Analisa BOD5 menggunakan prinsip pengukuran penurunan oksigen terlarut selama inkubasi 5 hari pada suhu 20°C. Prosedurnya meliputi persiapan larutan nutrisi, suspensi mikroba, dan air pengencer; pengukuran DO awal dan akhir untuk sampel, blanko, dan kontrol; serta perhitungan BOD5 berdasarkan selisih penurunan DO. Kontrol standar harus menghasilkan 198±30.5 mg/L untuk memenuhi

1. ANALISA BOD5 (SNI 6989.72;2009)
A. Prinsip :
Sejumlah tertentu contoh uji ditambahkan ke dalam larutan pengencer jenuh oksigen yang telah
ditambah larutan nutrisi dan bibit mikroba, kemudian diinkubasi dalam ruang gelap pada suhu 20C
±1C selama 5 hari, bahan control standar uji BOD ini, digunakan larutan glukosa- asam glutamate.
B. Bahan :
1. Larutan nutrisi yang terdiri dari :
 Larutan buffer Phosfat
Larutkan 8.5 gram KH2PO4, 21.75 gram K2HPO4, 33.4 gram Na2HPO4.7H2O, 1.7 gram
NH4Cl dalam aquadest ( < 1µS/cm) dan encerkan hingga 1 L, pH larutan = 7.2.
Atau
Larutkan 42.5 gram KH2PO4, 1.7 gram NH4Cl dalam 700 mL aquadest, atur pH larutan
sampai 7.2 dengan NaOH 30 %, encerkan sampai 1 L.
 Larutan MgSO4 : larutkan 22.5 gram MgSO4.7H2O dalam aquadest, encerkan sampai 1 L.
 Larutan CaCl2 : 27.5 gram CaCl2 anhidrat dilarutkan dalam air hingga 1 L.
 Larutan FeCl3.6H2O : larutkan 0.25 gram FeCl3.6H2O dalam air hingga 1 L.
2. Larutan suspensi mikroba : sumber bibit bisa dari limbah domestik / effluent dari pengolahan
yang belum mengalami klorinasi / desinfektan atau air sungai yang menerima buangan limbah
organik.
Cara pembuatan : cara I
 Ambil supernatant dari bibit mikroba ( limbah domestic )
 Lakukan aerasi dengan segera pada supernatant tersebut sampai akan digunakan.
Cara pembuatan : cara II ( Cara ini dilakukan berdasarkan standar OECD – Guidline for
Testing Chemical 301 – 1002 ready biodegradability. Dengan uraian sebagai berikut (
lampiran A) :
 Ambil air dari bak aerasi pada system pengolahan lumpur aktif.
 Pisahkan partikel – partikel kasar dari lumpur aktif dengan cara penyaringan
 Suspensi lumpur aktif yang telah dipisahkan dari partikel kasar, diendapkan selama 30
menit atau disentrifugasi dengan putaran 100 x g selama 10 menit
 Endapan dipisahkan, kemudian endapan ditambahkan ke dalam medium mineral (
lampiran B ) sampai kandungan padatan tersuspensi 3 – 5 graam MLSS atau jumlah
mikroba 107
sel/L sampai dengan 108
sel/L
 Homogenkan padatan tersuspensi dengan blender pada kecepatan sedang selama ± 2
menit, kemudian diendapkan selama ± 30 menit.
 Supernatant dipisahkan dan dijadikan sebagai bibit mikroba

