Download luận án tiến sĩ ngành sinh lý học thực vật với đề tài: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1. VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊ THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN
TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9
BẰNG PHƯƠNG PHÁPBIỂU HIỆN TẠM THỜI
TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana)
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”.
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Mã số: 9 42 01 12
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội, 2019

2. i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS.
Chu Hoàng Hà đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận
đƣợc sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hƣớng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học,
các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành cảm ơn
Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Công
nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Luận án đƣợc thực hiện tại, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử
nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ
Việt Nam. Với sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài
cấp Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Nghiên cứu sinh
Lê Thị Thủy
Lê Thị Thủy

3. ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi các số liệu và kết quả trình bày
trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên tạp chí khoa học chuyên
ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong
luận án.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả
Lê Thị Thủy

4. iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN................................................................................ Ii
MỤC LỤC........................................................................................... Iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT..................................................... Vi
DANH MỤC BẢNG........................................................................ Viii
DANH MỤC HÌNH......................................................................... Xi
MỞ ĐẦU............................................................................................... 1
1 Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................... 1
2 Mục tiêu nghiên cứu............................................................................ 3
3 Nội dung nghiên cứu............................................................................ 3
4 Những đóng góp mới của luận án........................................................ 3
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.......................................... 4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 5
1.1 Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9..................................... 5
1.1.1 Nguồn gốc virus cúm A/H7N9............................................................ 5
1.1.2 Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9.................................................. 6
1.1.3 Đa hợp tạo nên phân type A/H7N9....................................................... 9
1.1.4 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9...................... 10
1.1.5 Tình hình dịch cúm A/H7N9............................................................... 13
1.2 Vacxin phòng chống bệnh cúm A...................................................... 16
1.2.1 Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay................................... 16
1.2.2 Vacxin tái tổ hợp từ thực vật................................................................. 19
1.2.3 Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam...................................... 20
1.2.4 Một số nghiên cứu về vắc xin cúm ở Việt Nam 21
1.3 Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật thông qua
Agrobacterium.................................................................................... 24
1.3.1 Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât..................... 24
1.3.2 Quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium........................... 26

5. iv
1.3.3 Các chiến lƣợc tăng cƣờng biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực vật……….. 28
1.3.4 Tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật……………………………….. 34
1.4 Nano kim cƣơng (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công
nghệ sinh học................................................................................. 37
1.4.1 Giới thiệu chung về vật liệu nano kim cƣơng....................................... 37
1.4.2 Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ
sinh học.................................................................................................. 37
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 41
2.1 Vật liệu.................................................................................................. 41
2.1.1 Chủng vi khuẩn...................................................................................... 41
2.1.2 Các vector và vật liệu thực vật, động vật............................................... 41
2.1.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 42
2.1.4 Hóa chất……………………………………………………………… 42
2.1.5 Thiết bị………………………………………………………………... 43
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu..................................................................... 43
2.2.1 Các phƣơng pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo
chủng A. tumefaciens cho biểu hiện tạm thời...................................... 43
2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen............. 45
2.2.3 Các phƣơng pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu
hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá........................................... 47
2.2.4 Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp ……………………………. 50
2.2.5 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên
tinh sạch………………………………………………………………. 51
2.2.6 Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm……………………………… 55
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NHIÊN CỨU........................................................ 56
3.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên HA……………………………………………………. 56
3.1.1 Tổng hợ nhân tạo gen mã hóa kháng nguyên HA…………………….. 56
3.1.2 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA
mono_ELP.............................................................................................. 59
3.1.3 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA
trimeric_ELP ......................................................................................... 62

