Dokumen tersebut membahas tentang elektroforesis zona, yang merupakan teknik bioanalitik untuk memisahkan dan mengidentifikasi biomolekul berdasarkan perbedaan muatan dan ukuran molekulnya di bawah pengaruh medan listrik. Dokumen tersebut menjelaskan prinsip, jenis media, faktor yang mempengaruhi, dan aplikasi dari teknik elektroforesis zona ini.

1. BIOANALITIK
Jurusan KIMIA FMIPA INSTITUT PERTANIAN BOGOR13 Sep 2016
ELEKTROFORESIS
ZONA

2. Kelompok 1
 Marlon Benu (G451160061)
 Lusi Aferta (G451160161)
 Faradisa Anindita (G451160261)
 Septia Wahyu Elda (G451160091)

3. Elektroforesis Zona
1. Definisi dan Sejarah
2. Prinsip elektroforesis
3. Instrumentasi
4. Faktor yang
mempengaruhi pemisahan
• Elektroforesis kertas dan
selulosa asetat
• Elektroforesis gel pati
• Elektroforesis gel
poliakrilamida
• Elektroforesis gel agarosa
• Elektroforesis gel agarosa-PA
5. Elektroforesis Zona
6. Aplikasi elektroforesis
zona

4. Sejarah dan Definisi
Arne Tiselius
Swedia 1902-1971
Father of Electrophoresis
The Nobel Prize in Chemistry 1948
Untuk penelitiannya pada analisis elektroforesis dan adsorpsi,
khususnya penemuannnya mengenai sifat kompleks pada protein
serum.
Serum kuda pada pipa U dipisahkan dengan elektroforesis
menghasilkan 4 pita yang terpisah dengan baik yang terdiri atas
albumin dan 3 globulin yang diberi nama “α”, “β” dan “γ”

5. Definisi elektroforesis
 Alat bioanalitik pada penelitian dasar dan diagnosa
untuk isolasi dan identifikasi biomolekul dengan BM
yang tinggi (Mikkelsen, RS. & Corton, E. 2004)
 Suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi campuran
berdasarkan atas pergerakan partikel-partikel koloid
yang bermuatan, dibawah pengaruh medan listrik
(Bintang, Maria. 2010).
 Digunakan untuk memisahkan dan menentukan berat
molekul, mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein
atau asam nukleat, dan menetapkan titik isoelektrik
(Bintang, Maria. 2010).

6. Perkembangan teknik
elektroforesis
 1930 : Pipa U Tiselus
 1937 : Elekroforesis kertas disarankan oleh P Koning diaktualkan 1948 oleh E Fisher
 1939 : Elektroforesis zona dikembangkan
 1955 : Gel pati (Smithies)
 1957 : Selulosa asetat (J Kohn)
 1959 : PAGE (Raymond & Weintraub)
 1961 : IEF (Svensson)
 1964 : Disc gel electrophoresis (Ornstein & Davis)
 1969 : SDS electrophoresis (Beber & Osborn)
 1971 : Gel selulosa asetat (Meera)
 1975 : Elektroforesis 2 Dimensi
 1977 : sekuensing gel digunakan
 1979 : gel agarosa
 1983 : pulsed field electrophoresis
 1983 : capillary electrophoresis

7. 1. Prinsip Elektroforesis
Metode
Pemishan
Anion
Kation
Perbedaan
muatan pada
ion
Anoda
Katoda
Media Pemisahan
pH
Berat/ukuran Molekul
Tegangan Listrik
Faktor Pendukung
Berat dan
ukuran Molekul

8. Media
Perpindahan
Padat
Gel
Kertas saring &
Selulosa Asetat
Agarosa, dll
pH Buffer
Mempertaankan
pH
Ukuran Molekul
Ukuran Molekul harus sesuai dengan
besar pori pada media perindahan
Tegangan
Listrik
Proses
Elektroforesis
Pengontrolan Arus

9. PRINSIP ELEKTROFORESIS
PRINSIP PEMISAHAN :
- Menurut muatan partikel
- Menurut ukuran partikel

10. (1) Menurut Muatan Partikel
Ketika molekul
bermuatan ditempatkan
dalam medan listrik,
mereka bermigrasi ke
arah kutub baik positif
(anoda) atau negatif
(katoda) sesuai dengan
muatannya.

