễm. Mẫu nhiễm được tạo ra từ mẫu dược liệu (mẫu trắng) bằng phương pháp thêm chuẩn. Chiết và làm sạch mẫu nhiễm theo phương pháp đã nêu, phân tích sắc ký xác định hiệu suất thu hồi. - Mẫu trắng: Không có hoặc có dư lượng không đáng kể các chất cần khảo sát. - Tạo mẫu nhiễm: Tạo ra từ mẫu dược liệu (mẫu trắng) bằng phương pháp thêm chuẩn. - Đối với chiết lạnh, chiết Soxhlet và SPE trên C18 : Thêm 200 µl dung dịch chuẩn pha trong aceton có chứa các đối tượng phân tích cần khảo sát ở nồng độ thích hợp vào 5 g bột dược liệu trong bình nón nút mài để tạo mẫu nhiễm chứa chất phân tích có nồng độ mong muốn, đậy nút, lắc mạnh. - Tiến hành khảo sát tỷ lệ thu hồi: Chiết và làm sạch theo chỉ dẫn ở các mục tương ứng. Tiến hành phân tích theo các CTSK phù hợp với mỗi nhóm đối tượng phân tích. - Tiêu chuẩn đánh giá phương pháp chiết: Áp dụng tiêu chuẩn ghi trong USP hoặc Dược điển Châu Âu, phương pháp chiết được chấp nhận nếu như 70% ≤ R % ≤ 110% . 2.3. KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HOẶC TỪNG NHÓM DƯ LƯỢNG HCBVTV THƯỜNG DÙNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 2.3.1. Dược liệu sử dụng cho nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích. Đối tượng nông sản và dược liệu chọn để xây dựng phương pháp:
  43. 43. 42 - Một số dược liệu và cây trồng có bộ phận dùng là phần dưới mặt đất (rễ hoặc thân rễ) để khảo sát xây dựng phương pháp phân tích dư lượng HCBVTV nhóm OC. - Một số dược liệu có bộ phận dùng là phần trên mặt đất (lá, hoa, quả hoặc toàn thân) để khảo sát xây dựng phương pháp phân tích dư lượng HCBVTV nhóm OP và PY. Bảng 2.5. Dược liệu được sử dụng làm mẫu nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích STT Dược liệu (Tên La tinh) Đối tượng phân tích Ký hiệu 1 Sắn dây (Radix Puerariae) OC M1 2 Bạch chỉ (Radix Angelicae dahuricae) OC M2 3 Đương qui (Radix Angelica sinensis) OC M3 4 Đinh lăng (Radix Polysciacis) OC M4 5 Cúc hoa (Flos Chrysanthemi indici) OP, PY M5 6 Húng quế (Herba Ocimum basili) OP, PY M6 7 Bạc hà Á (Herba Menthae arvensis) OP, PY M7 Các mẫu ở địa phương trồng được mua của gia đình trực tiếp trồng. 2.3.2. Các HCBVTV thuộc 3 nhóm: OC, OP và PY Đối tượng phân tích gồm có 51 hợp chất (Bảng 2.6). - Nhóm chất OC: 24 hợp chất. - Nhóm chất OP: 20 hợp chất. - Nhóm chất PY: 5 hợp chất. - Các nhóm khác: 2 hợp chất. Ngoài ra, sử dụng 2 chất nội chuẩn (NC): - Hexaclorobenzen (HCB) ký hiệu NC1. - Carbophenothion (NC2). Xử lý mẫu: Áp dụng các phương pháp xử lý mẫu thích hợp đã khảo sát.
