SlideShare a Scribd company logo

Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY

•
•
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh từ cây thạch tùng, cho các bạn tham khảo

Education
1 of 76
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp. LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2019
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp. LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1 : TS. Lê Thị Minh Thành Hà Nội – 2019
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Nếu không đúng như nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình. Tác giả luận văn Hoàng Thị Hồng Anh
Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm chân thành tới TS. Lê Thị Minh Thành – Phó giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn Nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Trung Tâm Giống và Bảo Tồn Nguồn Gen Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 4 năm 2019 Hoàng Thị Hồng Anh
Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CYA Czapek yeast extract agar HPLC High-performance liquid chromatography MEA Malt Extract Agar MNNG N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet
Danh mục bảng Bảng 1.1. Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến............................................24 Bảng 1.2. Cơ chế tác động của tác nhân hóa học gây đột biến......................24 Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy ..............................................................32 Bảng 2.2. Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái .......................................33 Bảng 2. . Thành phần các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy.........................37 Bảng 2.4. Thành phần dung dịch môi trường MS .........................................39 Bảng 2.5. Nguồn C, N và chất bổ sung được lựa chọn..................................40 Bảng 2.6. Thành phần môi trường nhân giống..............................................41 Bảng .1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 trên các môi trường nuôi cấy ................................................................44 Bảng .2. Các khuẩn lạc đột biến được chọn ngẫu nhiên..............................49 Bảng . . Kết quả định lượng HupA của chủng đột biến...........................51 Bảng .4. Lượng sinh khối tươi thu được và hàm lượng HupA trong dịch chiết của chủng vi nấm LĐL4.4 các môi trường nuôi cấy khác nhau.53 Bảng .5. Ảnh hư ng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4........................................................................56 Bảng .6. Ảnh hư ng của hàm lượng nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4.......................................................58 Bảng .7. Ảnh hư ng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4 ..............................................................................58 Bảng . . Ảnh hư ng của chất bổ sung tới sinh khối tươi và hàm lượng HupA của chủng vi nấm nghiên cứu ...............................................................60 Bảng .9. Ảnh hư ng của hàm lượng ethanol tới sinh khối tươi và hàm lượng HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4 nghiên cứu ......................................61 Bảng .10. Khả năng sinh trư ng của chủng nấm LĐL 4.4 trên một số môi trường nhân giống ................................................................................63 Bảng .11. Ảnh hư ng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4.........................................................64
Bảng .12. Ảnh hư ng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4 .....................................................................................65 Bảng .1 . Ảnh hư ng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4...............................................................................66 Bảng .14. Ảnh hư ng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng chủng LĐL 4.4...........................................................................66 Bảng .15. Ảnh hư ng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4...............................................................................67 Bảng .16. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL 4.4 trên thiêt bị lên men 5 lít ........................................................69
Danh mục hình ảnh Hình 1.1: Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) [6] .............................6 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [2]............................................9 Hình 1. : Nấm nội sinh phát triển trong rễ cây Cối xay và cây Phong đường [11].......................................................................................................10 Hình .1. Hình thái khuẩn ty của chủng LĐL 4.4 trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy. ......................................................................................46 Hình .2. Đặc điểm vi hình thái của chủng Penicillium LĐL 4.4 trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy...................................................................46 Hình . . Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp. LĐL4.4 trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao...........................................................................47 Hình .4. Tỷ lệ sống sót chủng LĐL 4.4 sau xử lí đột biến...........................48 Hình .5. Khuẩn lạc các chủng đột biến 4.4hc15.2 (A), 4.4hc20.1 (B) và 4.4uv30.3 (C) trên môi trường PDA .....................................................50 Hình .6. Sắc kí lớp mỏng – TLC của chất chỉ thị HupA (a, b), dịch chiết nấm thể 4.4hc20.1 (d), 4.4uv 0. (e) và 4.4hc15.2 (f) trên bản silica gel Merk 0.25 mm được phát hiện bằng thuốc nhuộm KMnO4 0,5%...................50 Hình .7. Sắc ký đồ HPLC (UV 10 nm, Ref 90 nm) của chất chỉ thị Huperzine A (A) và các mẫu phân tích 4.4hc15.2 (B), 4.4hc20.1 (C) và 4.4uv30.3 (D) .......................................................................................51 Hình . . Sinh khối lên men và dịch chiết (hòa trong Chlorofom) chủng LĐL 4.4 trên môi trường MT9......................................................................54 Hình .9. Sắc kí đồ xác định hàm lượng HupA của chủng LĐL 4.4 trên môi trường MT 9.........................................................................................55 Hình .10. Sinh khối chủng LĐL 4.4 trong môi trường khoai tây (A), Czapek – Dox (B) và PDA (C)..........................................................................63 Hình .11. Sinh khối của chủng LĐL4.4 khi nuôi cấy các pH môi trường khác nhau .............................................................................................66 Hình 3.12. Sinh khối của chủng LĐL 4.4 khi nuôi cấy các nhiệt độ khác nhau......................................................................................................67
Hình 3.13. Sinh khối của chủng khi lắc các tốc độ khác nhau ...................68 Hình .14. Sinh khối lên men chủng LĐL 4.4 quy mô 5L các thời gian khác nhau .....................................................................................................70 Hình .15. Sắc ký đồ (UV 310 nm) dịch chiết chủng Penicillium sp. LĐL4.4 quy mô lên men 5L trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.............70
1 MỤC LỤC MỤC LỤC .....................................................................................................1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................6 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA VÀ HOẠT CHẤT HUPERZINE A..............................................................................6 1.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata)....................................6 1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA) ........................................................7 1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT.........................................9 1.2.1. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật .......................................10 1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật khác nhau .................................................................................................11 1.2. . Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật .................................13 1. . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A.14 1. .1. Các nghiên cứu trên thế giới...........................................................14 1. .2. Các nghiên cứu trong nước.............................................................18 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM ..................................................................19 1.4.1. Ảnh hư ng của nuôi cấy đến sự sinh trư ng phát triển của vi nấm .19 1.4.2. Các nguồn dinh dưỡng trong sinh trư ng của vi nấm......................20 1.5. TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN..............................22 1.5.1. Khái niệm chung ............................................................................22 1.5.2. Quy trình tạo giống bằng phương pháp gây đột biến.......................23 1.5. . Đột biến chủng bằng tia UV ...........................................................25 1.5.4. Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine)....25 1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [5] ..........................................................25 1.6.1. Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography – TLC)...................25 1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC )..................................................................................................27 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................31 2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................31 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................31
2 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm ....................................................31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................32 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi nấm.....................................32 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm33 2.2. . Các phương pháp gây đột biến chủng .............................................35 2.2.4. Các phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp .......355 2.2.5. Phương pháp tách chiết hoạt chất Huperzine A từ chủng nấm ........42 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt chất HupA...........................................42 CHƯƠNG . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................44 .1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI CỦA CHỦNG VI NẤM Penicillium sp. LĐL 4.4 ....................................44 3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN CHỦNG ..47 .2.1. Kết quả sàng lọc chủng đột biến có khả năng sản sinh Huperzine A .................................................................................................................48 .2.2. Kết quả xác định khả năng sinh tổng hợp HupA của các chủng đột biến bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC .....................50 . . NGHIÊN CỨU NÂNG CAO SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NU I CẤY CHỦNG ...................................................................................................52 . .1. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp..................................................................52 . .2. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp......................................................................62 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................72 4.1. KẾT LUẬN...........................................................................................72 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................73
3 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thần kinh thoái hóa tác động đến trí nhớ, suy ngh và hành vi của con người. AD ảnh hư ng đến hơn 20 triệu người trên toàn thế giới bao gồm cả 4,5 triệu người Mỹ và được coi là nguyên nhân lớn thứ ba gây tử vong các nước phát triển sau bệnh tim mạch và ung thư [1]. Hiện tại không có phương thức chữa trị cho AD. Tuy nhiên, sử dụng các chất ức chế cholinesterase (AChEI) là một trong những hầu hết các chiến lược được chấp nhận trong điều trị AD [2]. Huperzin A (HupA), một Lycopodium alkaloid, được tách chiết lần đầu tiên từ một cây thảo dược truyền thống của Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev. (Thạch tùng răng cưa) trong những năm 19 0 [3]. Sau khi các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc được công bố, thì các nhà khoa học Phương Tây đã kết luận rằng chất này có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh suy giảm về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. Alkaloid này có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgram. Trên thực tế, HupA ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, một enzym tạo ra sự suy thoái của acetylcholine. Khi mà enzym này bị thiếu hụt, hoặc chỉ có với hàm lượng rất thấp thì hàm lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện. So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [5]. Các nghiên cứu về hoạt chất Huperzine A trong cây H. serrata làm nguyên liệu trong sản xuất thuốc chữa trị các bệnh rối loạn về trí nhớ và AD