11. (2) Menurut Ukuran Partikel
Katode
Anode
45kD 10kD 25kD

12. Larutan garam
+ -
2H2O  O2 +4H+ + 4e-
2H2O +2e-
 H2 +2OH-
+ -
+- penyangga
Konduktivitas
rendah
Perbedaan Elektrolisis dan
Elektroforesis

13. PRINSIP
qE = fv
 q: muatan partikel dalam medium insulating
 f: koefisien friksi (gesekan)  dalam vakum =
0
 v: kecepatan partikel
 = v/E = q/f
 : mobilitas elektroforetik
 Bergantung pada medium penyangga, pH,
kekuatan ionik dan temperatur

14. Instrumentasi
Catho
de
Electrophor
esis tank
Paper
support
medium
Alat elektroforesis gel Alat elektroforesis kertas

15. Medium
 Kertas  kertas selulosa asetat  gel
 Fungsi :
- reseptor spot/pita dari zat-zat terlarut
- menyediakan jalur migrasi
 Medium berbeda : efektivitas pemisahan
berbeda bergantung sifat zat yang dipisahkan

16. Bufer
 Fungsi :
- Membawa arus yang diberikan  jembatan konduksi
- menyediakan Ph
- Menentukan muatan dari zat terlarut
 Kekuatan ionik buffer
- kekuatan tinggi  pita yang tajam
- kekuatan tinggi  panas lebih tinggi
 Bufer yang biasa digunakan
- bufer barbital & Tris-EDTA untuk protein
- tris-asetat-EDTA & tris borat-EDTA

17. Deteksi
 Dengan pewarnaan:
- Prinsip : diberi perreaksi spesifik
- cara : disemprot, diuapi, direndam, dll
- kadang perlu menghilangkan warna background pada
medium dengan destaining.
 Tanpa pewarnaan:
- deteksi dengan UV
- densitometer/scanner
 Indetifikasi
- mengukur jarak tempuh komponen  Rf
- Spot dengan Rf/jarak tempuh yang sama dengan standar
dianggap sebagai senyawa yang sama

18. Faktor yang mempengaruhi laju
migrasi muatan molekul
• pH• Sifat
• Ukuran pori
• intensitas• Muatan
• Ukuran
• Bentuk
Molekul
Medan
listik
Buffer
Media
penyangga

19. Jenis Elektroforesis
Moving Boundary Zone (berbata
(batas bergerak)
PaperGel
Polyacryalmide Agarose
Non Dissociating
(Native-PAGE)
Dissociating
(SDS-PAGE)
Agarose-PA

20. Elektroforesis Kertas
 Diperkenalkan 1950 untuk pemisahan protein (kertas
selulosa)
 Berperan pada pemisahan protein atas dasar mobilitasnya
pada pH tertentu.
 Menggunakan kertas saring sebagai medium penyangga
 gugus OH pada kertas dapat berinteraksi dengan sampel
menyebabkan pita berekor

21. Elektroforesis Kertas
 Teknik pengerjaan mirip dengan kromatografi kertas
 Aplikasi contoh :
- cara kering :
• seperti kromatografi kertas
• resolusi spot lebih baik karena lebih kecil
• belum ada jembatan konduksi
- Cara basah :
• Kertas dibasahi dengan bufer lalu contoh ditetesi
• Spot lebih lebar
• Sudah ada jembatan konduksi
 Hanya untuk molekul kecil yang mobilitasnya kecil  perlu potensial
tinggi (+200volt/cm)panas meningkat
 Efek elektroosmotik tinggi
 Efek difusi besar

