Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
------------  ----------
NGỌ VĂN NGÔN
N...
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
------------  ----------
NGỌ VĂN NGÔN
N...
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện.
Công trình đƣợc thực hiện trong th...
ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc, Ban Đào tạo sau
đại học, các quý thầy, cô giáo của ...
iii
MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các bảng viii
Danh mục các hình xi
MỞ ĐẦU 1
1 Tính cấp thiết...
iv
1.6.3 Loài phức 19
1.6.4 Kiểu gây bệnh 19
1.6.5 Kiểu quan hệ phả hệ 19
1.7 Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩ...
v
2.5.7 Phƣơng pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu
bệnh HXVK của nguồn vật liệu 48
2.5.8 Phƣơng pháp...
vi
3.3.2 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng
lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nh...
vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ
STT Ký hiệu, chữ viết
tắt và thuật ngữ
Diễn giải ký hiệu, chữ viết tắt và thuật ngữ...
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1.1 Giá trị sản xuất và sản lƣợng lạc của một số nƣớc đứng đầu thế giới
(niên vụ...
ix
3.8 Mức độ đa hình của 10 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân tích với các
isolate vi khuẩn R. solanacearum (Viện Công nghệ Si...
x
3.22 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng
lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy 106
3.23 Khả ...
xi
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên hình Trang
3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng năm 2012 55
3.2 Hìn...
xii
3.16 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16
dòng, giống lạc 111
3.17 Ảnh điện di gel polyacryl...
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày thuộc họ đậu, có
nguồn gốc ở ...
2
Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến
ở nhiều tỉnh trồng lạc trong cả nƣớc nhƣ: Bắc G...
3
Để rút ngắn thời gian trong việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi
khuẩn, ứng dụng chỉ thị phân tử là con đƣờng ...
4
Trên cơ sở chọn lọc các dòng, giống kháng bệnh và đánh giá một số đặc
điểm nông học chính, xác định đƣợc các dòng, giống...
5
khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt
Nam; đánh giá khả năng chống chịu bệ...
6
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên ...
7
giới đạt gần 7,39 triệu đô la Mỹ (USD), tiếp theo là Ấn Độ, Mỹ với các chỉ số này
lần lƣợt là 2,45 và 1,33 triệu USD (FA...
8
2012, năng suất lạc bình quân cả nƣớc đạt cao nhất là 2,13 tấn/ha. Sản lƣợng lạc của
cả nƣớc đạt cao nhất vào năm 2008 v...
9
Với điều kiện nóng ẩm của vùng nhiệt đới ở Malaysia, bệnh HXVK gây hại
nghiêm trọng trên nhiều loài cây trồng, trong đó ...
10
Theo Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010), bệnh héo xanh vi khuẩn là
một bệnh gây hại phổ biến trên cây lạc vùng Hà N...
11
1.4. Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc
Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi ...
12
Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma
longa, Cynara cardunculus var. scolymus, Emi...
13
lông roi và không di động, ngƣợc lại những isolate có độc tính thấp thƣờng có từ 1
đến 4 lông roi mọc đối nhau, có mức ...
14
chịu đựng kém với muối NaCl. Các isolate của vi khuẩn R. solanacearum không thể
phát triển trên môi trƣờng chứa 2% NaCl...
15
1.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh
héo xanh vi khuẩn hại lạc
Sự phát sinh,...
16
Nguyễn Văn Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tƣơng quan giữa
bệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc ...
17
phân lập thuộc loài R. solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có kích thƣớc
không đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) ...
18
Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà
(Solanaceae) và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân ...
19
Chủng của vi khuẩn R. solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ,
phân bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tí...
20
đã đƣợc áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R. solanacearum. Cách phân loại
này dựa trên phân tích trình tự các gen ...
21
nhiều quốc gia (Mehan et al., 1994). Một số nƣớc nhƣ Uganda, Mỹ, Thái lan,
Malaysia, Philippines, Sri Lanka cũng luôn c...
22
1.7.2. Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác
1.7.2.1. Biện pháp canh tác
Trên thế giới, ph...
23
vậy việc cày ải đất cũng có tác dụng làm giảm bệnh HXVK rất rõ, hơn nữa việc cày
ải còn làm hạn chế sự phát triển của c...
24
vào sản xuất (Tan et al., 1994). Nhiều tác giả khác cũng công bố kết quả góp phần
chứng minh luận điểm dùng hóa chất ph...
25
1.8. Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn
lọc giống kháng bệnh
1.8.1. Chỉ thị phân tử...
26
Kỹ thuật RFLP cũng đƣợc sử dụng để phân tích đa dạng giữa các giống thuộc
loài Arachis (giống đại diện sẽ đƣợc sử dụng ...
27
Trên cơ sở kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị RAPD, nghiên cứu của Halward et al.
(1993) cho thấy sự khác nhau rất ít ở loài ...
28
Chỉ thị SSR đƣợc sử dụng có hiệu quả trong việc xác định sự đa dạng di
truyền của các loài lạc trồng trọt đã đƣợc công ...
29
Đối với cây lạc, SSR là một công cụ về di truyền phù hợp trong việc lập bản
đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc v...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam

474 views

Published on

Liên hệ page để tải tài liệu
https://www.facebook.com/garmentspace
My Blog: http://congnghemayblog.blogspot.com/
http://congnghemay123.blogspot.com/
Từ khóa tìm kiếm tài liệu : Wash jeans garment washing and dyeing, tài liệu ngành may, purpose of washing, definition of garment washing, tài liệu cắt may, sơ mi nam nữ, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế quần âu, thiết kế veston nam nữ, thiết kế áo dài, chân váy đầm liền thân, zipper, dây kéo trong ngành may, tài liệu ngành may, khóa kéo răng cưa, triển khai sản xuất, jacket nam, phân loại khóa kéo, tin học ngành may, bài giảng Accumark, Gerber Accumarkt, cad/cam ngành may, tài liệu ngành may, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, vật liệu may, tài liệu ngành may, tài liệu về sợi, nguyên liệu dệt, kiểu dệt vải dệt thoi, kiểu dệt vải dệt kim, chỉ may, vật liệu dựng, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, tiêu chuẩn kỹ thuật áo sơ mi nam, tài liệu kỹ thuật ngành may, tài liệu ngành may, nguồn gốc vải denim, lịch sử ra đời và phát triển quần jean, Levi's, Jeans, Levi Straus, Jacob Davis và Levis Strauss, CHẤT LIỆU DENIM, cắt may quần tây nam, quy trình may áo sơ mi căn bản, quần nam không ply, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế áo sơ mi nam theo tài liệu kỹ thuật, tài liệu cắt may,lịch sử ra đời và phát triển quần jean, vải denim, Levis strauss cha đẻ của quần jeans. Jeans skinny, street style áo sơ mi nam, tính vải may áo quần, sơ mi nam nữ, cắt may căn bản, thiết kế quần áo, tài liệu ngành may,máy 2 kim, máy may công nghiệp, two needle sewing machine, tài liệu ngành may, thiết bị ngành may, máy móc ngành may,Tiếng anh ngành may, english for gamrment technology, anh văn chuyên ngành may, may mặc thời trang, english, picture, Nhận biết và phân biệt các loại vải, cotton, chiffon, silk, woolCÁCH MAY – QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH ĐÁNH SỐTÀI LIỆU KỸ THUẬT NGÀNH MAY –TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT – QUY CÁCH ĐÁNH SỐ - QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH MAY – QUY TRÌNH MAY – GẤP XẾP ĐÓNG GÓI – GIÁC SƠ ĐỒ MÃ HÀNG - Công nghệ may,kỹ thuật may dây kéo đồ án công nghệ may, công nghệ may trang phục, thiết kế trang phục, anh văn chuyên ngành may, thiết bị may công

Published in: Education
  • Be the first to comment

Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền bắc việt nam

  1. 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- NGỌ VĂN NGÔN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, NĂM 2015
  2. 2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- NGỌ VĂN NGÔN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62.62.01.12 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Nguyễn Văn Viết 2. TS. Hà Viết Cƣờng HÀ NỘI, NĂM 2015
  3. 3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện. Công trình đƣợc thực hiện trong thời gian từ năm 2012-2014. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, chƣa từng bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Luận án có sử dụng kết quả của đề tài khoa học “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng kỹ thuật chỉ thị ADN” do PGS.TS. Nguyễn Văn Viết - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm đề tài phối hợp với Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Phần kết quả nghiên cứu này đã đƣợc những ngƣời cùng tham gia thực hiện cho phép công bố trong luận án. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Ngọ Văn Ngôn
  4. 4. ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc, Ban Đào tạo sau đại học, các quý thầy, cô giáo của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Văn Viết và TS. Hà Viết Cƣờng, những ngƣời thầy tâm huyết đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hƣớng khoa học cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm; Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các địa phƣơng tác giả thu thập số liệu, quý thầy cô, cán bộ nghiên cứu, các phòng, bộ môn của đơn vị đã có nhiều ý kiến đóng góp và tạo điều kiện giúp đỡ quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, tác giả các công trình công bố đã trích dẫn trong luận án vì đã cung cấp nguồn tƣ liệu quý báu, những kiến thức liên quan trong quá trình tác giả nghiên cứu hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo UBND Thành phố Hà Nội, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Hà Nội; Chi cục Phát triển nông thôn Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về thời gian và tài chính để tác giả hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án. Cuối cùng, với tình yêu từ đáy lòng, tác giả xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ, vợ, con cùng các anh, chị, em của tác giả, những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên về vật chất và tinh thần để tác giả vững tâm hoàn thành luận án của mình. Xin chân thành cảm ơn. Tác giả luận án Ngọ Văn Ngôn
  5. 5. iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các bảng viii Danh mục các hình xi MỞ ĐẦU 1 1 Tính cấp thiết của đề tài 1 2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4 5 Những đóng góp mới của luận án 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 6 1.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam 7 1.2 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc 8 1.3 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 10 1.4 Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 11 1.5 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum 12 1.5.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo 12 1.5.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum 13 1.5.3 Phƣơng thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum 14 1.5.4 Ảnh hƣởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 15 1.5.5 Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh 16 1.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc 17 1.6.1 Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum 17 1.6.2 Chủng 18
  6. 6. iv 1.6.3 Loài phức 19 1.6.4 Kiểu gây bệnh 19 1.6.5 Kiểu quan hệ phả hệ 19 1.7 Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 20 1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh 20 1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 22 1.8 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 25 1.8.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống kháng bệnh 25 1.8.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 28 CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Nội dung nghiên cứu 36 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 2.3 Vật liệu nghiên cứu 37 2.4 Môi trƣờng, hóa chất dùng trong nghiên cứu 39 2.4.1 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong phân lập vi khuẩn, phản ứng sinh hóa 39 2.4.2 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong PCR 40 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.5.1 Phƣơng pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng 40 2.5.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 41 2.5.3 Phƣơng pháp thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc 41 2.5.4 Phƣơng pháp xác định biovar của vi khuẩn R.solanacearum 42 2.5.5 Phƣơng pháp thí nghiệm một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn R. solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh héo xanh hại lạc 43 2.5.6 Phƣơng pháp phân tích ADN 44
