Pengujian dengan penyaringan (filtrasi) dan Inokulasi langsung

1. UJI STERILITAS
Achmad Fauzi Al’amrie, S.Farm

2. PENCEGAHAN TERHADAP KONTAMINASI
MIKROBA
PENGUJIAN
STERIL
kondisi
aseptik
untuk
menghindari
kontaminasi

3. Media kultur dan suhu inkubasi
fluid thioglycollate medium terutama
ditujukan untuk kultur bakteri anaerob.
Namun, dapat juga mendeteksi bakteri aerob.
Fluid thioglycollate medium diinkubasi pada
suhu 30-35oC.
Soybean-casein digest medium untuk
pengkayaan jamur dan bakteri aerob.
soybean-casein digest medium diinkubasi
pada suhu 22,5oC.

4. Fluid Thioglycollate Medium
L-Cystine 0.5 g
Sodium chloride 2.5 g
Dextrose Monohydrate/anhydrous 5.5/5.0 g
agar 0.75 g
Yeast Extract (water-soluble) 5.0 g
Pancreatic Digest of casein 15.0 g
Sodium thioglycolic Acid 0.5 g
Or Thioglycolic Acid 0.3 mL
Resazurin Sodium Solution (1 in 1000),freshly prepared 1.0 mL
Purified Water 1000mL

5. Soybean-Casein digest Medium
Pancreatic Digest Of Casein 17.0 g
Papaic Digest of Soybean Meal 3.0 g
Sodium Chloride 5.0 g
Dibasic Potassium Phosphate 2.5 g
Dextrose Monohydrate/Anhydrous 2.5/2.3 g
Purified Water 1000 mL

6. Media untuk penisilin atau
sefalosporin
Media pengujian untuk penisilin atau sefalosporin
menggunakan fluid thioglycollate medium dan
soybean-casein digest medium
Penambahan β-laktam secara aseptis untuk
menonaktifkan penisilin atau sefalosporin
Metode uji kesesuian menggunakan
staphylococcus aureus sebagai pembanding
(konsentrasi β-laktam harus tepat)

7. Mikroorganisme yg digunakan dalam
pengujian pertumbuhan dan metode uji
kesesuaian
Aerobicbacteria
staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788,
NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054,
NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118,
NBRC 13275
Anaerobic bacterium
Clostridium sporogenes ATCC 19, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC
11437, NBRC 14293
Fungi
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179,
NBRC 1594
Aspergillus brasiliensis (aspergillus
Niger)
ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007,
NBRC 9455

8. Pengujian pertumbuhan aerob,
anaerob, dan jamur
• Penyiapan media
• Mikroorganisme yang digunakan dalam pengujian
: Clostridium sporogenes, pseudomonas
aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.
Preparasi
• media thioglycollate untuk sporogenes
clostridium (tidak lebih dari 100 cfu)
• pemipetan soybean-casein digest medium untuk
Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, dan
Candida albicans.
Pengkayaan
• Untuk bakteri tidak lebih dari 3 hari
• Untuk jamur tidak lebih dari 5 hariInkubasi

9. CAIRAN PENGENCER DAN PENCUCI UNTUK FILTRASI
MEMBRANE
fLUID A
1 gram jaringan
hewan yang telah
diuraikan oleh
enzim pepsin
ad air sampai 1 liter
saring atau sentrifugasi, pH
diatur 7.1 ± 0.2
Sediaan uji yang
mengandung senyawa
gol. Penisilin/Sefalosporin
(beta laktma)
+ enzim penisilinase

10. Lanjutan...
fLUID B
1 liter Fluid A
+ 1 ml tween 80
pH diatur 7.1 ± 0.2.
Digunakan bila
mengandung lesitin
atau
sediaan minyak atau
untuk uji peralatan steril dengan
menggunakan penyaring membran

11. fLUID K
1 gram jaringan
hewan yang telah
diuraikan oleh
enzim pepsin
+ 3 gram
beef extract
ad air
sampai 1
liter
pH diatur 6.9 ± 0.2
setelah sterilisasi
Semua cairan
pembilas harus
disterilkan dengan
otoklaf
Lanjutan.....