22. Selulosa Asetat
 1957: Kertas selulosa asetat
 Lebih cepat, meningkatkan resolusi dan sedikit
berekor, background warna lebih sedikit
dibanding kertas
 Lebih transparan, dapat digunakan dengan
deteksi optikal, mudah dilarutkan dalam
berbagai sampel, baik untuk isolasi

23. Elektroforesis Gel Pati
 gel pertama yang digunakan (1958)
 Pati kentang dipanaskan hingga menjadi
campuran homogen dan transparan. Larutan
panas diletakkan pada cetakan dan dibiarkan
pada suhu ruang hingga menjadi gel semisolid
 Permukaan gel ditutup dengan lilin atau
grease dan ujungnya diberi sumbu untuk
menghubungkan dengan elektroda
 Pergerakan dalam gel pati ditentukan oleh
muatan total dan ukuran molekul

24. Gel Pati
 memiliki efek pengayakan 
 molekul kecil cenderung bergerak dibandingkan yg besar.
 dikontrol oleh ukuran pori gel ukuran pori gel pati sangat
beragam
 memiliki muatan negatif pada rantai ujung (karboksilat)
berinteraksi dengan protein dan menutupi pergerakan
oleh mekanisme pertukaran ion
 kertas maupun pati memiliki sifat elektroforetik dan
kromatografi
 Elektroosmosis: muatan positif bufer bergerak ke
katoda
 pergerakan sampel dalam gel: penjumlahan migrasi
elektroforetik dan elektroosmotik.
 Efek elektroosmotik: ditentukan dengan blue dextran
setelah elektroforesis dan subtractied dari pergerakan
yang ditentukan.

25. Gel Poliakrilamida
 PAGE menggantikan gel pati untuk memisahkan protein,
fragmen RNA yg kecil, dan fragmen DNA yg sangat kecil.
 Lebih fleksibel daripada pati karena memiliki efek pengayakan
yang ditentukan oleh konsentrasi gel, tidak ada efek adsorpsi
protein pada gel
 Inisiator: amonium persulfat/kalium persulfat
 Katalis: tetrametiletilendiamina (TEMED, (CH3)2N(CH2)2N(CH3)2).
Konsentrasi monomer rendah memerlukan TEMED konsentrasi
tinggi

26. Gel Poliakrilamida
 Pewarna pelacak: bromfenol biru (anion) atau metilena biru
(kation)
 Bufer dibuat dalam keadaan dingin selama pemisahan
 Protein diendapkan pada tempatnya setelah pemisahan selama
peremndaman dalam larutan asam trikloroasetat (TCA) lalu
diwarnai untuk deteksi
 Apa perbedaan PAGE (PolyacrylAmide Gel
Electrophoresis)dalam bentuk kolom dan bentuk slab?

28. Gel Akrilamida
 Komposisi gel ditentukan oleh %T dan %C
 %T = bobot (g) monomer + cross-linker/100mL
 %C = 100 x (g cross-linker)/(gram monomer +
cross-linker)
 Rf = jarak protein/jarak marker
 Log Rf vs %T
 SDS-PAGE: standar protein

29. SDS PAGE
 Sodium Dodesil Sulfat (SDS) : Detergen
 Bagian hidrofobik bereaksi dengan protein
dengan perbandingan teraktur
 Protein membawa muatan SDS dengan Mr
berbeda  sampel memiliki muatan sama
tetapi berbeda Mr-nya.
 U=
𝑧𝑒
6𝜋𝜂
3𝑀𝑟.𝑉
4𝜋𝑁𝑜
−1
3
= kz𝑀𝑟
−1
3