  44. 44. 43 Bảng 2.6. Đối tượng xây dựng phương pháp phân tích STT HỢP CHẤT STT HỢP CHẤT Hợp chất cơ clo Hợp chất cơ phospho 1 Aldrin 25 Azinphos-methyl 2 Clorothalonil 26 Diazinon 3 2,2’-DDD 27 Diclorvos 4 4,4’-DDD 28 Dimethoat 5 2,2’-DDE 29 Disulfoton 6 2,4’-DDE 30 o,o,o-Triethyl-phosphat 7 2,2’-DDT 31 Famphur 8 2,4’-DDT 32 Fenitrothion 9 4,4’-DDT 33 Famofos 10 Dieldrin 34 Malathion 11 Endosulfan I (alpha) 35 Methamidophos 12 Endosulfan II (beta) 36 Methidathion 13 γ - Chlordan 37 Parathion-ethyl 14 Endrin 38 Parathion-methyl 15 Endrin aldehyd 39 Phorat 16 Endrin ceton 40 Phosalon 17 α-HCH 41 Profenofos 18 β-HCH 42 Sulfotep 19 δ-HCH 43 Thionazin 20 γ-HCH (Lindan) 44 Triclofon 21 Heptaclor 22 Heptaclor epoxid Hợp chất Pyrethroid 23 Methoxyclor 45 Cypermethrin 24 Hexaclorobenzen 46 Deltamethrin 47 Fenvalerat Các hợp chất thuộc nhóm khác 48 Permethrin 50 Cartap 49 Fenpropathrin 51 Diphenylamin
  45. 45. 44 2.3.3. Phân tích sắc ký khí định tính và định lượng HCBVTV Khảo sát và xây dựng 4 chương trình sắc ký: - Chương trình 1 : CTSK GC-MS/EI, áp dụng phân tích OC. - Chương trình 2: CTSK GC-MS/EI, áp dụng phân tích OP. - Chương trình 3: CTSK GC-MS/EI, áp dụng phân tích đồng thời OC, OP, PY và các hợp chất khác. - Chương trình 4: CTSK GC-MS/NCI, áp dụng phân tích OC. (a)Khảo sát khả năng tách các chất và tách riêng các nhóm chất - Sử dụng các dung dịch chuẩn tiêm vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ, xem xét độ phân giải, điều chỉnh sao cho độ phân giải giữa các chất phải > 1,5 và thời gian xuất hiện các pic của hỗn hợp trong khoảng 30 phút ± 10 phút. - Đối với hỗn hợp nhóm OC, OP và PY, sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp có chứa các chất OC, OP và PY tiêm vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ, xem xét độ phân giải, điều chỉnh sao cho độ phân giải giữa các chất phải > 1,5 và các chất phải tách riêng khỏi nhau. (b)Đánh giá phương pháp phân tích Đường chuẩn và độ tuyến tính: được thiết lập trên các dung dịch chuẩn (nồng độ cỡ µg/ml) hoặc thiết lập từ chuẩn được thêm vào mẫu khảo sát (nồng độ cỡ µg/g). + Đường chuẩn OC: Các dung dịch chuẩn hỗn hợp 20 chất có nồng độ mỗi chất 0,01 µg.ml-1 – 1 µg.ml-1 . + Đường chuẩn PY: Các dung dịch chuẩn hỗn hợp có 5 chất có nồng độ mỗi chất từ 0,01 µg.ml-1 – 5 µg.ml-1 . + Đường chuẩn OP: Hai hỗn hợp dung dịch chuẩn, mỗi hỗn hợp có lần lượt 9 và 15 chất, nồng độ mỗi chất 0,01 µg.ml-1 – 1 µg.ml-1 .
  46. 46. 45 Các dung dịch chuẩn được phân tích theo các chương trình sắc ký, xác định phương trình hồi qui tuyến tính và hệ số tương quan giữa diện tích pic và nồng độ các chất trong khoảng nồng độ đã nêu. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ: - LOD của mỗi chất được xác định bằng 3 lần tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất đó. Độ nhạy được xác định bằng hệ số góc của đường hồi qui giữa tín hiệu (Y, mV) và nồng độ (X, µg/ml hoặc µg/g). - LOQ được tính bằng 3,3 lần LOD. Sau khi đã xác định được giới hạn phát hiện theo phương pháp vừa nêu, đối với 1 số mẫu, kiểm tra lại bằng cách thêm một vài chất chuẩn ở khoảng nồng độ của ngưỡng phát hiện vào mẫu trắng để kiểm tra lại. - Dư lượng tối đa cho phép của một chất theo quy định giả sử là X mg/kg tương ứng với X µg/g. Vậy muốn xác định được mức dư lượng của 1 chất để so sánh với bảng mức dư lượng tối đa cho phép theo quy định thì giá trị LOQ phải thấp hơn X. Xác định độ lặp lại và độ tái hiện kết quả phân tích: - Độ lặp lại và độ tái hiện kết quả phân tích của hệ thống sắc ký: + Độ lặp lại được khảo sát trên thời gian lưu và diện tích pic của cùng một dung dịch chuẩn được tiêm 6 – 10 lần. Xác định độ lệch chuẩn (SD) của thời gian lưu (tR) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của diện tích pic tương đối (RA %). Trong phân tích dư lượng, theo dược điển, hệ thống sắc ký được coi là ổn định nếu RSD % < 6 %. + Độ tái hiện (tại cùng phòng thí nghiệm và trên cùng thiết bị phân tích), xác định tương tự độ lặp lại, khảo sát trên cùng một mẫu chuẩn. Giá trị được chấp nhận trong phân tích dư lượng nếu như RSD % < 12 %. - Độ lặp lại và độ tái hiện kết quả phân tích mẫu thử: Ở mức tin cậy P = 0,95, phương pháp phân tích được chấp nhận nếu như độ lặp lại kết quả phân tích trên mẫu thử không thấp hơn giá trị ghi trong Bảng 2.7.