6. v
3.1.4 Kết quả tạo vector chuyển gen mang gen mã hóa kháng nguyên HA
trimeric................................................................................................................... 65
3.1.5 Tạocấutrúcvectorchuyểngenthựcvậtmanggen HAtrimeric-IgMFc................ 68
3.2. Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện và tinh sạch protein HA tái tổ hợp. 71
3.2.1 Tối ƣu các điểu kiện biểu hiện protein HA tái tổ hợp………………… 71
3.2.2 Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein HA……………………………. 75
3.2.3 Kết quả đánh giá khả năng hình thành oligomer của protein HA
trimeric bằng phản ứng liên kết ngang………………………………... 83
3.3 Kết quả tạo phức hệ, khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của
kháng nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND ..............................
84
3.3.1 Kết quả tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND.............................
84
3.3.2 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA
trimeric-IgMFc................................................................................ 88
3.3.3 Đánh giá khả năng ngƣng kết hồng cầu của protein tinh sạch HA
mono_ELP và HA trimeric_ELP……………………………………... 89
3.4 Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng
nguyên HA và phức hệ HA trimeric:ND trên động vật………….... 91
3.4.1 Kết quả thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột……………....... 91
3.4.2 Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu với HA…………... 92
Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...................................... 95
4.1 Tổng hợp nhân tạo và thiết kế vector hỗ trợ biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên HA……………………………………………………. 95
4.1.1 Lựa chọn gen trong thiết kế vector biểu hiện........................ 95
4.1.2. Cấu trúc vector biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA .................... 96
4.2 Biểu hiện tạm thời gen mã hóa kháng nguyên HA thông qua vi
khuẩn Agrobacterium………………………………………………... 101
4.2.1 Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp....................... 101
4.2.2 Khả năng hình thành oligomer............................................................ 103
4.3 Khả năng tạo phức hệ và gây ngƣng kết hồng cầu của kháng
nguyên HA ....................................................................................... 104

7. vi
4.3.1 Khả năng tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND........................ 104
4.3.2 Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và phức hệ
kháng nguyên HA trimeric:ND(1:12)............................................... 105
4.4 Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột... 105
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................ 108
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN....... 110
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH............................................. 111
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 115
PHỤ LỤC

8. vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2b CMV Cucumber mosaic virus , (Protein 2b của virus khảm dƣa chuột)
35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã)
Aa Amino acid (axit amin)
Bp Base pair (Cặp base)
BSA Bovine serum albumin
CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ)
Cs Cộng sự
DNA Deoxyribonucleic acid
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
ELP Elastin-like polypeptide
ER Endoplasmic reticulum (Lƣới nội chất)
Fc Fragment crystallizable
HA Hemagglutinin
HAU Hemagglutination unit
HC-Pro Helper component protease (Protein hỗ trợ)
HRP Horseradish peroxidase
IgG
IMAC
Immunoglobulin G
Immobilized Metal Affinity Chromatoraphy (sắc khí ái lực)
Kb Kilobase
KDa Kilodalton
LB Luria-Bertani (Môi trƣờng nuôi vi khuẩn)
mITC Membrane-based ITC (phƣơng pháp tinh sạch qua màng)
NA Neuraminidase
OD Optical density (Mật độ quang)
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
PBS Phosphate-buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction

9. viii
PCS Polycloning site
ARN Ribonucleic acid
RNase Ribonuclease
SAP Shrimp alkaline phosphatase
ScFv Single chain variable fragment
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis
TAE Tris Acetate EDTA
TaqDNA
polymerase
Thermus aquaticus DNA polymerase
TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp)
v/p vòng/phút
VLP Virus-like particle
WHO World Health Oganization
WT Wild type (Cây không chuyển gen)

10. viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số thay đổi axit amin liên quan đến khả năng lây nhiễm,
gây bệnh và tính nhạy cảm với thuốc kháng virus của virus cúm
gia cầm A(H7N9) phân lập từ đợt dịch thứ năm………………... 14
Bảng 1.2 Danh sách một số giống gốc vắc xin cúm A/H7N9 chuyển giao
cho cơ sở có nhu cầu sản xuất………………………………….
20
Bảng 1.3 Sự so sánh các đặc trƣng kỹ thuật giữa CVD diamons, Titanium
và thép không gỉ............................................................................ 38
Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen HA mono_ELP,
HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-IgMFc............... 42
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR............................................................ 44
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép gen.............................................. 44
Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm dãy trực giao L9 (34
)……………………….. 49
Bảng 3.1 Nồng độ protein HA trong mẫu lá biểu hiện tạm thời protein HA
khi không sử dụng vector hỗ trợ và có sử dụng vector hỗ trợ
HcPro PRSV/2b CMV………………………………………….. 72
Bảng 3.2 Kết quả phân tích phƣơng sai của các công thức thí nghiệm
trong thí nghiệm trực giao………………………………………. 75
Bảng 3.3 Mức độ biểu hiện và khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của protein
HA....................................................................................................... 90

11. ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus cúm A...................................................... 8
Hình 1.2 Nguồn ngôc các phân đoạn gen của chủng virus H7N9 tái tổ hợp.. 9
Hình 1.3 Mô hình cấu trúc Hemagglutinin..................................................... 12
Hình 1.4 Sơ đồ mô tả bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời thông qua
Agrobacterium…………………………………………………………... 27
Hình 1.5 Quy trình tinh sạch protein bằng phƣơng pháp mITC……………. 36
Hình.1.6 Cấu trúc tinh thể của Nanodiamons………………………………. 37
Hình.1.7 Hình ảnh minh họa cho ứng dụng ND trong dẫn thuốc…………... 40
Hình 2.1 Chuyển gen vào lá cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm
thời nhờ A. tumefaciens................................................................ 48
Hình 2.2 Cơ chế gây phản ứng ngƣng kết hồng cầu....................................... 52
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột bạch BALB/C............. 54
Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen HA............................... 59
Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector pRTRA_HA mono_ELP.... 60
Hình 3.3 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.................. 61
Hình 3.4 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_ HA mono_ELP.................. 62
Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme
giới hạn BamHI/PspOMI................................................................. 63
Hình 3.6 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA
trimeric_ELP................................................................................ 64
Hình 3.7 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric_ELP bằng
enzyme cắt giới hạn....................................................................... 65
Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng bằng enzyme
giới hạn BamHI/PspOMI................................................................. 66
Hình 3.9 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA
trimeric............................................................................................ 67

12. x
Hình3.10 Kết quả kiểm tra vector pCB301_35S_ HA trimeric..................... 68
Hình 3.11 Kết quả thiết kế vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-
IgMFc................................................................................... 69
Hình 3. 12 Kết quả thiết kế vector pCB301_35S_SP_His_ HA
trimeric_IgMFc............................................................................. 70
Hình 3. 13 Kết quả đánh giá biểu hiện kháng nguyên HA.............................. 72
Hình 3.14 Kết quả biểu hiện protein HA tại các điều kiện thí nghiệm khác
nhau……………………………………………………………….. 74
Hình 3.15 Kết quả tối ƣu nồng độ PEG cho protein HA trimeric _
ELP……………………………………………………………… 77
Hình 3.16 Kết quả biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính sinh học
protein HA trimeric……………................................................. 78
Hình 3.17 Kết quả Western blot đánh giá sự biểu hiện của kháng nguyên
HA................................................................................................ 79
Hình 3.18 Kết quả tinh sạch HA trimeric-IgMFc bằng sắc ký ái lực............ 80
Hình.3.19 Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA mono_ELP bằng SDS-
PAGE và lai miễn dịch................................................................ 81
Hình.3.20 Đánh giá kết quả tinh sạch protein HA trimeric_ELP bằng SDS-
PAGE và lai miễn dịch …………………………………………. 82
Hình.3.21 Kết quả kiểm tra khả năng hình thành oligomer của protein HA
trimeric…….................................................................................. 84
Hình 3.22 Kết quả tổng hợp và đặc điểm hạt NDs......................................... 85
Hình 3.23 Kết quả tổng hợp và tính chất vật lý của HA trimeric-
ND...................................................................................... 85
Hình 3.24 Kết quả sàng lọc tỷ lệ trộn HA trimeric và hạt ND đƣợc đánh
giá bằng lai miễn dịch với kháng thể kháng cmyc........................ 87
Hình 3.25 Kết quả phản ứng gây ngƣng kết hồng HA trimeric-
IgFMc…………………………………………………………… 88

