Menjelaskan elektroforesis

1. ELEKTROFORESIS
Hi!
Hello!

2. DISUSUN OLEH KELOMPOK 8
1. SITI LAILATUL ROHMA (190105094)
2. SITI MUAWANAH (190105096)
3. SRI WIDIANTI (190105098)
4. VIDIA PUTRI KUSUMANDARI (190105100)
5. YULI INDRI ASTUTI (190105102)
6. YUNITA DWI MEITASARI (190105104)

3. Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan
untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat,
asam amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala
preparatif. keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih
tinggi dari pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar
(Andreas Manz, et.al, 2010).
Definisi Elektroforesis
Gambar : prinsip pemisahan elektroforesis

4. Prinsip Kerja Elektroforesis:
 Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutan yang
mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel.
 Pada elektroforesis media pemisahnya berupa gel Agarosa atau lainnya yang memiliki tingkat
viskositas tinggi. Laju dalam elektroforesis sangat bergantung pada kekentalan medium (n), ukuran
atau bentuk (r), dan muatan molekul (q). Kekuatan asam pada medium juga mempengaruhi besar
muatan pada saat ionisasi berlangsung sehingga diperlukan larutan buffer untuk mengatasi
masalah ini. Dan juga perlu dilakukan analisis terhadap kemampuan media untuk memisahkan
molekul- molekul agar lebih efektif dan maksimal.
 Alat elektroforesis terdiri dari medium pemisah yang terhubung dengan dua elektroda dan kertas
saring. Media pemisah dapat berupa gel Agarosa, pati atau poliakrilamida. Media terdiri dari dua
bagian yang dihubungkan dengan sumbu asbes; satu bagian berisi elektroda platina dan yang lain
kontak dengan medium elektroforesis.

5. Komponen Elektroforesis
Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen utama dalam penggunaanya.
 Larutan elektrolit yang berfungsi sebagai pembawa komponen. Umumnya
berupa larutan buffer dengan pH tertentu sesuai dengan karakteristik
senyawa yang akan dipisahkan.
 Media pemisah merupakan tempat proses pemisahan terjadi. Media
pemisah ini berupa kertas (selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji, gel
polikrilamid, busa poliuretan atau agar-agar.
 Yang paling penting adalah elektroda yang berfungsi sebagai penghubung
arus listrik dengan media pemisah dan baterai atau arus listrik sebagai
sumber energi (source) pada rangkaian alat.

6. Penggunaan Medium Pemisah
Ada dua medium yang sering digunakan dalam menggunakan elektroforesis yaitu :
1. Gel Agarosa, merupakan metode standar untuk mengidentifikasi serta memurnikan fragmen-
fragmen Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) dan Ribose Nucleic Acid. Senyawaan tersebut merupakan
pembawa genetika pada makhluk hidup-dilakukan pada medan listrik horizontal.
 Kelebihan : lebih mudah, sederhana dan laju pemisahannya lebih cepat membentuk
fragmen- fragmen dan tidak bersifat toksik.
 Kelemahan : memiliki sensitifitas tinggi dan mudah rusak sehingga memerlukan ketelitian
dan kehati-hatian pada proses pengerjaannya.
2. Gel poliakrilamida. Gel ini memiliki memiliki resolusi tinggi pada hasil pemisahannya.
Membutuhkan tegangan listrik yang tinggi pada pengerjaannya dan dilakukan pada medan
listrik vertical. Persiapan pengerjaan membutuhkan waktu relatif lama, mahal dan memiliki laju
pemisahan yang lebih lambat dibandingkan gel Agarosa (Rita Elfianis)

7. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Elektroforesis
Ada beberapa faktor penentu lainnya yang dapat
mempengaruhi proses pemisahan yaitu :
1. Sampel.
2. Larutan Buffer.
3. Medan listrik.

8. SDS-PAGE
 SDS-PAGE merupakan suatu teknik elektroforesis yang menggunakan polyacrylamide sebagai bahan
pemisah. SDS-PAGE banyak digunakan dalam praktikum biologi molekuler, genetik, biokimia, dan
biomedik. SDS-PAGE biasanya digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan sifat electrophoretic
mobility (pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dan
berat molekulnya (BM) dalam sebuah medan listrik)
 Prinsip kerja dari SDS-PAGE adalah ketika protein dipisahkan oleh elektroforesis melalui matriks gel dan
arus listrik diberikan, protein dengan molekul yang lebih kecil bermigrasi lebih cepat sedangkan molekul
yang lebih besar akan tertahan akibat pergerakan yang lebih lambat.
 Langkah SDS-PAGE
1. Pembuatan gel pemisah (separating gel)
2. Pembuatan gel pengumpul (stacking gel atau upper gel)
3. Pemanasan sampel
4. Dilarutkan. Runing pada plate 1 dengan arus 28A dengan tegangan 110V dan pada plate 2 dengan
arus 30A dan tegangan 130 V.
5. Gel direndam dalam larutan staining untuk proses pewarnaan selama 20 menit
6. Gel direndam dalam larutan destaining (Penghilangan warna) untuk proses pencucian 20 menit

