Praktikum elektroforesis SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran molekulnya. Mahasiswa menganalisis sampel enzim pepsin dengan berbagai konsentrasi dan menghitung berat molekul protein berdasarkan jarak migrasinya di gel. Hasilnya menunjukkan bahwa semua sampel memiliki berat molekul yang sama karena menghasilkan garis lurus, menandakan sampel yang sama yaitu enzim pepsin.

1. BAB V
PEMBAHASAN
Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami, mengetahui dan
mampu melakukan elektroforesis SDS PAGE dan dapat menentukan ukuran suatu protein
tertentu yang akan dilakukan pada praktikum ini. secara singkat Elektroforesis adalah sebuah
metode untuk separasi atau pemisahan sebuah molekul besar (seperti protein, fragmen DNA,
RNA dll) dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan
komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah
medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
padamakromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan
negatif dilewatkan melalui suatu medium (misal agarosa), maka molekul tersebut akan bergerak
dari muatan negatif menuju muatan positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada
rasio muatan terhadap massanya dan bentuk molekulnya (Yuwono, 2008).
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan
melalui suatu medium, misalnya gel agarose atau poliakrilamid, kemudian dialiri arus listrik dari
satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut
(Yuwono, 2005).
Terdapat dua macam elektroforesis yang berkembang yakni diantaranya adalah
elektroforesis kertas dan elektroforesis gel.
Elektroforesis Kertas: merupakan jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam
dan partikel bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion kompleks) sebagai fase gerak. Pemisahan
tersebut terjadi karena adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan
partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan
yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya absopsi zat terlarut
(Boyer, 2004). Elektroforesis Gel: merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase
diam untuk memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita yang
masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang sama. Elektroforesis gel
merupakan teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada

2. makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu dengan tenaga listrik.
Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah
pengaruh medan listrik. Media atau gel yang dapat digunakan yaitu agarose gel (elektroforesis
DNA) dan poliakrilamid gel (elektroforesis protein). Laju pergerakan molekul dipengaruhi oleh
ukuran molekul, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan
larutan buffer elektroforesis (Martin, 2006).
Pada percobaan Elektroforesis SDS-PAGE, alat yang digunakan antara lain: seperangkat
alat elektroforesis, kaca load, comb (sisir), mikropipet, mikrotip, beaker glass, timbangan
analitik, spatula, tube elektroforesis, kompor listrik, kuvet, dan spektrometer. Sedangkan bahan
yang digunakan antara lain: aquades, akrilamid, LGB (Lower Gel Buffer), TEMED (Tetra Etil
Metil Ethilene Diamine, APS (Amonia persulfat), pepsin, Running Buffer (berisi SDS), larutan
pewarna (Croomasil Brilian Blue, metanol, asam asetat glasial, aquabides), larutan pembilas
(metanol, asam asetat glasial, aquabides).
Sehari sebelum praktikum, praktikan melakukan penanaman bakteri E.coli
sebanyak 10ml dalam media LB, kemudian diinkubasi selama 18jam dengan temperature suhu
34 0 C dalam incubator goyang 150 rpm, kemudian dimasukan biakan bakteri dalam 3 mikrotube
dan sentrifugasi 2 menit 12.000 rpm untuk memisahkan pellet dan supernatant. Pellet yang telah
didapat kemudian dipindah atau dijadikan satu dengan memasukannya pada satu mikrotube lalu
pellet yang sudah dicampur disentrifugasi lagi, pellet hasil akhir yang didapat disuspensi dengan
larutan PBS ph 7.9 tujuannya untuk menghilangkan sisa bakteri, kemudian pellet dipindah ke
mikrotube besar, pellet yang telah disonifikasi selama 30 dektik dan telah didiamkan diulangi
sebanyak 10x. setelah melakukan prosedur tersebut kemudian suspense yang didapat dimasukan
ke mikrotube kecil dan disentrifugasi 5 menit dengan suhu 45 0C dengan kecepatan 10.000rpm,
supernatant yang dihasilkan disimpan dalam freezer dengan suhu 4 0C.
Kemudian tahapan selanjutnya adalah pembuatan gel poliakrilamid, hal pertama yang
dilakukan adalah praktikan mengecek kebocoran terlebih dahulu pada cetakan dengan
memasukan aquades dalam cetakan. Kemudian buat separating gel dengan memipet 2935.5µL
aquades, kemudian ditambahkan acrylamide 30% sebanyak 3ml dan temed 7,5µL dan APS 10%
sebanyak 7,5 µL. secara bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara
sempurna. Setelah itu diaduk supaya homogen.