4 đã thu được các thành tựu rất đáng quan tâm. Các kế hoạch bảo tồn, phát triển loài này được một số nước trong đó có Trung Quốc chú trọng phát triển. Ngoài phát triển trồng trọt, nhân giống invitro cũng đã được quan tâm nhằm nhân nhanh sản lượng cây và tăng cao sản lượng hoạt chất HupA [6, 7]. Tuy nhiên, do điều kiện nuôi trồng thực vật cây H. serrata cũng như nuôi cấy cây in vitro rất khó khăn (đòi hỏi phải mất nhiều thời gian kéo dài nhiều năm, chi phí nhiều cho trồng trọt nhân cây) để có thể thu được một lượng lớn cây nguyên liệu cho chiết tách được một lượng lớn HupA phục vụ việc sản xuất thuốc, nên việc tìm kiếm chủng vi nấm sản sinh ra HupA là quan trọng, cần được quan tâm và là một hướng đi mới nhằm hướng tới một nguồn nguyên liệu lớn có hiệu quả kinh tế cho ngành công nghiệp dược trong nước và trong điều trị bệnh suy giảm trí nhớ tại Việt Nam, đáp ứng cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Vi sinh vật nội sinh thường sống trong mô thực vật được tìm thấy vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật. Nấm nội sinh trong thực vật thường sinh trư ng, phát triển nội sinh hoàn toàn hoặc một phần trong mô của các tế bào cây chủ, thường không gây triệu chứng rõ ràng của bệnh. Gần đây, nấm nội sinh được phân lập từ các loại cây trồng đã được chấp nhận như là một nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp dược. Một lượng lớn các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học khác nhau đã được chiết xuất từ các nấm nội sinh này [8]. Do đó, việc nghiên cứu phân lập các chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata có khả năng sản sinh hoạt chất HupA đã được các nhà khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường lượng HupA cho ngành công nghiệp dược. Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được công bố, đặc biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp chất Hup A được tìm thấy sinh tổng hợp b i các loài nấm nội sinh trong cây H. serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Alternaria, Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis. Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách
5 "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Mặt khác, tại Việt Nam trước đây đã có nhiều nghiên cứu về vi nấm nội sinh trong một số loại cây trồng, tuy nhiên, các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt Nam đến nay là chưa có công bố. Hiện tại, lần đầu tiên tại Việt Nam, từ năm 2015 đến nay, Viện Công nghệ sinh học đã và đang có các nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài cấp cơ s và cấp Nhà nước về các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Việt Nam. Nhóm đề tài đã thu được các kết quả rất khả quan, trong đó chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt là một trong những chủng giống có tiềm năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA cao. Vì vậy, đề tài: ạ ừ y T ạ ù ư được thực hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng, từ đó tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc trong nghiên cứu, sản xuất hoạt chất HupA phục vụ cho sản xuất thuốc h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer sau này.  Mụ đí đề à : Nâng cao được khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A của chủng nấm Penicillium sp. LĐL4.4 nhằm tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc cho nghiên cứu, sản xuất HupA trong h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer.  d : - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4. - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp đột biến chủng. - Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp nuôi cấy chủng.
7 rất nhiều năm (có khi tới 15 năm) phát triển trong tự nhiên mới có thể để sử dụng làm thuốc. Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chất HupA từ cây Thạch tùng răng cưa làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc là không cao (khoảng 0,1%). B i vậy, có rất nhiều sự n lực để thực hiện việc sản xuất HupA như nuôi cấy in vitro cây H. serrata và tổng hợp hóa học [6]. Họ Huperziaceae bao gồm 2 chi: Huperia và Phlegmariurus. Loài Huperzia hiện đang nằm trong danh sách tuyệt chủng của các loài thực vật, hầu hết chúng được sử dụng trong mục đích y tế. Trong các loài khác nhau của Huperziaceae, hàm lượng HupA cao nhất được tìm thấy Phlegmariurus caritus cao hơn loài Huperzia serata. Cây trồng trong điều kiện độ ẩm cao ( các khu rừng ẩm ướt) cũng cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với cây trồng trong môi trường có độ ẩm thấp. Lượng HupA cũng thay đổi đáng kể theo mùa, cao nhất giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân. Hàm lượng Huperzine A cao nhất loài H. pinifolia (1765.9 µg g-1 dw), hàm lượng Huperzia elmeri từ Philippines (60 µg g-1 ) và H. carinata (1030 µg g-1 ) từ Queensland, Australia. Còn với H. serrata từ Trung Quốc đạt từ 80,2- 182,6 µg g-1 [5]. Trong điều kiện Việt Nam chỉ có thể nuôi trồng được H. serrata như của Trung Quốc. 1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA) Huperzine A là một Lycopodium alkaloid, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa. Các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên cô lập được chất này từ cây và tiến hành các thí nghiệm lâm sàng cũng như các ứng dụng điều trị các bệnh rối loạn trí nhớ tại Trung Quốc. Sau đó, các nhà khoa học phương Tây cũng nghiên cứu và đã kết luận HupA có tác dụng rất tốt trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. 1.1 2 1 Bệ Bệnh Alzheimer (AD, SDAT) hay đơn giản là Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất. Vào năm 1906, lần đầu tiên bác s tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer đã chỉ ra căn bệnh này không thể chữa được, mang tính thoái hóa và gây tử vong. Căn bệnh này được đặt theo
8 tên ông. Trong những năm 1970 - 1985 khoa học nhận thấy người mất trí các lứa tuổi khác nhau lại có triệu chứng lâm sàng giống nhau. Khi bệnh tiến triển, các triệu chứng bao gồm sự nhầm lẫn, khó chịu, thay đổi tâm trạng, mất khả năng phân tích ngôn ngữ, mất trí nhớ dài hạn, suy giảm các giác quan. Dần dần, cơ thể sẽ mất đi một số chức năng, cuối cùng dẫn đến cái chết. Bệnh Alzheimer có thể phát triển tiềm tàng trong một thời gian dài trước khi xuất hiện những triệu chứng có thể phát hiện được bệnh. Thông thường khi các triệu chứng này bộc lộ, thì người bệnh chỉ có thể sống được khoảng 7 năm, dưới % bệnh nhân sống thọ thêm 14 năm sau khi phát hiện bệnh. Bệnh này thường xuất hiện người trên 65 tuổi, tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy ra sớm hơn rất nhiều. Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới. Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1,18% vào năm 2050. Hiện nay khoa học vẫn chưa hiểu rõ nguyên nhân và tiến triển của bệnh Alzheimer. Nghiên cứu cho thấy căn bệnh này có liên quan với các mảng và đám rối trong não. Các phương pháp điều trị hiện tại chỉ giúp giảm một phần nhỏ triệu chứng bệnh, chưa có phương pháp trị liệu nào có thể ngăn chặn hoặc làm chậm tiến triển của bệnh. Tính tới thời điểm 200 , đã có hơn 500 thử nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra phương pháp chữa trị bệnh Alzheimer, nhưng vẫn chưa biết có kết quả nào khả quan trong các phương pháp đã được thử nghiệm. Một số thói quen sống đã được đưa ra khuyến cáo nhằm phòng ngừa bệnh Alzheimer, nhưng cũng chưa có đủ chứng cớ cho thấy những khuyến cáo này có thể làm giảm sự thoái hóa não. 1 1 2 2 đ ề ị bệ HupA là một alkaloid, có cấu trúc hóa học là C15H18N2O (hình 1.2), có trọng lượng phân tử là 242, 2, nhiệt độ nóng chảy 2 0o C, tan trong methanol, ethanol, ít hòa tan trong nước. Cơ chế của Hup A trong điều trị bệnh là: Trong cơ thể người, não sản xuất ra một chất truyền thần kinh là acetylcholine có chức năng quan trọng trong chuyển động cơ bắp, suy ngh và trí nhớ; aceteycholine bị ức chế, gây thoái hóa b i enzym acetylcholinesterase (AChE). Hoạt chất HupA có tác
9 dụng ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, giúp cho việc làm giảm lượng enzym này và khi đó lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện [10]. Trong một nghiên cứu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng 5 % bệnh nhân Alzheimer cải thiện đáng kể cả hai chức năng nhận thức và trí nhớ khi dùng 200 mcg HupA m i ngày. Ngoài ra, tác dụng tích cực ghi nhận những bệnh nhân này về chất lượng cuộc sống cũng như khả năng tìm lại những kỷ niệm đã qua trong quá khứ, nó không chỉ h trợ điều trị hiệu quả cho não bộ của người bệnh Alzheimer, người già có biểu hiện suy giảm trí nhớ mà còn có hiệu quả trong việc cải thiện trí nhớ người lớn khỏe mạnh. Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [9] So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [4]. 1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT Vi nấm nội sinh – fungal endophyte sống mô sâu thực vật, thể hiện mối liên kết giữa cây và nấm bằng cách hình thành khuẩn lạc trong mô tế bào thực vật các giai đoạn sinh trư ng phát triển cây chủ, thường không gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho cây [12, 13].
11 1 2 1 3 Sự yề ự ậ Vi nấm nội sinh có thể lây nhiễm từ phần này sang phần khác trong cây chủ (truyền ngang), hoặc các cây di truyền cho các thế hệ sau (truyền dọc). Ví dụ cho cơ chế truyền ngang: một số nghiên cứu chỉ ra rằng, trong hạt giống và cây hầu như không chứa nấm nội sinh, tuy nhiên tỷ lệ nấm nội sinh tăng lên khi lá hay hạt lớn lên [16, 17]. Còn số nấm nội sinh loài Neotyphodium và Epichloë lại được truyền theo chiều dọc lưu trữ trên thế hệ con cháu [18]. 1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật khác nhau Mặc dù nấm nội sinh trong thực vật đã được biết đến thế kỷ trước, nhưng chúng mới chỉ được quan tâm chú trọng tới trong vòng hơn 0 năm tr lại đây. Năm 19 1, Webber là nhà nghiên cứu đầu tiên công bố phát hiện nấm nội sinh Phomopisis oblonga cây Du (Ulmus). Loài nấm này sau đó được Clayton và cộng sự xác định thuộc Xylariaceae [12]. Từ đó đến nay, một loạt các nhóm cây cũng đã được phát hiện là có vi nấm nội sinh sống trong cây. Một số nghiên cứu vi nấm nội sinh thực vật trong những năm gần đây: - Nấm nội sinh cây thông đỏ (Taxus brevifolia): Năm 1995 – 1996, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp., Pestolotiopsis sp., Penicillium sp. và Truncatella sp [13]. Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã đưa ra biểu đồ về quy luật phân bố của các chủng nấm nội sinh trên các bộ phận của cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Theo đó, vi nấm nội sinh được phân bố trên tất cả các bộ phận khác nhau, nhiều nhất lá (50 chủng), thân (4 chủng), cành ( 9 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là quả (1 chủng). Bằng phương pháp phân loại hình
12 thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101và Gongroniella butleri SHT106 [13]. - Nấm nội sinh trong cây thầu dầu (Ricinus communi): Sardul và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập nấm nội sinh trong cây thầu dầu Ấn Độ. Các nhà khoa học cho rằng các nấm nội sinh này có khả năng sản sinh hoạt chất Hypericin (C30H16O8) có hoạt tính kháng sinh chống vi khuẩn E.Coli, các loài Samonella sp., Staphylococus sp. và các nấm Candida sp.. Kết quả, từ 46 mẫu (16 lá, 16 thân và 14 rễ) đã phân lập được 10 chủng nấm nội sinh thuộc các chi Aspergillus sp. , Fusarium sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Dreschslera sp [8]. - Nấm nội sinh trong chi cỏ xạ hương (Thymus): Cỏ xạ hương được biết đến như một loại gia vị, ngoài ra nó còn là một cây thuốc có tác dụng giảm đau, kháng viêm. Tại tỉnh Hameda – Iran, Sahar và cộng sự thu nhập các mẫu cây từ 6 loài cỏ xạ hương khác nhau vào ba thời điểm mùa xuân, hè, thu năm 2011 để tiến hành phân lập các chủng nấm nội sinh trong cây. Từ 00 mẫu cây thu được đã phân lập được 95 chủng thuộc 11 chi nấm khác nhau, ngoài ra còn có 6 loại nấm men. Gồm các chi: Fusarium sp., Aspergillus sp., Alternaria sp., Stemphylium sp., Ulocladium sp., Phoma sp., Curvularia sp., Cylindrocarpon sp., Cylindrocarpon sp; trong đó , các chi Alternaria sp., Phoma sp., Fusarium sp. là phong phú nhất. - Nấm nội sinh trong cây kiwi (Actinidia macrosperma): Ở Trung Quốc, cây Kiwi là một cây thuốc dùng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau như bệnh phong, áp xe, viêm thấp khớp, viêm khớp, vàng da, và huyết trắng bất thường. Trong nghiên cứu điều tra vi nấm nội sinh trong kiwi và xác định hoạt tính sinh học của chúng thu được 17 chủng vi nấm nội sinh phân lập được từ cây Kiwi Trung Quốc, có 11 chủng thuộc 5 chi khác nhau: Acremonium sp., Cylindrocarpon sp., Trichoderma sp., Paecilomyces sp., và Chaetomium sp. Sáu chủng với các đặc điểm hình thái và dữ liệu phân tử còn giới hạn nên mới chỉ xác định thuộc lớp Ascomycete [19].
13 1.2.3. Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật 1 2 3 1 T ô ệ Các chất có hoạt tính sinh học được sản xuất trực tiếp từ vi nấm nội sinh, hay là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và thực hiện một số chức năng bảo vệ, cung cấp các chất có lợi cho cây chủ [13]. Bên cạnh đó, vi nấm nội sinh cũng có thể là nguyên nhân gây biến đổi sinh lý cây chủ giúp cây chủ chống lại được với điều kiện sống bất lợi. Acremonium sp. là một dạng nấm nội sinh được biết đến khả năng có thể kiểm soát côn trùng gây hại. Lợi dụng tính chất này, Koga và cộng sự đã thực hiện cấy nhiễm nấm chi Acremonium vào các cây để chúng có thể truyền cho cây chủ khả năng kháng lại sự cạnh tranh với các loài gây hại cho cây. Kết quả nghiên cứu công bố đã cấy nhiễm thành công vào cây cỏ đuôi trâu (Festuca arundinacea) và cỏ hắc mạch (Lolium perenne), các cây này đã kháng lại được sâu kéo màng cỏ Poa P. teterrella [12]. Năm 1999, Pereira và cộng sự đã áp dụng trên cây chuối.Việc cấy nhiễm nấm nội sinh vào cây chuối không chỉ giúp cây có khả năng kháng lại thuốc diệt nấm mà nó còn đột biến để duy trì sự đối kháng [12]. Beauveria bassiana là loại nấm diệt côn trùng bằng cách gây bệnh lên côn trùng giai đoạn ấu trùng và trùng. Nấm này được cấy nhiễm vào một số hạt ngũ cốc để chống lại các côn trùng tấn công cây chủ trong một số giai đoạn sinh trư ng và phát triển. Tuy nhiên, trong một số cây đã tìm thấy sự có mặt của loài này, chứng tỏ nấm này có dạng nội sinh tự nhiên không liên quan tới quá trình nấm xâm nhập vào cây. Ngoài ra, một số nấm gây bệnh trên côn trùng cũng đã được phân lập trên một số cây trồng khác [12]. 1 2 3 2 T y dư Các chất có hoạt tính sinh học được sản sinh b i các vi nấm nội sinh được đánh giá là có tiềm năng phát triển trong l nh vực y dược. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid,