30. SDS PAGE

31. Gel Agarosa
 Digunakan awal 1970
 Polimer linear D-galaktosa dan 3,6-anhidrogalaktosa yang
diisolasi dari rumput laut
 Mengandung kurang dari 0.04% sulfat
 Gel terbentuk oleh ikatan hidrogen
 Ukuran pori lebih besar dari pada gel poliakrilamida
 Digunakan dalam bentuk slab untuk horisontal dan vertikal
 Relatif lebih mudah pecah
 Mengandung gugus bermuatan: sulgat, dan karboksilat 
berinteraksi dengan protein efek penukar ion &
elektroosmosis
 Pretreatmen dalam larutan alkali  hidrolisis gugus
bermuatan meningkatkan efek penyaringan
 Viskositasnya sangat dipengaruhi oleh suhu
 Banyak digunakan untuk pemisahan DNA

32. Gel Agarosa
 Digunakan untuk memisahkan fragmen-
fragmen DNA yang ukurannya memiliki
rentang beberapa ratus hingga sekitar
20.000 kb.
 Bersifat tidak toksik
 Pada konsentrasi 1% w/v gel dalam bufer
yang mengandung air dalam kadar tinggi,
struktur seratnya baik, ukuran porinya besar,
dan tahan terhadap gesekan.
 Proses elektroforesis sangat cepat,
khususnya pada pemisahan makromolekul.

33. Gel Poliakrilamida-agarosa
 Komposit gel poliakrilamidan dan agarosa 
meningkatkan ukuran pori gel dengan
kekuatan mekanik yang lebih baik
 Baik untuk asam nukleat, nukleoprotein,
protein

34. Pengaruh Kondisi Permisahan
dalam Elektroforesis
 Tegangan  Temperatur: perlu pendingin
 Difusi
 pH bufer  untuk nilai pH di bawah nilai titik
isoelektrik (pI), protein dapat bermuatan positif
dan akan bergerak mendekati katoda (negatif).
Jika pH > pI, protein akan memiliki muatan negatif
dan bergerak mendekati anoda (positif)
 Konsentrasi bufer  kekuatan ionik. Interaksi
antara spesi gugus permukaan yang bermuatan
dengan ion buffer menghasilkan ion atmosfer.
Keduanya bermuatan dan mobilitasnya
mempengaruhi kekuatan ion dan analit protein.

35. Pewarnaan

36. Beberapa pereaksi pewarna
Pereaksi Senyawa yang dideteksi
Amino black 10B Protein
Coomassie blue Protein
Silver nitrat Protein
Etidium bromida DNA dan RNA
Sudan black Lipid dan lipoprotein
Schiff-periodic acid Karbohidrat dan glukoprotein
Ninhydrin Asam Amino

37. Southern Blot
 Diperkenalkan oleh EM Southern (1975)
 Memindahkan DNA dari agarose ke
nitroselulosa atau membran nilon untuk
deteksi setelah agarosa direndalam dalam
larutan denaturasi (NaCl dan NaOH) untuk
merusak pasangan basa.

38. Northern Blot
 Memindahkan RNA dari agarosa ke membran
nitroselulosa
 Denaturasi menggunakan metil merkuri
hidroksida, glioksal, atau formaldehida karena
NaOH dapat menghidrolisis RNA pada posisi
OH 2’