3. Sebelum separating gel dimasukkan ke dalam cetakan, terlebih dahulu kaca loading
dibersihkan dengan cara dibilas menggunakan aquades sampai bersih kemudian di lap searah
menggunakan tisu,hal ini bertujuan agar kaca tidak tergores sehingga mempengarui proses
analisis yang dilakukan. Setelah itu kaca loading dipasang pada alat elektroforesis, separating gel
yang telah dibuat dimasukkan kedalam cetakan dengan menggunakan mikropipet sampai pada
batas yang ditentukan yakni sekitar ¾ bagian dan ¼ bagian sisanya digunakan untuk stacking
gel. Setelah itu gel dibiarkan terpolimerisasi dalam suhu ruang selama 15 menit. Kemudian
dituangkan sedikit aquades untuk membuat permukaan separating gel datar/gel yang dibentuk
tidak bergerigi yang dapat menyebabkan adanya sekat diantara separating gel dengan stacking
gel yang dapat mengganggu proses pemisahan molekul. Aquades yang ditambahkan kemudian
diserap dengan menggunakan tisu agar tidak mempengaruhi gel yang terbentuk.
Selanjutnya dibuat stacking gel (gel pengumpul). Cara pembuatan stacking gel hampir
sama dengan pembuatan separating gel, yang membedakan yaitu banyaknya atau jumlah yang
ditambahkan. Selain itu pada stacking gel digunakan UGP (Upper gel buffer) sebagai buffer pada
gel. Langkah pembuatanya yaitu pertama dimasukkan aquades 2935.5µL, 30% Akrilamid 7,5 µL
kedalam beaker glass. Penambahan akrilamid berfungsi untuk menentukan pori-pori gel pada
proses pemisahan gel sedang UGB sebagai buffer. Setelah itu dimasukkan 10% APS 7.5 µL dan
TEMED secara bersamaan dengan mikropipet supaya terjadi polimerisasi secara sempurna.
Setelah itu diaduk supaya homogen.
Langkah selanjutnya yaitu memasukkan stacking gel diatas gel pemisah dan disisipkan
gigi sisir yang berfungsi untuk mencetak sumuran yang akan digunakan sebagai tempat
meneteskan sampel. Gigi sisir dibiarkan sampai gel terpolimerisasi pada suhu ruang selama 15
menit. Setelah terbentuk sumuran selanjutnya gigi sisir diambil dari gel. Gel yang telah terbentuk
kemudian dipindahkan ke dalam tank elektroforesis dan siapkan digunakan untuk proses
selanjutnya.
Sementara itu, sampel pepsin yang masing-masing telah ditimbang sebanyak
0,005 gr, 0,0075 gr, 0,01 gr, 0,0125 gr, dan 0,015 gr yang dibungkus alumunium foil masing-
masing dimasukkan ke dalam tabung eppendorf lalu ditambahkan masing- masing sampel buffer
sebanyak 0,5 µL yang didalamnya mengandung SDS yang akan memberikan muatan negatif
pada sampel yang dianalisis serta β-mercaptoetanol yang dapat mereduksi ikatan disulfida pada
protein. Kemudian sampel dipanaskan diatas kompor listrik sehingga sampel dapat terdenaturasi