14 benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, steroid, terpenoid, tetralon,... [20]. Các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi như hóa chất nông nghiệp, thuốc kháng sinh, ức chế miễn dịch, chất chống oxy hóa và chất chống ung thư [18]. Ergoflavin (C30H26O14) thuộc nhóm hợp chất Ergochromes được mô tả như là một tác nhân chống ung thư mới được phân lập từ một loại nấm nội sinh phát triển trên lá của cây thuốc Sến xanh (một loài thuộc họ Hồng xiêm) Ấn Độ [21]. Chủng nấm nội sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy trong vỏ rễ cây Xoan, thúc đẩy sự sinh tổng hợp các amit phenylpropanoid - nhóm chất Phenylpropanoid này được chú ý vào việc sử dụng như thuốc chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm. Chủng nấm F0010 thuộc chi Xylaria sp. nội sinh trong cây thân g được mô tả là sản xuất ra Griseofulvin – một chất kháng sinh chống nấm được dùng điều trị cho người và động vật. Chất chống oxy hóa tự nhiên thường được tìm thấy trong cây thuốc, rau và trái cây. Tuy nhiên, chất chuyển hóa từ nấm nội sinh có thể là một nguồn tiềm năng của chất chống oxy hóa tự nhiên mới. Pestacin (C15H14O4) đã thu được từ các loại nấm nội sinh Pestalotiopsis sp. phân lập từ cây Terminalia morobensis. Pestacin được cho là có hoạt tính chống oxy hóa gấp 11 lần lớn hơn trolox - một dẫn xuất vitamin E [20]. Ngoài ra, các nhà khoa học đã tách chiết được rất nhiều các chất có hoạt tính sinh học có ứng dụng cao trong y dược từ các nấm nội sinh thuộc các chi: Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Penicillium, Pestalotiopsis, [20] 1. . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới 1 3 1 1 ề y T ạ ù ư Hầu hết hoạt chất Huperzine A hiện đang sử dung được tách chiết từ cây Thạch tùng răng cưa và các cây thuộc họ Thạch tùng. Tuy nghiên, trong cây Thạch tùng răng cưa chứa rất ít lượng Huperzine A. Bên cạnh đó, loài cây
15 này phải mất nhiều thời gian để phát triển (phải mất ít nhất 15 năm từ khi bào tử nảy mầm cho đến giai đoạn trương thành), đòi hỏi điều kiện phát triển ngặt nghèo và chi phí cao trong trồng trọt. Mặc dù các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra nhân giống in vitro có thể cung cấp lượng HupA cao hơn cây trồng tự nhiên [7, 6]; tuy nhiên, nó vẫn mất rất nhiều thời gian để có thể đủ lượng sinh khối cho thu nhận HupA nên chưa thể đáp ứng được hết nhu cầu của ngành công nghiệp dược. Gần đây, nấm nội sinh thực vật được phân lập từ các loại cây được chấp nhận như là nguồn nguyên liệu quan trọng cung cấp cho ngành công nghiệp dược. Một lượng lớn các chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học đa dạng đã được chiết xuất từ nấm nội sinh [22]. Do vậy, các nhà khoa học đã quan tâm đến việc nghiên cứu các chủng nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa có khả năng sản sinh hoạt chất HupA nhằm thay thế cho phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây trồng tự nhiên, giúp tăng cường lượng HupA phục vụ ngành công nghiệp dược. Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được công bố, đặc biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp chất Hup A được tìm thấy sinh tổng hợp b i các loài nấm nội sinh trong cây H. serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Coniochaeta, Rhizoctonia, Alternaria, Plectosphaerella,Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis. Với phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái và bằng phân tích trình tự ITS – rDNA, Shi và cs (2005) đã phân lập được 4 chủng: Cephalosporium sp., Plasmoparad sp., Saccharomyces sp., Penicillium sp. nội sinh trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh An Huy [21]; Huang và cs (2009) đã phân lập được 4 chủng trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh Hồ Nam (Cladosporium sp., Penicillium sp., Fusarium sp., and Coniothyrium sp.) [23]; Chen và cs (2011a,b) – sau khi khử trùng mẫu rễ, thân, lá cây H. Serrata bằng ethanol và sodium hypochloride, các mẫu cây được đặt nuôi trên môi trường PDA có bổ sung streptomycin sunfate - đã phân lập được 52 chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata trồng tỉnh Hải Nam và 5 chủng trong cây trồng tỉnh Quảng Tây, các chủng này thuộc 26 chi (Colletotrichum, Trichoderma, Fusarium, Coniochaeta, Rhizoctonia,
16 Alternaria, Aspergillus, Plectosphaerella, Podospora, Cyphellophora...)[24]. Trong đó - bằng kỹ thuật phân tích sắc ký màng lỏng (TLC) và sắc ký màng lỏng hiệu năng cao (HPLC) - Li và cộng sự (2007) đã xác định được chủng Acremonium sp. 2F09P0 B sản sinh HupA với hàm lượng , 2µg l [25]; Wang và cộng sự (2011) - với phương pháp khử trùng mẫu thân, lá cây H. serrata bằng ethanol và mercuric chloride, sau đó đặt các mẫu cây trên môi trường PDA có bổ sung streptomycin và ampicilin - đã phân lập được 127 chủng nấm, trong đó bằng nhận dạng hình thái và phân tích trình tự ITS đã định dạng được 69 chủng thuộc 19 chi nấm Aspergillus, Podospora, Penicillium, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis... [34]. Bằng kỹ thuật phân tích sắc ký màng lỏng (TLC) và sắc ký màng lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã xác định được 9 chủng có khả năng sản sinh HupA và chủng Shiraia sp. Slf14 cho sản lượng HupA cao nhất là 27, µg L [26]; trình tự gennom của chủng Shiraia sp. Slf14 đã được Zhang và cs công bố vào 2014. 1 3 1 2 ạ Các chủng giống vi nấm có khả năng sinh tổng hợp HupA là nguồn cung cấp HupA dễ kiểm soát và thao tác, có thể thu với lượng lớn với thời gian nhanh nhất. Tuy nhiên, chủng sản phân lập từ tự nhiên thường có khả năng tổng hợp hoạt chất sinh học thấp. Thông thường, để chủng có khả năng tổng hợp hoạt chất sinh học cao, có giá trị trong công nghiệp cần phải áp dụng các phương pháp nâng cao hoạt tính như lựa chọn các điều kiện, môi trường nuôi cấy thích hợp, tối ưu thành phần môi trường lên men theo mô hình đáp ứng bề mặt... hoặc gây đột biến chủng (đột biến cảm ứng, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, điều khiển hoạt động của gen, gây đột biến định hướng). Theo các tài liệu đã công bố hoạt tính huperzin A của các chủng nấm nội sinh khác nhau dao động từ ,32 đến 27, mcg L dịch lên men. Tuy nhiên nhiều chủng nấm dại phân lập có hoạt tính thấp, cần có sự nghiên cứu về thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, điều kiện lên men để tăng khả năng sản sinh Hup A. Các chủng nấm nội sinh tổng hợp Hup A cần nhiều chất dinh dưỡng đặc biệt trong môi trường sống, chúng phát triển tốt
17 trong cây thạch tùng và độ cao và nhiệt độ đặc biệt cho nên trong môi trường tổng hợp Hup A có lẽ cũng cần một số chất đặc biệt. Tuy nhiên, hai yếu tố nguồn cacbon và nguồn nito trong môi trường vẫn đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp Hup A. Các chủng vi nấm khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nito khác nhau để sinh tổng hợp Hup A. Theo Zhao X-M và cộng sự (201 ), khi nghiên cứu ảnh hư ng của nguồn cacbon đến tổng hợp Hup A của chủng Colletotrichum gloeosporioides ES026 cho thấy nguồn cacbon, glucose và sucrose, tổng hợp HupA cũng như hệ sợi mạnh hơn trong khi nguồn cacbon maltose cũng chủng này thì ngược lại [27]. Nghiên cứu tối ưu các điều kiện lên men khác nhau để sản xuất HupA từ C. gloeosporioides ES026 đã làm tăng 25,5 % sản lượng HupA. Môi trường khoai tây bổ sung glucose hoặc sucrose nhưng không có maltose đã làm tăng khả năng sản xuất HupA từ nấm. Ethanol được bổ sung vào môi trường đạt nồng độ cuối cùng 0,5-2% đã kích thích sự phát triển của nấm trong khi methanol với lượng tương tự đã ức chế sự tăng trư ng. Tuy nhiên, cả methanol và ethanol đã làm tăng khả năng sản xuất HupA lên nhiều (năng suất cao nhất của HupA tăng 51, 9% khi bổ sung ethanol). Phân tích sâu hơn cho thấy cả ethanol và methanol là chất cảm ứng mạnh mẽ cho sản xuất HupA, trong khi ethanol một phần được sử dụng như một nguồn carbon trong quá trình lên men. Màu sắc của sợi nấm dần dần tr nên đen khi cho ethanol trong khi cho methanol thì sợi nấm có màu xám trong suốt quá trình lên men. Các nghiên cứu này đã cho thấy tầm quan trọng của việc tối ưu hóa quá trình lên men, trong đó, kết hợp với các chất gây cảm ứng đem lại hiệu quả sản xuất hợp chất Hup A từ nấm nội sinh. Theo Zhu và cộng sự (2010), chủng nấm Shiraia sp. Slf14 sau khi lên men 14 ngày 2 o C cho lượng Hup A đạt 27, mcg L dịch lên men [26]. Nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp Hup A của chủng Shiraia sp. Slf14, Yan và cộng sự (2014) đã bổ sung vào môi trường lên men một số chất cảm ứng HSE (H. serrata extracts - tách chiết từ cây, lá thạch tùng răng cưa), L-Lysine và acid acetic với các nồng độ khác nhau, lên men 2 o C trong 14 ngày [28]. Việc bổ sung L-Lysine và HSE đã kích thích khả năng sinh Hup A và hệ
18 sợi nấm, với acid acetic thì ngược lại. Bổ sung 1 lượng rất nhỏ HSE đã làm tăng khả năng sinh Hup A, đạt 40 mcg g sinh khối khô. Đặc biệt, chủng Shiraia sp. Slf14 bổ sung 0,2 g L-1 l-lysine trong môi trường nuôi cấy năng suất Hup A tăng đến 296,7 mg L-1, cao hơn so với đối chứng không bổ sung L-Lysine khoảng 40%. Theo Zhou và cộng sự (2009), để tăng sản lượng huperzin A của nấm nội sinh Penicillium chrysogenum SHB từ cây họ Thạch sam (Lycopodium serratum), các điều kiện lên men lỏng đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy điều kiện lên men lỏng thích hợp nhất của SHB để sản xuất huperzin A là 28℃, pH ban đầu 6,4, tỉ lệ giống 12% , tuổi giống 4 giờ, khuấy 160 vòng phút và lên men trong ngày. Dưới những điều kiện này năng suất huperzin A có thể đạt 7,21 mcg /ml [28]. 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Ở Việt Nam trước đây đã có nhiều đề tài nghiên cứu về vi nấm nội sinh; tuy nhiên, các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt Nam đến nay là chưa có công bố. Gần đây, tại Viện Công nghệ sinh học các nhà khoa học đã phân lập được một số chủng vi nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Sa Pa và Đà Lạt. Bằng phương pháp sắc ký màng mỏng (TLC) và sắc ký hiệu năng cao (HPLC), nhóm đề tài đã xác định được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA thuộc các chi Penicillium, Fusarium, Xylaria, Fungal Endophyte...; trong đó có chủng Penicillium sp. LĐL4.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt. Các kết quả này là tiền đề và cơ s khoa học để các nhà khoa học thực hiện các nghiên cứu tiếp theo về tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu sản xuất HupA nhằm phục vụ h trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer Việt Nam.
19 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM 1.4.1. Ảnh hưởng của nuôi cấy đến sự sinh trưởng phát triển của vi nấm Sự sinh trư ng hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể được mô tả bằng khả năng hình thành các pellet, kích thước của các pellet và sinh khối sợi nấm thu được. Trong đó, sinh khối sợi là tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá khả năng sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể. Sự sinh trư ng và phát triển của nấm trong môi trường nhân giống dịch thể chịu ảnh hư ng của tát cả các yếu tố như thành phần dinh dưỡng, pH của môi trường, nhiệt độ nuôi cấy và tốc độ lắc trong quá trình nuôi giống. Độ pH môi trường nhân giống có ảnh hư ng đến chức năng của mảng tế bào, hình thái và cấu trúc tế bào, độ hòa tan của các muối, các ion, sự hấp thụ các chất dinh dưỡng và quá trình sinh tổng hợp các chất khác nhau. Các tế bào chỉ có thể phát triển trong một phạm vi pH nhất định và sự hình thành chuyển hóa các chất cũng chịu ảnh hư ng của giá trị pH [30]. Kim và cộng sự (200 ) đã báo cáo rằng, nồng độ các hợp chất polysaccharide ngoại bào và sinh khối sợi nấm đạt giá trị cao nhất tại pH = 6 và sẽ giảm dần khi giảm pH xuống ,0 hay tăng dần pH lên 9,0 [31] . Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh tổng hợp các chất tạo sinh khối sợi phụ thuộc vào m i loại nấm và điều kiện nuôi cấy. Nguồn dinh dưỡng carbon khác nhau có ảnh hư ng trực tiếp đến khả năng phân giải và hấp thụ dinh dưỡng của tế bào. Glucose và sucrose là 2 nguồn carbon mang lại hiệu quả sinh tổng hợp các hợp chất polysaccharide và tạo sinh khối sợi cao nhất đối với nấm. Nguồn dinh dưỡng nitrogen được sử dụng cho sự tăng trư ng hệ sợi nấm là amoniac, muối amoni, axit amin và nitrogen hữu cơ phức tạp [32]. Nitrogen hữu cơ được sử dụng rộng rãi nhất cho hầu hết các loại nấm và cho hiệu quả sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trưòmg dịch thể cao hơn nguồn vô cơ.
20 Ngoài dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy cũng là một yếu tố ảnh hư ng đến sự sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể. Nhiều nghiên cứu cho thấy, tốc độ lắc là cơ s duy nhất để cung cấp oxy hòa tan cho quá trình sống của sợi nấm trong môi trường dịch lòng, ảnh hư ng đến khả năng cuộn xoắn cùa hệ sợi nấm và ảnh hư ng trực tiếp đến hình thái kích thước pellet cũng như sinh khối sợi nấm thu được 1.4.2. Các nguồn dinh dư ng trong sinh trưởng của vi nấm Dinh dưỡng nấm mốc thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng. Đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được sử dụng – dinh dưỡng nội bào. Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trư ng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào. 1 2 1 D dưỡ b Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm mốc bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác như đường, rượu, acid hữu cơ, acid amin, Hầu hết các loài nấm mốc đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulase. Vì vậy, nấm mốc không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose. Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm mốc sử dụng đặc biệt là đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm mốc. Glucose được coi như nguồn carbon vạn năng đối với vi sinh vật. Trong môi trường có một h n hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trư ng tốt sẽ được ư tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường được gọi là
21 tính đa dưỡng của nấm mốc. Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết. Những loại nấm mốc cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau. Các loài khác nhu sẽ đồng hòa các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Các nguồn carbon khác thường được sử dụng cho dinh dưỡng nấm mốc như saccarose, maltose, lactose, các acid béo, 1 2 2 D dưỡ ơ Nguồn nito cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường. Các hợp chất hữu cơ chứa nito của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và pyrimidin, protein và một số vitamin. Nguồn nito vô cơ được nấm mốc sử dụng tốt là các muối amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amoni sucxinat. Trong môi trường có muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng. Các nguồn nito hữu cơ thường là h n hợp các acid amin, các peptid, các nucleic, Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên làm nguồn nito hữu cơ. Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc các acid amin vừa là nguồn nito vừa là nguồn carbon dinh dưỡng. Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acid amin mơi như là chất cho nhóm amin (NH2-). 1 2 3 D dưỡ y ố ô ơ Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm mốc bao gồm các nguyên tố phospho, kali, magie và lưu huỳnh, - Phospho: tham gia vào các thành phần quan trong của tế bào, như các nucleoproteic, acid nucleic, polyphosphate, phospholipid, Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng. Nấm mốc sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là
