Download luận văn thạc sĩ ngành hóa phân tích với đề tài: Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra, cho các bạn tham khảo Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

1. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đã
được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu nêu trong luận văn
là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên
cứu và Ứng dụng công nghệ Nha trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Nha trang, tháng 6 năm 2019
Tác giả
Mai Ngô Thương Hoài

2. LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và
Công nghệ. Ban lãnh đạo và các Phòng ban thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học
Thạc sĩ Hóa phân tích 2017-2019. Cảm ơn Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam thông qua Đề tài HTQT mã số QTRU04.06/18-19 đã hỗ trợ
kinh phí thực hiện đề tài
Tiếp theo, tôi xin cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Phạm Đức
Thịnh - Phó Viện trưởng, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang
và TS. Đào Việt Hà - Viện trưởng, Viện Hải dương học đã tận tình trong việc
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại Viện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giảng dạy và các anh chị cùng lớp cao học
CHE17 đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi bổ sung thêm kiến thức trong suốt
khóa học.
Tôi xin cảm ơn các anh chị Phòng Hóa Phân tích và Triển khai công nghệ
thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện và
giúp đỡ những thiếu sót về kiến thức chuyên ngành khi tôi làm thực nghiệm đề
tài của mình.
Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn gia đình và bạn bè của tôi, đã luôn bên
cạnh ủng hộ và hỗ trợ về mặt kinh tế cũng như tinh thần để tôi tiếp tục con
đường học tập của mình.
Học viên
Mai Ngô Thương Hoài

3. Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt
CS : Chondroitin sulfate
Cetavlon : Trimethyl Hexadecyl lammonium bromide
13
C-NMR : Carbon-13 NMR Spectroscopy
DEAE -Sepharose Fast Flow : Diethylaminoethyl- Sepharose Fast Flow
EtOH : Ethanol
FCS : Fucosylated chondroitin sulfate
FS : Fucan sulfate
Fuc : Fucose
GAG : Glycosaminoglycan
GalNAC : N-Acetyl galactosamine
Gal : Glactose
GlcA : Glucuronic axit
Gluc : Glucose
GLC : Gas Liquid Chromatography
GPC : Gel permeation chromatography
HPLC : High Performance Liquid
1
H-NMR : Proton NMR Spectroscopy
IR : Infrared Spectroscopydesorption/ionization
NMR : Nuclear Magnetic Resonance
PS : Polysaccharide sulfates
TCA : Triclorua acetic acid
TFA : Triflorua acetic acid

4. DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Hình thái chung bên ngoài của hải sâm [13]………………………8
Hình 1.2. Hải sâm Holothuria atra………………………………………. 10
Hình 1.3. Cấu trúc của Fucan sulfate được phân lập
từ các loài hải sâm...........................................................................................14
Hình 1.4. Cấu trúc Fucan sulfated từ hải sâm Holothuria edulis và
Ludwigothurea Grise .....................................................................................16
Hình 1.5. Cấu trúc minh họa của
Fucosylated chondroitin sulfate (R: ester sulfate)…………………………...16
Hình 1.6. Cấu trúc của Fucosylate chondroitin sulfate……………………...17
Hình 2.1. Hải sâm Holothuria atra đã được xử lý mẫu ……………………27
Hình 2.2. Quy trình chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra…………...............................................................................30
Hình 2.3. Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng
sắc ký trao đổi anion………...........................................................................31
Hình 2.4. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR
của polysaccharide…………………………………………………………41
Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của glycosaminoglycan
từ hải sâm Holothuria atra………….............................................................45
Hình 3.2. Phân đoạn glycosaminoglycan bằng
sắc ký trao đổi anion……………………........................................................50
Hình 3.3. Sắc ký đồ đường chuẩn của sắc kí khí GC ………………………51
Hình 3.4. Sắc ký đồ GC của thành phần đường đơn
phân đoạn F2 ……………………………………………………………….52
Hình 3.5. Phổ IR của phân đoạn F1 ………………………………………..55
Hình 3.6. Phổ 1
H-NMR của phân đoạn F1 …………………………………58

5. Hình 3.7. Phổ 13
C-NMR của phân đoạn F1………………………………... 59
Hình 3.8. Phổ IR của phân đoạn F2 ………………………………………..60
Hình 3.9. Phổ 1
H-NMR của phân đoạn F2 …………………………………61
Hình 3.10. Phổ 13
C-NMR của phân đoạn F2 ……………………………….62

6. DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm
tại một số vùng biển trên thế giới[15] ………………………………………11
Bảng 1.2. Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng
của một số loài hải sâm [16]……………………………………………….. 12
Bảng 1. 3. Thành phần hóa học của Fucosylated chondroitin sulfate được phân
lập từ thành tế bào của một số loài hải sâm [22]……………………………. 18
Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trưng fucoidan trên phổ hồng ngoại [58]………..39
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết glycosaminoglycan của các loài hải sâm ………..44
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của glycosaminoglycan
từ mẫu thô hải sâm Holothuria atra…………………………………………48
Bảng 3.3. Thông số các mẫu đường đơn chuẩn
được đo bằng phương pháp sắc kí khí GC………………………………….51
Bảng 3.4. Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan
từ hải sâm Holothuria atra ………………………………………………….54
Bảng 3.5.Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan
từ hải sâm Stichopus variegatus [49]………………………………………. 55

7. 1
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU....................................................................................................... 4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN......................................................................... 7
1.1.GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM.................................................................. 7
1.1.1. Giới thiệu chung về hải sâm......................................................... 7
1.1.2. Giới thiệu về hải sâm Holothuria atra.......................................... 8
1.1.2.1.Đặc điểm hình thái và sinh sản.................................................. 8
1.1.2.2. Phân bố và môi trường sống..................................................... 9
1.1.2.3. Phân loại.................................................................................. 9
1.1.3. Thành phần hóa học của hải sâm .............................................. 10
1.1.3.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng biển
trên thế giới......................................................................................... 10
1.1.3.2. Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng của một số
loài hải sâm......................................................................................... 12
1.2. TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLICAN ... 13
1.2.1. Các nghiên cứu về Fucan sulfate................................................ 13
1.2.2. Các nghiên cứu về Fucosylate chondroitin sulfate ................... 16
1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của glycosaminoglycan.......... 19
1.3. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM VỀ
GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM ............................................. 23
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu trên thế giới................................................ 23
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam ............................................... 24
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 27
2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU................................... 27
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................. 27
2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất..................................................... 27
2.1.2.1. Dụng cụ.................................................................................. 27
2.1.2.2. Thiết bị................................................................................... 28
2.1.2.3. Hóa chất................................................................................. 28
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 29

8. 2
2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải
sâm ........................................................................................................ 29
2.2.1.1. Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan........................... 29
2.2.1.2. Phương pháp tách phân đoạn glycosaminoglycan.................. 31
2.2.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của
glycosaminoglycan ............................................................................... 31
2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate ............... 31
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng sulfate ................................. 32
2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic axít........................... 32
2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein.............................. 32
2.2.2.5. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide ................. 32
2.2.2.6. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ...................................................... 32
2.2.2.7. Phương pháp phổ hồng ngoại IR............................................... 33
2.2.2.8. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ...................... 33
2.3. THỰC NGHIỆM................................................................................ 33
2.3.1. Chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra ..................................................................................... 33
2.3.1.1. Xử lý mẫu ............................................................................... 33
2.3.1.2. Chiết tách glycosaminoglycan................................................ 34
2.3.1.3. Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng phương pháp sắc
kí trao đổi anion DEAE-Sepharose fast flow (1,5 x 20 cm).................. 34
2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate .................................. 35
2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axit ............................................... 36
2.3.5. Phân tích hàm lượng protein ..................................................... 37
2.3.6. Phân tích thành phần đường đơn.............................................. 37
2.3.7. Phương pháp sắc kí thẩm thấu Gel (GPC) ............................... 38
2.3.8. Phương pháp phân tích phổ IR .................................................... 39
2.3.9. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR....................... 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................ 43
3.1. PHÂN LẬP VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
GLYCOSAMINOGLYACAN TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA....... 43

9. 3
3.1.1. Phân lập glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra ......... 43
3.1.2. Thành phần hóa học của glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra ..................................................................................... 45
3.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN
ĐOẠN CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN
TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA........................................................ 48
3.2.1. Tách phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra ..................................................................................... 48
3.2.2. Thành phần hóa học của các phân đoạn glycosaminoglycan
từ hải sâm Holothuria atra................................................................... 50
3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ
HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA.............................................................. 55
3.3.1. Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F1 được chiết tách từ
glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra ................................ 55
3.3.1.1. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F1 .................................... 55
3.3.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR của phân đoạn F1....... 56
3.3.1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13
C-NMR của phân đoạn F1 ..... 58
3.3.2. Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F2 được chiết tách từ
glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra ................................ 59
3.3.1.2. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F2 .................................... 59
3.3.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR của phân đoạn F2....... 60
3.3.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13
C-NMR của phân đoạn F2..... 61
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 63
4.1.KẾT LUẬN......................................................................................... 63
4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 65

10. 4
MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI:
Trong những năm gần đây, khái niệm về thực phẩm chức năng đã đưa ra
một cách tiếp cận mới và thiết thực để có được một sức khỏe tốt đó là khuyến
khích sử dụng các sản phẩm thiên nhiên giúp mang lại nhiều lợi ích sinh lý từ
đó làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính khác nhau. Hầu hết các thực phẩm
chức năng và thuốc hiện nay có nguồn gốc trực tiếp hoặc gián tiếp từ tự nhiên,
đặc biệt là các loài thực vật trên cạn và các loài sinh vật dưới biển. Điển hình
là các hợp chất glycosaminoglycan (GAG) được phân lập từ động vật biển nói
chung và hải sâm nói riêng, còn được gọi là polysaccharide sulfate (PS) là một
trong những hợp chất tự nhiên có giá trị cao và đang được nghiên cứu rộng rãi
gần đây nhờ sở hữu phổ hoạt tính sinh học rộng như: chống tạo mạch, kháng u,
chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối,...[1, 2].
Glycosaminoglycan từ hải sâm được phân chia thành hai nhóm khác
nhau là fucosylated chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS). FS là một
polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi gốc fucose và /hoặc fucose (sulfate), FS
từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm
sulfate trong gốc đường fucose [2]. FCS là một polymer có mạch nhánh và cấu
trúc được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại của disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc-
(1→4)-β-D-Gluc-(1→n). Cấu trúc mạch chính này cũng tương tự như cấu trúc
của các chondroitin có nguồn gốc từ động vật có vú, tuy nhiên sự khác biệt độc
đáo nhất của FCS hải sâm mà không một loài động vật hay thực vật ở cả trên
cạn và dưới biển có được chính là ở cấu trúc mạch nhánh được tạo nên bởi các
fucan sulfate ở vị trí C-3 của gốc Glucuronic axit [3]. FCS của các loài hải sâm
khác nhau được phân biệt dựa vào cấu tạo của mạch nhánh, số mạch nhánh và
mức độ sulfate hóa ở mạch nhánh cũng như ở mạch chính [1, 2, 4]. Cho tới nay,
nhóm các hợp chất GAG đã được nghiên cứu từ nhiều loài hải sâm khác nhau