  47. 47. 46 Bảng 2.7. Độ lặp lại kết quả phân tích được chấp nhận (Theo USP 30) Kết quả dư lượng Độ lặp lại Độ tái hiện 0,010 mg/kg ± 0,005 mg/kg (50 %) ± 0,01 mg/kg (100 %) 0,100 mg/kg ± 0,025 mg/kg (25 %) ± 0,05 mg/kg (50 %) 1,000 mg/kg ± 0,125 mg/kg (12,5 %) ± 0,25 mg/kg (25 %) (c) Tính toán và đánh giá kết quả Tính kết quả: - Nồng độ hóa chất BVTV trong mẫu thử (nếu có) được tính dựa vào phương trình hồi qui của đường chuẩn. Do độ pha loãng của mẫu thử là 1g.1ml-1 , nồng độ chuẩn là µg.ml-1 . Vậy nồng độ HCBVTV trong mẫu thử sẽ là µg.g-1 tương ứng với dư lượng HCBVTV trong mẫu (µg/g hay mg/kg). Đánh giá kết quả: So sánh dư lượng với bảng mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) theo các dược điển như BP 2009, hoặc USP 31 (2008). 2.4. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HCBVTV TRÊN MỘT SỐ MẪU NÔNG PHẨM THƯỜNG DÙNG VÀ CÂY THUỐC TẠI CÁC ĐỊA PHƯƠNG ĐÃ KHẢO SÁT - Dược liệu, nông sản trồng ở các địa phương kể trên. - Dược liệu mua trên thị trường, phần lớn được nhập từ Trung Quốc. Bảng 2.8: Danh mục dược liệu và nông sản khảo sát dư lượng HCBVTV TT Mẫu Bộ phận dùng Nguồn gốc Bình Minh, Hưng Yên Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên 1 Bạc hà Phần trên mặt đất Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Vạn phúc, Thanh Trì, Hà Nội2 Bạch chỉ Củ Vạn Phúc, Thanh Trì, Hà Nội
  48. 48. 47 Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Bạch linh Củ Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Xã Tự Nhiên, Thanh Trì, Hà Nội 3 Bạch truật Thân rễ Vạn Phúc, Thanh Trì, Hà Nội Thái Nguyên, Hà Nội Thái Nguyên, Hà Nội 4 Bồ bồ Phần trên mặt đất Trung tâm Bắc Trung Bộ, Viện Dược liệu Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội 5 Cam thảo Thân Thị xã Cao Bằng Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên 6 Cát căn Rễ Nghĩa Trai, Hưng Yên Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội7 Cốt khí củ Rễ Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội 8 Cúc hoa Phần trên mặt đất Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa Trung tâm cây thuốc Hà Nội Trung tâm cây thuốc Hà Nội 9 Diệp hạ châu Phần trên mặt đất Trung tâm cây thuốc Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên Nghĩa Trai, Hưng Yên 10 Đinh lăng Rễ Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội xã Bình Minh, Khoái châu, Hưng Yên xã Bình Minh, Khoái châu, Hưng Yên Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội 11 Địa liền Củ Ninh Hiệp, Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên12 Đương quy Củ Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội
  49. 49. 48 Ninh Hiệp, Hà Nội Ninh Hiệp, Hà Nội Chợ đầu mối phía nam, Hoàng Mai - Hà Nội Chợ đầu mối phía nam, Hoàng Mai -Hà Nội 13 Gừng Phần dưới mặt đất Chợ đầu mối phía nam, Hoàng Mai -Hà Nội Ninh Hiệp, Hà Nội Ninh Hiệp, Hà Nội 14 Hà thủ ô Rễ Nghĩa Trai, Hưng Yên Nghĩa Trai, Hưng Yên15 Hoa hoè Hoa Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên 16 Hoắc hương Phần trên mặt đất Nghĩa Trai, Hưng Yên Nghĩa Trai, Hưng Yên Bình Minh, Hưng Yên Bình Minh, Hưng Yên 17 Húng quế Phần trên mặt đất Chợ đầu mối phía nam, Hoàng Mai -Hà Nội Nghĩa Trai, Hưng Yên Bình Minh, Hưng Yên 18 Hương nhu Phần trên mặt đất Vạn Phúc, Thanh Trì, Hà Nội Trung tâm Bắc Trung Bộ, Hà Nội Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa 19 Hy thiêm Phần trên mặt đất Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội 20 Ích mẫu Phần trên mặt đất Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Ninh Hiệp, Hà Nội Bình Minh, Hưng Yên Bình Minh, Hưng Yên 21 Khổ sâm Phần trên mặt đất Nghĩa Trai, Hưng Yên Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa22 Kim tiền thảo Phần trên mặt đất Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa Chợ đầu mối phía nam, Hoàng Mai -Hà Nội 23 Kinh giới Phần trên mặt đất Bình Minh, Hưng Yên