22 orthophosphate. Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K. - Lưu huỳnh: là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (SH-) của một số enzyme CoA. B i vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp được protein. Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin, vitamin và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amoni và nguồn lưu huỳnh. - Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men. Thông thường ion K+ được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca2+, Mg2+ thường có mặt trong nước sinh hoạt, tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ quá cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước). Giúp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn. 1 2 D dưỡ á ưở Những chất kích thích sinh trường là các vitamin, các base purin và pyrimidin. Những nhân tố sinh trường cơ bản đối với nấm mốc là vitamin nhóm B, tiamin và acid paraaminobenzic. Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc quy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây, làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường. 1.5. TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN 1.5.1. Khái niệm chung
23 a) Khái niệm đột biến sinh học: Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền cấp độ phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các đời sau [34] - Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định hướng cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên. - Đa số là đột biến gen lặn và có hại, một số ít có lợi và có ý ngh a rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống. b) Phương pháp tạo đột biến [33] - Tạo đột biến bằng việc sử dụng các tác nhân vật lí - Tạo đột biến bằng các tác nhân hóa học - Tạo giống bằng phương pháp sốc nhiệt c) Cơ s khoa học của chọn giống bằng phương pháp đột biến [33] - M i một kiểu gen nhất định của một giống chỉ cho một năng suất nhất định. Trong điều kiện nuôi trồng tối ưu thì thì m i giống chỉ cho một năng suất tối đa nhất định (mức phản ứng của kiểu gen). - Để thu được hiệu năng cao hơn thì phải thay đổi vật chất di truyền của giống do đó ta sử dụng các tác nhân vật lí, hóa học tác động vào bộ máy di truyền để gây đột biến. 1.5.2. Quy trình tạo giống bằng phương pháp gây đột biến Quy trình tạo giống mới bằng phương pháp gây độ biến gồm các bước : Bước 1: Xử lí mẫu vật bằng tác nhân gây đột biến Bước 2: Chọn lọc các thể đột biến có kiểu hình mong muốn Bước : Tạo dòng thuần chủng 1.5.2.1. Xử í ẫ ậ bằ á y đ b ế a) Sử dụng tác nhân vật lí (Bảng 1.1)
24 Bảng 1.1. Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến Loại tác nhân Cơ chế tác động Cách sử dụng Các loại tia phóng xạ (tia X, tia gama, tia bêta, chùm nơtrôn...) Kích thích và iôn hóa các nguyên tử khi chúng đi xuyên qua các mô sống. Các phân tử ADN, ARN trong tế bào chịu tác động trực tiếp của các tia phóng xạ hoặc chịu tác động gián tiếp của chúng qua quá trình tác động lên các phân tử nước trong tế bào (đặc biệt là các gốc OH- và H2O2 sinh ra có tác dụng ôxi hóa rất mạnh) làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN gây ra đột biến gen và đột biến NST. Chiếu xạ với cường độ và liều lượng thích hợp lên đỉnh sinh trư ng của thân, cành hoặc hạt phấn, bầu nhụy, mô thực vật nuôi cấy. Tia tử ngoại Không có khả năng xuyên sâu và ion hóa các nguyên tử mà chỉ có khả năng kích thích, nhưng khi được tế bào hấp thu nó cũng gây ra đột biến gen và đột biến NST. Nhiệt độ Tăng giảm nhiệt độ đột ngột (sốc nhiệt) làm cơ chế nội cân bằng của cơ thể không kh i động kịp gây chấn thương bộ máy di truyền Thay đổi nhiệt đôi môi trường cách đột ngột b) Sử dụng tác nhân hóa học (Bảng 1.2): Bảng 1.2. Cơ chế tác động của tác nhân hóa học gây đột biến Loại tác nhân Cơ chế tác động 5BU(5 brôm uraxin) Thay thế T, chuyển đổi cặp A-T thành G-X qua nhân đôi ADN: A-T => A-5BU => G-5BU => G-X. Etyl metal sunfonat (EMS) Gây đột biến thay thế cặp G-X thành cặp A-T NMU Thay thế G –X thành X- G hoặc A-T Acridin Gây đột biến mất hoặc thêm cặp Nu, nếu được chèn vào mạch khuôn cũ gây đột biến thêm cặp Nu Côsixin Rối loạn hình thành thoi vô sắc dẫn đến rồi loạn phân li cặp nhiễm sắc thể
25 1 5 2 2 C ọ ọ á ể đ b ế ó ể ì ố Khi trong quần thể giống xuất hiện các đột biến, dựa vào những đặc điểm có thể nhận biết để tách các cá thể mang đột biến có lợi ra khỏi quần thể giống. 1 5 2 3 Tạ dò ầ Sau khi nhận biết được thể đột biến mong muốn, ta cho chúng sinh sản để nhân lên thành dòng thuần chủng theo đột biến tạo được. 1.5.3. Đột biến chủng bằng tia UV Tia UV có thể tạo ra đột biến giữa 2 vòng pyrimidine (cystosine hoặc thymine) để tạo nên 2 liên kết giữa chúng. Tia cực tìm tạo ra cầu nối dimer giữa các nhóm cytosine gần nhau. Việc dimer cytosine có thể tạo ra adenine (thay vì guanine) được bổ sung vào các sợi mới. Quá trình sao chép AND, CC (thể dại) thành TT (đột biến). Mặc dù, các đột biến điểm dimer cytosine trên ADN có thể được sửa chữa b i hệ thống của tế bào nhưng không thể hết. Kết quả là cặp GC, GC (tự nhiên) thành AT, AT (đột biến) sau khi chiếu UV. 1.5.4. Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine) NTG là một trong những hóa chất gây đột biến được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu hiện nay, có công thức phân tử C2H5N5O3. NTG gây đột biến mạnh thuộc lớp alkyl hóa. Dạng alkyl hóa gây đột biến bằng cách thêm nhóm methyl hoặc nhóm ethyl trên các bazo, đó tạo sự thay đổi khi kết cặp của các bazo trên sợi ADN. Cơ chế của sự đột biến này là đột biến điểm, làm biến đổi bazo gây ra sự kết cặp sai. NTG gây ra là các đột biến điểm, thay thế cặp GC bằng cặp AT, một số rất ít các trường hợp dẫn đến dịch chuyển khung đọc hoặc mất đoạn [34]. 1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [35] 1.6.1. Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography – TLC) Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua
26 pha t nh trên đó đã chấm h n hợp các chất cần tách. Pha t nh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong h n hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha t nh và dung môi làm pha động. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = Trong đó: - a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. - b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. - Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi, vị trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tương đối Rr. Hệ số dịch chuyển tương đối Rr được xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu được sắc ký trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với mẫu thử: Rr 
27 Trong đó: + a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. + c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn, tính bằng cm. 1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC ) 1 6 2 1 K á ệ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (hay còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong h n hợp [36]. Sắc ký lỏng hiệu lăng cao do Csaba Horváth biên soạn lần đầu cho bài báo Pittcon 1970 của ông, ban đầu chỉ ra rằng áp lực cao được sử dụng để tạo ra dòng chảy cần thiết cho sắc ký lỏng các cột đóng [37]. Ban đầu, máy bơm chỉ có một áp suất 500 psi ( 5 bar). Đây được gọi là sắc ký lỏng cao áp , hoặc HPLC, là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong h n hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa h n hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. M i thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của m i thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột. Sắc ký lỏng hiệu suất cao bây giờ là một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa học phân tích [36]. Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: - Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption liquid chromatography). - Sắc ký phân bố (partition chromatography). - Sắc ký ion (ion chromatography).
28 - Sắc ký rây phân tử (size exclusion gel permeation chromatography). Trong sắc ký phân bố nói chung, pha t nh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: - Pha t nh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý: sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). - Pha t nh liên kết hóa học với chất nền : sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography). Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: - Hòa tan mẫu phân tích. - Phù hợp với đầu dò. - Không hòa tan hay làm mòn pha t nh. - Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. - Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade). Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng h n hợp dung môi MeOH nước trước, rồi ACN nước hay THF nước. Với một h n hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các h n hợp MeOH, ACN và THF hoặc ethylenglycol với nước có độ rửa giải tương đồng. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn [36]. 1 6 2 2 y ắ Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong h n hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn nhau: Pha t nh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của h n hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp thụ hoặc phân bố
29 vào pha t nh tùy thuộc vào bản chất của cột và chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách [36]. Các chất sau khi ra khỏi cột tách sẽ được phát hiện b i bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. 1 6 2 3 Cơ ở ý yế Quá tình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha t nh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theobaor chất pha t nh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách của các chất ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký chúng ta có sắc đồ [36]. 1 6 2 y ắ ạ ệ ố C Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau [36]: - Hệ thống bơm: Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) - Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi: Bình chứa dung môi bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ 0.45 µm) và đuổi khí hòa tan. - Hệ tiêm mẫu: Để đưa mẫu phân tích vào cột. Có nhiều phương phap tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Mẫu thử (dạng lỏng hay rắn) đều phải hòa tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0.45µm trước khi tiêm. - Cột sắc ký lỏng HPLC: Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar
30 + Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pah t nh có đường kính rất nhỏ ( .5, 10 µm). + Đường kính cột: 4 hoặc 4.6 mm Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu sử dụng đúng cách. Ví dụ dung môi có tính chất axit mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay các nguyên liệu bẩn thì tuổi tho của cột sẽ bị giảm. - Detector trong HPLC: Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất cần phân tích mà sử dụng hay detector hấp thụ UV – VIS. Nguyên lý hoạt động của detector UV – VIS dựa trên nguyên lý hoạt động của phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa. 1 6 2 5 Ứ dụ C Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng cso ứng dụng chính: - Định tính và thử độ tinh khiết: Thời gian lưu của các chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ. - Sắc ký điều chế: Qua quá trình sắc ký các chất được tachs ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất. - Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lơn trong định lượng chất trong h n hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha t nh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả
31 năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong l nh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi nấm nội sinh Penicillium sp. LĐL 4.4 phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt - Việt Nam, đã được xác định có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A. Chủng Penicillium sp. LĐL4.4 hiện đang được lưu giữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học. - Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN. 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN. Hầu hết dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: - Cân phân tích (Mettelex, Toledo - Tủ cấy vô trùng (Esco, Singapore) - Máy lắc ổn nhiệt (Gerharat, Đức) - Tủ lạnh (Sanaky, Nhật) - Kính hiển vi điện tử (Nikon, Nhật) - Pipetman 10 µl, 200 µl, 1000 µl - Máy li tâm (Eppendof, Đức) - Nồi khử trùng (Tommy, Nhật) - Tủ ấm nuôi cấy VSV (Esco, Singapore) - Lò vi sóng (Electrolux, Nhật)
32 . 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi nấm 2 2 1 1 ươ á ô y Nuôi cấy lỏng: - Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị trong các bình tam giác 500ml chứa 150ml môi trường lỏng, khử trùng 121O C, 1 atm trong 30 phút. - Các sợi nấm thuần được cấy chuyển sang các bình tam giác đựng các môi trường lỏng. - Sau khi cấy xong, các bình tam giác được nuôi lắc 150 vòng phút, 28O C trong thời gian -5 ngày. Nuôi cấy trên đĩa thạch: - Chuẩn bị các môi trường có bổ sung thêm agar, khử trùng 121O C, 1 atm trong 30 phút. - Cấy chuyển chủng sang các đ a peptri chứa thạch môi trường. - Sau khi cấy xong, các đ a thạch được nuôi trong tủ ấm 2 O C trong thời gian 3-5 ngày. Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy Môi trường Thành phần (g L) PDA 200g Khoai tây; 10g Glucose; 16g Agar; 1L Nước cất PDB 200g Khoai tây; 10g Glucose; 1L Nước cất 2 2 1 2 ươ á b q Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đ a petri chứa môi trường PDA, chủng vi nấm được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khử trùng. Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 2 O C trong thời gian 3-5 ngày. Các ống giống sau khi phát triển sẽ được bảo quản 4O C.
33 Khoảng -6 tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môi trường mới. Phương pháp bảo quản giống lâu dài: Chủng vi nấm sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trong môi trường glycerol 20% nhiệt độ lạnh sâu -86O C. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu một số đ c điểm sinh h c của chủng nấm [38] Chủng vi nấm được nuôi cấy trên 6 môi trường khác nhau (đặc trưng của chi Penicillium) để quan sát đặc điểm hình thái và vi hình thái. Thành phần dinh dưỡng của các môi trường được thể hiện bảng 2.2. Bảng 2.2. Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái Môi trường Nguồn Carbon (g l) Nguồn Nitơ (g l) Nguyên tố khoáng (g l) CYA 3g Sucrose 0,5g Yeast extract 0,1g K2HPO4 3mg NaNO3 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O CYA+ NaCl 5% 3g Sucrose 0,5g Yeast extract 0,1g K2HPO4 3mg NaNO3 0,5g NaCl 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O Oat meal agar 6g Oat meal Yeast Extract 0,3g Yeast extract