11. 5
như Thelenata ananas [5], Peasonnothuria gaefei, Stichopus tremulus,
Holothuria vagabunda [6], Cucumaria japonica [7], Apostichopus japonicus,
Actinopyga mauritiana [8]. Các nghiên cứu này đều cho thấy sự khác biệt về
đặc điểm cấu trúc lẫn hoạt tính sinh học của GAG giữa các loài hải sâm.
Ở nước ta mặc dù đã có một số nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính
sinh học từ hải sâm, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu này tập trung phân lập,
nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất phân tử lượng thấp,
các hợp chất polymer sinh học như GAG từ đối tượng này vẫn còn rất ít được
quan tâm nghiên cứu. Trong số gần 70 loài hải sâm được phát hiện ở biển Việt
Nam mới chỉ có hai loài Holothuria spinifera và Stichopus variegatus được
nghiên cứu về hợp chất GAG [9, 10]. Holothuria atra là một trong số các loài
hải sâm tự nhiên có phân bố rất phổ biến ở nước ta, tuy nhiên cho tới nay vẫn
chưa có công bố nào nghiên cứu về hợp chất GAG từ hải sâm này.Vì vậy, thực
hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu trúc của
glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra” là cần thiết, các kết quả
nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp
theo về mối tương quan giữa đặc trưng cấu trúc và hoạt tính sinh học nhằm
định hướng phát triển và ứng dụng hiệu quả các hoạt chất tự nhiên thành thuốc
hoặc thực phẩm chức năng, đóng góp một phần quan trọng vào việc phục vụ
sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội.
2. MỤC ĐÍCH CỦA LUẬN VĂN:
Chiết tách và thu nhận glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra.
Phân tích một số đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan từ loài hải sâm
Holothuria atra.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU:
3.1. Đối tượng nghiên cứu:

12. 6
Glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
3.2. Phạm vi nghiên cứu:
Hải sâm Holothuria atra thu thập ở vùng biển Nha trang, tỉnh Khánh Hòa.
4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
- Chiết tách và thu nhận hợp chất glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria
atra.
- Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng phương pháp sắc ký
- Xác định thành phần hóa học của các phân đoạn glycosaminoglycan thu
nhận được (gồm: tổng carbohydarte, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic axit,
hàm lượng protein, thành phần các gốc đường đơn).
- Xác định được một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn glycosaminoglycan
đại diện từ loài hải sâm Holothuria atra.
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
5.1. Ý nghĩa khoa học:
Các kết quả nghiên cứu của đề tài là số liệu khoa học mới về thành phần
hóa học và đặc điểm cấu trúc của glycosaminoglycan được phân lập từ hải sâm
Holothuria atra.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn:
Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo,
giúp tìm kiếm và phát hiện những hoạt chất mới có giá trị dược dụng cao từ hải
sâm, nhằm tạo ra các dược liệu mới phục vụ sức khỏe xã hội và nâng cao giá
trị kinh tế của hải sâm.

13. 7
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ HẢI SÂM
1.1.1. Giới thiệu chung về hải sâm
Việc sử dụng hải sâm làm mặt hàng thực phẩm và hàng hóa đã bắt đầu ở
Trung quốc khoảng 1000 năm trước, sau đó do nhu cầu về giá trị dinh dưỡng
cũng như khả năng chữa một số loại bệnh truyền thống như: cao huyết áp, thấp
khớp, hen suyễn, liệt dương, táo bón...[4], dẫn đến việc khai thác hải sâm đã
lan rộng ra các nước châu Á. Hải sâm là một loại động vật không xương sống
thuộc lớp Holothuroidea, do đó còn được gọi là Holothurian, là một trong năm
lớp thuộc ngành động vật Da Gai (Echidermata). Tên khoa học của hải
sâm "Cucumis marimus" có nghĩa là "dưa chuột biển". Hải sâm còn được gọi
với những cái tên như đỉa biển, con rum, sâm biển, hải thử, đồn độp, sa tốn,…
[11]. Lớp hải sâm có khoảng 11 nghìn loài thuộc 5 bộ. Ở vùng biển Việt Nam
hiện nay ước tính có khoảng 70 loài hải sâm : Hải sâm trắng (Holothuria
scabra); Hải sâm đen (Holothuria vagabunda); Hải sâm vú (Holothuria
nobilis); Hải sâm mít (Actinopyga echinites)....
Hải sâm có một cơ thể thon dài, cấu tạo chính bên ngoài gồm miệng nằm
ở mặt bụng, quanh miệng có 20 xúc tu. Hậu môn nằm cuối thân. Mặt lưng có
2-3 hàng gai thịt lớn dạng hình nón khá dài chạy dọc theo hai đường biên lưng
cơ thể. Những chiếc gai thịt dài cũng xuất hiện ở mặt bên và phần rìa bụng. Mặt
bụng phẳng, có thể thấy rất nhiều chân ống tập trung thành 3 dải, dải ở giữa
rộng gấp đôi hai dải bên ngoài. Chân ống hình trụ, nhỏ và dài, cuối chân có đĩa
bám (Hình 1.1)[12]. Hải sâm được tìm thấy trên tất cả các đại dương và biển,
ở tất cả các vĩ độ, nhưng chủ yếu chúng sống ở đáy biển, trên bề mặt hoặc ngay
cả nằm sâu trong các lớp trầm tích, một số loài khác thì lại nằm ở các rạn san
hô, trên các thềm đá cứng. Thức ăn của hải sâm là các xác chết của động vật,
loài phù du và các chất hữu cơ dưới biển, nên các nhà khoa học còn đặt cho

14. 8
chúng cái tên là nhân viên vệ sinh biển. Một trong những cách hải sâm bắt mồi
là nằm trong sóng và bắt những loài trôi trong đó bằng các xúc tu, nên nhiều
khi có thể tìm thấy chúng với số lượng lớn ở cạnh các trang trại nuôi cá biển
của con người [13]. Hải sâm là động vật phân tính (trừ một số loài thuộc bộ
không chân (Apoda)), sinh sản bằng cách phóng tinh trùng và trứng vào nước
biển, trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ. Tùy vào điều kiện thời tiết,
nếu điều kiện thời tiết thuận lợi một cá thể có thể sản xuất hàng ngàn giao tử
[14].
Hình 1.1: Hình thái chung bên ngoài của hải sâm [13]
1.1.2. Giới thiệu về hải sâm Holothuria atra
1.1.2.1.Đặc điểm hình thái và sinh sản
Holothuria atra có hình trụ hẹp, toàn bộ bề mặt cơ thể mịn màng và hoàn
toàn đen, một số con ở các rặn san hô thì lại có nếp nhăn ngang trên bề mặt
lưng. Miệng nằm ở mặt dưới được bao quanh bởi một rìa gồm 20 xúc tu màu
đen, phân nhánh, hậu môn ở đầu còn lại. Chiều dài tối đa khi trưởng thành vào
khoảng 60 cm nhưng khích thước phổ biến là 20 cm . Trọng lượng và chiều dài
trung bình của hải sâm Holothuria atra tại các nước trên thế lần lượt là: 200 g
và 20 cm (Ấn Độ), 300 g và 30 cm (Ai Cập), 335 g và 23 cm (Việt Nam), 400
g và 15 cm (Mauritius) [13]. H. atra là loài ăn tạp, chúng dùng xúc tu tìm kiếm
các mảnh vụn từ xác động vật và các chất hữu cơ khác trong lớp trầm tích. Để

15. 9
chống lại kẻ săn mồi, chúng sẽ phát ra một chất độc màu đỏ qua da khi bị xâm
phạm. Mùa sinh sản của H. atra chủ yếu là mùa hè và mùa thu, nhưng ở các
vùng xích đạo thì chúng có thể sinh sản quanh năm. H. atra là loài phân tính,
nhưng chúng cũng có thể sinh sản bằng cách phân hạch ( các cá thể sống tự
phân chia theo cách co thắt dần dần, sau một thời gian có thể tách ra thành hai
cá thể riêng biệt).
1.1.2.2. Phân bố và môi trường sống
Holothuria atra sống ở các rạn san hô, đầm , bùn cát, trên các lớp đá vụn
và các thảm cỏ biển từ 0 đến 20 cm hoặc ở các khu vực đá vôi trầm tích dưới
biển ở Mauritius. Màu sắc của chúng làm cho chúng dễ bị nhận ra, chính vì thế
chúng hay ngụy trang thêm lớp cát trên lưng, đồng thời để giữ mát cho cơ thể
và tránh tia nắng mặt trời. Chúng rất thích các rạn san hô, nơi chúng không phải
tiếp xúc hoàn toàn với sóng nhưng nước lại được sục khí tốt và mát. Holothuria
atra có khả năng chịu được mức nhiệt ở 390
C.
Trên thế giới, hải sâm phân bố nhiều ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản,
Australia, Ấn Độ, Malaysia và vùng biển Đông Phi. Ở Việt Nam, hải sâm phân bố
chủ yếu ở các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu,
Phú Quốc, Côn Đảo, Kiên Giang,... [15].
1.1.2.3. Phân loại
Hải sâm đen (Holothuria atra).
Phân lớp Aspidochirotacea.
Bộ Aspidochirotida.
Họ Holothuriidae.
Chi Holothuria.
Loài Holothuria atra.

16. 10
Hình 1.2. Hải sâm Holothuria atra
1.1.3. Thành phần hóa học của hải sâm
Thành phần hóa học chủ yếu là protein, lipid, khoáng, các nguyên tố vi
lượng quý hiếm... Thông qua hàm lượng các chất trên, ta có thể đánh giá được
giá trị dinh dưỡng của hải sâm [6]. Cũng giống như các loài thuỷ sản khác, hàm
lượng các chất hóa học trong cơ thịt hải sâm cũng phụ thuộc vào giống loài,
môi trường sống, trạng thái sinh lý, mùa vụ, nguồn thức ăn, thời tiết…
1.1.3.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng biển
trên thế giới
Thành phần hóa học tính theo % trọng lượng khô của một số loài hải sâm
được thể hiện ở Bảng 1.1 cho ta thấy hải sâm ở các vùng biển trên thế giới
thường gặp đều có hàm lượng protein đạt giá trị cao (32,0-65,0%) và hàm lượng
lipid thấp (0,1-0,8%).
Protein trong mô hải sâm chứa nhiều thể keo (colagen) và chiếm 40÷60%