2.  Sebelum digunakan supernatant tersebut dikocok dengan menggunakan shaker selama
5 – 7 hari pada suhu yang sama pada suhu pengujian ( 20C ±3C).
Catatan : analisis perhitungan mikroba berdasarkan standar method for the examination
of water & wastewater 21st
edition. Pour plate method.
Catatan : analisis perhitungan mikroba berdasarkan standar method for the examination
of water & wastewater 21st
edition. Pixed and volatile solids ignited t 550C
Cara III : suspense bibit mikroba dapat dibuat dari BOD seed yang tersedia secara
komersial.
3. Larutan air pengencer :
 Siapkan air bebas mineral yang telah jenuh oksigen (min 7.5 mg/L) dalam botol gelas
yang bersih, atur suhu pada kisaran 20C± 3C.
 Tambahkan ke dalam tiap 1 L air tersebut , 1 mL larutan nutrisi.
 Tambahkan larutan suspensi mikroba ke dalam 1 L air pengecer :
 Mikroba cara I : 1 – 3 mL dan aduk sampai homogeny.
 Mikroba cara II : 1 – 10 mL dan aduk sampai homogeny.
 Mikroba cara III : sesuai dengan petunjuk penggunaan
Catatan : penjenuhan oksigen : alirkan aerator yang dilengkapi filter bebas organic pada air
bebas mineral atau juga dengan udara tekan bebas air, minyak dan gas.
Larutan air pengencer harus dibuat langsung saat akan digunakan
Volume bibit mikroba yang ditambahkan bisa berdasarkan hasil uji glukosa – asam
glutamate yang menghasilkan hasil BOD 198 mg/ L ± 30.5 mg/L.
4. Larutan glukosa – asam glutamate : larutkan 150 mg glukosa dan 150 mg asam glutamat yang
masing – masing telah dikeringkan 1 jam pada 103C, dalam air dan encerkan hingga 1 L.
5. Larutan asam sulfat : encerkan 28 mL H2SO4 pekat dengan air sampai 1 L
6. Larutan NaOH : larutkan 40 gram NaOH dalam iar hingga 1 L.
7. Larutan Natrium Sulfit : larutkan 1.575 gram Na2SO3 dalam air hingga 1 L, disiapkan saat akan
digunakan.
8. Larutan nitrifikasi inhibitor Allylthiourea (ATU) : larutkan 2.0 gram ATU ( C4H8N2S) dalam air,
encerkan hingga 1 L, simpan pada suhu 4C, larutan ini stabil selama 2 minggu.
9. Larutan asam assetat glacial 1 : 1 : larutkan 250 mL asam assetat dengan 250 mL air.
10. Larutan KI 10 % : larutkan 10 gram KI dalam air hingga 100 mL.
11. Larutan indicator amylum : larutan 2 gram kanji, 0.2 gram asam salisilat dalam air panas 100
mL, aduk sambil dipanaskan sampai larut.

3. C. Alat :
1. Botol DO
2. Inkubator suhu 20C±1C.
3. Botol gelas 5 – 10 L
4. Pipet vol. 1.0 mL dan 10.0 mL.
5. Labu ukur 100, 200, 1000 mL
6. pH meter
7. DO meter terkalibrasi
8. Shaker
9. Blender
10. Oven
11. Timbangan analitik
D. Prosedur
1. Pengambilan contoh uji
Pengambilan contoh uji berdasarkan SNI 06.6989.57-2008 untuk sampel air permukaan dan
SNI 06.6989.59-2008 untuk sampel air limbah
2. Penyimpanan contoh
a. Contoh sesaat ( grab samples)
Suhu penyimpanan sample sesaat dapat dilihat pada table di bawah ini :
Lama penyimpanan sample Suhu penyimpanan
< 2 jam Tidak perlu pendingin
2 – 6 jam ≤ 4C
6 – 24 jam ≤ 4C dan catat lama waktu penyimpanan
> 24 jam Contoh tidak mewakili BOD
b. Contoh gabungan ( composit sample)
Selama pengumpulan, contoh disimpan pada suhu ≤4C. Batas periode pengumpulan
contoh maksimal 24 jam dari waktu pengambilan contoh terakhir. Gunakan criteria
penyimpanan contoh gabungan seperti pada penyimapan contoh sesaat.
3. Persiapan pengujian
a. Pengaturan pH
 Kondisikan sample pada suhu ± 20C
 Ukur pH sampel, atur pada pH 6 – 8 dengan penambahan H2SO4 atau NaOH
 Penambahan asam atau basa tidak boleh menyebabkan pengenceran > 0.5%.