  7. 7. v 2.5.7 Phƣơng pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK của nguồn vật liệu 48 2.5.8 Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tập đoàn và so sánh giống 49 2.5.9 Chỉ tiêu theo dõi 50 2.5.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 51 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 52 3.1.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 52 3.1.2 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 54 3.1.3 Phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 55 3.1.4 Thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 58 3.2 Nghiên cứu biovar và đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 60 3.2.1 Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 60 3.2.2 Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thuộc các biovar khác nhau 63 3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum bằng phân tích ADN 67 3.2.4 Sự phân bố các biovar và đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 72 3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc, dòng lai và dòng triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng, giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78 3.3.1 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc mẫu giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78
  8. 8. vi 3.3.2 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 92 3.3.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 101 3.3.4 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc ƣu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 109 3.3.5 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 115 3.3.6 Kết quả khảo nghiệm Quốc gia giống lạc triển vọng 125 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 1 Kết luận 128 2 Đề nghị 129 Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 130 Tài liệu tham khảo 131 Phụ lục 144
  9. 9. vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ STT Ký hiệu, chữ viết tắt và thuật ngữ Diễn giải ký hiệu, chữ viết tắt và thuật ngữ 1 o C Nhiệt độ (độ C) 2 l Microliter 3 ADN Deoxy Nucleic Acid 4 Biovar Thứ sinh học 5 Bp base pair (cặp bazơ) 6 BVTV Bảo vệ thực vật 7 Cs Cộng sự 8 CT Công thức 9 ĐC Đối chứng 10 g Gram 11 HXVK Héo xanh vi khuẩn 12 ICRISAT International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (Viện Nghiên cứu Cây trồng cho vùng nhiệt đới bán khô hạn Quốc tế) 13 Isolate Mẫu thu thập 14 NXB Nhà xuất bản 15 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) 16 R. solanacearum Ralstonia solanacearum 17 Race Nòi 18 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình ADN đƣợc nhân bội ngẫu nhiên) 19 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn) 20 SPA Sucrose Peptone Agar 21 SSR Simple Sequence Repeat (Trình tự lặp lại đơn giản) 22 Strain Chủng 23 STT Số thứ tự 24 TLB Tỷ lệ bệnh 25 TZCA Tetrazolium Chloride Agar
  10. 10. viii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Giá trị sản xuất và sản lƣợng lạc của một số nƣớc đứng đầu thế giới (niên vụ 2011/2012) 6 1.2 Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc của Việt Nam (năm 2002 - 2012) 7 1.3 Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra ở châu Á 8 2.1 Trình tự các chỉ thị phân tử SSR liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn 38 2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 39 2.3 Phản ứng xác định biovar vi khuẩn R. solanacearum 43 2.4 Mức độ chống chịu bệnh HXVK hại lạc 49 3.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, vụ Xuân năm 2012 53 3.2 Đặc điểm hình dạng, màu sắc khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum trên môi trƣờng nhân tạo sau nuôi cấy 72 giờ 56 3.3 Kết quả kiểm tra phản ứng siêu nhạy của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 58 3.4 Kết quả xác định biovar của 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012-2013) 60 3.5 Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 64 3.6 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 65 3.7 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 66
  11. 11. ix 3.8 Mức độ đa hình của 10 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân tích với các isolate vi khuẩn R. solanacearum (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 68 3.9 Phân bố biovar vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 73 3.10 Phân bố của các nhóm vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 74 3.11 Biovar và nhóm đa dạng di truyền của các mẫu bệnh ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 75 3.12 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK của tập đoàn mẫu giống lạc (Thanh Trì, năm 2012 - 2013) 79 3.13 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2013) 84 3.14 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2012-2013) 87 3.15 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực của thu một số mẫu giống lạc trong tập đoàn (năm 2012-2013) 91 3.16 Đánh khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Thanh Trì, năm 2014) 92 3.17 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 95 3.18 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 98 3.19 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai đơn (năm 2014) 101 3.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Thanh Trì, năm 2013-2014) 102 3.21 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 104
  12. 12. x 3.22 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy 106 3.23 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai hồi quy (năm 2013-2014) 108 3.24 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc ƣu tú (Thanh Trì, năm 2014) 109 3.25 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc ƣu tú (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 112 3.26 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc ƣu tú (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 113 3.27 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc ƣu tú (năm 2014) 115 3.28 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc triển vọng (Thanh Trì, năm 2013-2014) 116 3.29 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc triển vọng (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 119 3.30 Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc triển vọng 120 3.31 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 121 3.32 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013-2014) 122 3.33 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (năm 2013-2014) 124 3.34 Tình hình bệnh hại chính và khả năng chịu hạn của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) 125 3.35 Năng suất của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) 126
  13. 13. xi DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng năm 2012 55 3.2 Hình thái vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên (A)- môi trƣờng TZC; (B) - môi trƣờng SPA; (C) và (D)- bảo quản nguồn vi khuẩn 57 3.3 Thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 59 3.4 Xác định biovar các isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 62 3.5 Kết quả tách chiết ADN một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 67 3.6 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPB7 69 3.7 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPC2 69 3.8 Quan hệ di truyền giữa các isolate vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 70 3.9 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhân tạo (năm 2013) (A: sau lây 30 ngày; B: sau lây 45 ngày) 81 3.10 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 25 mẫu giống lạc 82 3.11 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR Chỉ thị GA161 với 25 mẫu giống lạc 82 3.12 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 25 mẫu giống lạc 83 3.13 Thí nghiệm tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013) 89 3.14 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc 110 3.15 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc 111
  14. 14. xii 3.16 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc 111 3.17 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc 117 3.18 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc 118 3.19 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc 118 3.20 Giống lạc L28 và L29 124
  15. 15. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày thuộc họ đậu, có nguồn gốc ở Nam Mỹ và đƣợc trồng ở trên 100 quốc gia thuộc cả 6 châu lục. Lạc là cây trồng có giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp đứng thứ 2 trong các cây lấy dầu thực vật. Sản phẩm chế biến từ lạc rất đa dạng, trong đó chủ yếu từ hạt. Hạt lạc là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến và khô dầu. Bên cạnh giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế, cây lạc còn có thể trồng xen, trồng gối với những cây trồng khác góp phần cải tạo đất, chuyển dịch cơ cấu cây trồng nông nghiệp tăng thêm nguồn thu nhập cho ngƣời sản xuất. Ở Việt Nam, lạc đang là một trong số các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng. Ngoài ra, lạc còn là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, không đòi hỏi đầu tƣ phân bón cao do bộ rễ có khả năng cố định đạm, tạo ra lƣợng đạm sinh học cung cấp cho cây và làm tăng độ phì cho đất. Hiện nay, lạc là cây họ đậu chính tham gia vào các công thức luân canh, xen canh mang tính bền vững và thân thiện với môi trƣờng. Trong hơn 100 quốc gia trồng lạc trên thế giới, Việt Nam đứng thứ 10 về diện tích và trong 25 nƣớc trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích gieo trồng sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma và Indonesia (FAO, 2013). Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên nhƣng năng suất và sản lƣợng lạc tăng chƣa tƣơng xứng với tiềm năng. Nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các địa phƣơng trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nƣớc trời nhƣ đất đồi gò, đất bãi ven sông thƣờng bị bệnh gây hại, trong đó bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là đối tƣợng gây hại nặng trên cây lạc. Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng trồng lạc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Mỹ, Nhật Bản, Papua New Guinea, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Trung Quốc, Uganda, Việt Nam,… (He, 1986; Hayward, 1990; Mehan et al., 1994; Lam và Hamidah, 1995). Bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên cây lạc với tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5% đến 20% (Mehan et al., 1986), thậm chí có những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100% (Tan et al., 1994).
  16. 16. 2 Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều tỉnh trồng lạc trong cả nƣớc nhƣ: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh,... (Mehan và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lƣơng Tề, 1997a). Bệnh gây hại nghiêm trọng ở một số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động trong khoảng 15% đến 35% và ở vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%. Năm 1896 nhà bác học Smith là ngƣời đã phát hiện vi khuẩn R. solanacearum gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990). Bệnh HXVK gây hại nặng ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và các vùng có nhiệt độ ấm áp. Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây hại trên 400 loài cây trồng thuộc 80 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong hạt giống, trong đất và cỏ dại, chính vì vậy việc phòng chống bệnh gặp nhiều khó khăn. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở trong nƣớc và trên thế giới nhƣ biện pháp luân canh, sinh học, hóa học, bằng giống kháng bệnh... Tuy nhiên sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn (Liao, 2005a). Trong thời gian qua, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật đã chọn tạo thành công một số giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhƣ giống MD7 và giống TK10 phát triển ở một số vùng thƣờng bị bệnh gây hại góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên, các giống này sản xuất liên tục trong thời gian dài nên bị thoái hóa, năng suất và khả năng kháng bệnh giảm dần. Công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở nƣớc ta đã đạt đƣợc những kết quả đáng khích lệ, tuy nhiên chủ yếu theo phƣơng pháp truyền thống nên hiệu quả tích lũy các gen kháng bệnh vào con lai còn khó khăn và mất thời gian dài. Đến nay ở nƣớc ta chƣa có nghiên cứu nào về sử dụng chỉ thị phân tử để chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn đƣợc công bố. Các nghiên cứu mới chỉ khảo sát đánh giá mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của mẫu giống lạc bằng quan sát, đánh giá bệnh trong điều kiện nhân tạo và đánh giá ở các khu vực có nguồn bệnh trong điều kiện sản xuất.