13. xi
Hình 3.26 Kết quả ngƣng kết hồng cầu Hemagglutinin HA.......................... 89
Hình 3.27 Sơ đồ gây đáp ứng miễn dịch trên chuột………………………... 91
Hình 3.28 Kết quả thì nghiệm gây đáp ứng miễn dịch trên chuột………….. 92
Hình 3.29 Đáp ứng kháng thể ở chuột đƣợc xác định bằng ELISA………...
93
.

14. 1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Virus cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm đƣợc phát hiện tại Trung
Quốc từ năm 2013. Cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ
lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh (Gao và cs., 2013).
Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ
Orthomyxoviridae. Trên bề mặt capsid của hạt virus có protein Hemagglutinin (HA)
và Neuraminidase (NA) mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn
dịch. Kháng nguyên HA có 18 type (ký hiệu từ H1 đến H18) và kháng nguyên NA
có 11 type (ký hiệu từ N1 đến N11). Kháng nguyên HA đƣợc mã hóa bởi phân đoạn
4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng
của tế bào nhiễm và phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase (NA) là những protein
nằm trên bề mặt có tính kháng nguyên và gây bệnh. HA có khả năng đột biến trong
gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt là điểm cắt của
enzym protease ở vị trí có sự glycosyl hóa đã đƣợc xác định bao gồm Asn30,
Asn46, Asn249 trên tiểu phần HA1 và Asn421, Asn493 trên tiểu phần HA2. Cả 5 vị
trí này đều có tính bảo thủ cao trên kháng nguyên H7 của các chủng virus H7N9
gây bệnh trên ngƣời và gia cầm, Gen HA gồm 2 đoạn là HA1 và HA2 nối với nhau
bằng chuỗi oligopeptide, mã hóa cho gồm một dãy các amino acid là arginine và
lysine (-RRRKK-), tạo nên điểm cắt của protease. Đây là vùng quyết định độc lực
của virus hay tính gây bệnh của virus cúm. Phần HA1 và HA2 bộc lộ ra ngoài màng
và có khả năng làm ngƣng kết hồng cầu và chịu trách nhiệm cho việc gắn kết virus
vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ trong giai đoạn đầu tiên của quá trình xâm nhiễm
(Svedda và cs., 1981).
Trong đợt dịch cúm đầu tiên từ ngày 31/03/2013 có ba trƣờng hợp nhiễm virus
cúm gia cầm A/H7N9 trên ngƣời đƣợc phát hiện và công bố tại Thƣợng Hải và An
Huy, Trung Quốc. Chỉ trong một thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus
nguy hiểm này đã lây lan ra 11 tỉnh thành của Trung Quốc, gây ra 131 trƣờng hợp
nhiễm bệnh, đa phần bị suy hô hấp nặng, trong đó 39 ngƣời đã tử vong (WHO, 2013).