12. Uji Kesesuaian Metode
• Inokulasi mikroorganisme
ke dalam pengencer steril
untuk membilas filter
Filtrasi
membran
• Inokulasi mikroorganisme
ke dalam media
Inokulasi
langsung

13. Ada
pertumbuhan
mikroorganis
me
Bandingkan
dengan
kontrol media
tanpa produk
Uji sterilitas
tanpa
modifikasi
Tidak ada
pertumbuhan
mikroorganis
me
Bandingkan
dengan
kontrol media
tanpa produk
Lakukan
modifikasi
kondisi dan
ulang uji
kesesuaian
metode

14. Uji
kesesuaian
metode
Produk
baru
Terdapat
perubahan
kondisi
pengujian

15. Jumlah Sediaan yang Akan Diuji
Jumlah jumlah sediaan yang diuji tercantum pada
tabel 3 kecuali bila dinyatakan lain
Bila jumlah sampel mencukupi (lihat tabel 2), sampel
dapat dibagi kedalam beberapa bagian untuk
ditambahkan kedalam media spesifik pengujian dapat
menggunakan dua atau lebih media spesifik).
Bila jJumlah sediaan yang diuji tercantum dalam tabel
3 kecuali dinyatakan lain
umlah sampel tidak mencukupi untuk dilakukan
pembagian, gunakan dua kali jumlah sampel yang
tercantum pada tabel 3.
UJI STERILITAS UNTUK PRODUK YANG AKAN
DIUJI

17. Pengujian Sampel
Filtrasi Membran
sediaan yang mudah
disaring; sediaan yang
berkadar alkohol tinggi
atau sediaan
mengandung minyak;
sediaan yang larut
dalam pelarut air atau
minyak, sediaan yang
tidak memiliki efek
antimikrobial pada
kondisi pengujian.
Inokulasi Langsung
Media Kultur

18. Filtrasi Membran
Digunakan membran filter dengan ukuran
pori tidak lebih besar dari 0,45 µm.
Misalnya
Filtrat Cellulose nitrate
yang digunakan untuk
sampel larutan, minyak,
dan larutan kadar alkohol
lemah
Filtrat Cellulose acetate
yang digunakan untuk
larutan dengan kadar
alkohol tinggi

19. LARUTAN
Gunakan sejumlah sampel
sesuai dengan tebel 2 dan 3
(jika perlu dilakukan
pengenceran)
Dilakukan penyaringan
Pindahkan membran pada
media pertumbuhan yang
sesuai secara aseptik atau
potong membran menjadi 2
bagian dan masukkan
membran ke dalam media
masing-masing yang sesuai
Inkubasi media tidak lebih
dari 14 hari

20. PADATAN YANG TERLARUT
Larutkan sejumlah sampel
(sesuai dengan tabel 2 dan
3) dengan pelarut yang
sesuai misalnya aqua pro
injeksi, salin steril, atau
fluid A
Lakukan prosedur yang
seperti tercantum untuk
sampel larutan dengan
menggunakan
membran dan pelarut
yang sesuai.