  17. 17. 3 Để rút ngắn thời gian trong việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, ứng dụng chỉ thị phân tử là con đƣờng ngắn và hiệu quả, không những góp phần hạn chế tác hại của bệnh mà còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong phòng chống bệnh, bảo vệ môi trƣờng và tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc (Liao et al., 2005b; Peng et al., 2011; Ding et al., 2012). Trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử, cần xác định biovar, nòi và đánh giá đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc đồng thời phải chọn lọc đƣợc nguồn vật liệu các dòng, giống lạc mang gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử, từ đó làm cơ sở chọn tạo ra các dòng, giống lạc mới mang gen kháng với biovar, nòi vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc phổ biến ở các vùng sản xuất. Nhằm giải quyết đƣợc các yêu cầu quản lý bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trong sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” mang tính thời sự cấp thiết. 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2.1. Mục tiêu Xác định đƣợc đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam và dòng, giống lạc kháng bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống bệnh có hiệu quả. 2.2. Yêu cầu Điều tra xác định đƣợc mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Xác định đƣợc biovar, nòi và đặc điểm sinh học một số isolate vi khuẩn R. solanacearum thu thập ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Đánh giá đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Đánh giá đƣợc khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn giống, con lai và dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử.
  18. 18. 4 Trên cơ sở chọn lọc các dòng, giống kháng bệnh và đánh giá một số đặc điểm nông học chính, xác định đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh, có năng suất cao để phát triển trong sản xuất. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học mới về đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Cung cấp tƣ liệu khoa học mới về áp dụng phƣơng pháp sinh học phân tử kết hợp với đánh giá bệnh nhân tạo nguồn vật liệu và dòng, giống lạc kháng bệnh cho chọn tạo, phát triển giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả xác định đƣợc sự phân bố biovar, đa dạng di truyền các isolate vi khuẩn R. solanacearum ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam làm cơ sở bố trí giống kháng bệnh. Xác định đƣợc vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Một số mẫu giống lạc nhƣ L28, L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao có thể sử dụng trong quản lý cây trồng tổng hợp nhằm sản xuất lạc hiệu quả, bền vững. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu Loài vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc. Một số mẫu giống lạc trong tập đoàn, dòng lai, dòng triển vọng và giống lạc đƣợc trồng ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam là ký chủ của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài thực hiện tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Nghiên cứu tập trung vào điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng; xác định đa dạng di truyền, đặc điểm sinh học một số isolate vi
  19. 19. 5 khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam; đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn và chọn lọc các dòng, giống lạc kháng bệnh bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chỉ thị phân tử. 5. Những đóng góp mới của luận án Luận án bổ sung các tƣ liệu khoa học mới về bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đặc biệt là phòng chống bằng giống kháng bệnh; sử dụng thành công phƣơng pháp sinh học phân tử kết hợp phƣơng pháp truyền thống trong xác định đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum và chọn lọc giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Ứng dụng thành công đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp với chỉ thị phân tử SSR là pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn chọn lọc đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh HXVK và có năng suất cao gồm 26 mẫu giống trong tập đoàn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng cao), 07 dòng từ tổ hợp lai đơn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-41,6 tạ/ha), 14 dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,4-40,6 tạ/ha), 13 dòng lạc ƣu tú (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 36,6-40,5 tạ/ha) và 04 dòng lạc triển vọng (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-37,8 tạ/ha) để làm vật liệu chọn tạo và phát triển giống kháng bệnh. Xác định đƣợc 2 giống lạc triển vọng gồm L28 và L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao đã đƣợc khảo nghiệm Quốc gia để phát triển trong sản xuất.
  20. 20. 6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tƣơng trong số các cây trồng lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lƣợng) và đƣợc trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng Thế giới (FAO, 2013), các nƣớc có sản lƣợng lạc lớn nhất trong niên vụ 2011/2012 là Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria và Mỹ (bảng 1.1). Bảng 1.1. Giá trị sản xuất và sản lượng lạc của một số nước đứng đầu thế giới (niên vụ 2011/2012) Tên nƣớc Giá trị sản xuất (USD) Sản lƣợng (tấn) Trung Quốc 7.388,368 16.800,000 Ấn Độ 2.452,413 5.779,000 Nigeria 1.308,585 3.070,000 Mỹ 1.334,413 3.057,850 Myanmar 551,522 1.371,500 Tanzania 348,380 810,000 Indonesia 315,292 712,874 Argentina 299,808 685,722 Senegal 285,484 672,803 Cameroon 242,354 570,000 Nguồn: FAO (2013). Năng suất lạc trung bình toàn thế giới tăng, song cũng không đều giữa các vùng lãnh thổ, vùng tăng nhiều, vùng tăng ít, thậm chí nhiều nơi diện tích và năng suất lạc đều giảm. Năng suất lạc thế giới trong niên vụ 2011/2012 trung bình đạt 1,57 tấn/ha (FAO, 2013). Trong niên vụ 2011/2012 về sản lƣợng lạc, Trung Quốc là nƣớc đứng đầu với 16,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ với 5,78 triệu tấn và Việt Nam là nƣớc đứng thứ 12 với sản lƣợng 0,47 triệu tấn. Trung Quốc có giá trị sản xuất lạc lớn nhất thế
  21. 21. 7 giới đạt gần 7,39 triệu đô la Mỹ (USD), tiếp theo là Ấn Độ, Mỹ với các chỉ số này lần lƣợt là 2,45 và 1,33 triệu USD (FAO, 2013). 1.1.2. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam Sản xuất lạc ở nƣớc ta đƣợc phân bố ở hầu hết các vùng sinh thái nông nghiệp với diện tích trồng lạc chiếm khoảng 28% tổng diện tích cây công nghiệp hàng năm (gồm đay, cói, mía, lạc, đậu tƣơng và thuốc lá), tập trung ở các vùng chủ yếu nhƣ vùng Duyên hải Nam Trung Bộ, vùng Đồng bằng sông Hồng, vùng Trung du và Miền núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ. Các vùng khác có diện tích trồng lạc thấp hơn. Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam (năm 2002 - 2012) Năm Diện tích (1.000 ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lƣợng (1.000 tấn) 2002 246,7 1,62 400,4 2003 243,8 1,67 406,2 2004 263,7 1,78 469,0 2005 269,6 1,81 489,3 2006 246,7 1,87 462,5 2007 254,5 2,00 510,0 2008 255,3 2,08 530,2 2009 245,0 2,09 510,9 2010 231,4 2,11 487,2 2011 223,8 2,08 465,9 2012 220,5 2,13 470,6 Nguồn: Tổng cục Thống kê (2013). Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam (2013) cho thấy, trong vòng 10 năm qua (2002-2012). Mặc dù diện tích giảm từ 246,7 ha (năm 2002) xuống còn 220,5 ha (năm 2012) nhƣng sản xuất lạc ở Việt Nam đã có những bƣớc chuyển biến tích cực về năng suất từ 1,62 tấn/ha (năm 2002) tăng lên 2,13 tấn/ha (năm 2012) với sản lƣợng tăng từ 400,4 nghìn tấn (năm 2002) lên 470,6 nghìn tấn (năm 2012). Năm
  22. 22. 8 2012, năng suất lạc bình quân cả nƣớc đạt cao nhất là 2,13 tấn/ha. Sản lƣợng lạc của cả nƣớc đạt cao nhất vào năm 2008 với 530,2 nghìn tấn (Tổng cục Thống kê, 2013). 1.2. Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng trồng lạc. Tuy nhiên, bệnh gây hại nghiêm trọng hơn ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Denny, 2006; Genin và Denny, 2012). Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc thông báo ở Đông và Đông Nam Á nhƣ Trung Quốc (He, 1986); Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Papua New Guinea và Ấn Độ (Hayward, 1990). Bệnh cũng đƣợc thông báo ở một số nƣớc nhƣ Đài Loan, Nhật Bản và Nam Carolina ở Mỹ. Bệnh cũng đƣợc coi là gây thiệt hại kinh tế quan trọng ở Uganda (Mehan et al., 1994); ở Indonesia, Thái Lan, Malaysia (Lam và Hamidah, 1995) và Việt Nam (bảng 1.3). Bảng 1.3. Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra ở châu Á Nƣớc Mức độ giảm năng suất (%) Nguồn tài liệu Trung Quốc 10 - 100 Tan et al., 1994 Indonesia 5 - 65 Machmud và Rais, 1994 Malaysia 0 - 20 Lam và Hamidah, 1994 Philippines 30 Natural, 1994 Thái Lan >50 Butranu et al., 1994 Việt Nam 5 - 80 Hong et al., 1994 Nguồn: Pande et al. (1998). Hàng năm ƣớc tính thiệt hại do bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) trên lạc từ 50.000 đến 150.000 tấn (Machmud và Rats, 1994). Ở Trung Quốc, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở 16 tỉnh, nhƣng gây hại chủ yếu ở vùng sản xuất lạc miền Trung và miền Nam Trung Quốc, các tỉnh bị bệnh nặng là Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, An Huy. Tỷ lệ bệnh héo xanh ở Quảng Đông từ 10% đến 20%, ở những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100% (Tan et al., 1994).
  23. 23. 9 Với điều kiện nóng ẩm của vùng nhiệt đới ở Malaysia, bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên nhiều loài cây trồng, trong đó có cây lạc. Trên cây lạc, tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5% đến 20% và là nguyên nhân chính làm diện tích trồng lạc giảm từ 5.197 ha năm 1980 còn 1.318 ha năm 1986 với sản lƣợng tƣơng ứng từ 19.437 tấn giảm còn 5.000 tấn (Mehan et al., 1986). Kết quả khảo sát năm 1993 cho thấy bệnh xuất hiện chủ yếu ở các vùng trồng lạc chính của vùng Kelantan và Terengganu. Tỷ lệ bệnh trên đồng ruộng biến động từ 0% đến 20% (Lam và Hamidah, 1995). Mức độ thiệt hại của bệnh ở vùng đất thấp có tƣới thƣờng thấp hơn ở vùng đất cao và khô hạn. Bệnh gây hại chủ yếu ở Nam Sumatra, Tây Java và Nam Sulawesi. Các vùng thuộc Trung và Đông Java, Bali và Bắc Sulawesi bệnh nhẹ hơn (Hayward, 1990; Machmud và Hayward, 1993). Ở Thái Lan, bệnh héo xanh vi khuẩn R. solanacearum gây hại lạc ở nhiều vùng thuộc miền Nam, miền Trung và các tỉnh phía Bắc. Bệnh gây hại chủ yếu ở những vùng trồng lạc liên tục nhiều vụ hàng năm trồng trên đất cát và tùy thuộc và giống, khí hậu, điều kiện canh tác (Butranu et al., 1994). Ở Việt Nam từ năm 1968, Đặng Thái Thuận và cs. (1968) đã phát hiện, mô tả bệnh chết ẻo cây lạc, mức độ gây hại của bệnh từ 20% đến 30%. Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều vùng trồng trong cả nƣớc (Mehan và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lƣơng Tề, 1997a). Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1991) cho rằng ở 14 hợp tác xã trồng lạc thì bệnh HXVK hại nặng nhất ở một số điểm điều tra của tỉnh Nghệ An với tỷ lệ từ 15% đến 40%, trong khi đó ở các điểm điều tra của huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang tỷ lệ bệnh trung bình chỉ từ 10% đến 15%. Nguyễn Văn Liễu và cs. (1995) điều tra tình hình bệnh HXVK hại lạc trong sản xuất ở miền Bắc và xác định hầu hết các giống lạc đang đƣợc trồng phổ biến trong sản xuất tại thời điểm nghiên cứu là không kháng bệnh HXVK (tỷ lệ cây chết trung bình trong vụ Xuân là 15% đến 25%, ở những vùng ổ dịch bệnh gây chết từ 90% đến 100%). Theo Nguyễn Văn Liễu (1998), bệnh HXVK có ở hầu khắp các vùng trồng lạc của miền Bắc, các tỉnh trọng điểm trồng lạc nhƣ Nghệ An, Thanh Hoá, Bắc Giang là những vùng bị bệnh gây hại từ 10% đến 20%.