39. Western Blot
 Mentransfer protein dari gel ke membran
nitroselulosa

40. Deteksi fragmen DNA pada
membran dengan DNA Probes

41. APLIKASI ELEKTROFORESIS
ZONA
 Penentuan Muatan dan Bobot Molekul Protein
dengan PAGE

42. Penentuan BM DNA dengan gel
agarosa

43. Identifikasi Isoenzim

44. Diagnosis Penyakit

45. Imunoelektroforesis

46. APLIKASI PADA
JURNAL

47. Identifikasi Isolat Bakteri Asam Laktat
dari Usus ikan Bandeng ( Chanos
- chanos ) yang Potensial aktifitas
terhadap Bakteri Patogen
menggunakan metode PCR 18s
rRNA
Ringkasan
Penelitian ini bertujuan untuk
mengidentifikasi bakteri asam laktat
dari usus ikan bandeng (Chanos
chanos) yang mempunyai potensial
aktifitas terhadap bakteri patogen
menggunakan metode PCR 18s
rRNA. Bakteri asam laktat diisolasi
menggunakan media selektif MRS
agar untuk bakteri asam laktat.
Identifikasi isolat PCR 18S rRNA
dan metode sequencing dari isolasi
DNA , amplifikasi DNA
menggunakan PCR , visualizasi
DNA dari amplifikasi dengan
elektroforesis , Basic Local
Alignment Search Tool ( BLAST )
dan tree view program . Dari
analisis PCR dan tree view program
, BAL adalah Lactobacillus
acidophilus dengan strain ATTC
4796 .

48. Bakteri asam laktat ( BAL ) yang dikenal sebagai
mikroorganisme yang memiliki sifat probiotik . Mereka
dapat menghasilkan senyawa penghambat seperti asam
laktat , hidrogen peroksida , diasetil , asetal dehyde dan
bakteriosin . Senyawa ini mampu menghambat
pertumbuhan mikroorganisme berbahaya
 Bandeng yang berkembang biak di perairan payau memiliki
karakteristik bertubuh ramping , sirip bercabang , sisik
berdaging seperti kaca dan putih . Ini memiliki keunikan ,
yang mulutnya ompong dan dasar rumput laut konsumsi
makanan . Selain itu , panjang usus dari bandeng 9 kali
lebih panjang dari panjang tubuh ( Murtidjo [ 4 ] ) . Dalam
usus panjang , ada berbagai jenis bakteri termasuk bakteri
asam laktat ( BAL ) , yang membantu proses pencernaan
makanan . BAL juga berfungsi bakteri antagonis terhadap
bakteri patogen . Bakteri asam laktat dapat diisolasi dan
diuji aktivitas antagonis terhadap bakteri patogen dan
dapat dikembangkan sebagai antibiotik baru .
 Urutan gen rRNA 16s adalah teknik molekuler untuk
mengidentifikasi mikroorganisme hingga tingkat spesies .
Metode ini telah dianggap sebagai salah satu alat canggih
ditingkat molekuler untuk mengidentifikasi bakteri yang
diisolasi . analisis 16S rRNA telah memfasilitasi studi
populasi mikroba tanpa budidaya berdasarkan penilaian
kuantitatif darikeanekaragaman mikroba saat ini (
Subramani , Aalbersberg [ 9 ] ) .Tujuan dari penelitian ini
adalah untuk mengembangkan PCR 18s rRNA untuk
secara bersamaan mendeteksi spesies Lactobacillus
dalam reaksi tunggal .

49.  Penelitian ini menggunakan bakteri
asam laktat isolat potensial
biopreservatif dari Kabupaten
Pohuwato yang dibudidayakan di
Deman ROGOSA tajam ( MRS ) Agar
di 35oC selama 24 jam , reagen PCR :
campuran deoxyribonucleotide trifosfat
( dNTP ) , Larutan penyangga , LA Taq
, primer 1141R Dan 765R , dH2O , Big
Dye Teminator , gel agarosa ,
penyangga TAE ( 1x ) Merck 106.023 )
, DF penyangga ( Merck.71340 ),
mencuci penyangga , lotion penyangga
, SYBR aman, EDTA ( Merck.324503 )
, natrium asetat ( Merck . 106.268 ) ,
etanol ( Merck.104025 ) , Alkohol 70 %
( Merck.117946 ) . Mesin peralatan
PCR Thermal cycler Takara , Machin
elektroforesis , UV transluminator Gel
Doc Sys - Vilber Loumart , sequensing
ABI 3130 XL Genetik Analyzer.