4. sempurna pada suhu 90˚C selama 5 menit. Selanjutnya sampel diangkat dan didinginkan untuk
selanjutnya dilakukan proses analisis. Sampel yang telah tersedia kemudian dimasukkan ke
dalam sumuran sebanyak 0,01 µL. Kemudian alat elektrolisis dipasang dan dimasukkan buffer
tank ke dalam tank elektrolisis sampai pada batas sumuran. Buffer ini digunakan sebagai
penghantar listrik yang akan membantu memisahkan sampel saat alat dinyalakan.
Pada proses pewarnaan, gel yang telah dielektroforesis dipindahkan dari tank kedalam
wadah plastik. Pewarnaan (staining) pita protein dilakukan dengan jalan merendam gel hasil
elektroforesis (setelah dilepas dari rangkaian plat) dalam larutan Coomasie brilliant blue (CBB)
lalu gel yang terdapat dalam wadah plastik dishaker selama 15 menit, penggoyangan perlu
dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh CBB. kemudian dilakukan
destaining untuk menghilangkan kelebihan warna dengan jalan merendam gel dalam larutan
destaining (aquabides, metanol, asam asetat glasial dan Coomasie brilliant blue) dan dishaker
selama 10 menit. Selain itu, perendaman dengan larutan destaining bertujuan untuk
menghilangkan CBB yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk
menghilangkan CBB yang tidak berada pada band protein. Setelah itu dilakukan pencucian lagi
dengan aquades serta dimasukkan potongan kertas saring untuk menyerap warna yang akan
dibilas hingga gel menjadi jernih dengan pita terpisah jelas satu sama lainnya. Pembilasan
berfungsi untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan pewarnaan yang
dilakukan oleh larutan destaining. Kemudian dilakukan penghitungan Rf (Retention factor) pada
sampel yang telah terpisah yang kemudian digunakan untuk mencari berat molekul dari sampel.
Dari hasil percobaan elektroforesis yang dilakukan pada sampel enzim pepsin didapatkan
pita-pita dimana dari pita yang terbentuk dihitung panjang atau RF (Retention Factor) yang
akhirnya didapatkan BM sampel. Pada percobaan tersebut digunakan marker yaitu protein yang
mengandung beberapa komponen enzim.
Dan dari hasil percobaan didapatkan panjang pita sampel, dan panjang separating gelnya.
Sehingga dari data tersebut dapat dihitung RF sampel dengan rumus RF = panjang pita diatas
dibagi dengan panjang separating gel, sehingga didapatkan nilai RF sampel dan log BM sehingga
didapatkan persamaan didapatkan persamaan y = -3.034x + 16.82 dimana x=RF sampel dan
y=log BM. Dari persamaan tersebut didapatkan y atau log BM yang kemudian dicari BM sampel
dengan antilog y sehingga didapatkan BM sampel pada masing – masing percobaan yang

5. dilakukan oleh masing – masing kelompok, berturut – turut didapatkan 35.89 KDa, 35.89 KDa,
56.49 KDa, 33. 265 KDa, 52.456 KDa, 52.456 KDa, 41.773 KDa, 33.265 KDa, 30.831 KDa,
52.456 KDa, 38.725 KDa, dan 30.831 KDa.
Apabila diperhatikan posisi pita dari sampel dan pita-pita dari marker pada gel, akan
terlihat bahwa pita sampel membentuk garis lurus dengan marker. Hal ini menunjukkan bahwa
sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama karena sampel yang digunakan sama, yaitu
enzim pepsin. Molekul dengan berat yang sama akan bergerak menempuh jarak yang sama
sehingga membentuk garis lurus (Suranto, 2006).
Pita-pita bisa terbentuk atau nampak disebabkan karena adanya sejumlah partikel sampel
yang tersangkut pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada sampel yang
bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki berat molekul sama akan terakumulasi di titik
yang sama, sehingga membentuk beberapa pita dengan panjang berbeda yang terpisah
berdasarkan berat molekulnya (Hames, 2004).
Dari hasil percobaan, sampel membentuk garis lurus. Hal tersebut mengindikasikan
bahwa sampel-sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama karena sampel yang
digunakan sama, yaitu enzim pepsin. Molekul dengan berat yang sama akan bergerak menempuh
jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus (Bollag, 2009).
Faktor-faktor yang berpengaruh pada percobaan Elektroforesis kali ini yaitu ukuran dan
bentuk molekul, konsentrasi gel, pH, suhu, dan voltage.
 Ukuran dan Bentuk Molekul : . Semakin besar ukuran molekul maka pergerakan akan
semakin lambat, bentuk molekul sekunder atau tersier mempunyai pergerakan yang lebih
lambat dari pada protein primer.
 Konsentrasi Gel : Pada konsentrasi gel yang rendah maka pergerakan protein lebih cepat
dan sebaliknya pada konsentrasi gel yang lebih tinggi maka pergerakan protein akan lebih
lambat.
 pH : Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena akan
mempengaruhi titik isoelektrik protein sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan arah
pergerakan protein.

6.  Suhu : suhu akan mempengaruhi denaturasi protein dimana pada Elektroforesis
digunakan suhu 90-95 0C untuk mendenaturasi protein.
 Voltage : voltage yang digunakan juga mempengaruhi pergerakan protein dimana dengan
voltage yang tinggi maka pergerakan protein dalam gel elektroforesis akan lebih cepat,
sebaliknya jika voltage yang digunakan rendah maka pergerakan protein dalam gel akan
lambat.