  24. 24. 10 Theo Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010), bệnh héo xanh vi khuẩn là một bệnh gây hại phổ biến trên cây lạc vùng Hà Nội và phụ cận. Trong năm 2008- 2009, kết quả điều cho thấy tỷ lệ bệnh HXVK hại lạc cao nhất ở huyện Ý Yên, tỉnh Nam Định trên giống lạc Sen lai (1,28%) và tỷ lệ bệnh thấp nhất ở huyện Lạng Giang, tỉnh Bắc Giang trên giống lạc L14 (0,19%). 1.3. Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc Mehan et al. (1994) đã mô tả triệu chứng bệnh HXVK hại lạc nhƣ sau: triệu chứng bệnh có thể quan sát rõ trên cây lạc sau khi trồng 2 - 3 tuần. Cây con nhiễm bệnh nặng, héo chết nhanh. Trên đồng ruộng triệu chứng bệnh thể hiện rõ và nhiều nhất ở giai đoạn cây bắt đầu ra hoa trở đi. Dấu hiệu đầu tiên của bệnh là một vài lá ở phía trên tái đi, hơi rủ xuống. Lúc đầu, lá cây héo vào ban ngày và ban đêm lại hồi phục đƣợc, nhƣng chỉ sau vài ngày cây bị héo nhanh chóng, bộ lá héo rũ xuống không hồi phục đƣợc. Tiếp theo là cây bị khô, lá có màu xanh nâu, chóp rễ cây bệnh bị thối nhũn, mầu nâu đen. Cắt gốc thân có thể thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài lên phía trên. Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt ngang có dịch nhầy trắng sữa chảy ra. Đối với cây già hơn hoặc những giống ít bị nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn thì quá trình héo diễn ra từ từ và thƣờng bắt đầu bị bệnh ở cành trên và cuối cùng toàn bộ cây có thể bị héo và chết. Đôi khi cây bị nhiễm bệnh héo xanh không biểu hiện rõ triệu chứng. Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là loại bệnh hại mạch dẫn nên triệu chứng đặc trƣng nhất là mạch dẫn ở thân, cành, rễ bị biến màu nâu sẫm, trong đó chứa đầy dịch vi khuẩn. Trên cây bệnh lá bị héo rũ, cuối cùng cây héo khô, rễ và quả lạc bị thối đen (Mehan et al., 1994). Ở Việt Nam, Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010) nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc tại vùng Hà Nội và phụ cận cho biết, triệu chứng gây hại chủ yếu của bệnh trên cây lạc làm lá ngọn héo rũ có mầu xanh tái, mặt lá phía dƣới, các cành cũng bị héo dần và chết nhanh. Ban đầu lá héo vào ban ngày, ban đêm lại phục hồi, nhƣng chỉ sau vài ngày cây lạc héo rũ hẳn xuống không phục hồi đƣợc. Cắt gốc thân thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài lên phía trên. Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt ngang có dịch nhầy trắng nhƣ sữa chảy ra.
  25. 25. 11 1.4. Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn đƣợc Smith đặt tên là Bacillus solanacearum. Tiếp theo, vi khuẩn đƣợc đổi tên là Pseudomonas solanacearum (Smith, 1896). Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia. Vi khuẩn P. solanacearum đã đƣợc phân loại lại thành Burkholderia solanacearum (Yabuuchi et al., 1992). Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng B. solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi mới là Ralstonia. Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B. solanacearum đã đƣợc đổi tên lại là R. solanacearum (Yabuuchi et al., 1995). Sau Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về vi khuẩn năm 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia solanacearum. Hiện nay phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Phylum): Proteobacteria Lớp (Class): Beta Proteobacteria Bộ (Order): Burkholderiales Họ (Family): Ralstoniaceae Chi (Genus): Ralstonia Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010). Ngoài ra, vi khuẩn còn có các tên đồng nghĩa khác (synonym) là Pseudomonas ricini (Archibald) Robbs, 1954; Pseudomonas batatae Cheng và Faan, 1962 (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010). Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.), vi khuẩn R. solanacearum còn gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus spp., Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var. cicla, Capsicum annuum, Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis,
  26. 26. 12 Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma longa, Cynara cardunculus var. scolymus, Emilia sonchifolia sp., Eucalyptus sp., Galinsoga parviflora sp., Gossypium sp., Heliconia sp., Heliconia caribaea, Hevea brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea subsp. europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus, Pogostemon cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis, Siraitia grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona grandis, Urtica dioica, Washingtonia filifera, Zingiber officinale,... (Hayward, 1994; Mehan et al., 1994, Agrios, 2008; Chandrashekara và Prasnnakumar, 2010; Peng et al., 2012; Wu et al., 2013; Lin et al., 2015). Tuy nhiên, loài vi khuẩn R. solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hoá hình thành nhiều nòi và biovar khác hẳn nhau về tính chuyên hoá ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau ở các vùng địa lý sinh thái. Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc. Theo Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1993) vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác. Đỗ Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại nghiêm trọng trên cây cà chua, khoai tây, lạc. Đoàn Thị Thanh và cs. (1995) cho biết vi khuẩn R. solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn ký sinh và gây hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà. Tác giả còn cho rằng đây là loài vi khuẩn đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae). Năm 1977, Lê Lƣơng Tề (1997a) đã xác định vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác nhƣ cà chua, khoai tây, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và đay. 1.5. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum 1.5.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo R. solanacesrum là vi khuẩn hình que, kích thƣớc tế bào 0,5 x 1,5 µm, nhuộm gram âm. Các mẫu phân lập (isolate) có độc tính cao phần lớn không có
  27. 27. 13 lông roi và không di động, ngƣợc lại những isolate có độc tính thấp thƣờng có từ 1 đến 4 lông roi mọc đối nhau, có mức di động cao và đều có các lông roi nhỏ ở rìa (Mehan et al., 1994; Anitha et al., 2003). Nếu isolate vi khuẩn chuyển sang kiểu khuẩn lạc nâu, răn reo là isolate vi khuẩn mất tính độc (nhƣợc độc). Để phát hiện dòng vi khuẩn có tính độc thƣờng dùng môi trƣờng chọn lọc TZCA (tetrazolium chloride agar). Trên môi trƣờng này isolate vi khuẩn có tính độc sẽ có khuẩn lạc nhỏ, ở giữa màu hồng, rìa trắng (Kelman, 1954). Vi khuẩn R. solanacearum có cấu tạo đơn bào. Cấu trúc của tế bào vi khuẩn gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lƣợng khô của tế bào có tác dụng bảo vệ và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định. Tế bào gồm chất nguyên sinh, chất này chứa bào tƣơng, chất nhân (nucleus) và các hạt tròn nhỏ khác nhau trong có chứa chất dinh dƣỡng dự trữ. Bào tƣơng giàu RNA còn nhân giàu ADN. Bằng kính hiển vi điện tử có thể phân biệt đƣợc các cấu trúc đại phân tử với đƣờng kính khoảng 200 Ao (Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome. Các phân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein. Trong tế bào vi khuẩn không thể hiện rõ nhân nhƣ trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật, nhƣng trong bào tƣơng thƣờng có thể phân biệt đƣợc “những nhiễm sắc thể” mà thƣờng đƣợc xem nhƣ tƣơng ứng với nhân. Tế bào chất nằm trong màng bào tƣơng, ngoài màng bào tƣơng lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có hình dạng nhất định. Thức ăn vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao đổi hình thành trong bào tƣơng cũng qua màng đó mà bị thải ra ngoài (Kinaly và cs., 1983; Izrainxki, 1988; Mehan et al., 1994). 1.5.2. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum Vi khuẩn R. solanacearum là vi khuẩn háo khí, không hình thành bào tử và nhuộm gram âm. Vi khuẩn này có khả năng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate nhƣ là nguồn các bon dự trữ. Vi khuẩn R. solanacearum không hóa lỏng gelatin, không thủy phân tinh bột, không có khả năng tạo indol và không sử dụng arginin. Tuy nhiên, loài vi khuẩn này có khả năng tạo ra H2S, khử nitrat, có khả năng thủy phân Tween 80, phản ứng dƣơng tính Le-van, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidase và catalase, urê, pectin, ôxi hóa acetat, malonate và gluconate. Vi khuẩn R. solanacearum
  28. 28. 14 chịu đựng kém với muối NaCl. Các isolate của vi khuẩn R. solanacearum không thể phát triển trên môi trƣờng chứa 2% NaCl và bị kìm hãm ở môi trƣờng có 0,5% đến 1,5% NaCl (Hayward, 1964; He et al., 1983; Ryan et al., 2008). 1.5.3. Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum Vi khuẩn R. solanacearum tồn tại trong đất, trong tàn dƣ thực vật. Nhiều loài cỏ dại còn là ký chủ phụ của loài vi khuẩn này, là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây trồng. Vi khuẩn còn tồn tại trong hạt giống. Ở Indonesia và Trung Quốc, hạt lạc thu từ những cây nhiễm bệnh có thể truyền bệnh cho vụ sau. Vi khuẩn tồn tại trên vỏ hạt, vỏ lụa và trong phôi hạt (Middleton và Hayward, 1990; Machmud, 1993; Anitha et al., 2003). Vi khuẩn R. solanacearum xâm nhập vào cây lạc qua vết thƣơng cơ giới hoặc qua lỗ mở tự nhiên ở rễ của cây và đƣợc nhân lên nhanh chóng trong mạnh dẫn làm cho mạnh dẫn trở nên bị tắc nghẽn, vi khuẩn có thể tiếp tục xâm nhập vào những mô lân cận. Trong quá trình này, vi khuẩn sản sinh ra các hệ men nhƣ pectinase, cellulose để phân hủy mô, tế bào cây và sinh ra các độc tố làm tắc mạch dẫn, cản trở vận chuyển nƣớc, nhựa nguyên và nhựa luyện trong cây làm cây bị héo nhanh chóng. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum có độc tính đƣợc quyết định bởi hệ gen độc hrp (hypersensitive response and pathogenicity). Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là bệnh lây lan chủ yếu qua đất. Trong số các vi khuẩn hại cây trồng thì vi khuẩn R. solanacearum bền vững nhất trong đất. Vi khuẩn R. solanacearum có thể sống sót trong đất bỏ hóa vài năm thậm chí cả khi không có cây trồng trên đất đó. Vi khuẩn R. solanacearum có thể qua đông trong đất, đất bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh ban đầu quan trọng nhất. Vi khuẩn tồn tại lâu trong đất khi trồng liên tục cây ký chủ nhiễm bệnh hoặc có sự kết hợp với cây ký chủ khác xen kẽ trên đồng ruộng. Vi khuẩn tồn tại tốt ở đất đủ ẩm, thoáng khí, nhƣng bị kìm hãm ở đất khô và đất bị ngập nƣớc. Vi khuẩn R. solanacearum lây lan chủ yếu qua đất nhƣng cũng dễ dàng truyền lan theo nguồn nƣớc, qua mƣa gió và qua những vết thƣơng cơ giới, qua dụng cụ sản xuất của con ngƣời, cũng có thể qua vết thƣơng ở rễ do côn trùng và tuyến trùng gây ra (Middleton và Hayward, 1990).