  50. 50. 49 Bình Minh, Hưng Yên Nghĩa Trai, Hưng Yên Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa Trung tâm cây thuốc Tam Đảo, Viện Dược liệu 24 Mã đề Phần trên mặt đất Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Xã Tự nhiên, Thanh Trì, Hà Nội 25 Ngải cứu Phần trên mặt đất Xã Duyên Hà, Thanh Trì, Hà Nội Xã Duyên Hà, Thanh Trì, Hà Nội Xã Duyên Hà, Thanh Trì, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội 26 Ngưu tất Toàn thân, rễ Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Trung tâm cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu Trung tâm cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu Trung tâm cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu 27 Râu mèo Phần trên mặt đất Trung tâm cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội 28 Sài đất Phần trên mặt đất Ninh Hiệp, Hà Nội Trung tâm Bắc Trung Bộ, Viện Dược liệu29 Sâm báo Rễ Xã Hoà Bình, Hà Trung, Thanh Hóa Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Chợ Đông Kinh, Lạng Sơn 30 Tam thất Rễ Chợ Đông Kinh, Lạng Sơn Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội31 Tam thất gừng Rễ Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội 32 Thổ phục linh Rễ Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội Vạn Phúc, Thanh Trì, Hà Nội33 Truật nam Rễ Vạn Phúc, Thanh Trì, Hà Nội Chợ đầu mối phía nam, Hoàng Mai - Hà Nội Chợ đầu mối phía nam, Hoàng Mai - Hà Nội 34 Tía tô Phần trên mặt đất Hiệu thuốc phố Lãn Ông, Hà Nội
  51. 51. 50 2.5. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU. 2.5.1. Hóa chất – dung môi - thuốc thử. - Khí methan, khí heli: Tinh khiết phân tích 99,99% Messer (Đức). - Nội chuẩn: mua của hãng Supelco, bao gồm Hexaclorobenxen (NC 1- nội chuẩn đối với các OC ) và Carbophenothion (NC2- sử dụng cho cả 3 nhóm chất). - Chuẩn hỗn hợp HCBVTV thuộc các nhóm OC, OP và PY. + Chuẩn OC: Hỗn hợp 20 chất 1mg/ml, pha trong hỗn hợp hexan – toluen (1:1) (mua của hãng Supelco, Mỹ). Hỗn hợp Pesticide-Mix 14 (mua của hãng Supelco, Mỹ). gồm Aldrin, 4,4’-DDD, 2,4’-DDE, 2,4’-DDT, 4,4’-DDT, Dieldrin, Endosulfan I (alpha), Endosulfan II (beta), Endrin, α-HCH, β-HCH, γ-HCH (Lindan), Heptaclor, Heptaclor epoxid, Hexaclorobenzen và Methoxyclor; + Chuẩn PY: Chuẩn đơn (mua của hãng Sigma- Aldrich), bao gồm: Cypermethrin 100 mg. Fenvalerat 250 mg Deltamethrin 100 mg. Permethrin 100 mg Fenpropathrin 100 mg + Chuẩn OP: Gồm hỗn hợp chứa 9 chất, bao gồm Dimethoat, Disulfoton, Famphur, Parathion-methyl, Parathion-ethyl; O, O, O-Triethylphosphat; Phorat, Sulfotep và Thionazin; Nồng độ mỗi chất 2000µg/ml pha trong n- hexan – toluen (80-20) mua của hãng Dr.Ehrenstorfer GmbH, CHLB Đức. Hỗn hợp 15 chất, bao gồm: O, O, O-Triethylphosphat, Diclorvos, Methamidophos, Trichlorfon, Diazinon, Disulfoton, Dimethoat, Parathion- methyl, Parathion-ethyl, Malathion, Famophos, Sulfotep, Phorat, Thionazin Azinphos-methyl ( nồng độ 0,2 mg/ml, pha trong aceton, mua của hãng Dr.Ehrenstorfer GmbH, CHLB Đức).