17. 11
tổng số protein, đặc biệt có 1 số loài collagen có thể lên đến 77,5% [15]. Hàm
lượng protein trong hải sâm rất dễ tiêu hóa nên thích hợp cho người già yếu và
suy nhược cơ thể. Hàm lượng lipid trong hải sâm thấp nhưng lại chứa các hợp
chất đặc biệt như phospholipid, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, acid
béo no và không no (34 loại acid béo), trong đó acid béo không bão hòa chiếm
ưu thế và các acid béo có nhiều nối đôi chiếm từ 43,1-75,0% gồm: linoleic,
arachidoric, eicosatrrienic, eicosapentaenoic là các acid béo không thay thế có
hoạt tính sinh học cao và là tiền chất của prostaglandin một loại dược phẩm
quý. Lipid trong hải sâm có khả năng chữa bệnh xơ cứng động mạch do dư thừa
cholesterol. Khi tiêm lipid của hải sâm cho thỏ bị bệnh cholesterol thì hàm
lượng cholesterol huyết giảm 36,6%; lipoprotein giảm 31,6%; hệ số cholesterol
trên phospholipid giảm 14,8%. Dưới tác dụng của lipid hải sâm, khả năng làm
đông máu tăng đáng kể. Một số giả thuyết cho rằng lipid của hải sâm có khả
năng tạo este hòa tan cholesterol và đào thải nó qua cơ quan bài tiết. Vậy, thịt
hải sâm giàu protein và nghèo lipid (nhưng lại chứa các hợp chất có hoạt tính
sinh học cao) là một loại thực phẩm thích hợp cho những người bị rối loạn lipid
máu và các bệnh lý về động mạch vành. Hơn nữa, trong hải sâm có holothurin
(trong cơ thịt) có tác dụng ức chế, đình chỉ sự phân bào, lipid hải sâm làm tăng
trạng thái trao đổi lipid và protein trong máu, trong gan động vật, tăng cường
quá trình oxy hóa khử trong cơ thể và góp phần chống xơ cứng động mạch ở
người [8]
Bảng 1.1. Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng
biển trên thế giới[15]
TT Vùng biển
Hàm lượng % trọng lượng khô
Protein Lipit
1 Địa Trung Hải 55,0÷ 65,0 0,7

18. 12
2 Trung Quốc -Nhật Bản 64,0 0,8
3 Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương 32,0÷ 52,0 0,5÷ 0,7
4 Liên Xô ( cũ) 60,0÷ 65,0 0,1÷ 0,8
5 Nha Trang- Khánh Hòa 40,76÷ 77,54 0,1÷ 0,65
1.1.3.2. Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng của một số loài hải
sâm
Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng trong mô cơ của một số loài
hải sâm được trình bày ở Bảng 1.2 cho ta thấy trong thịt hải sâm chứa nhiều
nguyên tố vi lượng quý hiếm như Se là chất giải độc, làm vô hiệu hóa các kim
loại nặng đi vào cơ thể qua đường ăn uống (như chì và thủy ngân) để thải ra
nước tiểu.
Bảng 1.2. Thành phần khoáng vi lượng của một số loài hải sâm [16]
TT Tên loài
Hàm lượng (g/g trọng lượng khô)
Fe
(x106
)
Cu
(x106
)
Mg
(x106
)
N
(x106
)
1 Hải sâm vú trắng 6,80 3,86 11,13 17,57
2 Hải sâm hài 4,08 2,93 9,72 15,73
3 Hải sâm da trăn 1,57 1,05 5,12 12,11
4 Hải sâm đen 2,25 2,20 3,77 28,09
5 Hải sâm cát 7,54 1,88 12,66 24,24
6 Hải sâm đỏ 2,88 1,19 6,14 19,33

19. 13
Ngoài các yếu tố protein, lipid, khoáng, nguyên tố vi lượng… trong thành
cơ thể của hải sâm còn chứa một loại hợp chất quý hiếm có giá trị cực kì cao
về mặt dược liệu đó là polysaccharide sulfate (PS) hay glycosaminoglycan
(GAG) là một trong những hợp chất có giá trị nhất của hải sâm vì chúng sở hữu
những hoạt tính sinh học được đánh giá cao như: chống tạo mạch, kháng u,
chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối,…[1, 2].
Glycosaminoglycan được phân chia thành hai nhóm khác nhau là fucosylated
chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS). FS là một polymer mạch thẳng
được cấu tạo bởi gốc fucose và /hoặc fucose (sulfate), FS từ mỗi loài hải sâm
có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm sulfate trong gốc
đường. FS từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của
các nhóm sulfate trong gốc đường fucose [2]. FCS là một polymer có mạch
nhánh, cấu trúc mạch nhánh của fucosylfated chondroitin sulfate được tạo nên
bởi các đơn vị lặp lại của disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-Gluc-
(1→n). Cấu trúc mạch chính này cũng tương tự như cấu trúc của các
chondroitin có nguồn gốc từ động vật có vú, tuy nhiên sự khác biệt độc đáo
nhất của FCS hải sâm mà không một loài động vật hay thực vật ở cả trên cạn
và dưới biển có được chính là ở cấu trúc mạch nhánh được tạo nên bởi các
fucan sulfate ở vị trí C-3 của gốc Glucuronic axit [3]. FCS của các loài hải sâm
khác nhau được phân biệt dựa vào cấu tạo của mạch nhánh, số mạch nhánh và
mức độ sulfate hóa ở mạch nhánh cũng như ở mạch chính [1, 2, 4].
1.2. TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN
1.2.1. Các nghiên cứu về Fucan sulfate
Nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc của Fucan sulfate từ hải sâm được thực
hiện bởi Ana - Cristina và cộng sự, nhóm tác giả này đã chiết tách và phân tích
cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea thu ở vùng biển Brazil,
fucan này được tạo nên bởi gốc đường đơn Fuc(2OSO3
-
) liên kết 1,3 với gốc

20. 14
Fuc(2,4OSO3
-
) [17]. Mười năm sau Kariya và cộng sự đã công bố một fucan
sulfate khác từ hải sâm Stichopus japonicus có cấu trúc tương tự với hải sâm
Ludwigothurea grisea, chỉ khác nhau về tỉ lệ liên kết giữa các gốc Fuc(2OSO3
-
) và gốc Fuc(2,4OSO3
-
) [18]. Kể từ đó tới nay các nghiên cứu về cấu trúc của
fucan sulfate từ hải sâm liên tục được công bố, đặc biệt trong vài năm gần đây
nhờ các cải tiến về trang thiết bị kỹ thuật sử dụng trong phân tích cấu trúc của
các polymer ngày càng hiện đại. Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm
Isostichopus badionotus được Chen và các cộng sự [4] giải thích chi tiết có cấu
tạo từ các đơn vị lặp lại của tetrasaccharide (Hình1.3). Một số fucan sulfate
khác được phân lập từ hải sâm Acaudina molpadioides cũng có cấu trúc gồm
các tetrasaccharide lặp lại tương tự như cấu trúc của fucan sulfate hải sâm
Isostichiopus Badionotus, chỉ khác nhau ở trình tự liên kết của các gốc fucose
sulfat (Hình 1.3).
Hình 1.3. Cấu trúc của Sulfate fucan được phân lập từ các loài hải sâm
Thelenota ananas, Isostichiopus badionotus [19], Acaudina molpadioides và
Stichopus japonicus [18]
Bằng phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR ở nhiệt

21. 15
độ cao, Wu và cộng sự [20] đã xác định và so sánh cấu trúc của fucan từ 4 loài
hải sâm khác nhau gồm Pearsonothuria graeffei, Holothuria vagabunda,
Stichopus tremulu và Isostichopus badionotus, kết quả thu được cho thấy fucan
sulfate của hải sâm Pearsonothuria graeffei có chứa chủ yếu các gốc 2,4-
disulfate và non-sulfate fucose, fucan sulfate của hải sâm Isostichopus
badionotus có chứa chủ yếu là các gốc non- sulfate fucose , 2-sulfate fucose và
2-4-disulfate fucose, trái ngược với hai loài trên, hải sâm Stichopus tremulu ở
vùng biển lạnh và hải sâm Holothuria vagabunda ở vùng biển nóng (biển nhiệt
đới) có chứa chủ yếu các gốc non-sulfate fucose. Một năm sau đó nhóm tác giả
này đã công bố chi tiết cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Pearsonothuria
graeffei được tạo nên bằng sự lặp lại của tetrasaccaride [19]. Năm 2015, Long
và các cộng sự [21] đã công bố một cấu trúc nhánh mới của fucan sulfate (Hình
1.3 D) từ hải sâm Apostichopus japonicus hoàn toàn khác so với cấu trúc của
fucan này đã được công bố trước đó bởi Kariya và cộng sự [18]. Sau đó khi
nghiên cứu cấu trúc của sulfate fucan từ hai loài hải sâm Holothuria edulis và
Ludwigothurea grise từ tác giả Myron và cộng sự [22] đã công bố rằng cấu
trúc của fucan sulfate từ hai loài hải sâm này cũng có cấu trúc mạch nhánh
(Hình 1.4) chứ không phải có cấu trúc mạch thẳng như các công bố trước đó,
như vậy có thể thấy cấu trúc của fucan sulfate không chỉ biến đổi theo loài mà
còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường sống cũng như các kỹ thuật chiết tách
và phân tích khác nhau [23]. Trong khi đó, hoạt tính sinh học của
glycosaminoglycan nói chung và fucan sulfate nói riêng chịu ảnh hưởng của
các đặc trưng cấu trúc, với mỗi biến đổi về cấu trúc có thể dẫn đến những hoạt
tính sinh học khác nhau và khả năng úng dụng khác nhau.

22. 16
Hình 1.4. Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Holothuria edulis và
Ludwigothurea Grise
1.2.2. Các nghiên cứu về fucosylate chondroitin sulfate
Fucosylate chondroitin sulfate (FCS) là một hợp chất đặc biệt chỉ có duy
nhất ở hải sâm [20]. Về mặt cấu trúc, glycosaminoglycan của hải sâm được tạo
nên bởi dạng polysaccharide phổ biến thường thấy ở động vật có vú là
chondroitin sulfate , nhưng khác nhau ở vị trí C-3 của gốc uronic axit có tạo
mạch nhánh bởi nhóm fucose sulfate, (Hình 1.5)[24]. Nhóm fucose sulfate
mạch nhánh có khả năng làm nhiệm vụ là tránh sự phân hủy của
glycosaminoglycan bởi enzyme chondroitin được sinh ra bởi sinh vật biển, làm
tăng mật độ điện tích để thích nghi với điều kiện môi trường biển và đồng thời
có hoạt tính sinh học cao hơn so với các hợp chất tương tự về mặt dược dụng,
ví dụ như hợp chất Heparin [25] nên FCS được nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt
là những năm gần đây.
.
Hình 1.5. Cấu trúc minh họa của fucosylated chondroitin sulfate (R: ester
sulfate)

23. 17
 Sự đa dạng về cấu trúc của Fucosylate chondroitin sulfate (FCS)
Hình 1.6. Cấu trúc của fucosylate chondroitin sulfate
(a) β-D-glucuronic acid, Glucuronic Acid. (b) N-acetyl- β-D-
galactosamine, N-Acetyl galactosamine .(c) mạch nhánh fucose, α-L-
fucose [18]
Dựa vào sự phát triển của các kỹ thuật quang phổ hiện đại, sử dụng
phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp phân tích
methyl hóa đã xác định được cấu trúc phân tử của FCS, nhìn chung gồm 3 thành
phần chính là: uronic acid, sulfate, các gốc đường amin, cấu trúc mạch khung
thì tương tự như chondroitin sulfate ở động vật có vú (CS), tuy nhiên mạch
nhánh fucopyranose được phát hiện có thể gắn ở một vài vị trí khác nhau trên
mạch chính (có thể ở gốc D-glucuronic acid hoặc gốc D-galactosamin). Hơn
nữa các nhánh fucose này có mô hình sulfate có thể phân biệt được so với mạch