  29. 29. 15 1.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc Sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có liên quan chặt chẽ với các yếu tố thời tiết khí hậu nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, mƣa, gió, độ pH đất,... Từ lúc xâm nhiễm tới khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên của bệnh phải trải qua một khoảng thời gian nhất định. Thời gian đó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh. Bệnh phát triển mạnh, thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm nhất là ở nhiệt độ từ 25o C đến 35o C nên bệnh gây hại chủ yếu là ở vùng nhiệt đới. Đất có độ ẩm cao >60% và độ pH 5 - 6,8 thích hợp cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn (Anitha et al., 2003). Bệnh hại nặng hơn trên đất cát pha, thịt nhẹ, trên ruộng nghèo chất hữu cơ, độc canh cây ký chủ… Bệnh phát triển kém, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn trên các ruộng luân canh lạc với lúa nƣớc, các loài cây không phải là ký chủ và trên đất kiềm hoặc bón vôi. Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1995) cho rằng bệnh HXVK hại lạc là một trong những bệnh phổ biến phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ tƣơng đối cao. Theo Lê Lƣơng Tề (1997b), bệnh HXVK hại lạc thƣờng phát sinh ở cả hai thời vụ trồng là lạc Xuân và lạc Thu. Trong điều kiện nhiệt độ tƣơng đối cao, ẩm ƣớt, cây sinh trƣởng kém, đất cát, nhất là trên đất trồng độc canh cây lạc, bệnh gây hại nặng. Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại lạc với các yếu tố sinh thái, kỹ thuật, Lê Lƣơng Tề (1997b) cho rằng bệnh có thể phát sinh ở các giai đoạn sinh trƣởng của cây, cao điểm của bệnh là thời kỳ cây ra hoa đến quả non, sau đó bệnh giảm ở giai đoạn quả già. Về ảnh hƣởng của phân bón thì vôi và kali có tác dụng hạn chế tác hại của bệnh, cho năng suất lạc cao hơn so với đối chứng. Chế độ luân canh có ảnh hƣởng tới sự phát triển của bệnh, chu kỳ luân canh càng dài, mức độ gây hại của bệnh càng giảm. Ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc thì tỷ lệ bệnh HXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc Xuân - lạc Thu hoặc lúa - khoai tây - lạc. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng ở phía bắc Việt Nam, bệnh HXVK phát sinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sông, còn trên đất luân canh với lúa nƣớc thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn. Đỗ Tấn Dũng (1999) nghiên cứu bệnh HXVK hại lạc ở vùng Đông Anh, Hà Nội có nhận xét bệnh phát sinh và gây hại nặng từ giai đoạn cây lạc ra hoa rộ đến quả non.
  30. 30. 16 Nguyễn Văn Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tƣơng quan giữa bệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc liên tục trên đất gò đồi và đất dốc miền núi làm gia tăng tích lũy nguồn bệnh và làm tăng tỷ lệ bệnh các năm tiếp theo. 1.5.5. Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh Trên đồng ruộng có thể xác định bệnh nhanh bằng cách cắt một đoạn thân ngắn khoảng 3 cm gần gốc thân cây bị bệnh, ngâm vào cốc nƣớc, sau một thời gian xuất hiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt. Cắt dọc theo thân cây, dễ dàng nhận thấy mạch dẫn bị chuyển màu thành nâu sẫm hoặc nâu nhạt (Wang và Hou, 1983). Phƣơng pháp chẩn đoán này cũng đã đƣợc áp dụng tại Việt Nam (Burgess et al., 2009; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010). Có nhiều phƣơng pháp để xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc nhƣ phân lập trên môi trƣờng, phƣơng pháp huyết thanh, phƣơng pháp phân tích PCR (Mehan và Mc. Donald, 1995). Theo Mehan (1995), môi trƣờng tetrazolium chloride agar (TZCA) phù hợp để phân lập vi khuẩn R. solanacearum, còn môi trƣờng sucrose peptone agar (SPA) phù hợp để nhân vi khuẩn R. solanacearum. Trên môi trƣờng TZCA khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum tròn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng, còn trên môi trƣờng SPA, khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum có hình dạng tròn, nhẵn bóng, màu trắng sữa. Nhiều công trình nghiên cứu về phƣơng pháp và ứng dụng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) trong chẩn đoán bệnh trên cây trồng và các ứng dụng khác trong bệnh học thực vật đã đƣợc công bố. Phƣơng pháp PCR có nhiều lợi thế hơn hẳn so với các phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống nhờ có độ nhạy cao, tốc độ nhanh. Bằng phƣơng pháp ứng dụng PCR, chỉ một vài giờ, từ một đoạn ADN ban đầu và đoạn mồi có thể nhân lên hàng trăm triệu lần sau đó đi sâu phân tích kiểu gen, xác định, nhận biết một cách chính xác nòi, biovar vi khuẩn R. solanacearum ở trong mẫu cây bệnh cũng nhƣ trong đất nhiễm bệnh. Theo kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệm tham gia mạng lƣới nghiên cứu vi khuẩn héo xanh ở các nƣớc và vùng lãnh thổ châu Á, Thái Bình Dƣơng nhƣ: Australasia, Đài Loan, Philippines,… thì sản phẩm PCR của các mẫu
  31. 31. 17 phân lập thuộc loài R. solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có kích thƣớc không đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) và chỉ có các isolate cho sản phẩm PCR có kích thƣớc nhƣ vậy mới có tính độc (Opina et al., 1997). 1.6. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc 1.6.1. Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum Trong hơn 40 năm qua, nhiều tác giả sử dụng khái niệm nòi và biovar để phân biệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum. Biovar của vi khuẩn R. solanacearum đƣợc xác định dựa trên khả năng chuyển hóa cácbon hydrat, cụ thể là khả năng ô xy hóa 3 đƣờng đôi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rƣợu Hexo - cacbon (dulcitol, manitol, sorbitol) (Hayward, 1964; He et al., 1983). Hiện nay, 5 biovar của vi khuẩn R. solanacearum đã đƣợc ghi nhận bao gồm: - Biovar 1: không ô xy hóa cácbon hydrat. - Biovar 2: ô xy hóa đƣờng nhƣng không ô xy hóa rƣợu. - Biovar 3: ô xy hóa tất cả các bon hydrat. - Biovar 4: chỉ ô xy hóa rƣợu. - Biovar 5: ô xy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhƣng không ô xy hóa sorbitol, dulcitol. Các mẫu R. solanacearum thuộc biovar 2 phân lập từ vùng Amazon (châu Mỹ) có đặc tính sinh hóa khá khác biệt (dựa trên khả năng sử dụng đƣờng ribose và đƣờng trehalose). Nhóm này đƣợc đặt tên là biovar 2-T (hoặc N2) còn biovar 2 gốc đƣợc đổi thành biovar 2-A (Hayward, 1995b). Biovar 1, biovar 3 và biovar 4 gây hại cho lạc còn biovar 2 và biovar 5 không gây bệnh cho lạc. Biovar 1 gây bệnh trên lạc ở Mỹ, còn hầu hết các isolate gây bệnh trên cây lạc ở các nƣớc châu Á, châu Phi chủ yếu là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Theo Wu et al. (2013), 11 isolate của vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ các tỉnh khác nhau của Trung Quốc thuộc biovar 3. Buddenhahem và Kelman (1964), Hayward (1964), He et al. (1983) đã phân chia các isolate vi khuẩn R. solanacearum thành 5 nòi (race) dựa trên phổ ký chủ. Năm nòi của R. solanacearum gồm:
  32. 32. 18 Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà (Solanaceae) và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân bố chủ yếu ở vùng đất thấp của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nòi 1 gồm biovar 1, biovar 3 và biovar 4. Nòi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và Nam Mỹ gồm biovar 2 và biovar 3. Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua và đƣợc tìm thấy ở vùng ôn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao. Nòi 3 chỉ có biovar 2. Nòi 4 (race 4): Gây hại trên gừng, tìm thấy chủ yếu ở Philippines. Nòi 4 chỉ có biovar 4. Nòi 5 (race 5): Gây hại trên cây dâu tằm, lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Trung Quốc. Nòi 5 chỉ có biovar 5. Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn R. solanacearum phân lập đƣợc kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc và một số cây ký chủ khác, các mẫu phân lập đƣợc đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4. Đỗ Tấn Dũng (1999) cho rằng, tác nhân gây ra bệnh HXVK trên cây cà chua, cà pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do loài vi khuẩn R. solanacearum Smith, thuộc nòi 1, biovar 3. Các isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ các cây ký chủ đều có khả năng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnh khác nhau, điều đó thể hiện tính độc, tính gây bệnh giữa các isolate vi khuẩn cũng khác nhau. Phân tích các mẫu bệnh HXVK thu thập từ một số vùng trồng lạc, Nguyễn Thị Yến và cs. (2002) cũng xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (2002) đã cho biết trồng lạc ở đất đồi gò, đất bãi ven sông thƣờng bị bệnh héo xanh gây hại nặng và cũng đã xác định đƣợc biovar 3 và biovar 4 gây hại trên lạc ở Việt Nam. 1.6.2. Chủng Cho tới nay, không có một định nghĩa chính thức về chủng (strain) của vi khuẩn R. solanacearum. Các tác giả trên thế giới thƣờng sử dụng thuật ngữ chủng để chỉ các mẫu vi khuẩn R. solanacearum khác nhau về bất cứ đặc điểm nào nhƣ nguồn gốc phân lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền.