15. 2
Trong đợt dịch cúm A/H7N9 thứ 5 trên ngƣời tại Trung Quốc diễn ra từ 19/1/2017 đến
14/2/2017 đã khiến 36 ngƣời chết trên tổng số 304 ngƣời mắc bệnh (WHO, 2017). Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định đây là một tỷ lệ cao bất thƣờng cho một sự lây
nhiễm mới và xác định H7N9 là chủng virus rất nguy hiểm đối với con ngƣời.
Các nghiên cứu về hệ gen, xác định các vùng biến đổi của virus cúm A/H7N9
đã cho thấy virus A/H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn và có độc lực cao hơn với tế
bào của loài có vú (ngƣời, heo...) so với các chủng virus cúm gia cầm khác. Cho
đến nay chƣa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ ngƣời
sang ngƣời - yếu tố cơ bản để A/H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm.
Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa ngƣời và ngƣời đã từng xảy ra với virus H7 (dịch
H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền ngƣời-
ngƣời của virus H7N9 hiện nay.
Ở Việt Nam chƣa ghi nhận trƣờng hợp cúm A/H7N9 trên ngƣời cũng nhƣ trên
gia cầm; tuy nhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao do
Việt Nam có đƣờng biên giới trải dài với Trung Quốc. Vấn đề cấp bách hiện nay,
ngoài việc ngăn chặn lây lan và triển khai các biện pháp phòng bệnh thì việc nghiên
cứu chủ động sản xuất vacxin phòng bệnh hết sức quan trọng.
Trong những năm gần đây một hƣớng mới đã đƣợc ứng dụng để phát triển các
loại vacxin cúm khác nhau, trong đó có hƣớng nghiên cứu tạo vacxin thực vật. Hệ
thống biểu hiện ở thực vật rất hữu dụng vì vacxin đƣợc tạo ra hứa hẹn sẽ có giá
thành thấp hơn từ 10-20 lần so với phƣơng pháp truyền thống. Tuy nhiên, protein
tái tổ hợp đƣợc tích luỹ trong cây trồng chuyển gen lại không cao và thiếu một
phƣơng thức tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả. Để khắc phục nhƣợc điểm này,
hiện nay hệ thống biểu hiện tạm thời là phƣơng pháp hữu ích để sản xuất kháng
nguyên tái tổ hợp ở thực vật. Phƣơng pháp này có ƣu điểm nhanh, hàm lƣợng
protein tái tổ hợp cao, không bị ảnh hƣởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực
vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn nhƣ lá.
Nhận thấy việc nghiên cứu biểu hiện các kháng nguyên của virus cúm
A/H7N9 trong tế bào thực vật là rất cần thiết. Hơn nữa mô hình sản xuất kháng

16. 3
nguyên tái tổ hợp bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời ở thực vật có thể sản xuất vacxin
với số lƣợng lớn và nhanh chóng (1-2 tháng) đáp ứng kịp thời khi dịch bệnh xảy ra. Việc
kết hợp kháng nguyên tái tổ hợp với vật liệu nano nhằm sản xuất vacxin dạng nhƣ virus
like particle để làm tăng hoạt tính kháng nguyên. Với cơ sở khoa học và ứng dụng nhƣ
trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây
bệnh cúm A/H7N9 bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana
benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Biểu hiện và xác định đƣợc đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA và phức
hệ kháng nguyên HA trimeric:ND (Nanodiamon)
- Đánh giá đƣợc hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch
trên động vật thí nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA
trimeric:ND
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên và thiết
kế vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên HA.
Nội dung 2: Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA của virus
H7N9 ở lá thuốc lá.
Nội dung 3: Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của
kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12).
Nội dung 4: Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng
nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND trên động vật thí nghiệm.
4. Những đóng góp mới của luận án
- Đã thiết kế thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện pCB301/HA mono_ELP
pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimeric-IgMFc
mang gen HA đƣợc tổng hợp nhân tạo từ gen HA của chủng virus cúm H7N9 và tạo
chủng Agrobacterium mang vector tƣơng ứng.
- Biểu hiện và tinh sạch thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA
mono_ELP, pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA
trimeric-IgMFc trong cây thuốc lá bằng phƣơng pháp mITC và IMAC.