24. 18
chondroitin sulfate [26] và mô hình sulfate của fucan nhìn chung thường ở vị
trí C-2, 3 và 4, mặc dù một số công bố tồn tại kiểu liên kết glycosidic giữa các
gốc fucose theo dạng liên kết (1→2, 1→3 hoặc 1→4) và liên kết glycosidic của
các fucan này với mạch chính CS có thể ở vị trí C-3 của gốc glucuronic acid.
Cho tới nay, cấu trúc hóa học ưu thế của vài loài đã nhận biết được mức độ biến
đổi cấu trúc bởi sự biến đổi lớn liên quan đến sự sulfat hóa và thành phần nhánh
(Hình 1.6). Dựa trên thành phần monosaccharide từ mỗi loài, các tài liệu tham
khảo cho thấy hầu hết tỉ lệ giống nhau giữa D-glucoronic acid và D-
glucosamine nhưng tỷ lệ của sulfate và fucose có sự thay đổi lớn. Theo tác giả
Zhao và cộng sự [27] đã nhận định thành phần monosaccharide không chỉ phụ
thuộc vào loài khác nhau mà còn bị ảnh hưởng bởi phương pháp chiết tách.
Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của Chen và cộng sự [19] đã chỉ ra rằng,
mùa vụ thu hoạch và môi trường sống có thể ảnh hưởng đến sự thay đổi cấu
trúc FSC. Bảng 1.3 mô tả tổng hợp về tỷ lệ thành phần monosaccharide theocác
tài liệu đã được công bố về FSC các loài hải sâm khác nhau.
Bảng 1. 3. Thành phần hóa học của FCS được phân lập từ thành tế bào
của một số loài hải sâm [22]
Loài hải sâm
Thành phần hóa học (tỉ lệ mol)
U:N:F:-OSO3
-
Stichopus variegatus 1:0,83:1,07:3,82
Holothuria leucospilota 1:1,06:0,89:3,83 1:1,04:0,81:2,06
Holothuria atra 1:0,87:0,69:2,35
Holothuria scabra 1:0,78:0,53:1,34
Ludwigothurea grisea 1:0,85:1,85:2,04 1:1,10:1,07:2,93
Pearsonothuria graeffei 1:0,8:1,5:2,6 1:0,8:1,3:2,5
Holothuria vagabunda 1:1,1:0,9:2,7

25. 19
Stichopus tremulus 1:0,8:1,2:3,0
Isostichopus badionotus 1:0,7:0,9:3,1
Thelenota ananas 1:1,09:1,12:3,83
Holothuria nobilis 1:0,96:0,82:2,99
Holothuria edulis 1:1,28:0,82:3,5
1.2.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của glycosaminoglycan
Hải sâm được xem là món cao lương mỹ vị ở Malaysia, Trung Quốc,
Nhật Bản, Indonesia do người ta tin tưởng vào tác dụng chữa bệnh của nó: cao
huyết áp, thấp khớp, hen suyễn, liệt dương, táo bón…[11, 25]. Người ta thường
mua hải sâm khô và nấu cho mềm dưới dạng món súp hoặc món hầm hoặc om
và món hải sâm nhìn giống món thạch nhưng ăn không ngon lắm. Trong ẩm
thực Nhật Bản, món Konotawa được nấu bằng hải sâm nấu thành cao, ướp muối
và xử lý khô để ăn dần. Nhìn chung món ăn chế biến từ hải sâm không ngon
lắm, và cũng không thể sử dụng được hết giá trị vốn có của nó.
Sau này nhờ sự phát triển của khoa học kỹ thuật các nghiên cứu về hải
sâm cho thấy chúng có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý như: các
polysaccharide sulfates hóa, saponin, collagen, glycosyl shingolipid, sialic
acid, … [26], trong đó được quan tâm nhất chính là các hoạt tính sinh học của
các glycosaminoglycan (polysaccharide sulfates) . Các glycosaminoglycan của
hải sâm có thể được chia thành hai dạng chính là fucan sulfate hóa (FS) hay
còn gọi là fucoidan Hải sâm và fucosylated chondroitin sulfate hóa (FSC) [27].
Các thành phần này đã và đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu nhờ sở hữu
nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ, chống tắc nghẽn mạch máu
[27], điều chỉnh sự hình thành mạch máu [28] ức sự di căn của tế bào ung thư
[29], kháng tế bào hủy xương và kháng ung thư [27]. Trong đó hoạt tính kháng
đông tụ là một trong số các hoạt tính được nghiên cứu sâu rộng nhất của các

26. 20
glycosaminoglycan hải sâm.
1.2.3.1. Hoạt tính chống đông tụ máu của FCS
Gần đây, hầu hết các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của FCS đã được
tập trung vào chống đông máu và chống huyết khối. FCS thể hiện tác dụng
chống đông máu tuyệt vời thông qua thrombin (FIIa) và ức chế yếu tố Xa (Fxa)
qua trung gian antithrombin III (ATIII), và cũng chứng minh rằng trọng lượng
phân tử và mức độ sulfate hóa của một FCS tác động lớn đến hoạt tính sinh học
này [30, 31]. FCS chiết xuất từ hải sâm Ludwigothurea grisea cho thấy hoạt
tính chống huyết khối rất tốt trên các nhánh fucose sulfate [32]. Các hoạt động
chống đông máu của FCS với các kiểu sulfate khác nhau cũng đã được điều tra
và nó đã được chứng minh là nhánh fucose 2,4-O-sulfate, là đặc điểm cấu trúc
quan trọng cần thiết cho việc chống đông máu và ức chế thrombin. Các hoạt
động chống đông máu của hải sâm Holothuria Mecicana trong công trình
nghiên cứu xét nghiệm đông máu huyết tương của Qinying và cộng sự [33],
đem so sánh với hoạt tính chống đông tụ máu của Heparin và hải sâm
Isostichopus badionotus [4, 34]. Kết quả hiển thị FCS của Holothuria
Mecicana có hoạt tính chống đông máu nội tại tương tự như Heparin, nhưng
lại yếu hơn của hải sâm I. badionotus, là do mật độ sulfate hóa của các nhánh
fucosyl ở hải sâm I. badionotus cao hơn hải sâm H. Mecicana. Qua các công
trình nghiên cứu[4, 30, 31, 32, 33, 34], ta có thể thấy FCS là một tiềm năng và
có thể sử dụng để thay thế Heparin trong lĩnh vực chống đông tụ máu. Ngoài
ra, các nghiên cứu của Liu và cộng sự [ 30, 35], cũng đã phân lập ra hai phân
đoạn FCS từ hải sâm Cucumaria frondosa và Thelenota anana, và chứng minh
được FSC có tiềm năng trong điều trị ung thư và chống đông tụ máu.
1.2.3.2. Hoạt tính tái sinh tế bào
Glycosaminoglycan đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển mô
mới của cơ thể vì nó có khả năng liên kết với protein hình thành treoglycans

27. 21
và các yếu tố tăng trưởng tuần tự, là trung tâm của sự biệt hóa tế bào và chức
năng [36] . Sự tham gia của chondroitin sulfate (CS) và dermatan sulfate (DS),
trong các cơ chế tái tạo của hệ thống thần kinh trung ương, phát triển gan và tái
tạo mô liên kết đã thúc đẩy sự quan tâm về glycosaminoglycan trong y học tái
sinh [37]. Vì hiện tại CS không thể được tổng hợp hóa học, nên các nhà nghiên
cứu đã tổng hợp qua các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên thông qua các động
vật trên cạn lẫn động vật dưới biển [38, 39]. Và công trình nghiên cứu của J.
Valcarcel và cộng sự [40] đã công bố rằng glycosaminoglycan có trong động
vật biển tìm thấy CS có hàm lượng cao hơn trong động vật trên cạn.
1.2.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Theo các nghiên cứu được công bố, glycosaminoglycan của hải sâm [27,
28, 29] cũng như fucoidan của rong biển [41] đều sở hữu những hoạt tính sinh
học quý có giá trị dược học cao. Trong đó, fucoidan của rong biển đã được
chứng minh là có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mạnh [42], nhưng ở hải
sâm lại chưa có công bố nào. Sau đó, vào năm 2017, đã có công trình nghiên
cứu công bố về hoạt tính này ở 5 mẫu hải sâm Stichopus variegatus, Holothuria
spinifera, H. atra, P.graeffei, B. argus [43], kết quả thu nhận được rằng chỉ có
2 phân đoạn F3- S. variegatus và F3- H. spinifera có thấy sự kháng lại các
chủng gây bệnh với đường kính vòng vô khuẩn là từ 10 – 11 mm trên hai chủng
vi khuẩn bệnh là B. cereus và S. aureus, đây đều là hai chuẩn vi khuẩn gram
âm. Đặc biệt hai phân đoạn F3- S. variegatus và F3- H. spinifera đều là các
phân đoạn fucan sulfate hóa cao với hàm lượng sulfate lần lượt là 38,60% và
32,92%, kết quả này có thể liên quan đến vai trò của nhóm sulfate với hoạt tính
kháng khuẩn của hai phân đoạn glycosaminoglycan này. Như vậy,
glycosaminoglycan của hải sâm cũng có thể được coi như là một chất kháng
sinh tiềm năng mới và cần được nghiên cứu sâu hơn.

28. 22
1.2.2.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Theo các công trình nghiên cứu đã công bố [29, 18], glycosaminoglycan
của hải sâm có phổ hoạt tính sinh học rất đa dạng, đặc biệt là hoạt tính kháng
ung thư, do vậy nhóm polymer đã trở thành đề tài thu hút được sự quan tâm
nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các nguồn
dược liệu mới. Theo báo cáo nghiên cứu của tác giả Thịnh và cộng sự [43], thử
nghiệm các phân đoạn có hàm lượng sulfate cao của 3 mẫu hải sâm S.
variegatus, H. spinifera, B. argus để tiến hành thử nghiệm thăm dò hoạt tính
gây độc tế bào ung thư người trên hai dòng tế bào ung thư là ung thư phổi (LU-
1) và ung thư gan (Hep-G2). Chất đối chứng dương được sử dụng ở thí nghiệm
này là DMSO (Dimethyl sulfoxide). Kết quả thí nghiệm cho thấy chỉ có 2 mẫu
F3 - H. spinifera và F3 – B. argus có hoạt tính gây độc tế bào ung thư, trong
đó mẫu F3 – B. argus có hoạt tính gây độc tế bào rất tốt trên 02 dòng tế bào
ung thư phổi (LU-1) và ung thư gan (Hep-G2) với tỷ lệ gây độc tế bào là 78,22%
(LU-1), 71,05% (Hep-G2). Phân đoạn F3 - H. spinifera chỉ có hoạt tính gây
độc tế bào ung thư gan (Hep-G2) với tỷ lệ gây độc là 53,15%. Đặc biệt là 2
phân đoạn F3 - H. spinifera và F3 – B.argus đều là phân đoạn của fucan sulfate.
Bên cạnh đó phân đoạn F3 - H. spinifera vừa có hoạt tính kháng vi sinh vật
kiểm định và gây độc tế bào gan, F3 – B.argus chỉ có hoạt tính rất tốt với gây
độc tế bào ung thư phổi và gan. Điều này cho thấy cơ chế sinh học của các
glycosaminoglycan từ hải sâm rất khác nhau, có thể có hoạt tính tốt với dòng
tế bào ung thư này, nhưng lại không có hoạt tính với dòng ung thư khác, đó là
do sự khác nhau về đặc trưng cấu trúc. Theo những công trình nghiên cứu khác
của Kariya và cộng sự [18], hai phân đoạn fucan sulfate được phân lập từ loài
hải sâm Stichoupus japonicus đều có khả năng ức chế tế bào hủy xương tới
99,8% và 96,3% sự hình thành của tế bào hủy xương . Tác giả Su và cộng sự
[44] vào năm 2011 đã công bố hai phân đoạn glycosaminoglycan được phân