  52. 52. 51 Ngoài ra, đề tài còn sử dụng các chuẩn đơn, bao gồm: Triclofon 250mg; Clorothalonil 250 mg (mua của hãng Sigma- Aldrich); Cartap 500mg, Abamectin 100mg mua của hãng Supelco. - Dung môi (tinh khiết sắc ký, Merck): aceton, diethylether, ethanol, n- hexan, methanol, toluen… - Florisil® cỡ rây 60 – 100 (theo USP 26) tương ứng kích thước 0,250 - 0,150 mm của Fluka Chemie GmbH CH-9471 Buchs; - Silica gel sắc ký (0,063 - 0,200 mm), sấy ở 150o C trong 4 giờ, khử hoạt hoá bằng 1,5% nước). - Than hoạt. 2.5.2. Máy móc và thiết bị. - Hệ thống chiết pha rắn LiChrospher 12 với các cột chiết pha rắn khác nhau: Cột SPE silica gel loại nhồi sẵn (6 ml, 1 g); Cột SPE C18 loại nhồi sẵn (3ml, 0,5g)... - Bộ chiết Soxhlet cỡ mẫu 5 g (bình cầu 100 ml) và cỡ mẫu 10 g (bình cầu 250 ml); Nồi cách thủy; - Máy cất quay chân không (Rotavapor, Buchi R114). - Máy sắc ký khí khối phổ Shimadzu GC-MS –QP2010 với detector khối phổ đồng thời 2 chế độ EI/CI và NCI. - Máy sắc ký khí Shimadzu GC-MS –QP2010 với detector ECD. - Các thư viện khối phổ: NIST147, NIST27, PMW_TOX2, SZTERP, WILEY7 và thư viện phổ thuốc trừ sâu PEST_NCI. - Cột mao quản DB5-MS và HP5 (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm): silica nóng chảy, tẩm 0,25 µm pha tĩnh poly (5% diphenyl) (95% dimethyl) siloxan. - Máy lắc siêu âm Branson 3510 (Đức); Ultrasonic LC 60H (Elma – Đức) - Máy xay dược liệu IKA – Đức; - Rây.
  53. 53. 52 2.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU. - Khảo sát điều tra: phương pháp thống kê, sử dụng công cụ hỗ trợ Microsoft Excel. - Đánh giá phương pháp phân tích: phương pháp thống kê.
  54. 54. 53 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH TRỒNG VÀ SỬ DỤNG HCBVTV TRÊN CÂY THUỐC ĐƯỢC TRỒNG TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG 3.1.1. Thành phần dược liệu được trồng tại các địa phương khảo sát Tiến hành khảo sát tình hình trồng dược liệu tại năm xã trong vùng nghiên cứu cho thấy các loại dược liệu và các bệnh hay gặp trên dược liệu được thể hiện trong bảng sau: Bảng 3.9. Danh mục cây thuốc được trồng tại các địa phương khảo sát TT Cây thuốc Tên khoa học Bộ phận dùng Các bệnh thường gặp 1 Bạc hà Mentha arvensis L. Lamiaceae Toàn thân Sâu, nấm 2 Bạch chỉ Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth.et Hook.f. Apiaceae Rễ Nhện đá, sâu xám, đốm lá, lở cổ rễ 3 Cát căn Pueraria thomsonii Benth. Fabaceae Rễ Nhện đá 4 Cốt khí củ Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. Polygonaceae Rễ Sâu 5 Cúc hoa Chrysanthemum indicum L. Asteraceae Hoa Sâu xanh, nấm trắng 6 Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria L. Euphorbiaceae Phần trên mặt đất Lở cổ rễ

×