17. 4
- Đã xác định đƣợc cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và khả năng gây
ngƣng kết hồng cầu của protein HA với hiệu giá ngƣng kết của HA trimeric_ELP và
HA trimeric bằng 2 HAU, HA trimeric:ND (1:12) bằng 1024 HAU với lƣợng 5 µg
tại giếng đầu tiên.
- Các kháng nguyên HA dạng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đều gây
đáp ứng miễn dịch ở chuột trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng
miễn dịch mạnh hơn HA trimeric.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
5.1. Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc
vector chuyển gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và
HA trimeric-IgMFc mã hóa cho các kháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng
nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện tạm thời; tách
chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các
kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là
bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị
phòng virus cúm trong thực vật.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa các kháng
nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimeric-
IgMFc của chủng virus cúm đang lƣu hành tại Trung Quốc và các chủng A.
tumefaciens mang các vector này có thể đƣợc sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản
xuất và phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm.
Quy trình biểu hiện gen HA trên lá cây thuốc lá bằng phƣơng pháp biểu hiện
tạm thời với các điều kiện tối ƣu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các
kháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA
trimeric-IgMFc hoặc các protein tái tổ hợp khác.
Kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric : ND đƣợc tạo ra trong đề tài luận án
là ứng viên tiềm năng cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm ở
Việt Nam.

18. 5
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9
1.1.1. Nguồn gốc virus cúm A/H7N9
Sự thích ứng trên vật chủ ở động vật có vú của virus cúm A/HAxNAy chính
là sự chuyển đổi thụ thể sialic acid thích ứng từ loài chim sang thích ứng gần
hơn đối với ngƣời (Paulson và cs., 2013). Trong hai năm (2012 - 2013), một số
chủng tái tổ hợp phân type HAxNAy đã đƣợc hình thành tạo nên các phân type
gây nhiễm và gây bệnh trên ngƣời, đáng quan tâm nhất là H7N9 gây chết ngƣời
phát hiện năm 2013 (Liu và cs., 2013; Yang và cs., 2013; Cui và cs., 2014) và
H10N8 công bố cuối năm 2013 (To và cs., 2013; 2014; Chen và cs., 2014). Virus
cúm A (H7N9) là một phân nhóm nhỏ của một nhóm lớn các virus cúm A mang
gen kháng nguyên HA (H7), lƣu hành giữa các loài chim. Đã có nhiễm một số
phân nhóm khác của virus cúm A mang gen H7 trên ngƣời, bao gồm các phân
type H7N2, H7N3, H7N7 và đã đƣợc thông báo tại Australia, Canada, Italy,
Mexico, Hà Lan, Vƣơng quốc Anh và Hoa Kỳ, tuy nhiên, mức độ biểu hiện và
tầm quan trọng của sự truyền lây rất giới hạn.
(http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/latest_update_h7n9/en/i
ndex.htm).
Virus cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới đƣợc phát hiện tại
Trung Quốc. Ngay sau khi dịch cúm xảy ra, các nghiên cứu về virus cúm
A/H7N9 đã đƣợc tiến hành nhằm thu thập dữ liệu, giải mã hệ gen, xác định các
vùng biến đổi, từ đó tìm ra phƣơng thức để phòng và chống dịch bệnh. Mẫu virus
cúm A/ H7N9 đƣợc lấy từ ba bệnh nhân nhiễm bệnh đầu tiên (kí hiệu
A/Shanghai/1/2013, A /Shanghai/2/2013, và A/Anhui/1/2013) đã đƣợc giải mã
và trình tự các vùng mã hóa của 8 phân đoạn gen virus đã đƣợc đăng trên cơ sở
trình tự dữ liệu của tổ chức Sáng kiến toàn cầu về chia sẻ dữ liệu cúm (GISAID).