29. 23
lập từ hải sâm Acaudina leucoptoct có hoạt tính ức chế sự hình thành của tế bào
ung thư S180.
1.3. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM VỀ
GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu trên thế giới
Vào năm 1984, Vaseur là nhà nghiên cứu đầu tiên về hoạt chất
polysaccharide sulfates ở động vật biển không xương [23]. Nhưng mãi tới năm
1987, cấu trúc của các Fucan sulfate mới được nghiên cứu [3]. Sau đó các
nghiên cứu về cấu trúc của polysaccharide sulfates, đặc biệt ở hải sâm (GAG)
được tăng lên đáng kể trong hai thập kỷ qua. Alves và các cộng sự [45] đã công
bố cấu trúc và hoạt tính sinh học của các polysaccharide sulfates từ hai loài hải
sâm Isostichopus badionotus và Ludwigothurea grisea. Trái ngược với cấu trúc
phức tạp và dị thể của fucoidan từ rong nâu [4, 46], polysaccharide sulfates từ
động vật không xương sống biển có cấu trúc đồng nhất, mạch thẳng và lặp lại
với chỉ từ 1-, 3- hoặc 4- đơn vị đường. Trong đó kiểu liên kết glycosid và mô
hình sulfates là thống nhất và không thay đổi. Tuy nhiên, mỗi loài đều có một
cấu trúc fucan sulfates hóa riêng biệt, các cấu trúc khác nhau ở vị trí liên kết
giữa các gốc fucose và mức độ cũng như vị trí sulfates trên các gốc đường.
Thành phần chủ yếu của polysaccharide sulfates từ hải sâm là L-fucose và các
nhóm este sulfates, các polysaccharides này là một trong những hợp chất có
hoạt tính sinh học mạnh nhất của hải sâm. Chen và các cộng sự [19] đã công
bố các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính kháng đông tụ của fucan sulfates từ
các loài hải sâm Isostichopus badionotus và L. grisea. Kariya và cộng sự [18]
đã phân lập được hai loại fucan sulfates từ hải sâm Sichopus japonicus nghiên
cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính ức chế tế bào hủy xương. Gần đây, nhóm
tác giả Long Yu và cộng sự [21] đã công bố các kết quả hoạt tính kháng ung
thư dạ dày của fucan sulfates được phân lập từ loài hải sâm Acaudina

30. 24
molpadioides.
Như trên ta có thể thấy, các polysaccharide sulfates từ hải sâm sở hữu
nhiều hoạt tính sinh học quý. Hoạt tính sinh học của polysaccharide có mối
quan hệ chặt chẽ với cấu trúc của chúng. Do vậy, việc phân tích cấu trúc
polysaccharide có ý nghĩa vô cùng quan trọng giúp giải thích cơ chế các
tương tác sinh học và thúc đẩy nhanh chóng đưa vào ứng dụng trong thực tiễn
[21]. Cho đến nay polysaccharide sulfates (fucoidan) từ hơn 20 loài rong nâu
khác nhau đã được nghiên cứu cấu trúc và phát triển thành các thực phẩm
chức năng thương mại. Tuy nhiên, mới chỉ có polysaccharide sulfates
(glycosaminoglycan) từ 4 loài hải sâm được nghiên cứu cấu trúc cho tới ngày
nay.
1.3.2. Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam
Bởi đặc thù nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt, địa
hình phía đông giáp với Vịnh Bắc Bộ và biển Đông, nên nguồn tài nguyên sinh
vật biển hết sức phong phú và đa đạng (11.000 loài sinh vật thủy sinh, 1.300
loài sinh vật trên đảo, cùng vô số loài chủng vi sinh vật ).Tuy vậy, việc nghiên
cứu sinh vật nhiệt đới biển của Việt Nam cho đến nay vẫn chủ yếu theo định
hướng giá trị thực phẩm, dinh dưỡng và xuất khẩu, việc nghiên cứu, khai thác,
sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên thiên nhiên sinh vật để tạo ra các sản phẩm
có giá trị cao phục vụ cuộc sống còn hạn chế chưa tương xứng với tiềm năng
của biển Việt Nam. Các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển ở
Việt Nam mặc dù đã bắt đầu từ những thập niên 60 của thế kỷ 20, nhưng từ đó
cho tới nay không có nhiều công trình liên quan được công bố. Các nghiên cứu
hầu hết tập trung vào xác định thành phần hóa học và hàm lượng của các nhóm
hợp chất lipit, protein, các nguyên tố đa-vi lượng, các nhóm chất độc tố biển.
Các nghiên cứu sâu hơn về hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên
nhiên biển chỉ mới được bắt đầu khoảng 10 năm trở lại đây chủ yếu được thực

31. 25
hiện bởi các nhà khoa học thuộc Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học các Hợp
chất thiên nhiên và một số viện khác thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Trong tuyển tập cụm công trình “Khai thác sử dụng hợp lý
nguồn tài nguyên thiên nhiên sinh vật Biển Việt Nam nhằm tạo ra các sản phẩm
có giá trị phục vụ cuộc sống” do các nhà khoa học thuộc Viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam (gồm các Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học các Hợp chất
thiên nhiên, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Tài
nguyên Môi trường Biển Hải phòng) thực hiện, đã công bố các kết quả nghiên
cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên từ 5
đối tượng sinh vật biển chọn lọc (gồm: hải miên cành Haliclona sp1., bọt biển
xốp đen Icrinia echinata, Cầu gai Diadema setosum, hải sâm Holothuria
vagabunda và Holothuria scabra). Các tác giả đã tách chiết xác định được cấu
trúc 30 chất sạch (có 4 chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên) cùng
những kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy một số chất sạch có hoạt
tính chống ung thư và kháng sinh rất cao. Trong số tất cả các nhóm hợp chất đã
và đang nghiên cứu từ sinh vật biển, thì hầu như chưa có bất kỳ nghiên cứu nào
thực hiện với nhóm các hoạt chất polysaccharide sulfates hóa từ đối tượng này,
mặc dù chúng sở hữu hoạt tính kháng động tụ và kháng ung thư rất mạnh [23].
Ở nước ta, nhóm hoạt chất polysaccharide sulfates từ tài nguyên biển mới chỉ
được nghiên cứu trên đối tượng thực vật biển, cụ thể là các loài rong biển trong
khoảng 10 năm trở lại đây [47]. Trong khi đó, vẫn còn rất ít nghiên cứu về
polysaccharide sulfate từ hải sâm nói riêng cũng như động vật thân mềm biển
nói chung, mặc dù đây là nhóm chất có hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng
ung thư mạnh với tiềm năng rất lớn để phát triển thành các nguồn dược liệu và
thuốc mới.
Tóm lại, từ việc phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
và trong nước, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu

32. 26
trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra” được đề xuất thực
hiện nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về glycosaminoglycan từ sinh vật
biển nói chung và từ hải sâm nói riêng, theo hướng nghiên cứu các hợp chất
mới có hoạt tính sinh học ứng dụng làm thực phẩm bổ dưỡng và thực phẩm bảo
vệ sức khỏe từ nguồn tài nguyên biển.

33. 27
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là nhóm hợp chất glycosaminoglycan
(hay còn được gọi là polysaccharide sulfate) được chiết tách từ Hải sâm
Holothuria atra thu ở biển Nha trang. Hải sâm Holothuria atra được thu tại
vùng biển Nha trang vào thời điểm tháng 12 năm 2018, mẫu được thu một cách
ngẫy nhiên bằng phương pháp lặn bắt bằng tay, mẫu sau khi bắt được giữ trong
nước biển sử dụng các thùng xốp có nắp đậy để vận chuyển về phòng thí
nghiệm. Mẫu hải sâm được phân loại bởi Thạc sĩ Nguyễn Thị Mỹ Ngân, chuyên
gia phân loại động vật biển không xương sống thuộc Viện Hải Dương Học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1. Hải sâm Holothuria atra đã được xử lý mẫu
2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất
2.1.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm như: ống nghiệm, bình tam giác, cốc
thủy tinh, ống đông, pipet, cuvet, ống ly tâm…

34. 28
2.1.2.2. Thiết bị
Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
 Máy sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao HPEAC Dionex ICS-3000
(Thermo, Mỹ)
 Máy phân tích thành phần cacbonhydrat: Biotronik (Durrum-X4-20;
0,63x30 cm; 60o
C; bicinchoninate method; Shimadzu C-R2AX
detector.
 Máy phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR: Bruker WM-500
 LC/MS iontrap 1100 AGILENT.
 Thiết bị phân tích phổ hồng ngoại: NICOLET IMPACT-410FT-IR
SPECPTROMETER.
 Máy li tâm siêu tốc: eppendorf, Centrifuge 8504 R
 Máy đông khô: LyoQuest Plus ECO 50 (Telstar, Spain)
 Máy sấy chân không: FRANCE-ETUVE
 Máy cô quay chân không: Heidolph-Laboratory 4003-digital
 Màng siêu lọc MWCO 10kDa, VIVAFLOW 200
 Máy đo quang: SHIMAZDU UV-VIS 1601PC SPECTROMETER
 Máy xay đa năng QE-1000: xuất xứ Trung Quốc, điện áp 220V/ 50Hz,
công suất 2400W, tốc độ quay 28000 r.p.m.
2.1.2.3. Hóa chất
Các hóa chất tinh khiết sử dụng của hãng Sigma bao gồm: L-Cystein, N-
Acetyl galactosamin, N-Acetyl glucosamin, Glucuronic acid, D-Galactose, L-
Fucose, D-Glucose, D-glucuronic acid. EDTA, CH3COONa, CH3COOH,
NaHB4, NH4OH, Na2SO4, K2SO4, NaOH, TCA (Tricloacetic acid), Gelatin,
BaCl2, TFA (Trifluoroacetic acid), nhựa trao đổi ion DEAE-Sepharose Fast
Flow, màng thẩm tách kích thước 10 kDa.
Các hóa chất công nghiệp khác gồm: Enzyme Papain có xuất xứ Ấn Độ,