9. Lanjutan
 Persiapan Gel
 Pewarnaan Gel
 Gel Media
 Aliran elektroosmotik

10. Instrumentasi Elektroforesis
a. Elektroforesis Gel
 komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel. pemisahan dapat dilakukan secara vertikal atau
horizontal.
 Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit.
 Untuk pemisahan vertical, Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi kepadatan tinggi untuk
mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper reservoir
 Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue memastikan lebih
direproduksi separatios
b. Visualisasi Dan Deteksi
Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan pewarnaan dengan warna,
pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly digunakan adalah coomassie brilian biru. gel
direndam dalam larutan alkohol asam ini temperatur tinggi pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam,
pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh jumlah mencuci langkah. Deteksi batas untuk protein berkisar
sekitar 100 ng ke 1. pewarnaan perak lebih sensitif dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip
dengan protografhy

11. Lanjutan
c. Metode Gel Elektroforesis
 Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS –PAGE)
Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran protein dan
berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya deterjen anionik natrium
dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan protein pada
temperature 950C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing seperti ᵝmercapto
etanol. Hasilnya lengkapdiperoleh terjadi pada struktur sekunder dan tersier. Molekul melintang
melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asamamino
 Isoelektrik Focussing(IEF)
Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic seperti protein atau
peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk pemisahan dan pemurnian
protein peptida dan asam amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose dan PA
keduanya digunakan pada metode IEF.

12. Lanjutan
 Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)
Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal. Bagian yang satu
akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya yang lain akan terpisah sama
dengan yang pertama. Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau asam nukleat dapat
dipisahkan dengan resolusi yang tinggi.Hasil fingerprint dapat dibandingkan dengan database
elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk mereproduksi dan metode ini secara teknis
menantang membutuhkan pengalaman personil dalam operasi.

13. Kelebihan Dan Kekurangan Dalam Elektroforesis
 Kelebihan :
Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sederhana, digunakan untuk
memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan
karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana.
 Kekurangan :
Memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah, waktu pemisahan yang relative
lama, dan berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena
kuat arus searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan
tegangan listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan noda
hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan
.tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis menjadi
tidak terlalu jelas .memisah.

14. Penelitian Penggunaan Elektroforesis
 Hermanto S., et al (2014) melakukan penelitian tentang penggunaan metode SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly
Acrylamide Gel Electrophoresis) bertujuan untuk mengidentifikasi sumber gelatin yang digunakan pada kapsul keras. Hal
ini merujuk pada penggunaan gelatin sebagai salah satu bahan utama sistem pengiriman (delivery) obat medis atau
farmasi.
 Kolagen tulang sapi dan lemak babi merupakan salah satu sumber penghasil gelatin. Dengan ada penelitian tersebut dapat
dilakukan pemerikasaan terhadap kehalalan suatu produk yang memanfaatkan metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl
Sulphate Poly Acrilamide Gel Elektrophoresis).
 Tahap awal penelitian dilakukan optimasi terhadap standar gelatin sapi dan babi yang dihidrolisis dengan pepsin pada pH
4.5 dan suhu 60 oC selama 1 jam, 2 jam dan,3 jam. Gelatin yang dihasilkan hidrolisis selanjutnya dianalisis dengan SDS-
PAGE untuk menentukan waktu hidrolisis optimal. Kemudian identifikasi gambaran gelatin hidrolisat dibandingkan
berdasarkan perbedaan bobot molekulnya.
 Hasil penelitian yang diperoleh kemudian diaplikasikan terhadap indikasi sumber gelatin pada beberapa sampel kapsul
keras yang diperoleh dari pasaran dan dibandingkan dengan kapsul keras gelatin hasil simulasi. Hasil hidrolisis optimum
selama 3 jam menunjukkan adanya pitapita spesifik pada gelatin sapi dengan bobot molekul 15 kDa; 18,5 kDa; 33 kDa dan
47 kDa serta pita spesifik pada gelatin babi dengan bobot molekul 12,8 kDa; 17,3 kDa, 23,7 kDa dan 37 kDa. Hasil yang
sama diperoleh pada kapsul keras sampel dengan pita-pita gambaran protein yang identik dengan standar gelatin sapi.
Hasil analisis yang diperoleh menunjukkan ketiga sampel yang diuji diduga merupakan kapsul yang terbuat dari gelatin
sapi.