50.  penelitian Penentuan
spesies Lactobacillus
itu dipermormed
isolasi total genom DNA
, DNA amplifikasi ,
elektroforesis ,
pemurnian gel
elektroforesis,
sequencing siklus PCR
, pemurnian siklus
sequencing ,
sequencing dan Search
Dasar Lokal Aligment
Tool ( BLAST ) dan
Pohon tampilan

51. Elektroforesis
Disiapkan gel agarosa 1%, 0,25 g dilarutkan
dalam 25 penyangga agarose TAE (1x) dan
kemudian dipanaskan untuk melarutkan
agarosa. Didinginkan sampai suhu 450C
ditambahkan 0,25 uL SYBR kemudian
dituangkan ke dalam cetakan dan didiamkan
sampai gel mengeras.elektroforesis; Produk
PCR kemudian diperiksa dengan
elektroforesis.Elektroforesis dilindungi di TAE
penyangga (1x). Sebanyak 50 uL PCR produk
dan 6x memuat dye 10 uL homogen dengan
cara memipet 2-3 kali dan kemudian dimasukkan
ke dalam pipet dan gel dengan hati-hati. Loading
dye berfungsi untuk meningkatkan densitas
sampel sehingga tidak keluar dari sumur dan
sampel berwarna untuk memudahkan
pengamatan proses migrasi saat itu. Juga
dimasukkan ke dalam gel sumur lain sebagai
pembanding (penanda) 4μL 1 Kb DNA Ladder
campuran fermentas Gen Ruler DNA untuk
memfasilitasi penentuan ukuran DNA.
Elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 volt
selama 25 menit, maka hasil elektroforesis gel
diperiksa lebih lanjut oleh transluminator UV dan
difoto untuk dokumentasi. Kemudian pita DNA
muncul pada 600 pasangan basa yang dipotong
memasuki tahap pemurnian.

52. Pemurnian Gel Elektroforesis
Memurnikan Gel Elektroforesis dengan
Fragmen Ekstraksi GeneAid Gel / PCR
DNA Kit DF penyangga gel
menambahkan Potongan dari 300 uL ,
diinkubasi pada 600C selama 15 menit
pada blok panas sampai gel kemudian
dispindown larut dan kemudian
dimasukkan ke dalam kolom filter dan
disentrifugasi pada 13000 x g selama 1
menit . Kemudian supernatan dibuang ,
dan kemudian menambahkan 600 mL
mencuci penyangga ke dalam kolom filter
kemudian disentrifugasi pada 13000 xg
selama 1 menit , lepaskan supernatan
dan sentrifugasi dalam kolom kosong
untuk menghilangkan sisa mencuci
penyangga di 13000 xg selama 3 menit
dan kemudian memindahkan kolom filter
ke eppendorf baru dan ditambahkan
larutan 40 mL lotion penyangga dan
diinkubasi selama 5 menit pada suhu
kamar . saat itu disentrifugasi pada 13000
x g selama 2 menit . Hapus kolom filter.
Menyimpan supernatan pada suhu 40 c.

53.  Elektroforesis
Hasil amplifikasi DNA
menggunakan 1141R
primer dan 765R
menghasilkan DNA
fragmen yang sangat
jelas dengan ukuran
sekitar 597 pasangan
basa diperiksa dengan
elektroforesis yang
salah satu teknik
utama dalam biologi
molekuler.

55. Sebagai kesimpulan
penelitian ini telah
berhasil diidentifikasi
berdasarkan 16S
rRNA analisis urutan
gen dari isolasi
Bakteri Asam Laktat
dari usus bandeng
sebagai
Lactobacillus
acidophilus
ATTC4796 ( 98 %
kesamaan ) .

56. Buku Acuan
 Meloan CE. 1999. Chemical Separations:
Principles, Techniques and Experiments.
Canada, John Willey & Sons.
 Mikkelsen, RS. & Corton, E. 2004.
Bioanalytical Chemistry. Canada, John Willey
& Sons.
 Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik
Penelitian. Erlangga. Jakarta.

57. TERIMA KASIH