19. 6
Trƣớc đây, hầu hết các ca nhiễm H7N7 ở ngƣời xảy ra do tiếp xúc chăn
nuôi gia cầm bị dịch bệnh, biểu hiện triệu chứng đơn giản, chủ yếu là viêm kết
mạc và viêm nhẹ đƣờng hô hấp trên, ngoại trừ một ca tử vong, đã xảy ra ở Hà
Lan (Koopmans và cs., 2004). Dịch cúm A (H7N9) bắt đầu đƣợc ghi nhận tại
Trung Quốc từ 3/2013 đến tháng 2/2018 có tới 5 đợt dịch, trong đó đợt dịch thứ
5 diễn ra từ tháng 10/2016 tới tháng 10/2017 là đợt dịch lớn nhất từ trƣớc tới
nay cả về quy mô, số lƣợng ca mắc bệnh và tốc độ lây lan tạo thành đợt dịch
thứ 5 với 541 trƣờng hợp mắc so với 135 ca nhiễm đƣợc báo cáo trong đợt dịch
đầu tiên, 320 ca nhiễm đƣợc báo cáo trong vụ dịch thứ hai, 226 ca nhiễm ở vụ
dịch thứ ba và 119 ca nhiễm ở vụ dịch thứ tƣ. Dịch đạt đỉnh cao vào tháng
2/2017 với khoảng 50-60 trƣờng hợp mắc mới/tuần, sau đó từ tháng 3 đến nay
có xu hƣớng giảm dần với khoảng 18-34 trƣờng hợp mắc mới/tuần. Từ 3/2017
đến nay đã ghi nhận thêm 3 địa phƣơng thuộc khu vực Cam Túc, Tây Tạng và
Thiểm Tây có trƣờng hợp bệnh mới. Nhƣ vậy trong đợt dịch thứ 5 đã ghi nhận
các trƣờng hợp mắc cúm A/H7N9 tại 17 tỉnh tại Trung Quốc. Theo Tổ chức Y
tế Thế giới, từ tháng 2/2013 đến tháng 1/2018, có tổng cộng 1.624 trƣờng hợp
xác định mắc cúm H7N9 ở ngƣời trong đó có ít nhất 621 trƣờng hợp tử vong tại
Trung Quốc. Hầu hết các trƣờng hợp nhiễm là do trực tiếp tiếp xúc với động
vật hoặc với môi trƣờng nhiễm, đặc biệt là chợ động vật sống (Yu và cs.,
2013). Tuy nhiên xu hƣớng thích ứng của virus cúm A/H7N9 trên tế bào niêm
mạc phổi và thụ thể tiếp đón hemagglutinin H7 ngày càng cao, đây là mối lo
sinh học của việc lan truyền giữa ngƣời và ngƣời (Knepper và cs., 2013;
Dortmans và cs., 2013).
1.1.2. Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9
Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8 - 1,1%
RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate (Murphy và
Websters 1996). Dƣới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có
dạng hình cầu đƣờng kính từ 50 -100 nm. Một số ít có dạng hình sợi đƣờng kính
20 nm và dài từ 200-300nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ

20. 7
bọc ngoài (envelope) và lõi chứa ARN. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn
gốc từ màng tế bào nhiễm đã đƣợc đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus
vào, bao gồm một số protein đƣợc glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein
dạng trần không đƣợc glycosyl hoá (non-glycosylated protein). Protein bề mặt có
cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngƣng kết hồng cầu HA, protein
enzym cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix). Lipid tập trung ở màng virus,
chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít
carbohydrate gồm các loại đƣờng galactose, mannose, ribose, fructose,
glucosamin. Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi
ARN nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của virus
đƣợc cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân
bố dày đặc, mỗi gai mấu có độ dài khoảng từ 10 -14 nm có đƣờng kính 4-6 nm, đó
là những kháng nguyên bề mặt của virus. bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm :
HA, NA, MA( matrix) và các dấu ấn khác của virus ( Bender và cs., 1999; Zhou
và cs., 2007). Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử HA và NA (tỉ lệ
khoảng 4HA/1NA), đây là hai loại kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá
trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy và Webster, 1996;
Wagner và cs., 2002).
Hệ gen virus cúm A là ARN sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt
(Hình 1.1A), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn đƣợc sắp
xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2),
NS (NS1 và NS2) (Murphy và Webster, 1996; Rabadan và cs., 2006). Mỗi phân
đoạn ARN của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 -100 nm,
đƣờng kính 9 -10 nm, đƣợc bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là
lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1B).

21. DOWNLOAD ĐỂ XEM ĐẦY ĐỦ NỘI DUNG
MÃ TÀI LIỆU: 52028
DOWNLOAD: + Link tải: tailieumau.vn
Hoặc : + ZALO: 0932091562