35. 29
hoạt độ 50.000 UI/gam; cồn thực phẩm (Ethanol 98%); Aceton (TQ-Trung
Quốc); HCl (TQ); NaCl (TQ); H2SO4(TQ); NaOH (TQ)
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ
hải sâm
2.2.1.1. Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan
Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm được thực hiện dựa
theo phương pháp của (X. Dong và cs, 2014) [1]. Phương pháp chiết tách
glycosaminoglycan được thực hiện như sơ đồ hình 2.2

36. 30
Hình 2.2. Quy trình chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
Xử lý hóa học
Bất hoạt
enzyme
Các hợp chất
màu, hợp chất
trọng lượng phân
tử thấp, lipít
Bột glycosaminoglycan
sulfates thô
Xử lý cơ
học
Bã Chiết
Chiết với các điều kiện
thích hơp nhất: pH =6,
nhiệt độ 55 C, tỷ lệ
DM/NL 40/1, thời gian 24
giờ
Ly tâm
 Ngâm chiết với EtOH
98%, trong vòng 5-7
ngày, tỷ lệ cồn/hải sâm:
3 lít/1kg
 Sau đó chiết với Aceton
trong vòng 24h, tỷ lệ
aceton/khối lượng hải
sâm: 2 lít/1kg
 Ngâm chiết trong điều
Hải sâm tươi
Bã
Tủa
Hexadecyltrimethyl-
amonium bromide
(cetavlon) 10%
Ly tâmDịch
Hòa tan Tủa 2N NaCl/EtOH 20%
Kết tủa Cồn 98%
Ly tâm +rửa
muối
Cồn 85%Dịch
Sấy
Nội tạng, tạp
chất

37. 31
2.2.1.2. Phương pháp tách phân đoạn glycosaminoglycan
GAG từ hải sâm được tiến hành tách phân đoạn tinh chế theo phương pháp
sử dụng cột sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Sepharose Fast Flow [49]
Hình 2.3. Phân đoạn tinh chế các glycosaminoglycan bằng
sắc ký trao đổi anion
2.2.2. Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của
glycosaminoglycan
2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate
Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: Hàm lượng đường tổng được
xác định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [50]. Dung dịch chuẩn được
Chuẩn bị cột tách
(cột sắc ký trao đổi anion)
Chuẩn bị dung dịch
glycosaminoglycan
Chạy mẫu lên cột
Chạy thẩm tách
Cô đặc
Thu phân đoạn
Bột
glycosaminoglycan
Đông khô

38. 32
sử dụng là glucose với các nồng độ khác nhau từ 25 -200𝜇𝑔/𝑚𝑙.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng sulfate
Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với
BaCl2/gelatin, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [51]. Dung dịch chuẩn được sử
dụng là K2SO4 với các nồng độ từ khác nhau từ 100 – 1000µg/ml.
2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic axít
Hàm lượng uronic axít được xác định sử dụng phương pháp Carbazole
[10]. Dung dịch chuẩn được sử dụng là D-glucuronic axit với các nồng độ khác
nhau từ 10 – 50µg/ml.
2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp của Lowry [52].
Dung dịch chuẩn được sử dụng là Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine
serium albumin) với các nồng độ khác nhau từ 40 – 200 µg/ml.
2.2.2.5. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide
Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC, sau khi
glycosaminoglycan được thủy phân axít về các monomer. Các đường đơn
fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất
chuẩn [53].
2.2.2.6. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
Khối lượng phân tử trung bình của glycosaminoglycan xác định bằng
phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC).
Phép đo GPC được thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent 1100, với cột Shodex
SB-806HQ và detector RID (refractive index detector) tại Trường Đại học
Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nhiệt độ của
cột được giữ ở 600
C. Glycosaminoglycan nồng độ 1mg/ml. Thể tích mẫu bơm

39. 33
là 0,5ml với tốc độ 1,0ml/phút. Dung dịch NaCl (1mg/ml) được sử dụng làm
chất rửa giải [54].
2.2.2.7. Phương pháp phổ hồng ngoại IR
Mẫu glycosaminoglycan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20
mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của glycosaminoglycan được ghi trên máy
Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương
- Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga), trong vùng
số sóng 4000-400 cm-1
[6]. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1
ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí
axial hay equatorial [55, 56].
2.2.2.8. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR và 13
C-NMR được ghi trên máy
Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh
Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn
Đông, L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam). Mẫu glycosaminoglycan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/ml,
đo ở tần số 75,5 MHz tại nhiệt độ 350
C.
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra
2.3.1.1. Xử lý mẫu
Hải sâm tươi mổ bụng, loại bỏ nội tạng, phần thịt được rửa sạch với nước
và axit axetic 0,1N để loại bớt mùi, cắt nhỏ. Tiếp theo, ngâm chiết phần thịt
hải sâm đã làm sạch với cồn 98%và 5ml HCHO, trong vòng 5-7 ngày ở nhiệt
độ phòng, tỷ lệ cồn/khối lượng hải sâm: 3/1 (v/v) để xử lý loại chất béo và các
hợp chất màu. Lọc tách dịch chiết cồn ( được lưu giữ lại sử dụng cho các nghiên

40. 34
cứu khác), phần thịt hải sâm được chiết tiếp với cồn 96% ở nhiệt độ 600
C trong
thời gian 5 giờ, dịch chiết được lọc tách, phần thịt được ngâm chiết qua đêm
với aceton ở nhiệt độ phòng. Sau khi lọc tách dịch chiết aceton, phần thịt hải
sâm được phơi khô tự nhiên trong không khí ở nhiệt độ phòng. Bỏ vào hộp có
nắp đậy để bảo quản.
2.3.1.2. Chiết tách glycosaminoglycan
Hải sâm sau khi phơi khô tiến hành thủy phân trong 500ml dung dịch
NaOH 0.5 N trong 4 giờ ở nhiệt độ 60o
C, sau đó được hiệu chỉnh về pH = 6
bằng dung dịch CH3COOH 0.5 N. Sau thủy phân ta có được hỗn hợp dịch sệt.
Dịch sệt chiết với hỗn hợp (3,5g enzyme papain và 5mM L.Cysteine, 5mM
EDTA), sấy ở nhiệt độ 600
C trong 24h. Hỗn hợp chiết sau đó được đun sôi
khoảng 10 - 15 phút để bất hoạt enzyme, tiến hành lọc qua màng vải sạch tinh
khiết, giấy lọc. Tiếp đó cho ly tâm với cồn (3 lần: 75 độ, lần cuối cồn 96 %),
thu dịch, loại bỏ cặn. Dịch chiết sau khi ly tâm được cô quay chân không đến
còn ¼ thể tích ban đầu (100 ml), cho thêm từ từ 10 ml Cetavlon 10% vào, khuấy
trộn đều để tạo kết tủa glycosaminoglycan cho đến khi dung dịch trở nên trong
suốt, kết tủa để lắng qua đêm ở 40
C. Tiếp tục đem hỗn hợp ly tâm với cồn 20%
tốc độ 7000 vòng/phút, thời gian 10 phút, nhiệt độ 10 C, thu lấy kết tủa. Hòa
tan tủa (phức polysaccharide-cetavlon) với dung dịch 500 ml dung dịch [NaCl
2N/ Ethanol = 100 : 15 (v/v), tiếp theo thêm vào 4 – 5 lần thể tích Ethanol 96%
để kết tủa polysaccharide sulfate hóa, để yên trong vòng 24 h.Tiến hành gạn
lọc, ly tâm với cồn 75% để loại dần muối ra khỏi polysaccharides (7000/phút,
10o
C, 10 phút), thu được tủa polysaccharides. Tủa polysaccharides được hòa
tan với nước cất và đem đi thẩm tách 3 ngày bằng nước máy chạy nước nhỏ
giọt, 1 ngày trong nước cất. Thu dịch và cô quay chân không để thu được bột
polysaccharides sulfate thô hay glycosaminoglycan thô.

41. 35
2.3.1.3. Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng phương pháp sắc
ký trao đổi anion DEAE-Sepharose fast flow (1,5 x 20 cm)
 Chuẩn bị dung dịch polysaccharide sulfates: Cân 500 (mg) bột
glycosaminoglycan (GAG) được hòa tan trong 50 ml dung dịch đệm acetate
natri 0,1 M (pH 5), ly tâm tách cặn. Phần dung dịch được nạp lên cột sắc ký
trao đổi anion DEAE-Sepharose fast flow (1,5 x 20 cm).
 Chuẩn bị cột sắc ký trao đổi aninon DEAE-Sepharose fast flow (1,5 x 20
cm): Cột trước tiên được cân bằng với dung dịch đệm acetat natri 0,1M (pH=5).
 Tiến hành chạy cột phân đoạn: Cột được rửa giải bằng dung dịch đệm
0,1M acetat natri (pH=5) cho đến khi thử phản ứng âm tính của GAG bằng
thuốc thử phenol/axit sulfuric, tiếp tục rửa giải cột theo gradient nồng độ muối
NaCl từ 0 – 2N được pha trong dung dịch đệm 0,1M acetat natri (pH 5), tốc độ
rửa giải 0,8 ml/phút, và thu các phân đoạn GAG, mỗi phân đoạn thu 10 ml. Các
phân đoạn được thu nhận và kiểm tra bằng phép đo tổng carbohydrat để xác
định các phân đoạn GAG thu được. Từng phân đoạn GAG được gom lại, cô
đặc bằng hệ cô quay chân không và thẩm tách trong nước cất để loại muối. Mẫu
sau khi chạy thẩm tách được đông khô để thu được bột GAG.
2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate
Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định theo phương pháp phenol
– acid sulfuric (Dubois và cs, 1956) [50].
Cân 5mg mẫu thêm 1ml H2O lắc tan, ly tâm (10000 vòng/phút, 10 phút).
Lấy dịch trong, pha loãng dung dịch 10 lần (100 µl dịch mẫu hòa với 900 µl
nước cất). Lấy 200µl dung dịch đã pha loãng, thêm vào 200µl thuốc thử phenol
5%, lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thì thêm tiếp 1ml dung dịch
H2SO4 đậm đặc, lắc đều rồi đun cách thủy trong thời gian từ 5 – 10 phút thì
dừng lại. Lấy ra để nguội đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 𝜆 = 490nm. Sử dụng
glucose làm chất chuẩn với các nồng độ từ 25 – 50 – 100 – 150 – 200 µg/ml.