15. Jurnal kedua yang kami ambil dari Lutfi Andre, et al (2016)
berjudul “Pemanfaatan Nata de Coco sebagai Media Gel
Elektroforesis Pada Zat Warna Remazol : Pengaruh pH, Waktu
dan Aplikasi Pemisahan Gelatin”
 Pada penelitian ini, diamati pengaruh pH larutan buffer, waktu elektroforesis dan aplikasi
pemisahan gelatin menggunakan elektroforesis dengan media nata de coco. Nata de coco yang
berumur 4 hari memiliki ketebalan yang sesuai yaitu 0,454 cm dan waktu inkubasi yang tidak
terlalu lama sehingga umur tersebut digunakan dalam penelitian ini.
 Pada pengaruh pH dinyatakan dengan kekuatan ion, dimana semakin besar kekuatan ion
larutan, maka semakin jauh jarak migrasi remazol. Lama waktu elektroforesis mempengaruhi
jarak migrasi remazol Kondisi optimum elektroforesis gel menggunakan nata yang didapat,
digunakan untuk uji pemisahan gelatin menggunakan pewarna remazol turquoise dan
didapatkan dua pita pemisahan dengan jarak pita masing-masing 2 cm dan 3,6 cm.

16. Hasil yang diperoleh pemanfaatan gel nata de coco sebagai media dalam
proses gel elektroforesis telah dilakukan. Berdasarkan hasil pengamatan
dan data yang diperoleh menunjukkan kesimpulan bahwa gel nata de coco
dapat digunakan sebagai gel dalam proses gel elektroforesis dengan kondisi
sebagai berikut :
1. Umur nata de coco yang dapat digunakan minimal umur 4 hari.
2. Nilai pH larutan buffer fosfat tidak memberikan pengaruh terhadap migrasi
remazol, melainkan yang mempengaruhi adalah kekuatan ionnya, dimana
semakin besar kuat ion maka semakin jauh jarak migrasi remazol.
3. Semakin lama waktu elektroforesis, semakin jauh jarak migrasi yang ditempuh
remazol.
4. Pemisahan gelatin menggunakan pewarnaan remazol turquoise blue
menghasilkan 2 pita pemisahan dengan jarak pemisahan 2cm dan 3,6cm.

17. Jurnal ketiga yang kami ambil dari Wery Aslinda1 dan Ahyar
Ahmad (2016) berjudul “Isolasi dan Karakterikasi Agarosa dari
Makroalga Merah Euchema Cottoni untuk Pemisahaan Fragmen
DNA”.
 Agarosa telah diisolasi dari makroalga merah Euchema Cottoni yang terdapat di perairan Takalar. Agarosa ini
dikarakterisasi berdasarkan persen rendamen, sifat-sifat fisiknya dan dianalisa dengan spektrofotometer IR.
Sifat-sifat ini dibandingkan dengan produk agarosa komersial Takara, Japan dan ditemukan bahwa agarosa yang
diisolasi dari E. Cottoni menunjukkan hasil yang relatif sama dengan agarosa komersial.
 Berdasarkan hasil isolasi agarosa dari makroalga, kandungan sulfatnya sebesar 0,26%, titik leleh sebesar 96 0C,
dan viskositas sebesar 14 cps. Agarosa ini kemudian diaplikasikan untuk pemisahan fragmen DNA dengan hasil
menunjukkan kualitas pemisahan dan ketajaman pita yang kurang baik jika dibandingkan dengan agarosa
komersil.
 Hasil yang diperoleh berdasarkan hasil elektroforesis sampel DNA Ladder dengan menggunakan agarosa yang
diisolasi dari makroalga E. Cottoni menunjukkan hasil elektroforesis yang tidak terlalu jelas pemisahan setiap
pita DNA sehingga sulit dalam pembacaan pita DNA itu sendiri dan berdasarkan hasil perbandingan analisis
DNA pada elektroforesis menggunakan agarosa makroalga E. Cottoni dengan agarosa komersil (Takara, Japan),
menunjukkan hasil kualitas pemisahan dan ketajaman pita yang kurang baik pada makroalga E. Cottoni jika
dibandingkan dengan agarosa komersil (Takara, Japan) sehingga belum dapat diaplikasikan langsung dalam
analisis dan pemisahan pita-pita DNA.

18. TERIMA KASIH