34 Sucrose 0,5g Peptone CREA 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O Malt Extract Agar 2g Dextrose 2g Malt Extract 0,6g Peptone Các bước tiến hành: i. Nuôi cấy nấm trên đ a peptri chứa các môi trường. Theo dõi hằng ngày thời gian phát triển, hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc trên các môi trường nuôi cấy khác nhau. ii. Nuôi cấy, quan sát vi hình thái: Dùng que cấy lấy một miếng thạch có sợi nấm phát triển kích thước khoảng 0,5 cm x 0,5 cm đặt lên lam kính rồi lấy lamen đậy lên bề mặt miếng thạch. Sau đó đặt lam kính chứa lamen đó vào trong đ a peptri. Nuôi 2 O C trong khoảng thời gian -7 ngày cho đến khi sợi nấm mọc lan đều bề mặt lamen. Soi dưới kính hiển vi quang học; quan sát hệ sợi, bào tử, cuống bào tử, vách ngăn, của chủng nấm.
35 2.2.3. Các phương pháp gây đột biến chủng 2.2.3 1 ươ á y đ b ế bằ UV [39] 1 ml dịch nuôi cấy chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 (pha loãng nồng độ 10-6 ) được chuyển vào các đ a peptri khử trùng, gạt đều dịch nuôi cấy trên đ a để tế bào phân bố đều, bật tia UV (50W – 254 nm), khoảng cách từ nguồn UV đến đ a là 15 cm. Sau 5, 10, 15, 20 và 0 phút chiếu UV, các đ a được chuyển vào bóng tối để 1 giờ đồng hồ nhiệt độ phòng. 100 µl dịch đã chiếu được trang lên đ a PDA, ủ - 5 ngày 2 o C. Khi nấm đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc trên đ a thí nghiệm và đối chứng (không xử lí đột biến) để xác định phần trăm sống sót của bào tử sau chiếu tia UV. Các dòng đột biến được nhân nuôi, tách chiết và xác định hàm lượng HupA bằng HPLC. 2.2.3 2 ươ á y đ b ế bằ N-metyl- ’-nitro-N- Nitrosoguanidin (MNNG) [39] Chủng nấm Penicillium sp. LĐL 4.4 được nuôi cấy trong môi trường PDB, 2 ml dịch nuôi cấy được ly tâm 10000 vòng phút trong 5 phút thu sinh khối. Sinh khối nấm được hòa vào 1.5 µl dung dịch NTG (100 mg ml, pha trong đệm 0.2M citrate, pH 5), vortex đều. Sau thời gian ủ 5, 10, 15, 20 và 0 phút 0o C, 50 µl dịch được hòa vào 45 ml dung dịch NaCl 0.9%, ly tâm rửa lần. Sau đó dịch được pha loãng đến nồng độ 10-3 rồi cấy trang trên các đ a thạch PDA, nuôi 3 - 5 ngày 2 o C rồi đếm số khuẩn lạc mọc. Các dòng đột biến được nhân nuôi, tách chiết và xác định hàm lượng HupA bằng HPLC. 2.2.3.3 ươ á y đ b ế bằ óng siêu âm [40] Chủng LĐL 4.4 nuôi cấy trên môi trường PDB, dịch nuôi cấy (mật độ tế bào khoảng 106 / mL) được đặt trong một cốc thủy tinh có chứa nước đá, đặt trong lò vi sóng công suất 1200W - thời gian xử lý bức xạ là: 0, 20, 50, 80, 110, 130 giây. Sau đó dịch được pha loãng đến nồng độ 10-6 rồi cấy trang trên các đ a thạch PDA, nuôi 3 - 5 ngày 2 o C rồi đếm số khuẩn lạc mọc. 2.2.4. Các phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp 2.2.4 1 ươ á ự ọ ô ườ ô y í
36 Chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 được nghiên cứu nuôi trên các môi trường nuôi cấy vi nấm có thành phần cải tiến khác nhau (Bảng 2.3 và bảng 2.4). Sau 120 giờ nuôi cấy nhiệt độ thích hợp 2 o C, xác định hoạt tính và sinh khối. Trên môi trường nào vi nấm sinh trư ng tốt, tích lũy nhiều sinh khối mà khả năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA trong tế bào cao nhất sẽ được lựa chọn làm môi trường nuôi cấy.
37 Bảng 2.3. Thành phần các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy Môi trường Khoai tây (g/l) Nguồn Carbon (g l) Nguồn Nitơ (g l) Nguyên tố khoáng (g l) Thành phần khác MT 1 150g 10 g Cao nấm men 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 10ml Ethanol 10g Glucose 5g Peptone 5g Tryptone MT 2 150g 10 g Cao nấm men 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 200mg Lysine 10g Glucose 5g Peptone 5g Tryptone MT 3 200g 20g Glucose - - 10ml Ethanol MT 4 200g 20g Glucose - - 200mg Lysine MT 5 150g 10g Cao nấm men 1/10 dung dịch MS (*) 10ml Ethanol 10g Glucose 5g Peptone 5g Tryptone
38 MT 6 150g 10g Malt extract 10g cao nấm men 10g Cao thịt 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 10ml Ethanol MT 7 150g 10g sucrose 10g fructose 10g maltose 10g Peptone 10g Tryptone 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 10ml Ethanol MT 8 150g 10g Malt extract 10g cao nấm men 10g Cao thịt 1 10 dung dịch MS (*) 10ml Ethanol MT 9 150g 10g sucrose 10g fructose 10g maltose 10g Peptone 10g Tryptone 1 10 dung dịch MS (*) 10ml Ethanol
39 (*) Bảng 2.4. Thành phần dung dịch môi trường MS Thành phần đa lượng Thành phần vi lượng Vitamins và chất hữu cơ 1.650mg Ammonium nitrate (NH4NO3) 6.2 mg Boric acid (H3BO3) 100 mg i-Inositol 440mg Calcium chloride (CaCl2 · 2H2O) 0.025 mg Cobalt chloride (CoCl2 · 6H2O) 0.5 mg Niacin 370 mg Magnesium sulphate (MgSO4 · 7H2O) 0.025 mg Cupric sulphate (CuSO4 · 5H2O) 0.5 mg Pyridoxine · HCl 170 mg Potassium phosphate (KH2PO4) 27.8 mg Ferrous sulphate (FeSO4 · 7H2O) 0.1 mg Thiamine · HCl 1.900 mg Potassium nitrate (KNO3) 22.3 mg Manganese sulphate (MnSO4 · 4H2O) 2 mg Glycine 0.83 mg Potassium iodide (KI) 1 g Edamin (tùy chọn) 0.25 mg Sodium molybdate (Na2MoO4 · 2H2O) 8.6 mg Zinc sulphate (ZnSO4·7H2O) 37.2 mg Na2EDTA · 2H2O 2 2 2 ươ á ự ọ ồ b , ơ à b í ô ườ n ô y Môi trường nuôi cấy thích hợp được lựa chọn sẽ được dùng làm môi trường cơ s để lựa chọn nguồn C, N và chất bổ sung thích hợp. Tiến hành phối hợp nguồn C, N và chất bổ sung (Bảng 2.5) để chọn ra thành phần môi trường thích hợp cho khả năng sinh trư ng và sinh tổng hợp HupA cao nhất.
40 Bảng 2.5. Nguồn C, N và chất bổ sung được lựa chọn 2 2 3 ươ á á đ ề ệ ô y Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác dung tích 500 ml trên máy lắc tốc độ 100 - 250 vòng phút, với môi trường lên men đã lựa chọn trên. Các thông số nghiên cứu bao gồm nhiệt độ, pH, độ thông khí, tỷ lệ giống, tuổi giống và động thái lên men. Các yếu tố được kế thừa từ kết quả của các thí nghiệm trước. - Lựa chọn môi trường nhân giống: Các môi trường dùng để nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp cho chủng sinh trư ng tốt gồm Czapek – Dox, PDB, Khoai tây (Thành phần thể hiện bảng 2.6). Cấy giống vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (150 vòng phút), nhiệt độ 28o C trong 3 ngày. - Khảo sát thời gian nhân giống: Chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường PDB, trên máy lắc (150 vòng phút), nhiệt độ 2 o C trong dải thời gian 24 – 72 giờ, sau đó tiếp giống sang môi trường lên men đã được lựa chọn. - Khảo sát tỷ lệ giống: Khảo sát ảnh hư ng của tỷ lệ giống tới sinh tổng hợp HupA trong khoảng từ - 15%, sau đó tiếp giống sang môi trường lên men đã được lựa chọn. Cacbon Nitơ Chất bổ sung Cao malt Cao nấm men Ethanol Tinh bột tan Cao thịt Methanol Casein thủy phân Acid acetic Pepton + trypton L-lysin Dịch chiết cây Thạch tùng răng cưa
41 - Khảo sát pH: Nghiên cứu ảnh hư ng của pH môi trường đến sinh trư ng hệ sợi nấm chủng trong môi trường dịch thể. Các bình nhân sinh khối được nuôi trong thời gian 120 giờ với tỷ lệ giống và tuổi giống được lựa chọn thí nghiệm trước. Đánh giá sự sinh trư ng hệ sợi giống nấm tại các ngưỡng pH môi trường là 6, 6.5, 7 và 7,5. - Khảo sát nhiệt độ: Các bình nhân sinh khối được nuôi 6 nhiệt độ khác nhau từ 25÷ 0o C. - Khảo sát độ thông khí: Chủng nấm trong môi trường dịch thể được nuôi lắc trong môi trường dịch thể với các tốc độ khác nhau (100, 120, 150, 1 0 và 200 vòng phút) để khảo sát sự ảnh hư ng của tốc độ lắc tới sự sinh trư ng hệ sợi nấm. - Xác định động thái lên men: Quá trình lên men chủng LĐL 4.4 được tiến hành trong thiết bị lên men thể tích 5-10 lít, với các điều kiện lên men đã xác định các thí nghiệm trên. Sau m i 12 giờ lên men, tiến hành lấy mẫu, xác định pH, sinh khối nấm và hàm lượng HupA. Bảng 2.6. Thành phần môi trường nhân giống Môi trường Thành phần (g/L) Czapek - Dox 30g Saccharose 3g NaNO3 1g K2HO4 0,5g MgSO4 0,5g KCl 0,1g FeSO4 PDB 200g Khoai tây 10 glucose Khoai tây 200g Khoai tây
42 2.2.5. Phương pháp tách chiết hoạt chất Huperzine A từ chủng nấm [26] Các bước tiến hành - Nuôi nấm trong ≥250 ml môi trường PDA-I lỏng, lắc 150 rpm, 2 o C trong 5-14 ngày tùy chủng; - Ly tâm 000 rpm thu sinh khối nấm; - Sấy khô sinh khối nấm 45-50o C; - Nghiền nấm bằng nitơ lỏng thành bột mịn; - Bổ sung một lượng ammonia 10% với tỉ lệ 1 ml 1 g bột nấm trong 1-2h nhiệt độ phòng; - Bổ sung 0ml dung môi HCl 5% tỉ lệ 1: 0 ml, lắc nhiệt độ phòng trong 24h; - Ly tâm thu dịch chiết 000 rpm 10 phút; - Chỉnh dung dịch thu được về pH 9-10 bằng NaOH 10% NH4OH 25%; chiết lần với Chloroform, thu pha dưới; - Cô quay loại bỏ dung môi, thu được căn alkaloid toàn phần được hòa tan trong 1 lượng methanol đậm đặc ≥1ml. 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt chất HupA [26] 2 2 6 1 ươ á ắ ý b ỏ - TLC - Nguyên liệu, hóa chất: + Dịch chiết nấm nội sinh + Hóa chất: Chất chuẩn Huperzine A, chloroform, acetone, isopropanol, axit acetic, axit tartaric, phenol, isoamyl alcohol, iod, KMnO4 + Bản mỏng silicagel Merck 0.25mm - Tiến hành: (1) Hòa tan chất chuẩn Huperzine A trong Methanol 1mg ml. Pha loãng đến các nồng độ chuẩn; (2) Hoạt hóa bản mỏng silicagel bằng
43 cách sấy 1h 110o C. Mẫu được chấm lên bản mỏng bằng pipet (chất chuẩn HupA 1µl nồng độ 10-6 ; mẫu dịch chiết nấm là 5 µl). Khoảng cách các giếng chấm cách mép dưới 1 cm, hai bên mép 0.5 cm, giữa các giếng 0.7 cm. Kích thước của vệt chấm càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt. Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi; ( ) Dùng kẹp đưa bản mỏng đã chấm vào bình dung môi, đậy nắp bình.Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến khi cách mép trên tấm bản mỏng 1 cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ bản mỏng; (4) Sử dụng thuốc nhuộm KMnO4 0.5% xịt đều lên bản mỏng. Sấy nhẹ bản mỏng, quan sát vết. 2.2.6 2 ươ á ắ ý ỏ ệ – HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột phân tích Zorbax SB – C18 RP (3.0 x 15 nm) trên hệ thống detector PDA. Qua khảo sát các điều kiện chạy khác nhau, lựa chọn ra điều kiện chạy cho HupA với hệ thống thiết bị hiện có là: - Bước sóng phân tích: 10 nm - Vận tốc dòng chảy: 1ml phút - Chế độ chạy: isocratic + Kênh A: 5% nước - 20mM Amoniacetat + Kênh B: ACN - 0.1% A.Acetic - Lượng mẫu bơm: 10 ul - Thời gian phân tích: 20 phút
44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI CỦA CHỦNG VI NẤM Penicillium sp. LĐL 4.4 Trong các nghiên cứu trước, chủng Penicillium sp. LĐL4.4 đã đựơc phân loại đến chi theo phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự vùng rADN – ITS khi nuôi cấy trên môi trường PDA. Để tìm hiểu thêm về đặc điểm sinh học của chủng LĐL4.4, tiến hành nuôi cấy chủng trên 6 môi trường nuôi cấy có thành phần dinh dưỡng khác nhau - đặc trưng cho chi Penicillium - như mô tả phần phương pháp. Kết quả cho thấy trên 6 môi trường nuôi cấy có nguồn dinh dưỡng khác nhau - đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn ty trên các môi trừơng dinh dưỡng khác nhau là khác nhau; tuy nhiên các đặc điểm sợi khuẩn ty và bào tử của chủng LĐL4.4 đều giống nhau: sợi khuẩn ty có vách ngăn, bào tử trần không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i (hình .1, .2 và bảng .1). Các đặc điểm này đều cho thấy chủng LĐL4.4 là thuộc chi Penicillium như đã được phân loại. Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 trên các môi trường nuôi cấy Môi trường Đ c điểm hình thái Vi hình thái Khuẩn lạc Sợi sinh dư ng Sợi cơ chất Đ c điểm khác CYA - Đường kính khuẩn lạc ≈ 3cm. - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt - Dạng mép khuẩn lạc:dày, liền, có khía đồng tâm Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng nâu. - Giọt tiết: nhiều, không màu - Sắc tố hòa tan: không. - Sợi nấm: có vách ngăn. - Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. CYA + - Đường kính khuẩn lạc ≈ 4cm. Màu sắc: xanh lục, Màu sắc: vàng nâu - Giọt tiết: nhiều, không - Sợi nấm: có vách ngăn.
45 NaCl 5% - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt - Dạng mép khuẩn lạc: dày, liền, có khía đồng tâm. viền trắng. màu. - Sắc tố hòa tan: không. - Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. Yeast Extract Sucrose - Đường kính khuẩn lạc ≈ 2,5 cm. - Hình dáng khuẩn lạc: tròn. -- Dạng mặt: nhung mượt - Dạng mép khuẩn lạc: dày, liền, không có khía. Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng nâu - Giọt tiết: ít, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. - Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. Oat Meal Agar - Đường kính khuẩn lạc ≈ 1,3cm. - Hình dáng khuẩn lạc: tròn, cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt. - Dạng mép khuẩn lạc: mỏng, không có khía. Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng - Giọt tiết:nhiều, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. -Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. CREA - Đường kính khuẩn lạc ≈ 1,8 cm. - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt. - Dạng mép khuẩn lạc: không. Màu sắc: trắng Màu sắc: trắng - Giọt tiết: ít, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. -Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. Malt Extract Agar - Đường kính khuẩn lạc ≈ 2,1cm. - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt. - Dạng mép khuẩn lạc: mỏng, không có khía. Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng nâu - Giọt tiết: ít, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. -Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i.
47 3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN CHỦNG Chủng nấm Penicillium sp. LĐL4.4 đã xác định được khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A với hàm lượng 1,38 mg/L dịch lên men trên môi trường PDB (Hình 3.3). Hình 3.3. Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp. LĐL4.4 trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Để có thể nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng, tiến hành đột biến chủng bằng 3 phương pháp chiếu tia UV, sử dụng hóa chất MNNG và sóng siêu âm (như mô tả phần phương pháp) nhằm tạo ra những dòng biến thể mới có khả năng cho sản lượng HupA cao hơn chủng gốc.
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY
Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY

Recommended

Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tốLuận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tíaLuận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Viết thuê trọn gói ZALO 0934573149
 
Luận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOT
Luận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOTLuận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOT
Luận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOT
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo
Nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảoNuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo
Nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo
Ho Chi Minh
 
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...
Dịch Vụ Viết Thuê Khóa Luận Zalo/Telegram 0917193864
 
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

Recommended

Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tốLuận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Luận văn: Khả năng tập chống chịu của khoai tây trước các yếu tố
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tíaLuận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Luận văn: Khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của chủng vi khuẩn tía
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Ảnh hưởng của một số chế phẩm vi sinh vật đến nước ao nuôi tôm - Gửi miễn phí...
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Luận án: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9...
Viết thuê trọn gói ZALO 0934573149
 
Luận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOT
Luận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOTLuận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOT
Luận văn: Ứng dụng than cacbon hoá làm giá thể sinh học, HOT
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo
Nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảoNuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo
Nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo
Ho Chi Minh
 
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...
Luận án: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của l...
Dịch Vụ Viết Thuê Khóa Luận Zalo/Telegram 0917193864
 
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng si...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanh
Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanhNghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanh
Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanh
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...
Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...
Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562
Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562
Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562
Trần Đức Anh
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt nam
Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt namNghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt nam
Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt nam
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAY
Luận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAYLuận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAY
Luận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...
ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...
ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Quocphong Nguyen
 
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
bctntlvn (125).pdf
bctntlvn (125).pdfbctntlvn (125).pdf
bctntlvn (125).pdf
Luanvan84
 
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
tai lieu ve nuoi cay thuy sinh
tai lieu ve nuoi cay thuy sinhtai lieu ve nuoi cay thuy sinh
tai lieu ve nuoi cay thuy sinh
Paradise Kiss
 
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vậtPhân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chiKhảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...
Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...
Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...
jackjohn45
 
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 

More Related Content

What's hot

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Quocphong Nguyen
 
bctntlvn (125).pdf
bctntlvn (125).pdfbctntlvn (125).pdf
bctntlvn (125).pdf
Luanvan84
 
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
https://www.facebook.com/garmentspace
 
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chiKhảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
https://www.facebook.com/garmentspace
 

What's hot (19)

Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...
Luận án: Tính chất của vật liệu nano YVO4:Eu3+ và EuPO4.H2O - Gửi miễn phí qu...
 
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chu...
 
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (theo...
 
Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanh
Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanhNghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanh
Nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất hạt điều tẩm trà xanh
 
Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...
Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...
Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật đối với bệnh vàng lá thối rễ cây ba kích...
 
Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562
Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562
Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562
 
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.
đáNh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp.
 
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenolLuận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
Luận án: Cấu trúc, khả năng chống oxy hóa của một số polyphenol
 
Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt nam
Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt namNghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt nam
Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa việt nam
 
Luận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAY
Luận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAYLuận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAY
Luận văn: Sự tăng trưởng in vitro của mầm lúa ngập úng, HAY
 
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng và đánh giá hiệu quả áp dụng hệ thống quản l...
 
ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...
ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...
ảNh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh trưởng và của cải bẹ xanh (br...
 
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sin...
 
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
Phân lập một số chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên có khả năng tăng sinh mạn...
 
bctntlvn (125).pdf
bctntlvn (125).pdfbctntlvn (125).pdf
bctntlvn (125).pdf
 
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết từ dâu tằm (morus al...
 
tai lieu ve nuoi cay thuy sinh
tai lieu ve nuoi cay thuy sinhtai lieu ve nuoi cay thuy sinh
tai lieu ve nuoi cay thuy sinh
 
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vậtPhân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
Phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học của hoạt chất từ thực vật
 
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chiKhảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
Khảo sát hàm lượng lân trong đất ở nông trường phạm văn cội – củ chi
 

Similar to Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY

Similar to Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY (20)

Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...
Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...
Nhân giống cây ba kích tím (morinda officinalis how) bằng phương pháp nuôi cấ...
 
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT THỦY CANH (HYDROPONICS) TRỒNG MỘT SỐ RAU THEO MÔ HÌNH GIA Đ...
 
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
Phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậ...
 
Khóa luận nông lâm kết hợp.
Khóa luận nông lâm kết hợp.Khóa luận nông lâm kết hợp.
Khóa luận nông lâm kết hợp.
 
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
Luận văn: Khả năng tập chống chịu hạn hán của khoai tây, HAY - Gửi miễn phí q...
 
Nghiên Cứu Thành Phần Loài Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Tại Khu Bảo Tồn Thiên Nhiên...
Nghiên Cứu Thành Phần Loài Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Tại Khu Bảo Tồn Thiên Nhiên...Nghiên Cứu Thành Phần Loài Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Tại Khu Bảo Tồn Thiên Nhiên...
Nghiên Cứu Thành Phần Loài Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Tại Khu Bảo Tồn Thiên Nhiên...
 
Hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng lên tế bào ung thư
Hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng lên tế bào ung thưHiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng lên tế bào ung thư
Hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng lên tế bào ung thư
 
Luận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAY
Luận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAYLuận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAY
Luận án: Đặc điểm sinh học của rệp sáp bột hồng hại sắn, HAY
 
Đề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằm
Đề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằmĐề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằm
Đề tài: Tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu cao chiết từ Dâu tằm
 
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
ảNh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng nhân nhanh sinh khối phôi sâm n...
 
Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...
Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...
Luận văn: Nghiên cứu nhân giống cây Oải hương lá xẻ (Lavandula dentata L.) bằ...
 
Luận án: Phát triển giống lúa kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)
Luận án: Phát triển giống lúa kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)Luận án: Phát triển giống lúa kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)
Luận án: Phát triển giống lúa kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)
 
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
Nghiên cứu bảo quản thanh long ruột trắng sau thu hoạch bằng màng gelatin kết...
 
Luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học của 3 loài thuộc chi Polygonum, họ Rau...
Luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học của 3 loài thuộc chi Polygonum, họ Rau...Luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học của 3 loài thuộc chi Polygonum, họ Rau...
Luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học của 3 loài thuộc chi Polygonum, họ Rau...
 
Luận văn: Nghiên cứu xử lý thuốc diệt cỏ Glyphosate trong nước
Luận văn: Nghiên cứu xử lý thuốc diệt cỏ Glyphosate trong nướcLuận văn: Nghiên cứu xử lý thuốc diệt cỏ Glyphosate trong nước
Luận văn: Nghiên cứu xử lý thuốc diệt cỏ Glyphosate trong nước
 
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp....
 
Luận văn: Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật...
Luận văn: Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật...Luận văn: Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật...
Luận văn: Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật...
 
Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây xạ đen (celastrus hindsii)
Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây xạ đen (celastrus hindsii)Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây xạ đen (celastrus hindsii)
Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh mô sẹo cây xạ đen (celastrus hindsii)
 
Tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích ứng dụng trong nuôi tôm thẻ chân trắ...
Tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích ứng dụng trong nuôi tôm thẻ chân trắ...Tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích ứng dụng trong nuôi tôm thẻ chân trắ...
Tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích ứng dụng trong nuôi tôm thẻ chân trắ...
 
Vi khuẩn quang hợp Phototrophic Bacteria để xử lí chất hữu cơ
Vi khuẩn quang hợp Phototrophic Bacteria để xử lí chất hữu cơVi khuẩn quang hợp Phototrophic Bacteria để xử lí chất hữu cơ
Vi khuẩn quang hợp Phototrophic Bacteria để xử lí chất hữu cơ
 

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Yếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.doc
Yếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.docYếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.doc
Yếu Tố Tự Truyện Trong Truyện Ngắn Thạch Lam Và Thanh Tịnh.doc
 
Từ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.doc
Từ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.docTừ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.doc
Từ Ngữ Biểu Thị Tâm Lí – Tình Cảm Trong Ca Dao Người Việt.doc
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Môn Khoa Học Tự Nhiên Theo Chuẩn Kiến Thức Và K...
 
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
Quản Lý Thu Thuế Giá Trị Gia Tăng Đối Với Doanh Nghiệp Ngoài Quốc Doanh Trên ...
 
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
Thu Hút Nguồn Nhân Lực Trình Độ Cao Vào Các Cơ Quan Hành Chính Nhà Nước Tỉnh ...
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thương Mại ...
 
Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...
Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...
Vaporisation Of Single And Binary Component Droplets In Heated Flowing Gas St...
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Các Trường Thpt Trên Địa Bàn Huyện Sơn Hà Tỉnh Quản...
 
Tác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.doc
Tác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.docTác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.doc
Tác Giả Hàm Ẩn Trong Tiểu Thuyết Nguyễn Việt Hà.doc
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Ngắn Hạn Tại Ngân Hàng Công Thƣơng Chi...
 
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
Quản Lý Nhà Nước Về Nuôi Trồng Thủy Sản Nước Ngọt Trên Địa Bàn Thành Phố Hải ...
 
Song Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.doc
Song Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.docSong Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.doc
Song Song Hóa Các Thuật Toán Trên Mạng Đồ Thị.doc
 
Ứng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.doc
Ứng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.docỨng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.doc
Ứng Dụng Số Phức Trong Các Bài Toán Sơ Cấp.doc
 
Vai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.doc
Vai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.docVai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.doc
Vai Trò Của Cái Bi Trong Giáo Dục Thẩm Mỹ.doc
 
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
Quản Lý Hoạt Động Giáo Dục Ngoài Giờ Lên Lớp Ở Các Trường Thcs Huyện Chư Păh ...
 
Thu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.doc
Thu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.docThu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.doc
Thu Hút Vốn Đầu Tư Vào Lĩnh Vực Nông Nghiệp Trên Địa Bàn Tỉnh Gia Lai.doc
 
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
Quản Lý Hoạt Động Dạy Học Ngoại Ngữ Tại Các Trung Tâm Ngoại Ngữ - Tin Học Trê...
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Doanh Nghiệp Tại Ngân Hàng Thƣơng Mại ...
 