42. 36
2.3.3. Phân tích hàm lượng sulfate
Hàm lượng sulfate được xác định theo phương pháp đo độ đục với
BaCl2/gelatin (Dodgson và cs, 1962) [51].
Cân 5mg mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5ml, thêm vào
2ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100 o
C trong thời gian 6 giờ. Lấy 150µl
dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 1,5ml TCA (Triclorua acetic axit) và
1,5ml hỗn hợp (0, 5% gelatin + 0, 5% BaCl2) lắc đều để tạo kết tủa. Phản ứng
được thực hiện và giữ yên 10 – 15 phút ở nhiệt độ phòng, rồi đem đo độ đục ở
bước sóng 𝜆 = 360nm. Sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn với các nồng độ từ 100
– 250 – 500 – 750 – 1000 µg/ml.
2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axit
Hàm lượng uroic axit được xác định dựa trên phương pháp Carbazole
(Bitter, T.; Muir, H.M, 1962) [10]
 Hóa chất sử dụng phân tích:
- Dung dịch A: 0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 ml nước cất, thêm vào từ từ
90 ml dung dịch H2SO4 đã được làm lạnh, hỗn hợp được để qua đêm ở nhiệt độ
phòng trước khi sử dụng.
- Dung dịch B: 100 mg Carbazole được hòa tan trong 100 ml cồn tuyệt đối.
 Tiến hành thí nghiệm:
Cân 1mg mẫu hòa tan với 1ml nước cất. Lấy dung dịch pha loãng 5 lần (
200 µl hòa với 800 µl nước cất) . Lấy 250µl dung dịch mẫu đã pha loãng cho
vào ống nghiệm dung tích 10 ml, thêm vào 1, 5 ml dung dịch, phản ứng được
tiến hành ở 100 o
C trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc
nước đá, thêm tiếp 50µl dung dịch B lắc đều, cho phản ứng lại ở 100 o
C trong
15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng bằng ngâm trong cốc
nước đá và tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 𝜆 = 525nm. Mẫu thực GAG

43. 37
và mẫu so sánh (mẫu caborhydrate không chứa uronic axit) được thực hiện theo
các bước tương tự như mẫu chuẩn. Sử dụng D-glucuronic axit làm chất chuẩn
với khoảng nồng độ từ 10 – 20 – 30 – 40 – 50 µg/ml.
2.3.5. Phân tích hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp của Lowry (1951)
[52].
Pha loãng dung dịch gốc BSA (1mg/ml) bằng nước cất thành các nồng độ
khác nhau (tối thiểu 5 nồng độ: 40 – 80 – 120 – 160 – 200 µg/ml) để tiến hành
xây dựng đồ thị chuẩn. Lấy 0,5ml dung dịch chứa protein với các nồng độ khác
nhau được cho vào ống nghiệm, thêm 2,5 ml dung dịch C (gồm hỗn hợp dung
dịch A và B theo tỉ lệ 50:1, trong đó dung dịch A gồm: NaOH 0,1M và Na2CO3
2% và dung dịch B: CuSO4.5H2O 0.5% pha trong dung dịch Natri Citrat (1%)
hoặc dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%) vào mỗi ống nghiệm, lắc đều để yên
trong 20 phút. Sau đó, cho vào hỗn hợp trong mỗi ống nghiệm 0,25ml thuốc
thử Folin 1N, lắc đều và để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên
máy so màu quang điện ở bước sóng 𝜆 = 750nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu
kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo
phương pháp thống kê thông thường. Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị và
tiến hành theo quy trình trên đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính giá trị
protein.
2.3.6. Phân tích thành phần đường đơn
Phân tích thành phần các đường đơn của GAG là bước quan trọng đầu
tiên trong nghiên cứu cấu trúc của GAG. Quy trình chung để xác định các đường
đơn là thủy phân GAG thành các monosacarit và sau đó phân tích thành phần
của từng monosacarit bằng phương pháp sắc ký. Hai phương pháp sắc ký phổ
biến nhất được sử dụng để phân tích thành phần các đường đơn là phân tích trực
tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [53] và phân tích gián tiếp thông

44. 38
qua các dẫn xuất acetyl hóa của chúng bằng sắc ký khí (GC):
Glycosaminoglycan được thủyphân → Khử → Acetyl hóa → Sắc ký [56].
Mẫu glycosaminoglycan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung
tích 5ml, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic axít) 2M lắc đều cho tan, đem thủy
phân ở 100o
C trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay
chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại
hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành
phần đường trên thiết bị phân tích carbohydrate IC-500 Biotronik (Germany),
sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm Borat
kali, tốc độ rửa giải 0,6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp
bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C-R2 AX. Các đường đơn fucose,
glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn.
Hàm lượng các đường đơn được tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn.
2.3.7. Phương pháp sắc kí thẩm thấu Gel (GPC)
GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để phân
tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. GPC
có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lượng trung
bình (Mw), trọng lượng phân tử trung bình số (Mn), và đặc trưng cơ bản nhất
của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tử của nó. GPC được sử dụng
để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymer tổng hợp hay các polymer tự
nhiên như glycosaminoglycan. Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố
trọng lượng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành
các thành phần của nó như polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia
[54].
Tác giả Descamps và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký thẩm thấu
gel được áp dụng để tinh chế và phân đoạn glycosaminoglycan theo trọng lượng
phân tử. Áp dụng sắc ký thẩm thấu gel sau khi thực hiện sắc ký trao đổi ion là

45. 39
phương pháp đặc trưng để loại bỏ muối được sử dụng để giải hấp chất quan
tâm khỏi nhựa trao đổi ion. Mặc dù, thẩm tách và kết tủa trong cồn cũng được
sử dụng cho mục đích loại muối và các hợp chất trọng lượng phân tử thấp. Tuy
nhiên, sắc ký thẩm thấu gel là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ
thuật này cho phép phân đoạn glycosaminoglycan theo trọng lượng phân tử,
đồng thời loại bỏ được muối cũng như các tạp chất trọng lượng phân tử thấp
khác. Các loại nhựa được sử dụng cho việc tinh chế và phân đoạn
glycosaminoglycan là Sephadex G-50 và G-100, Sepharose CL-6B, CL-48 và
Sephacryl S-400[54]. Sắc ký thẩm thấu gel và sắc ký trao đổi anion không gây
ảnh hưởng lên nhóm este sulfate của glycosaminoglycan. Tuy nhiên, sự thay
đổi mạnh về lực ion có thể ảnh hưởng đến cấu hình không gian của các
glycosaminoglycan. Những sự thay đổi về cấu hình phân tử này có thể cũng
ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chúng.
2.3.8. Phương pháp phân tích phổ IR
Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng
ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc
đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí
là C4, còn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào
phổ NMR để xác định các vị trí này.
Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trưng fucoidan trên phổ hồng ngoại [57]
Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của - anome
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6
822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí
equatorial

46. 40
845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial
847 Dao động của liên kết C1-H của - anome
893 Dao động của liên kết C1-H của - anomer
917 Dao động vòng của -anome
1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal
1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C
1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO
1430 Dao dộng gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O
3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
Mẫu glycosaminoglycan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20
mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của fucoidan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-
75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn
lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga), trong vùng số
sóng 4000-400 cm-1
[55]. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1
ta
có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí
axial hay equatorial [55, 58, 59].
2.3.9. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của
carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyển
hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi

47. 41
monosacarit có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β-
của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ
5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm. Phổ
cộng hưởng từ hạt nhân proton được coi như một phương pháp đặc trưng để
nhận biết glycosaminoglycan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu
𝛿 từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl, các tín
hiệu có độ dịch chuyển hóa học 𝛿 từ 5,0 đến 5,5 ppm là vùng của H-1 (H- α)
của glycosaminoglycan.
Hình 2.4. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide
Mặc dù phổ 13
C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiều
thuận lợi hơn phổ 1
H-NMR trong phân tích cấu trúc của glycosaminoglycan
do các tín hiệu trong phổ 13
C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-
220 ppm) so với phổ 1
H- NMR. Vì vùng giá trị 𝛿 lớn nên các tín hiệu ít chồng
lấp lên nhau như trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong
phổ 13
C-NMR thường xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các
tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm. Với
glycosaminoglycan thì vùng tín hiệu đặc trưng để nhận biết trong phổ 13
C-
NMR là vùng trường cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vòng
α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thường xuất hiện trong

48. 42
vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng
từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu
sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp hơn từ 170-180 ppm (hình 2.4). Các tín hiệu
của nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, như C-6 của vòng pyranose và
C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trường cao hơn từ 60-64 ppm,
trong khi các tín hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp
(C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong
vùng 65-87 ppm.
Như vậy, có thể thấy việc đánh giá và phân tích cấu trúc của các
polysaccharide là rất khó khăn và với glycosaminoglycan còn khó khăn hơn
rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết
có mức độ lặp lại không cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1
H-
NMR và 13
C-NMR là không đủ. Để đánh giá phân tích cấu trúc các
polysaccharide phức tạp này, các nhà nghiên cứu thường kết hợp các phương
pháp hóa học như chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao
đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa,
metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phương pháp phổ NMR, đôi
khi cả phương pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc.

49. 43
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA GLYCOSAMINOGLYACAN
TỪHẢISÂM
3.1.1. Phân lập glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
Glycosaminoglycan (GAG) được phân lập từ Hải sâm Holothuria atra
bằng thủy phân với papain, hàm lượng glycosaminoglycan thu nhận được là
5,1% ( bảng 3.1) tính theo trọng lượng mẫu chiết khô sau khi đã ngâm xử lý
trong cồn và aceton. Kết quả này cao hơn đáng kể so với hàm lượng
glycosaminoglycan (polysaccharide sulfate) từ các loài hải sâm khác trên thế
giới đã được công bố như: Stichopus japonicas ở Nhật Bản 0,62% [18];
Apostichopus japonicas 1,7 % [8]; nhưng thấp hơn so với hàm lượng GAG thu
nhận được từ các loài hải sâm thuộc cùng chi Holothuria chi như: Holothuria
vagabunda 6,3% ở Ấn Độ Dương [60], Holothuria nobilis 8,3% [4] và một số
loài khác chi như: Pearsonothuria graeffei 11,0%, Isostichopus badionnotus
9,9%, Stichopus tremulus 7,0% [4,18,6], Acaudina molpadioidea 7,6% [1],
Stichopus variegatus 6,8% [6]. Tuy nhiên, sự khác nhau về hàm lượng của
glycosaminoglycan từ mỗi loài hải sâm chỉ mang tính chất tương đối và rất khó
để đánh giá về sự biến đổi hàm lượng GAG từ các loài hải sâm, sự khác biệt
này có thể được giải thích là do sự mỗi loài hải sâm có những đặc trưng cấu
trúc thành tế bào cơ thể khác nhau do vậy các chuỗi carbohydrate liên kết với
protein trong thành tế bào cơ thể mỗi loài hải sâm cũng khác nhau. Ngoài ra,
hàm lượng glycosaminoglycan hải sâm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác
như: điều kiện địa lý, môi trường sống khác nhau, thời gian thu hoạch và kể cả
các kỹ thuật chiết tách khác nhau. [8].
Như vậy, có thể thấy hàm lượng glycosaminoglycan luôn có sự biến đổi
giữa loài này với loài kia kể cả là trong cùng một chi hay giữa các chi hải sâm
khác nhau.