4. b. Penghilangan zat pengganggu
Klorin sisa
 100 mL sample + 10 mL KI (10%) + 10 mL as.assetat (1:1) + beberapa tetes
amylum, jika berwarna biru titrasi dengan natrium sulfit sampai warna biru tepat
hilang. Catat pemakaian natrium sulfit ( a mL).
 100 mL contoh yang lain + a mL natrium sulfit, kocok dan biarkan 10 menit + 10
mL KI dan 10 mL as. Assetat, bila warna larutan berwarna biru titrasi larutan
dengan natrium sulfit sampai warna biru tepat hilang, catat volume natrium sulfit
( b mL).
 Ke dalam 100 mL sampel yang akan diuji BOD nya tambahkan a + b natrium
sulfit.
Toksik lain
 Bila sampel mengandung toksik lakukan pengenceran sesuai dengan table .2.
Hidrogen Peroksida
 Kocok smapel dalam wadah terbuka selama 1 – 2 jam lebih
 Hentikan pengocokan dan ukur DO sampel
 Biarkan sampel tanpa pengocokan selama 30 menit, ukur DO sampel< H2S
dinyatak telah hilang bila tidak ada peningkatan DO.
Oksigen terlarut jenuh
 Hilangkan kelebihan oksigen dengan cara pengocokan atau aerasi suhu 20C
± 3C.
c. Larutan glukosa – asam glutamate
 Kondisikan larutan glukosa – asam glutamate pada suhu 20C ± 3C.
 20 mL larutan glukosa – asam glutamate dalam labu ukur 1 L, encerkan hingga
1 L dengan air pengencer, aduk sampai homogen.
d. Larutan contoh uji/ sampel
 Kondisikan sampel pada suhu 20C ± 3C.
 Dalam labu ukur 1 L lakukan pengenceran dengan air pengencer tergantung
pada karakteristik sampel, pilih pengenceran yang dapat menghasilkan
penurunan DO minimal 2.0 mg/L dan sisa DO setalah inkubasi 5 hari 1.0 mg/L.
 Pengenceran sampel dapat berdasarkan table 2.

5. Tabel. 2
Jenis sampel Jumlah sampel (%) Faktor pengenceran
Limbah industri yang sangat padat 0.01 – 1.0 1000 – 100
Limbah yang diendapkan 1.0 – 5.0 100 – 20
Effluent dari proses biologi 5.0 – 25 20 – 4
Air sungai 25 - 100 4 -1
Sumber : APHA edisi ke 21
4. Pengujian
 Siapkan 2 botol DO (A1;A2), isi botol tersebut sampai meluap dengan larutan contoh uji,
tutup botol perlahan, hindari terbentuknya gelembung udara.
 Kocok botol, bilas dan tambahkan air aquadest pada sekitar mulut botol yang telah
ditutup.
 Simpan botol DO (A2) pada incubator suhu 20C± 1C selama 5 hari ± 6 jam.
 Ukur hasil DO pada botol A1 dengan alat DO meter atau dengan cara titrasi secara
iodometri (azide) – DO nol hari ( pengukuran tidak boleh lebih dari 30 menit setelah
pengenceran).
 Ukur pula hasil DO pada botol A2 setelah inkubasi 5 hari – DO 5 hari.
 Lakukan pula langkah – langkah di atas terhadap blanko air pengencer ( B1;B2) dan
kontrol standar larutan glukosa – asam glutamate (C1;C2).
 Lakukan kembali langkah – langkah di atas terhadap beberapa macam pengenceran
sampel uji.
Catatan I : untuk mencegah nitrifikasi pada sampel uji, maka harus ditambahkan 1 mL
larutan inhibitor / 1 L larutan pengencer.
Catatan II : oksigen terlarut yang dikonsumsi oleh mikroba dalam air pengencer selama
5 hari berkisar 0.6 – 1.0 mg/L.
Catatan III : frekuensi pengerjaan blanko dan kontrol standar dilakukan 5 – 10 % per
satu seri pengukuran, atau minimal 1 kali untuk jumlah sampel kurang dari 20.
E. Perhitungan hasil
BOD5 (mg/L) = (A1 – A2) - B1 – B2 x VC
VB
P
Dimana :