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.docTạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
Tạo Việc Làm Cho Thanh Niên Trên Địa Bàn Quận Thanh Khê, Thành Phố Đà Nẵng.doc
 
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
Quản Trị Rủi Ro Tín Dụng Trong Cho Vay Trung Và Dài Hạn Tại Ngân Hàng Thương ...
 

Recently uploaded

Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
mskellyworkmail
 
Tử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận Hạn
Tử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận HạnTử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận Hạn
Tử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận Hạn
Kabala
 
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
ltbdieu
 

Recently uploaded (20)

Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng HàLuận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
Luận văn 2024 Tuyển dụng nhân lực tại Công ty cổ phần in Hồng Hà
 
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT HÓA HỌC 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, TRƯ...
 
Chương 6: Dân tộc - Chủ nghĩa xã hội khoa học
Chương 6: Dân tộc - Chủ nghĩa xã hội khoa họcChương 6: Dân tộc - Chủ nghĩa xã hội khoa học
Chương 6: Dân tộc - Chủ nghĩa xã hội khoa học
 
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hộiTrắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
Trắc nghiệm CHƯƠNG 5 môn Chủ nghĩa xã hội
 
Bài học phòng cháy chữa cháy - PCCC tại tòa nhà
Bài học phòng cháy chữa cháy - PCCC tại tòa nhàBài học phòng cháy chữa cháy - PCCC tại tòa nhà
Bài học phòng cháy chữa cháy - PCCC tại tòa nhà
 
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
Everybody Up 1 - Unit 5 - worksheet grade 1
 
Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3
Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3
Hướng dẫn viết tiểu luận cuối khóa lớp bồi dưỡng chức danh biên tập viên hạng 3
 
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdfGiáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
Giáo trình xây dựng thực đơn. Ths Hoang Ngoc Hien.pdf
 
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft WordTrích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
Trích dẫn theo Harvard với Microsoft Word
 
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.pptNHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
NHững vấn đề chung về Thuế Tiêu thụ đặc biệt.ppt
 
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
NHẬN XÉT LUẬN VĂN THẠC SĨ: Các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của n...
 
Tử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận Hạn
Tử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận HạnTử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận Hạn
Tử Vi Là Gì Học Luận Giải Tử Vi Và Luận Đoán Vận Hạn
 
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
GIỮ GÌN VÀ PHÁT HUY GIÁ TRỊ MỘT SỐ BÀI HÁT DÂN CA CÁC DÂN TỘC BẢN ĐỊA CHO HỌC...
 
Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...
Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...
Hoàn thiện công tác kiểm soát chi NSNN qua Kho bạc Nhà nước huyện Tri Tôn – t...
 
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
26 Truyện Ngắn Sơn Nam (Sơn Nam) thuviensach.vn.pdf
 
Tiểu luận tổng quan về Mối quan hệ giữa chu kỳ kinh tế và đầu tư trong nền ki...
Tiểu luận tổng quan về Mối quan hệ giữa chu kỳ kinh tế và đầu tư trong nền ki...Tiểu luận tổng quan về Mối quan hệ giữa chu kỳ kinh tế và đầu tư trong nền ki...
Tiểu luận tổng quan về Mối quan hệ giữa chu kỳ kinh tế và đầu tư trong nền ki...
 
22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...
22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...
22 ĐỀ THI THỬ TUYỂN SINH TIẾNG ANH VÀO 10 SỞ GD – ĐT THÁI BÌNH NĂM HỌC 2023-2...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
XÂY DỰNG KẾ HOẠCH KINH DOANH CHO CÔNG TY KHÁCH SẠN SÀI GÒN CENTER ĐẾN NĂM 2025
 
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
TỔNG HỢP HƠN 100 ĐỀ THI THỬ TỐT NGHIỆP THPT TIẾNG ANH 2024 - TỪ CÁC TRƯỜNG, ...
 