50. 44
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết glycosaminoglycan của các loài hải sâm.
*% tính theo trọng lượng nguyên liệu hải sâm khô
Mẫu glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra được tiến hành đo
xác định khối lượng phân tử cũng như mức độ nhiễm tạp bởi các hợp chất
không mong muốn khác nếu có bằng kỹ thuật sắc ký thẩm thấu gel GPC (Gel
Permeation Chromatography). Kết quả sắc ký đồ xác định trọng lượng phân tử
của glycosaminoglycan Holothuria atra thu nhận được như trình bày trên hình
3.1. Kết quả trên hình 3.1 cho thấy chỉ xuất hiện một đỉnh duy nhất với mức độ
phân tán khối lượng phân tử Mw/Mn = 1,84, chứng tỏ mẫu có sự phân bố về
khối lượng phân tử không lớn và mẫu không bị nhiễm tạp bởi các nhóm hợp
chất không mong muốn khác.
Kết quả khảo sát trên cho thấy phương pháp phân lập glycosaminoglycan
từ hải sâm Holothuria atra cho hiệu suất chiết tách tương đối cao, khối lượng
phân tử phân bố tập trung, độ phân tán không nhiều và hoàn toàn thích hợp để
Hải sâm Hiệu suất
chiết
GAG (*%)
Hải sâm Hiệu suất
chiết
GAG(*%)
Holothuria atra 5,1% Apostichopus japonicas
[8]
1,7 %
Stichopus japonicas
[18]
0,6 % Holothuria vagabunda
[58]
6,3 %
Pearsonothuria
graeffei
11,0 % Holothuria nobilis
[4]
6,3 %
Isostichopus
badionnotus
9,9 % Stichopus tremulus 7,0 %
Acaudina
molpadioidea [1]
7,6 % Stichopus variegatus [6] 6,8%

51. 45
áp dụng trong nghiên cứu các đối tượng hải sâm ở vùng biển Việt Nam.
Như vậy, kết quả khảo sát trọng lượng phân tử của glycosaminoglycan
không chỉ cho phép đánh giá về khối lượng phân tử trung bình, mức độ phân
tán khối lượng của mẫu mà còn giúp đánh giá về chất lượng của sản phẩm ở
khía cạnh không lẫn tạp chất trong quá trình thủy phân hải sâm và thu nhận sản
phẩm. Kết quả này cũng có ý nghĩa rất lớn đến các nội dung nghiên cứu tiếp
theo trong việc xác định thành phần hóa học cũng như đặc trưng cấu trúc của
glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra.
Khối lượng phân tử (D)
Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
3.1.2. Thành phần hóa học của glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra
Glycosaminoglycan có nguồn gốc từ sinh vật biển nói chung phần lớn là
các polymer dị thể với cấu trúc hóa học rất đa dạng, được cấu tạo nên bởi nhiều
gốc đường khác nhau và cả nhóm sulfate . Vì vậy phân tích thành phần đường
đơn cũng như hàm lượng sulfate là bước quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu

52. 46
đặc trưng cấu trúc của các glycosaminoglycan.
Theo kết quả (bảng 3.2), hàm lượng tổng carbohydrate của hải sâm
Holothuria atra là (43,5 %) cao hơn với các loại hải sâm: Apostichopus
japonicus (24,7%) [61], Acitinopyga mauritiana (35,59%) [61]; tương đương
với các loại hải sâm: A. Mauritiana (44,62%), B. Marmorata (45,91%), thấp
hơn so với các loại hải sâm: Holothuria mexicana (58,54%) [62]. So sánh kết
quả hàm lượng sulfate của hải sâm Holothuria atra (23,2% ) (bảng 3.2) với
mẫu PS từ hải sâm Apostichopus japonicas [8] được công bố trước đây bởi Liu
và cộng sự, hàm lượng Sulfate chiếm 15,74% [63] hay Ludwigothurea grisea
(13,9%) [3], nhận thấy rõ ràng là Hải sâm Holothuria atra có mật độ sulfate
hóa cao hơn nhiều, và có hàm lượng tương đương với các hải sâm khác như
Isosticopus badionotus (22,1%) [3], Cucumaria japonica [7]. Kết quả phân tích
hàm lượng sulfate của hải sâm Holothuria atra (bảng 3.2) và so sánh với nhiều
loại hải sâm khác nhau trên thế giới cho thấy đây là một polymer dị thể sulfate
hóa cao. Theo các nghiên cứu trước đó về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học
với các đặc trưng cấu trúc của GAG hải sâm đã chứng minh rằng mật độ nhóm
sulfate đóng vai trò quan trọng nhất quyết định đến các hoạt tính sinh học của
nhóm hợp chất polymer sinh học này . Bên cạnh đó trong thành phần của mẫu
GAG này còn phát hiện thấy sự có mặt của cả uronic axit và protein với hàm
lượng lần lượt là 5,9% và 3,2%.
Kết quả phân tích thành phần đường đơn của mẫu GAG từ hải sâm
Holothuria atra (bảng 3.2) cho thấy có tới 04 gốc đường đơn khác nhau tạo nên
PS, trong đó đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và
Glucuronic axit (GlcA) là thành phần chính, gốc đường N-Acetyl
Galactosamine chiếm ưu thế hơn , còn có một lượng nhỏ đường Galactose
(Gal). Kết quả này rất phù hợp với các công bố trước đó về glycosaminoglycan
là một polymer dị thể được tạo nên từ nhiều gốc đường khác nhau và nhóm

53. 47
sulfate [4; 1; 7; 8; 14]. So sánh thành phần đường đơn giữa nghiên cứu
glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra (bảng 3.2) với các loại hải sâm
trên thế giới, nhận thấy các kết quả này cũng tương tự thành phần đường đơn
của glycosaminoglycan từ các loại hải sâm như Thelenata ananas[65],
Apostichopus japonicus, Actinoyaga mauritiana [ 8], Acaudina molpadioidea,
Holothuria nobilis [1], trái lại thành phần đường đơn của PS từ các loài hải sâm
như Ludwigothurea grisea, Isosticopus badionotus và Brandthorurea
arenicola chỉ được tạo nên từ 3 gốc đường và chỉ có đường Fucose (Fuc) là
thành phần chính, hai gốc đường N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và
Glucuronic axit (GlcA) chỉ chiếm một lượng rất nhỏ[3]. Tóm lại, thành phần
đường đơn của glycosaminoglycan từ hải sâm phần lớn đều có đặc điểm chung
là được tạo nên chủ yếu từ các đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine
(GalNAc) và Glucuronic axit (GlcA), cùng với một hàm lượng nhỏ hoặc không
đáng kể các gốc đường đơn khác nhau Galactose (Gal), Glucose (Glu)[1, 66].
Tuy nhiên, mỗi loài hải sâm đều có sự khác biệt về hàm lượng và thành phần
các gốc đường. Sự biến đổi về thành phần đường không chỉ được phát hiện
trong các loài hải sâm khác nhau mà cùng một chi hay thậm chí cùng loài thu
ở những vùng địa lý khác nhau , điều này có thể được lý giải là do ảnh hưởng
của điệu kiện môi trường sống khác nhau cũng như các đặc trưng cấu tạo của
mỗi loài.
Glycosaminoglycan từ hải sâm được phát hiện gồm có hai nhóm
polysaccharide chính là fucosylated chondroitin sulfate (FCS) và fucan
sulfate (FS) bởi các nhà nghiên cứu người Nhật Bản vào năm 1956 khi họ
nghiên cứu và chiết tách glycosaminoglycan từ hai loài hải sâm Apostichopus
japonicus và Cucumarina japonica. Kể từ thời điểm đó trở đi đã có rất nhiều
nghiên cứu tập trung vào đặc trưng hóa học của FCS và FS từ hải sâm
Apostichopus japonicus [20] và nhiều loài hải sâm khác như Pearsonothuria

54. 48
graeffei, Stichopus chemolus, Holothuria vagabunda, Isostichopus badionotus
[20]. Như vậy, có thể thấy các polysaccharides từ hải sâm tương đối phức tạp
về thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc. Vì vậy, để nghiên cứu cấu trúc
đặc trưng của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra, các bước tách
phân đoạn tinh chế sẽ tiếp tục được thực hiện nhằm làm đơn giản hóa việc
nghiên cứu cấu trúc của chúng.
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của GAG từ mẫu thô hải sâm Holothuria atra
GAG
Tổng
carbohydrat
%
Tỷ lệ mol giữa các gốc
đường Sulfate
**%
Uronic
acid
**%
Protein
**%
Fuc GlcA GalNAc Gal
GAG 43,5 1 0,95 1,13 0,16 23,2 5,9 3,2
**% tính theo khối lượng của mẫu GAG
3.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN
ĐOẠN CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN
3.2.1. Tách phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
Các nghiên cứu về glycosaminoglycan hải sâm đã công bố trước đây đều
cho thấy mỗi loài hải sâm thường chứa nhiều phân đoạn glycosaminoglycan có
cấu trúc khác nhau thuộc hai nhóm là fucan sulfate (FS) và fucosylated
chondroitin sulfate (FCS) [4]. Kết quả tách phân đoạn tinh chế GAG Holothuria
atra bằng sắc kí trao đổi ion trên cột DEAE-Sepharose fast flow cho ra hai phân
đoạn F1 và F2 như (hình 3.2). Như vậy có thể dự đoán glycosaminoglycan từ
loài hải sâm này có hai nhóm cấu trúc khác nhau tương ứng với mỗi phân đoạn
và mỗi phân đoạn sẽ tương ứng với một nhóm GAG có sự tương đồng về mặt
cấu trúc. Kết quả sắc ký đồ trên hình 3.2 cho thấy mỗi phân đoạn GAG được
tách ra ở các nồng độ rửa giải NaCl khác nhau, phân đoạn F1 được rửa giải với

55. 49
nồng độ muối NaCl dao động từ khoảng 0,5N đến 0,8N, nồng độ rửa giải NaCl
của F2 dao động từ 1N đến 1,5N, kết quả này có thể được giải thích là do sự
khác nhau về đặc điểm cấu trúc của mỗi phân đoạn thu nhận được từ mỗi loài
hải sâm. Hàm lượng mỗi phân đoạn thu nhận được so với khối lượng mẫu GAG
đem phân đoạn là 29,5% (F1) và 53,5% (F2), nhận thấy hàm lượng F2 chiếm
gấp đôi so với F1. Các kết quả tương tự được công bố trước đó [20] về bốn loại
hải sâm khi cho tách phân đoạn bằng sắc ký trao đổi ion, cho thấy GAG của hải
sâm I. Badionotus có kết quả tương tự hàm lượng F2 > F1, ngược lại GAG của
ba loài còn lại là P.graeffei, H.vagabunda, S.Tremulus cho kết quả với phân
đoạn F1>F2, và được chứng minh là đều chứa 1 phân đoạn fucan sulfate và 1
phân đoạn fucosylated chondroitin sulfate [4] , Một công bố khác nghiên cứu
về hải sâm Stichopus variegatus [49], PS được phân đoạn từ hải sâm Stichopus
variegatus thu được ba phân đoạn tương ứng với hàm lượng là F1(18,33%),
F2(20,21%), F3(45,96%), F1<F2<F3, và cũng đã được chứng mình là là đều
chứa 1 phân đoạn fucan sulfate và 1 phân đoạn fucosylated chondroitin sulfate.
Các nghiên cứu sau này về GAG hải sâm cũng đều thu nhận được hai nhóm
FuCS và FuS [48].Tuy nhiên, thành phần và cấu trúc của FCS và FS từ mỗi loài
hải sâm là khác nhau, thậm chí trong cùng một chi hoặc cùng 1 giống loài. Vì
thế muốn làm rõ thêm về đặc điểm cấu trúc của mỗi phân đoạn chúng ta cần
nghiên cứu thêm về thành phần hóa học của mỗi phân đoạn GAG.