21. Gunakan sejumlah produk untuk
masing-masing media tidak lebih
dari jumlah yang tercantum dalalm
tabel 2 dan 3
Minyak dan cairan berminyak yang
mempunyai viskositas yang rendah
masih mungkin dapat disaring tanpa
pengenceran melalui membran
Minyak dengan viskositas tinggi jika
perlu diencerkan terlebih dahulu
dengan menggunakan pengencer
steril yang sesuai misalnya isopropyl
myristate yang menunjukkan tidak
mempunyai aktivitas antimikroba
ketika dalam kondisi uji
Biarkan minyak berpenetrasi
melewati membran
saring dengan menggunakan
tekanan atau dihisap secara perlahan
Cuci membran minimal tiga kali
dengan cara melewatkan kurang
lebih 100 ml larutan steril yang
sesuai misalnya Fluid A ke dalam
membran dimana larutan tersebut
mengandung emulgator yang sesuai
misalnya polisorbat 80 dengan
konsentrasi 10 g per L (Fluid K)
Pindahkan membran ke dalam
media pertumbuhan, inkubasi
seperti pada sampel larutan
MINYAK DAN CAIRAN BERMINYAK

22. SALEP DAN KRIM
Gunakan sejumlah produk untuk
masing-masing media tidak lebih
dari jumlah yang tercantum
dalalm tabel 2 dan 3
Salep dengan basis lemak dan
emulsi air dalam minyak dapat
diencerkan sampai 1 % ke dalam
isopropyl myristate dengan
pemanasan jika diperlukan
tetapi tidak lebih dari 40o, kecuali
jika diperlukan pemanasan lebih
dari 44o
Saring secepat mungkin
Dilakukan prosedur seperti yang
tercantum untuk sampel minyak
dan cairan berminyak.

23. SEDIAAN SOLID UNTUK
INJEKSI SELAIN ANTIBIOTIK
Preparasi sampel sesuai dengan yang
tercantum dalam label, kemudian dilakukan
prosedur seperti yang tercantum untuk sampel
larutan atau minyak dan cairan berminyak.
(catatan: jika diperlukan, dapat ditambahkan
pengencer untuk membantu ketika proses
penyaringan).

24. ANTIBIOTIK SOLID UNTUK INJEKSI
Produk dengan isi < 5 g
Dari 20 wadah masing-masing masukkan
sekitar 300 mg sediaan solid ke dalam 500
ml wadah steril secara aseptik
Larutkan dengan 200 ml Fluid A dan
dihomogenkan
Untuk liquid atau suspensi, masukkan
sejumlah sampel ekuivalen dengan 300
mg sediaan solid ke dalam 500 ml wadah
steril, larutkan dengan 200 ml Fluid A dan
dihomogenkan
Kemudian lakukan prosedur sesuai
dengan yang tercantum untuk sampel
larutan atau minyak dan cairan
berminyak.
Produk dengan isi ≥ 5 g
Dari 6 wadah masing-masing masukkan
sekitar 1 g sediaan solid ke dalam 500 ml
wadah steril secara aseptik
Larutkan dengan 200 ml Fluid A dan
dihomogenkan
Untuk liquid, masukkan sejumlah sampel
ekuivalen dengan 1 g sediaan solid ke
dalam 500 ml wadah steril, larutkan
dengan 200 ml Fluid A dan
dihomogenkan
Kemudian lakukan prosedur sesuai
dengan yang tercantum untuk sampel
larutan

25. ANTIBIOTIK SOLID,
BULK, DAN CAMPURAN
Secara aseptik ambil sejumlah sampel sesuai
dengan tabel 2, ekuivalen dengan 6 g sediaan
solid, masukkan dalam 500 ml wadah steril.
Larutkan dalam 200 ml Fluid A dan dicampur.
Kemudian lakukan prosedur sesuai dengan yang
tercantum untuk sampel larutan.

26. PRODUK AEROSOL STERIL
Untuk produk aerosol steril, bekukan wadah
dengan menggunakan alcohol-dry ice sampai -
20o selama kurang lebih 1 jam. Tambahkan 100
ml Fluid D ke dalam wadah dan homogenkan
secara perlahan. Kemudian lakukan prosedur
sesuai dengan yang tercantum untuk sampel
larutan atau minyak dan cairan berminyak.