  33. 33. 19 Chủng của vi khuẩn R. solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ, phân bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn (Buddenhagen và Kelman, 1964). Bên cạnh phƣơng pháp truyền thống xác định nòi dựa vào phạm vi ký chủ và xác định biovar dựa vào phản ứng sinh hóa, nhờ thành tựu của sinh học phân tử, ngày nay phân tích ADN trở thành phƣơng pháp chính xác và phù hợp để xác định chủng nhiều loại ký sinh. Bên cạnh phƣơng pháp truyền thống xác định nòi và biovar, Hayward (1990) cho biết, bằng phân tích ADN qua phƣơng pháp RFLP đã xác định vi khuẩn R. solanacearum gây hại lạc gồm 2 nhóm chính là nhóm I và nhóm II. Nguyễn Văn Tuất và cs. (2007) đã phân tích tính đa hình của 25 isolate vi khuẩn với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và phân chia thành 2 nhóm gồm nhóm I và nhóm II. 1.6.3. Loài phức Khi phân tích đa dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh, Gillings và Fahy (1993) đã nhận thấy vi khuẩn R. solanacearum rất đa dạng và gợi ý rằng vi khuẩn này có lẽ là một loài phức (complex species). Theo Fegan và Prior (2005) “loài phức” là một tập hợp các cá thể có quan hệ gần gũi nhƣng thuộc các loài khác nhau. Các nghiên cứu đa dạng vi khuẩn dựa trên lai ADN cho thấy vi khuẩn héo xanh cực kỳ đa dạng với mức độ tƣơng đồng ADN của các mẫu vi khuẩn thƣờng < 70% (là ngƣỡng thƣờng đƣợc sử dụng để phân biệt vi khuẩn ở mức loài). Hiện nay, vi khuẩn R. solanacearum chính thức đƣợc xem là một loài phức (Meng, 2013). 1.6.4. Kiểu gây bệnh Các chủng vi khuẩn héo xanh còn đƣợc phân biệt thành các kiểu gây bệnh (pathotype) dựa trên phản ứng đối với một loại cây trồng nào đó. Theo Tan et al. (1994), 36 mẫu vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ 6 tỉnh của Trung Quốc đã đƣợc xếp thành 7 kiểu gây bệnh khác nhau cụ thể dựa trên độc tính của chúng đối với 6 giống lạc chỉ thị (Xiekangking, Taishan sanlirou, Huangchuan zhigan, Lukang qing, Fuhua Sheng, Ehua 1). 1.6.5. Kiểu quan hệ phả hệ Gần đây, một hệ thống phân loại nữa gọi là kiểu quan hệ phả hệ (phylotype)
  34. 34. 20 đã đƣợc áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R. solanacearum. Cách phân loại này dựa trên phân tích trình tự các gen mã hóa nhƣ gen 16S RNA ribosome, gen egl, gen hrpB, và gen mutS (Poussier et al., 2000; Allen et al., 2005; Prior và Fegan, 2005). Có 4 phylotype (Denny, 2006) đã đƣợc ghi nhận và phân tích cho thấy các phylotype tƣơng quan với nguồn gốc địa lý của các chủng: phylotype I gồm các chủng chủ yếu từ châu Á, phylotype II từ châu Mỹ, phylotype III từ châu Phi và các đảo thuộc Ấn Độ Dƣơng và phylotype IV từ Indonesia (Remenant et al., 2011). Nhìn chung, phylotype là hệ thống phân loại rất ổn định và có ý nghĩa về mặt tiến hóa đối với phức hợp loài vi khuẩn R. solanacearum (Meng, 2013). 1.7. Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 1.7.1. Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh Trên thế giới, từ năm 1910 biện pháp dùng giống kháng bệnh HXVK đã đƣợc biết đến trên cây lạc. Việc chọn tạo và đƣa vào ứng dụng giống lạc Schwarz 21 kháng bệnh HXVK tại Indonesia năm 1927 và sau đó giống này trở thành vật liệu khởi đầu cho chọn giống lạc kháng bệnh nhƣ Gajah, Pelanduk, Tupai (Middleton và Hayward, 1990). Ở Trung Quốc cũng đã tạo đƣợc những giống lạc kháng bệnh HXVK cho năng suất cao và chất lƣợng tốt nhƣ Luhua 3, Guiyou 28, Zhong Hua 2, Yue You 92, Jinyou 3121. Những giống lạc kháng R. solanacearum thƣờng tỷ lệ nhiễm bệnh trong khoảng 10%, trong khi đó ở những giống nhiễm bệnh thì ở cùng điều kiện tỷ lệ nhiễm bệnh lên đến 90% (Mehan et al., 1994). Ở Uganda, Busolo-Bulafu et al. (1993) đã nghiên cứu đánh giá chọn lọc nhiều giống lạc và đã tìm ra đƣợc một số giống lạc kháng bệnh HXVK đƣa vào thực tế sản xuất nhƣ Igola-1, AT474/3/5/3. Chƣơng trình chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã rất đƣợc chú ý ở Trung Quốc. Những giống lạc vừa có tính kháng bệnh HXVK vừa có khả năng cho năng suất cao đã đƣợc đƣa vào sản xuất có vai trò hết sức quan trọng trong việc kiểm soát bệnh và tăng sản lƣợng lạc ở những vùng nhiễm bệnh HXVK (Mehan et al., 1986). Cuối những năm 1960 đã có một số lƣợng giống lạc kháng bệnh HXVK đáng kể đƣợc đƣa vào sản xuất (Mehan et al., 1994). Việc xác định nguồn gen kháng bệnh HXVK luôn đƣợc coi là một hƣớng ƣu tiên và đƣợc xúc tiến ngay từ những giai đoạn nghiên cứu đầu tiên về bệnh HXVK ở
  35. 35. 21 nhiều quốc gia (Mehan et al., 1994). Một số nƣớc nhƣ Uganda, Mỹ, Thái lan, Malaysia, Philippines, Sri Lanka cũng luôn coi việc sử dụng giống chống bệnh là biện pháp chính và quan tâm nhất trong chƣơng trình kiểm soát bệnh HXVK (Mehan et al., 1994). Từ đó cho thấy sử dụng giống khánh bệnh luôn là hƣớng ƣu tiên hàng đầu trong chiến lƣợc phòng chống bệnh HXVK ở hầu hết các nƣớc mà có bệnh HXVK gây hại. Trong các thập kỷ 1960 - 1980 việc sàng lọc giống lạc kháng bệnh HXVK tiếp tục đƣợc thực hiện và đã xác định đƣợc nhiều dòng có tính kháng nhƣ: PI 341884, PI 341885, PI 341886, R12, 708, ICGS 5313, ICGS 7968. Với sự hợp tác của ICRISAT, nhiều giống và dòng lạc đƣợc nhập từ ICRISAT đƣợc tiếp tục đánh giá tính kháng ở Uganda (Busolo-Bulafu et al., 1993). Ở Việt Nam, công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã đƣợc nghiên cứu thành công và ứng dụng trong sản xuất. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1993) đã chọn đƣợc một số giống lạc kháng bệnh HXVK nhƣ giống KPS17, đặc biệt là giống MD7 có tính kháng bệnh HXVK cao, đƣợc đƣa vào khảo nghiệm diện rộng và sản xuất tại một số vùng sinh thái. Theo Nguyễn Văn Liễu và cs. (1998) giống lạc Gié Nho Quan là giống có mức kháng bệnh HXVK cao nhất trong tập đoàn (tỷ lệ cây sống sót trong vƣờn nhiễm trung bình là 94,9 ± 1,9%). Phổ kháng bệnh của giống này rộng với nhiều nguồn bệnh ở các vùng sinh thái khác nhau thuộc miền Bắc và ổn định qua nhiều vụ, nhiều năm. Hầu hết các giống trong bộ giống lạc kháng bệnh HXVK quốc tế đều biểu hiện ở mức kháng và kháng cao trong điều kiện miền Bắc Việt Nam. Giống MD7 đã đƣợc công nhận là giống chính thức và phát triển ở nhiều tỉnh trồng lạc trọng điểm (Nguyễn Xuân Hồng và cs., 2002). Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuất và cs. (2007), trong số 94 mẫu giống lạc tham gia đánh giá chỉ có 5 mẫu lạc kháng cao và kháng trung bình, còn lại các giống đều bị nhiễm. Kết quả nghiên cứu này khẳng định đƣợc rằng tỷ lệ các mẫu giống lạc kháng bệnh HXVK là rất ít. Do vậy công tác nghiên cứu, xác định nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh là cần thiết và đòi hỏi nhiều công sức. Nguyễn Thị Vân và cs. (2013) đã chọn tạo thành công giống lạc TK10 kháng bệnh HXVK và đã phát triển ở nhiều vùng sản xuất đem lại hiệu quả kinh tế cao.