6. A1 : Kadar DO sampel uji 0 hari (mg/L)
A2 : Kadar DO sampel uji 5 hari (mg/L)
B1 : Kadar DO blanko 0 hari (mg/L)
B2 : Kadar DO blanko 5 hari (mg/L)
VB : Volume suspensi mikroba (mL) dalam botol DO blanko
VC : Volume suspensi mikroba (mL) dalam botol DO sampel uji
P : Perbandingan volume sampel uji (V1) dengan volume total (V2)
Catatan bila sampel uji tidak ditambahkan mikroba maka VB = 0
F. Pengendalian mutu
 Gunakan bahan kimia p.a
 Gunakan alat gelas yang bebas kontaminan
 Gunakan alat ukur yang terkalibrasi dan terverifikasi
 Dikerjakan oleh analis yang kompeten
 Gunakan aquadest yang bebas kontaminan, penurunan konsentrasi oksigen terlarut
maksimal < 0.4 mg/L dalam 5 hari.
 BOD5 kontrol standar larutan glukosa asam glutamate harus berkisar 198 ± 30.5 mg/L
dengan rumus sebagai berikut :
BOD5 (mg/L) = (C1 – C2) - B1 – B2 x VS
VB
P
Dimana :
C1 : Kadar DO control standar 0 hari (mg/L)
C2 : Kadar DO control standar 5 hari (mg/L)
B1 : Kadar DO blanko 0 hari (mg/L)
B2 : Kadar DO blanko 5 hari (mg/L)
VB : Volume suspensi mikroba (mL) dalam botol DO blanko
VS : Volume suspensi mikroba (mL) dalam botol DO control standar
P : Perbandingan volume control standar (V1) dengan volume total (V2)
Perbedaan nilai replikasinya (RPD) tidak boleh lebih dari 30 %, dengan perhitungan :
% RPD = Hasil pengukuran – duplikat pengukuran
( Hasil pengukuran + duplikat pengukuran ) /2
X 100 %

7. Pembuatan medium mineral :
a. Persiapan larutan induk
Buat 4 jenis larutan induk medium mineral dengan bahan kimia p.a, :
1. Larutan induk A
Larutkan 8.5 gram KH2PO4 + 21.75 gram K2HPO4 + 33.40 gram Na2HPO4.2H2O + 0.5 gram
NH4Cl dalam 1 L aquadest, atur pH sampai 7.4 ± 0.2 dengan penambahan HCL 0.1N atau
NaOH 0.1N.
2. Larutan induk B
Larutkan 27.50 gram CaCl2 atau 36.40 gram CaCl2.2H2O dalam 1 L aquadest
3. Larutan induk C
Larutkan 22.5 gram MgSO4.7H2O dalam 1L aquadest
4. Larutan induk D
Larutkan 0.25 gram FeCl3.6H2O dalam 1 L aquadest
b. Pembuatan medium mineral
 Masukan 10 mL larutan induk A ke dalam Erlenmeyer 2 L
 + 800 mL air, aduk sampai homogeny
 + larutan induk B; C; D masing – masing 1 mL, encerkan larutan sampai 1 L.
Catatan : untuk menghindari kontaminasi terhadap larutan induk, tambahkan 1 tetes HCl encer
atau 0.4 gram EDTA / 1 L larutan
Catatan : jika terbentuk endapan pada larutan induk, maka harus diganti dengan laruran baru
Perkiraaan Nilai BOD5 berdasarkan COD dalam penentuan volume sampel dan volume pengencer
Perkiraan nilai BOD5 Volume sampel Volume air pengencer
0 – 7 300 0
6 – 21 100 200
12 – 42 50 250
30 – 105 20 280
60 – 210 10 290
120 - 240 5 205
300 – 1050 2 298
600 - 2100 1 299

8. Bagan alir bibit mikroba
Lumpur Aktif
Tersuspensi
Partikel Kasar
saring
Endapan Cairan
Endapkan30 menit/
Sentrifuse 10menit
+ mediummineral
Larutan inokulum (TSS 3 – 5 g MLSS / L
Atau 107
– 108
sel /L
Supernatan
(sebagai inokulum mikroba
Endapan
Blender 2 menit sampai
homogeny, endapkan 30
menit
Bibit Mikroba
Aerasi sebelum digunakan