27. ALAT DENGAN LABEL STERIL
Secara aseptik lewatkan Fluid D melewati alat
yang akan diuji. Tampung fluid ke dalam wadah
steril, dan kemudian lakukan prosedur sesuai
dengan yang tercantum untuk sampel larutan
atau minyak dan cairan berminyak.

28. Cara Inokulasi Langsung pada Media
medium
Pindahkan sejumlah sampel
yang akan diuji sesuai dengan
tabel 2 dan tabel 3 secara
langsung pada media sampai
volume produk tidak lebih dari
10% dari volume medium atau
bila dinyatakan lain.
netralisasi
Senyawa penetralisir
Pengenceran dengan media

29. • Cairan berminyak
• Salep dan Krim
• Benang Bedah dan Benang Operasi Lainnya
• Sediaan Solid
• Kapas yang Dimurnikan, Kasa, Perban Bedah dan
Bahan Lain Sejenis
• Alat Steril

31. Kesimpulan pemeriksaan media sebagai bukti
makroskopik pertumbuhan mikroba dilihat
selama interval masa inkubasi
Jika bahan yang diuji terdapat kekeruhan, sehingga
adanya pertumbuhan mikroba tidak dapat segera
ditentukan oleh pemeriksaan visual, maka 14 hari
setelah awal pemindahan porsi inkubasi (masing-
masing tidak kurang dari 1 ml) ke vessels dari media
yang sama
inkubasi original dan transfer vessels tidak kurang
dari 4 hari

32. Jika tidak
ada bukti
pertumbuh
an mikroba
ditemukan
Jika bukti pertumbuhan
mikroba ditemukan,
kecuali dapat dibuktikan
dengan jelas bahwa tes itu
tidak valid untuk penyebab
yang tidak terkait dengan
produk yang akan
diperiksa
Jika tidak ada
bukti
pertumbuhan
mikroba
ditemukan
dalam tes ulang,
yang diperiksa
produk sesuai
dengan tes
untuk sterilitas
produk
diperiksa
sesuai
dengan tes
untuk
sterilitas
Jika ada bukti
pertumbuhan
mikroba
ditemukan
Jika
pertumbuhan
mikroba
ditemukan
dalam tes
ulang,
produk yang
diperiksa
tidak sesuai
dengan tes
untuk
sterilitas.

33. Tes mungkin dianggap tidak valid hanya jika satu
atau lebih kondisi berikut ini terpenuhi:
Jika data
pemantauan
mikrobiologi dari
fasilitas pengujian
sterilitas
menunjukkan
kesalahan
Jika sebuah
tinjauan prosedur
pengujian yang
digunakan selama
pengujian
tersebut
mengungkapkan
kesalahan
Jika
Pertumbuhan
mikroba
ditemukan dalam
kontrol negative
Jika setelah
penentuan
identitas
mikroorganisme
terisolasi dari tes,
pertumbuhan
spesies ini
dianggap
menegaskan
kesalahan
sehubungan
dengan material
dan atau teknik
yang digunakan
dalam melakukan
prosedur uji
sterilitas.
Jika tes ini dinyatakan tidak sah, hal ini diulang dengan jumlah
yang sama seperti pada unit pengujian awal

35. • Bila menggunakan teknik filtrasi membran,
gunakan, bila memungkinkan, seluruh isi
kontainer, tetapi tidak kurang dari jumlah yang
disyaratkan dalam Tabel 2, diencerkan bila perlu
sekitar 100 mL dengan larutan steril yang cocok,
seperti Fluid A.
• Bila menggunakan teknik inokulasi langsung
media, gunakan jumlah sampel sesuai dengan
tabel 2, kecuali dinyatakan lain. Tes sterilitas
bakteri dan jamur dilakukan pada sampel yang
sama dari produk yang akan diperiksa. Ketika
volume atau jumlah dalam wadah tunggal tidak
cukup untuk melaksanakan tes ini,maka isi dari
dua atau lebih wadah yang digunakan untuk
mengokulasi media yang berbeda