  36. 36. 22 1.7.2. Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 1.7.2.1. Biện pháp canh tác Trên thế giới, phòng chống bệnh bằng biện pháp luân canh cây trồng để làm giảm thiệt hại của bệnh HXVK là biện pháp đã đƣợc Smith đƣa ra lần đầu vào năm 1896, sau đó đã có nhiều công bố về vấn đề này. Những công bố đó đã chỉ ra rằng: nhiều loại cây không phải là ký chủ khi luân canh với cây lạc hoặc các cây họ cà có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ và mức độ gây hại của bệnh. Việc luân canh lạc với lúa nƣớc đƣợc ứng dụng rộng rãi ở những vùng có tƣới nƣớc thuộc miền Nam Trung Quốc, nơi mà bệnh HXVK gây hại nặng. Công thức luân canh này cũng phù hợp với những vùng đất có tƣới hoặc những vùng có lƣợng mƣa lớn thuộc Nam và Đông Nam Á (Mehan et al., 1994). Ở những vùng đất khô hạn, theo Tan et al. (1994) thì luân canh lạc với ngô hoặc cao lƣơng với chu kỳ từ 4 đến 5 năm hoặc với mía từ 2 đến 5 năm cũng làm giảm đáng kể thiệt hại do bệnh HXVK gây ra. Đặc biệt biện pháp luân canh lạc với ngô là có tính khả thi ở nhiều vùng bị bệnh HXVK gây hại nặng thuộc một số nƣớc ở Đông Nam Á. Việc luân canh lạc với cây không phải là ký chủ nhƣ ngô, lúa, mía là một biện pháp hữu hiệu để kiểm soát bệnh (Mehan et al., 1994). Luân canh cây trồng không phải là ký chủ của vi khuẩn héo xanh hại lạc là một trong những giải pháp quan trọng giúp giảm mật độ vi khuẩn trong đất và hạn chế tối đa nguồn bệnh từ các tàn dƣ thực vật vụ trƣớc. He (1990) cho rằng ngâm ruộng 15 ngày đến 30 ngày trƣớc trồng lạc hoặc luân canh với cây lúa nƣớc từ 2 đến 4 năm có tác dụng giảm tỷ lệ nhiễm bệnh của lạc. Ở các công thức luân canh khác nhau, hiệu quả phòng chống bệnh HXVK cũng khác nhau (Machmud, 1993). Đối với các vùng đất cao, khó khăn trong việc trồng lúa nƣớc và có tƣới nƣớc nói chung thì luân canh với cây lúa mì, đại mạch, tiểu mạch, ngô trong chu kỳ từ 4 năm 5 năm cũng có tác dụng giảm tỷ lệ bệnh (Wang và Hou, 1983; Mehan et al., 1994). Trên đất sét, bón vôi kết hợp với phân hữu cơ cũng có hiệu lực phòng bệnh nhƣng không ổn định. Xử lý và cải tạo đất bằng việc bón tăng cƣờng phân chuồng, lƣu huỳnh, canxi cũng đem lại những kết quả khác biệt nhau (Kelman et al., 1994). Tuy nhiên, một số tác giả cho rằng việc bổ sung các chất hữu cơ và vô cơ trên đã làm tăng sức đề kháng của cây do vi khuẩn R. solanacearum rất mẫn cảm với điều kiện khô, vì
  37. 37. 23 vậy việc cày ải đất cũng có tác dụng làm giảm bệnh HXVK rất rõ, hơn nữa việc cày ải còn làm hạn chế sự phát triển của cỏ dại, vì cỏ dại cũng rất có thể là ký chủ của vi khuẩn héo xanh hại lạc (Mehan et al., 1994). 1.7.2.2. Biện pháp sinh học Biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK chủ yếu sử dụng các chế phẩm vi sinh vật đối kháng. Nhiều loại vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc nhƣ Pseudomonas cepacia, Ps. fluorescens, Bacillus polymyxa, B. subtilis, v.v.,…(Nawangsih et al., 2012; Wang và Liang, 2014). Tại Indonesia, Nawangsih et al. (2012) sử dụng các chế phẩm Pseudomonas fluorescens RH4003 và Bacillus subtilis AB89, Bacillus sp. KS2 có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh vi khuẩn héo xanh hại lạc. Ở Việt Nam, đối với biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK hại lạc, Nguyễn Thu Hà và cs. (2006) đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Bacillus sp. nhằm hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn và nâng cao năng suất đối với cây lạc. Lê Nhƣ Kiểu và cs. (2010) đã xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật (VSV) phòng chống bệnh HXVK hại lạc qui mô phòng thí nghiệm. Mức độ sống sót và hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm duy trì sự ổn định sau 3 tháng bảo quản. Tác giả đã sử dụng chủng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm vi sinh vật cho lạc gồm Ps1 (Pseudomonas fluorescens), TS6 (Pseudomonas sp.), BK1 (Bacillus sp.), Ba5.1 (Bacillus subtilis) và T15 (Bacillus megaterium). 1.7.2.3. Biện pháp hóa học Biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vật đƣợc cho là ít có hiệu quả trong phòng chống vi khuẩn R. solanacearum do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch của cây. Xử lý đất bằng các loại thuốc xông hơi ít có tác dụng hạn chế bệnh. Wang và Hou (1983) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc đã đƣợc tiến hành từ những năm 1960. Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin liều lƣợng 300 kg/ha xử lý đất trƣớc khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt. Một số thuốc khác nhƣ Thiabendazol (C5H6N6S2) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhƣng do thuốc này có độ độc cấp tính cao với con ngƣời và gia súc nên chƣa thể áp dụng
  38. 38. 24 vào sản xuất (Tan et al., 1994). Nhiều tác giả khác cũng công bố kết quả góp phần chứng minh luận điểm dùng hóa chất phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả thấp. Dùng thuốc kháng sinh đƣợc coi là biện pháp hạn chế bệnh HXVK có triển vọng, thay thế thuốc hóa học do thuốc kháng sinh đƣợc hấp phụ tốt, chuyển dịch trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng. Tuy nhiên, dùng thuốc kháng sinh dễ tạo ra các chủng vi khuẩn mới kháng thuốc. Hơn nữa thuốc kháng sinh có giá thành cao cũng là một trở ngại cho việc ứng dụng rộng rãi. Theo Kiraly và cs. (1983) thì dùng streptomycine với liều lƣợng từ 200 đến 400 mg/lít đã kìm hãm sự sinh trƣởng và sinh sản của vi khuẩn, tuy nhiên nếu dùng streptomycine không cẩn thận có thể gây ra sự phát triển của những chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng thuốc ở ngƣời và kết quả là rất nguy hiểm nếu dùng rau quả tƣơi có sử dụng streptomycine để phòng chống bệnh. Hartman và Elphinstone (1994) cũng đã nghiên cứu việc xử lý đất bằng một số loại muối nhƣ KNO3, NaNO3, NaCl và KCl với nồng độ 1% cũng thấy mật độ vi khuẩn R. solanacearum ở trong đất giảm đáng kể tới mức không thể phân lập đƣợc nữa ở 4 đến 25 ngày sau xử lý, tùy loại muối. Nhƣ vậy, cho tới nay việc dùng hóa chất để kiểm soát bệnh HXVK là chƣa có tính khả thi trong điều kiện sản xuất đại trà. 1.7.2.4. Biện pháp quản lý tổng hợp Để kiểm soát và phòng chống bệnh HXVK, yếu tố quan trọng là sử dụng giống sạch bệnh, dùng giống chống chịu với bệnh HXVK, luân canh với những cây trồng không phải là ký chủ của bệnh, áp dụng những biện pháp canh tác tốt (vệ sinh đồng ruộng và cây trồng, quản lý giun đất, loại bỏ thân cây bị bệnh, làm cỏ, khử trùng nông cụ, không tƣới nƣớc bị ô nhiễm, cày ải phơi nắng đất,…). Hạn chế làm đất sau khi trồng (việc làm đất chỉ tại thời điểm trồng để tránh gây tổn thƣơng đến rễ cây). Việc làm cỏ cũng nên làm bằng tay để tránh tổn thƣơng đến cây trồng. Áp dụng biện pháp kiểm dịch: Khi bệnh HXVK đã xuất hiện, việc kiểm dịch cần phải đƣợc áp dụng triệt để tránh sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh héo xanh ra các vùng khác chƣa nhiễm bệnh. Vì vậy biện pháp quản lý tổng hợp mới thành công trong việc giảm sự lây lan và phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả.
  39. 39. 25 1.8. Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 1.8.1. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống kháng bệnh Trong thời gian gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cũng nhƣ trong việc sàng lọc giống kháng bệnh và tính chống chịu đƣợc đặc biệt quan tâm. Xác định đƣợc chỉ thị ADN liên kết chặt với tính trạng nào đó thì có thể sử dụng cho chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (marker assisted selection-MAS). Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình. Chỉ thị phân tử đƣợc chia làm hai loại chính: (1) Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP); (2) Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR (RAPD, AFLP…). 1.8.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Ở loài A. hypogaea, sự khác biệt ở mức độ phân tử đã đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật RFLP (Kochert et al., 1991; Halward et al., 1991). Kochert et al. (1991) đã chỉ ra không có sự khác biệt giữa A. hypogaea và A. monticola. Tuy nhiên, một sự khác biệt đáng kể giữa các loài Arachis đã đƣợc ghi nhận. Để chọn giống có hiệu quả, cần phải nghiên cứu mối liên kết giữa tính trạng mong muốn với một lƣợng lớn chỉ thị để đánh giá quần thể với nhiều tính trạng nhƣ: năng suất, tính kháng, mùi vị... Một bản đồ liên kết với nhiều chỉ thị, đặc biệt là đƣợc lập với một số lƣợng lớn chỉ thị (mức độ bão hòa) có thể đƣợc sử dụng để phân lập các gen quan tâm. Bằng phân tích quần thể F2, một bản đồ RFLP đã đƣợc lập ở lạc của cặp lai nhị bội (2n = 2x = 20) giữa A. stenosperma Krapov. và W.C. Gregory và A. cardenasii Krapov và W.C. Gregory. Bản đồ có chiều dài 1.063 cM với 117 chỉ thị trong 11 nhóm liên kết, 15 chỉ thị không liên kết cũng đã đƣợc thông báo (Halward et al., 1993). Bản đồ di truyền thứ 2 trên cơ sở chỉ thị RFLP đƣợc lập bởi Burow et al., (2001) của cặp lai tứ bội Florunner x 4x [A. batizocoi Krapov và W.C. Gregory (A. cardenasii x A. diogoi Hoehne)]. Phần lớn trong 380 chỉ thị RFLP đƣợc lập bản đồ có tính di truyền bởi nhiều cặp nhiễm sắc thể, với một số trƣờng hợp ngoại lệ một nhóm liên kết có thể ở trên nhiều nhiễm sắc thể.
  40. 40. 26 Kỹ thuật RFLP cũng đƣợc sử dụng để phân tích đa dạng giữa các giống thuộc loài Arachis (giống đại diện sẽ đƣợc sử dụng để lai với A. hypogaea) và tạo nên các nhóm bằng việc sử dụng các phân tích đa chiều tƣơng ứng chặt chẽ với các nhóm hình thái. Thể tứ bội đƣợc tách biệt rõ ràng với thể nhị bội (Kochert et al., 1991). Stalker et al. (1995) đã sử dụng kỹ thuật RFLP trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa 18 dòng của loài A. duranensis Krapov và W.C. Gregory và đã phát hiện một lƣợng lớn khác biệt giữa các dòng trong loài này, sự khác biệt giữa các mẫu trong dòng cũng đƣợc xác định bằng RFLP. Kochert et al. (1991) kết luận rằng, giống lạc trồng trọt là kết quả lai giữa A. duranensis và A. ipaensis Krapov và W.C. Gregory, phân tích lục lạp cũng chỉ ra rằng A. duranensis đóng vai trò là mẹ trong cặp lai. Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locut gen. Do vậy có thể phân biệt đƣợc các cá thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ƣu việt của loại chỉ thị RFLP. Hạn chế của phƣơng pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lƣợng công việc cồng kềnh. Đặc biệt là tiêu hao một lƣợng lớn ADN mà số lƣợng đa hình thu đƣợc rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận đƣợc đa hình. 1.8.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR Phản ứng PCR dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN nhờ enzym ADN polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, mồi (primer), các nucleotide (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động nhƣ một chất xúc tác. Tùy theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trƣng. a) Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Chỉ thị RAPD đƣợc tạo ra do sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ bắt mồi thấp. Sản phẩm của phản ứng đƣợc phân tích bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dƣới đèn cực tím. RAPD là chỉ thị trội do không phân biệt đƣợc thể dị hợp tử. Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP. Lợi thế của chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (Rohlf, 2000).
  41. 41. 27 Trên cơ sở kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị RAPD, nghiên cứu của Halward et al. (1993) cho thấy sự khác nhau rất ít ở loài A. hypogaea. Chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng để xác định các giống và dòng trong chi Arachis. Các chỉ thị RAPD sử dụng trong nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt di truyền lớn giữa các giống thuộc loài Arachis (Halward et al., 1991; Subramanian et al., 2000; Mondal et al., 2007; Vyas et al., 2014; Vadodariyagopal et al., 2014). Chỉ thị RAPD có một hạn chế nữa là độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đặc biệt đối với những sinh vật có hệ gen lớn. Garcia (1995) sử dụng kỹ thuật RAPD đã phát hiện ra sự tƣơng đồng giữa chỉ thị RAPD và RFLP. Nghiên cứu cho thấy, trong mỗi thế hệ tự phối đã phát hiện số lƣợng của các chỉ thị phân tử biến mất do sự giảm phân bất thƣờng và kết quả của sự mất gen ngẫu nhiên. Tuy nhiên, trong quần thể tam bội đƣợc tạo ra bởi tự phối lục bội, có thêm gen của loài A. cardenasii vào bộ gen của loài A. hypogaea ở 10 trong 11 nhóm liên kết trên bản đồ phân tử nhị bội. Điều đó chỉ ra rằng, sự thêm gen có thể xảy ra từ các dạng nhị bội đến các dạng trồng trọt và bộ gen của loài A. hypogaea rất giống nhau. b) Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Simple Sequence Repeat-SSR) Đối với cây lạc, SSR là một chỉ thị đƣợc ƣa thích trong việc lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chƣơng trình chọn giống. SSR còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 2 đến 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn. Bản chất đa hình của vi vệ tinh là do sự khác biệt về số lần lặp của các đơn vị lặp. Sự đa hình của các locut vi vệ tinh đƣợc xác định bằng phản ứng PCR dùng 2 mồi đƣợc thiết kế trên trình tự bản thực ở 2 đầu của vùng lặp. Chỉ thị vi vệ tinh là chỉ thị có nhiều ƣu điểm vì nó là chỉ thị đồng trội và mức độ đa dạng của quần thể có thể đƣợc xác định khi dùng nhiều chỉ thị vi vệ tinh phân bố trên toàn bộ bộ gen. Những chuỗi đa hình đơn giản này đã đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tƣợng động vật và thực vật (Perrier và Colette, 2006). Hopkins et al. (1999) đã ghi nhận 6 chỉ thị SSR đa hình ở A. hypogaea với số alen ở mỗi chỉ thị dao động từ 2 đến 14 alen. Sự khác biệt giữa 15 trong số 19 giống lạc đã đƣợc ghi nhận.
  42. 42. 28 Chỉ thị SSR đƣợc sử dụng có hiệu quả trong việc xác định sự đa dạng di truyền của các loài lạc trồng trọt đã đƣợc công bố (Hopkins et al., 1999;. Ferguson et al., 2004;. Mace et al., 2006). Bản đồ liên kết di truyền với các chỉ thị SSR đã đƣợc xây dựng cho bộ đôi lặp lại AA trong bộ gen (Moretzsohn et al., 2004), BB (Moretzsohn et al., 2005, 2013), bộ bốn AABB (Li et al., 2004; Varshney et al., 2005, 2009; Hong et al., 2008, 2010). Gần đây, có nhiều nghiên cứu về cơ sở di truyền có tính chuyên sâu để phát triển chỉ thị SSR cung cấp các công cụ di truyền phục vụ cho nghiên cứu tổng thể giống lạc, các chỉ thị SSR đang đƣợc tập trung nghiên cứu, đã có hàng trăm chỉ thị SSR đa hình đã đƣợc nhận biết ở loài lƣỡng bội Arachis đƣợc công bố (Gimenes et al., 2007; Guo et al., 2009; Varshney et al., 2009; Hong et al., 2010; Gautami et al., 2009; Ravi et al., 2011; Mondal và Badigannavar, 2010; Qin et al., 2012; Sujay et al., 2012; Shirasawa et al., 2012). 1.8.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh Kết quả nghiên cứu và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trên thế giới còn hạn chế so với một số cây trồng khác. Trên cây lạc, chỉ thị RAPD đƣợc ứng dụng để đánh giá đa dạng di truyền đối với một số bệnh hại lạc, trong đó có bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, chỉ thị RAPD có mức đa hình thấp giữa các giống lạc nghiên cứu (Subramanian et al., 2000;. Dwivedi et al., 2003; Mondal et al., 2007; Kumari et al., 2009). Tuy nhiên, ứng dụng chỉ thị RAPD cho kết quả tốt trong việc nghiên cứu đa hình của các giống lạc kháng tuyến trùng và kháng bệnh rỉ sắt gây hại trên cây lạc (Mondal et al., 2007; Mondal và Badigannavar, 2010). Bera et al. (2014) đã sử dụng 10 mồi RAPD để phân tích đa hình ADN của 34 mẫu giống lạc nghiên cứu tại Ấn Độ. Đối với mồi RAPD, số phân đoạn ADN tạo đƣợc trên bản gel điện di từ 11-18 phân đoạn với kích thƣớc từ 500-1.500 bp. Trong đó, mồi OPT6 tạo ra số phân đoạn nhiều nhất (18 phân đoạn) và mồi OPT5 tạo ra số phân đoạn ít nhất (11 phân đoạn). Mức độ đa hình của các mẫu giống lạc đánh giá từ 72,7% đến 100%.
  43. 43. 29 Đối với cây lạc, SSR là một công cụ về di truyền phù hợp trong việc lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chƣơng trình chọn giống. Các chỉ thị phân tử đối với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc đã đƣợc một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu bằng các chỉ thị SSR cũng nhƣ về biểu hiện gen liên quan đến bệnh héo xanh vi khuẩn. Việc nhận biết các dòng, giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn thuyết phục nhất là đánh giá phản ứng của các dòng, giống khi lây nhiễm với vi khuẩn gây bệnh, theo dõi vật liệu lây nhiễm qua một số vụ. Theo Tang et al. (2007), sử dụng 34 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 24 giống lạc trồng (Arachis hypogaea L.) đã cho thấy có 10 đến 16 chỉ thị SSR cho đa hình. Mức độ khác biệt di truyền của các giống lạc cao, biểu đồ quan hệ di truyền cho thấy hình thành 4 cụm khác nhau của các giống lạc nghiên cứu. Các dòng lạc kháng bệnh đƣợc xác định thông qua việc sàng lọc trên đồng ruộng khi lây nhiễm với vi khuẩn gây bệnh. Với 33 chỉ thị phân tử SSR đánh giá trên 46 kiểu gen đƣợc chọn lọc đã phát hiện ra 107 alen, trong đó có 101 alen đa hình (chiếm 99,4%). Tỷ lệ đa hình alen dao động từ 0,103 đến 6,669 với giá trị trung bình là 0,386. Phân tích cây phả hệ cho thấy 2 nhóm riêng biệt trong nguồn gen kháng bệnh phổ biến, tƣơng ứng với 2 phân loài hypogaea và fastigiata của loài A. hypogaea. Tuy nhiên, những dòng của 2 loài phụ gồm peruviana và aequatoriana nằm cùng nhóm với những dòng của phân loài hypogaea, mà không nằm cùng với những dòng khác thuộc phân loài fastigiata. Ngoài ra, phân tích sự thay đổi phân tử đã ghi nhận đƣợc 15% trong tổng số những thay đổi của nhóm có phản ứng với bệnh héo xanh vi khuẩn. Điều này hết sức có ý nghĩa trong việc chọn kiểu gen bố mẹ cho các cặp lai tạo quần thể lập bản đồ và lai tạo nhằm mở rộng nguồn di truyền cho các dòng, giống lạc trong tƣơng lai (Mace et al., 2007). Jiang et al., 2007a xác định có 29 chỉ thị trong số 78 chỉ thị SSR phát hiện đa hình đã đƣợc xác định dựa trên một tập đoàn 31 giống lạc có mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn khác nhau. Trong một nghiên cứu khác, 32 chỉ thị SSR đƣợc xây dựng từ 45 giống lạc cũng đƣợc phát hiện 99,4% đa hình (Mace et al., 2007). Jiang et al. (2007b) đã dựa trên quần thể F6 của cặp lai giữa hai giống Yuanza 9102 và Chico phân tích trên 354 chỉ thị SSR đã nhận đƣợc 8 nhóm liên kết, trong đó nhận đƣợc 2 chỉ thị SSR là 7G2 và PM137 liên kết với bệnh héo xanh vi khuẩn.

×