Khả năng sinh tổng hợp Hupezine của chủng nấm hội sinh, HAY

  • 1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp. LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2019
  • 2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Họ và tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp. LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1 : TS. Lê Thị Minh Thành Hà Nội – 2019
  • 3. Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Nếu không đúng như nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình. Tác giả luận văn Hoàng Thị Hồng Anh
  • 4. Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm chân thành tới TS. Lê Thị Minh Thành – Phó giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn Nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Trung Tâm Giống và Bảo Tồn Nguồn Gen Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 4 năm 2019 Hoàng Thị Hồng Anh
  • 5. Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CYA Czapek yeast extract agar HPLC High-performance liquid chromatography MEA Malt Extract Agar MNNG N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet
  • 6. Danh mục bảng Bảng 1.1. Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến............................................24 Bảng 1.2. Cơ chế tác động của tác nhân hóa học gây đột biến......................24 Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy ..............................................................32 Bảng 2.2. Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái .......................................33 Bảng 2. . Thành phần các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy.........................37 Bảng 2.4. Thành phần dung dịch môi trường MS .........................................39 Bảng 2.5. Nguồn C, N và chất bổ sung được lựa chọn..................................40 Bảng 2.6. Thành phần môi trường nhân giống..............................................41 Bảng .1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 trên các môi trường nuôi cấy ................................................................44 Bảng .2. Các khuẩn lạc đột biến được chọn ngẫu nhiên..............................49 Bảng . . Kết quả định lượng HupA của chủng đột biến...........................51 Bảng .4. Lượng sinh khối tươi thu được và hàm lượng HupA trong dịch chiết của chủng vi nấm LĐL4.4 các môi trường nuôi cấy khác nhau.53 Bảng .5. Ảnh hư ng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4........................................................................56 Bảng .6. Ảnh hư ng của hàm lượng nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4.......................................................58 Bảng .7. Ảnh hư ng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL4.4 ..............................................................................58 Bảng . . Ảnh hư ng của chất bổ sung tới sinh khối tươi và hàm lượng HupA của chủng vi nấm nghiên cứu ...............................................................60 Bảng .9. Ảnh hư ng của hàm lượng ethanol tới sinh khối tươi và hàm lượng HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4 nghiên cứu ......................................61 Bảng .10. Khả năng sinh trư ng của chủng nấm LĐL 4.4 trên một số môi trường nhân giống ................................................................................63 Bảng .11. Ảnh hư ng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm LĐL 4.4.........................................................64
  • 7. Bảng .12. Ảnh hư ng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4 .....................................................................................65 Bảng .1 . Ảnh hư ng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4...............................................................................66 Bảng .14. Ảnh hư ng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng chủng LĐL 4.4...........................................................................66 Bảng .15. Ảnh hư ng của độ thông khí đến khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng LĐL 4.4...............................................................................67 Bảng .16. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp HupA của chủng nấm LĐL 4.4 trên thiêt bị lên men 5 lít ........................................................69
  • 8. Danh mục hình ảnh Hình 1.1: Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) [6] .............................6 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [2]............................................9 Hình 1. : Nấm nội sinh phát triển trong rễ cây Cối xay và cây Phong đường [11].......................................................................................................10 Hình .1. Hình thái khuẩn ty của chủng LĐL 4.4 trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy. ......................................................................................46 Hình .2. Đặc điểm vi hình thái của chủng Penicillium LĐL 4.4 trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy...................................................................46 Hình . . Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp. LĐL4.4 trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao...........................................................................47 Hình .4. Tỷ lệ sống sót chủng LĐL 4.4 sau xử lí đột biến...........................48 Hình .5. Khuẩn lạc các chủng đột biến 4.4hc15.2 (A), 4.4hc20.1 (B) và 4.4uv30.3 (C) trên môi trường PDA .....................................................50 Hình .6. Sắc kí lớp mỏng – TLC của chất chỉ thị HupA (a, b), dịch chiết nấm thể 4.4hc20.1 (d), 4.4uv 0. (e) và 4.4hc15.2 (f) trên bản silica gel Merk 0.25 mm được phát hiện bằng thuốc nhuộm KMnO4 0,5%...................50 Hình .7. Sắc ký đồ HPLC (UV 10 nm, Ref 90 nm) của chất chỉ thị Huperzine A (A) và các mẫu phân tích 4.4hc15.2 (B), 4.4hc20.1 (C) và 4.4uv30.3 (D) .......................................................................................51 Hình . . Sinh khối lên men và dịch chiết (hòa trong Chlorofom) chủng LĐL 4.4 trên môi trường MT9......................................................................54 Hình .9. Sắc kí đồ xác định hàm lượng HupA của chủng LĐL 4.4 trên môi trường MT 9.........................................................................................55 Hình .10. Sinh khối chủng LĐL 4.4 trong môi trường khoai tây (A), Czapek – Dox (B) và PDA (C)..........................................................................63 Hình .11. Sinh khối của chủng LĐL4.4 khi nuôi cấy các pH môi trường khác nhau .............................................................................................66 Hình 3.12. Sinh khối của chủng LĐL 4.4 khi nuôi cấy các nhiệt độ khác nhau......................................................................................................67
  • 9. Hình 3.13. Sinh khối của chủng khi lắc các tốc độ khác nhau ...................68 Hình .14. Sinh khối lên men chủng LĐL 4.4 quy mô 5L các thời gian khác nhau .....................................................................................................70 Hình .15. Sắc ký đồ (UV 310 nm) dịch chiết chủng Penicillium sp. LĐL4.4 quy mô lên men 5L trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.............70
  • 10. 1 MỤC LỤC MỤC LỤC .....................................................................................................1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................6 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA VÀ HOẠT CHẤT HUPERZINE A..............................................................................6 1.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata)....................................6 1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA) ........................................................7 1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT.........................................9 1.2.1. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật .......................................10 1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật khác nhau .................................................................................................11 1.2. . Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật .................................13 1. . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A.14 1. .1. Các nghiên cứu trên thế giới...........................................................14 1. .2. Các nghiên cứu trong nước.............................................................18 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM ..................................................................19 1.4.1. Ảnh hư ng của nuôi cấy đến sự sinh trư ng phát triển của vi nấm .19 1.4.2. Các nguồn dinh dưỡng trong sinh trư ng của vi nấm......................20 1.5. TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN..............................22 1.5.1. Khái niệm chung ............................................................................22 1.5.2. Quy trình tạo giống bằng phương pháp gây đột biến.......................23 1.5. . Đột biến chủng bằng tia UV ...........................................................25 1.5.4. Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine)....25 1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [5] ..........................................................25 1.6.1. Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography – TLC)...................25 1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC )..................................................................................................27 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................31 2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................31 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................31
  • 11. 2 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm ....................................................31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................32 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi nấm.....................................32 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm33 2.2. . Các phương pháp gây đột biến chủng .............................................35 2.2.4. Các phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp .......355 2.2.5. Phương pháp tách chiết hoạt chất Huperzine A từ chủng nấm ........42 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt chất HupA...........................................42 CHƯƠNG . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................44 .1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI CỦA CHỦNG VI NẤM Penicillium sp. LĐL 4.4 ....................................44 3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN CHỦNG ..47 .2.1. Kết quả sàng lọc chủng đột biến có khả năng sản sinh Huperzine A .................................................................................................................48 .2.2. Kết quả xác định khả năng sinh tổng hợp HupA của các chủng đột biến bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC .....................50 . . NGHIÊN CỨU NÂNG CAO SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NU I CẤY CHỦNG ...................................................................................................52 . .1. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp..................................................................52 . .2. Kết quả nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA bằng nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp......................................................................62 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................72 4.1. KẾT LUẬN...........................................................................................72 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................73
  • 12. 3 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thần kinh thoái hóa tác động đến trí nhớ, suy ngh và hành vi của con người. AD ảnh hư ng đến hơn 20 triệu người trên toàn thế giới bao gồm cả 4,5 triệu người Mỹ và được coi là nguyên nhân lớn thứ ba gây tử vong các nước phát triển sau bệnh tim mạch và ung thư [1]. Hiện tại không có phương thức chữa trị cho AD. Tuy nhiên, sử dụng các chất ức chế cholinesterase (AChEI) là một trong những hầu hết các chiến lược được chấp nhận trong điều trị AD [2]. Huperzin A (HupA), một Lycopodium alkaloid, được tách chiết lần đầu tiên từ một cây thảo dược truyền thống của Trung Quốc - Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev. (Thạch tùng răng cưa) trong những năm 19 0 [3]. Sau khi các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc được công bố, thì các nhà khoa học Phương Tây đã kết luận rằng chất này có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh suy giảm về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. Alkaloid này có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgram. Trên thực tế, HupA ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, một enzym tạo ra sự suy thoái của acetylcholine. Khi mà enzym này bị thiếu hụt, hoặc chỉ có với hàm lượng rất thấp thì hàm lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện. So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [5]. Các nghiên cứu về hoạt chất Huperzine A trong cây H. serrata làm nguyên liệu trong sản xuất thuốc chữa trị các bệnh rối loạn về trí nhớ và AD
  • 13. 4 đã thu được các thành tựu rất đáng quan tâm. Các kế hoạch bảo tồn, phát triển loài này được một số nước trong đó có Trung Quốc chú trọng phát triển. Ngoài phát triển trồng trọt, nhân giống invitro cũng đã được quan tâm nhằm nhân nhanh sản lượng cây và tăng cao sản lượng hoạt chất HupA [6, 7]. Tuy nhiên, do điều kiện nuôi trồng thực vật cây H. serrata cũng như nuôi cấy cây in vitro rất khó khăn (đòi hỏi phải mất nhiều thời gian kéo dài nhiều năm, chi phí nhiều cho trồng trọt nhân cây) để có thể thu được một lượng lớn cây nguyên liệu cho chiết tách được một lượng lớn HupA phục vụ việc sản xuất thuốc, nên việc tìm kiếm chủng vi nấm sản sinh ra HupA là quan trọng, cần được quan tâm và là một hướng đi mới nhằm hướng tới một nguồn nguyên liệu lớn có hiệu quả kinh tế cho ngành công nghiệp dược trong nước và trong điều trị bệnh suy giảm trí nhớ tại Việt Nam, đáp ứng cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Vi sinh vật nội sinh thường sống trong mô thực vật được tìm thấy vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật. Nấm nội sinh trong thực vật thường sinh trư ng, phát triển nội sinh hoàn toàn hoặc một phần trong mô của các tế bào cây chủ, thường không gây triệu chứng rõ ràng của bệnh. Gần đây, nấm nội sinh được phân lập từ các loại cây trồng đã được chấp nhận như là một nguồn nguyên liệu quan trọng của ngành công nghiệp dược. Một lượng lớn các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học khác nhau đã được chiết xuất từ các nấm nội sinh này [8]. Do đó, việc nghiên cứu phân lập các chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata có khả năng sản sinh hoạt chất HupA đã được các nhà khoa học quan tâm nhằm thay thế, tăng cường lượng HupA cho ngành công nghiệp dược. Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được công bố, đặc biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp chất Hup A được tìm thấy sinh tổng hợp b i các loài nấm nội sinh trong cây H. serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Alternaria, Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis. Ở Việt Nam, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách
  • 14. 5 "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Mặt khác, tại Việt Nam trước đây đã có nhiều nghiên cứu về vi nấm nội sinh trong một số loại cây trồng, tuy nhiên, các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt Nam đến nay là chưa có công bố. Hiện tại, lần đầu tiên tại Việt Nam, từ năm 2015 đến nay, Viện Công nghệ sinh học đã và đang có các nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài cấp cơ s và cấp Nhà nước về các chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Việt Nam. Nhóm đề tài đã thu được các kết quả rất khả quan, trong đó chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt là một trong những chủng giống có tiềm năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA cao. Vì vậy, đề tài: ạ ừ y T ạ ù ư được thực hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng, từ đó tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc trong nghiên cứu, sản xuất hoạt chất HupA phục vụ cho sản xuất thuốc h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer sau này.  Mụ đí đề à : Nâng cao được khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A của chủng nấm Penicillium sp. LĐL4.4 nhằm tạo được nguồn nguyên liệu chủng giống gốc cho nghiên cứu, sản xuất HupA trong h trợ điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh Azheimer.  d : - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4. - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp đột biến chủng. - Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng vi nấm Penicillium sp. LĐL4.4 bằng phương pháp nuôi cấy chủng.
  • 15. 7 rất nhiều năm (có khi tới 15 năm) phát triển trong tự nhiên mới có thể để sử dụng làm thuốc. Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chất HupA từ cây Thạch tùng răng cưa làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc là không cao (khoảng 0,1%). B i vậy, có rất nhiều sự n lực để thực hiện việc sản xuất HupA như nuôi cấy in vitro cây H. serrata và tổng hợp hóa học [6]. Họ Huperziaceae bao gồm 2 chi: Huperia và Phlegmariurus. Loài Huperzia hiện đang nằm trong danh sách tuyệt chủng của các loài thực vật, hầu hết chúng được sử dụng trong mục đích y tế. Trong các loài khác nhau của Huperziaceae, hàm lượng HupA cao nhất được tìm thấy Phlegmariurus caritus cao hơn loài Huperzia serata. Cây trồng trong điều kiện độ ẩm cao ( các khu rừng ẩm ướt) cũng cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với cây trồng trong môi trường có độ ẩm thấp. Lượng HupA cũng thay đổi đáng kể theo mùa, cao nhất giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân. Hàm lượng Huperzine A cao nhất loài H. pinifolia (1765.9 µg g-1 dw), hàm lượng Huperzia elmeri từ Philippines (60 µg g-1 ) và H. carinata (1030 µg g-1 ) từ Queensland, Australia. Còn với H. serrata từ Trung Quốc đạt từ 80,2- 182,6 µg g-1 [5]. Trong điều kiện Việt Nam chỉ có thể nuôi trồng được H. serrata như của Trung Quốc. 1.1.2. Hoạt chất Huperzine A (HupA) Huperzine A là một Lycopodium alkaloid, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa. Các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên cô lập được chất này từ cây và tiến hành các thí nghiệm lâm sàng cũng như các ứng dụng điều trị các bệnh rối loạn trí nhớ tại Trung Quốc. Sau đó, các nhà khoa học phương Tây cũng nghiên cứu và đã kết luận HupA có tác dụng rất tốt trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt đối với bệnh Alzeimer. 1.1 2 1 Bệ Bệnh Alzheimer (AD, SDAT) hay đơn giản là Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất. Vào năm 1906, lần đầu tiên bác s tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer đã chỉ ra căn bệnh này không thể chữa được, mang tính thoái hóa và gây tử vong. Căn bệnh này được đặt theo
  • 16. 8 tên ông. Trong những năm 1970 - 1985 khoa học nhận thấy người mất trí các lứa tuổi khác nhau lại có triệu chứng lâm sàng giống nhau. Khi bệnh tiến triển, các triệu chứng bao gồm sự nhầm lẫn, khó chịu, thay đổi tâm trạng, mất khả năng phân tích ngôn ngữ, mất trí nhớ dài hạn, suy giảm các giác quan. Dần dần, cơ thể sẽ mất đi một số chức năng, cuối cùng dẫn đến cái chết. Bệnh Alzheimer có thể phát triển tiềm tàng trong một thời gian dài trước khi xuất hiện những triệu chứng có thể phát hiện được bệnh. Thông thường khi các triệu chứng này bộc lộ, thì người bệnh chỉ có thể sống được khoảng 7 năm, dưới % bệnh nhân sống thọ thêm 14 năm sau khi phát hiện bệnh. Bệnh này thường xuất hiện người trên 65 tuổi, tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy ra sớm hơn rất nhiều. Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên toàn thế giới. Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1,18% vào năm 2050. Hiện nay khoa học vẫn chưa hiểu rõ nguyên nhân và tiến triển của bệnh Alzheimer. Nghiên cứu cho thấy căn bệnh này có liên quan với các mảng và đám rối trong não. Các phương pháp điều trị hiện tại chỉ giúp giảm một phần nhỏ triệu chứng bệnh, chưa có phương pháp trị liệu nào có thể ngăn chặn hoặc làm chậm tiến triển của bệnh. Tính tới thời điểm 200 , đã có hơn 500 thử nghiệm lâm sàng nhằm tìm ra phương pháp chữa trị bệnh Alzheimer, nhưng vẫn chưa biết có kết quả nào khả quan trong các phương pháp đã được thử nghiệm. Một số thói quen sống đã được đưa ra khuyến cáo nhằm phòng ngừa bệnh Alzheimer, nhưng cũng chưa có đủ chứng cớ cho thấy những khuyến cáo này có thể làm giảm sự thoái hóa não. 1 1 2 2 đ ề ị bệ HupA là một alkaloid, có cấu trúc hóa học là C15H18N2O (hình 1.2), có trọng lượng phân tử là 242, 2, nhiệt độ nóng chảy 2 0o C, tan trong methanol, ethanol, ít hòa tan trong nước. Cơ chế của Hup A trong điều trị bệnh là: Trong cơ thể người, não sản xuất ra một chất truyền thần kinh là acetylcholine có chức năng quan trọng trong chuyển động cơ bắp, suy ngh và trí nhớ; aceteycholine bị ức chế, gây thoái hóa b i enzym acetylcholinesterase (AChE). Hoạt chất HupA có tác
  • 17. 9 dụng ức chế việc sản sinh ra acetylcholinesterase, giúp cho việc làm giảm lượng enzym này và khi đó lượng acetylcholine trong não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện [10]. Trong một nghiên cứu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng 5 % bệnh nhân Alzheimer cải thiện đáng kể cả hai chức năng nhận thức và trí nhớ khi dùng 200 mcg HupA m i ngày. Ngoài ra, tác dụng tích cực ghi nhận những bệnh nhân này về chất lượng cuộc sống cũng như khả năng tìm lại những kỷ niệm đã qua trong quá khứ, nó không chỉ h trợ điều trị hiệu quả cho não bộ của người bệnh Alzheimer, người già có biểu hiện suy giảm trí nhớ mà còn có hiệu quả trong việc cải thiện trí nhớ người lớn khỏe mạnh. Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Huperzine A [9] So với các loại thuốc dược phẩm tacrine, donepezil, rivastigmine và galanthamine; HupA và dẫn xuất bán tổng hợp của ZT-1 có hoạt động chống AChE tốt hơn, thời gian dài hơn, khả dụng sinh học đường uống cao hơn và ít tác dụng độc hại hơn [4, 5]. HupA đã được phê duyệt trong năm 1990 Trung Quốc như là một thuốc điều trị Alzheimer và bán trên thị trường Mỹ như một chế độ ăn uống bổ sung, và ZT-1 đã được hoàn thành giai đoạn II lâm sàng thử nghiệm cả Trung Quốc và châu Âu, năm 2007 nước Pháp coi đây là vấn đề phải quan tâm hàng đầu của quốc gia [4]. 1.2. VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT Vi nấm nội sinh – fungal endophyte sống mô sâu thực vật, thể hiện mối liên kết giữa cây và nấm bằng cách hình thành khuẩn lạc trong mô tế bào thực vật các giai đoạn sinh trư ng phát triển cây chủ, thường không gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho cây [12, 13].
  • 18. 11 1 2 1 3 Sự yề ự ậ Vi nấm nội sinh có thể lây nhiễm từ phần này sang phần khác trong cây chủ (truyền ngang), hoặc các cây di truyền cho các thế hệ sau (truyền dọc). Ví dụ cho cơ chế truyền ngang: một số nghiên cứu chỉ ra rằng, trong hạt giống và cây hầu như không chứa nấm nội sinh, tuy nhiên tỷ lệ nấm nội sinh tăng lên khi lá hay hạt lớn lên [16, 17]. Còn số nấm nội sinh loài Neotyphodium và Epichloë lại được truyền theo chiều dọc lưu trữ trên thế hệ con cháu [18]. 1.2.2. Một số nghiên cứu về phân lập nấm nội sinh trong các loài thực vật khác nhau Mặc dù nấm nội sinh trong thực vật đã được biết đến thế kỷ trước, nhưng chúng mới chỉ được quan tâm chú trọng tới trong vòng hơn 0 năm tr lại đây. Năm 19 1, Webber là nhà nghiên cứu đầu tiên công bố phát hiện nấm nội sinh Phomopisis oblonga cây Du (Ulmus). Loài nấm này sau đó được Clayton và cộng sự xác định thuộc Xylariaceae [12]. Từ đó đến nay, một loạt các nhóm cây cũng đã được phát hiện là có vi nấm nội sinh sống trong cây. Một số nghiên cứu vi nấm nội sinh thực vật trong những năm gần đây: - Nấm nội sinh cây thông đỏ (Taxus brevifolia): Năm 1995 – 1996, các nghiên cứu ngoài nước đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã được phân lập từ cây thuộc các chi: Taxomyces sp., Pestolotiopsis sp., Penicillium sp. và Truncatella sp [13]. Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã đưa ra biểu đồ về quy luật phân bố của các chủng nấm nội sinh trên các bộ phận của cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Theo đó, vi nấm nội sinh được phân bố trên tất cả các bộ phận khác nhau, nhiều nhất lá (50 chủng), thân (4 chủng), cành ( 9 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là quả (1 chủng). Bằng phương pháp phân loại hình
  • 19. 12 thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101và Gongroniella butleri SHT106 [13]. - Nấm nội sinh trong cây thầu dầu (Ricinus communi): Sardul và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân lập nấm nội sinh trong cây thầu dầu Ấn Độ. Các nhà khoa học cho rằng các nấm nội sinh này có khả năng sản sinh hoạt chất Hypericin (C30H16O8) có hoạt tính kháng sinh chống vi khuẩn E.Coli, các loài Samonella sp., Staphylococus sp. và các nấm Candida sp.. Kết quả, từ 46 mẫu (16 lá, 16 thân và 14 rễ) đã phân lập được 10 chủng nấm nội sinh thuộc các chi Aspergillus sp. , Fusarium sp., Curvularia sp., Alternaria sp., Dreschslera sp [8]. - Nấm nội sinh trong chi cỏ xạ hương (Thymus): Cỏ xạ hương được biết đến như một loại gia vị, ngoài ra nó còn là một cây thuốc có tác dụng giảm đau, kháng viêm. Tại tỉnh Hameda – Iran, Sahar và cộng sự thu nhập các mẫu cây từ 6 loài cỏ xạ hương khác nhau vào ba thời điểm mùa xuân, hè, thu năm 2011 để tiến hành phân lập các chủng nấm nội sinh trong cây. Từ 00 mẫu cây thu được đã phân lập được 95 chủng thuộc 11 chi nấm khác nhau, ngoài ra còn có 6 loại nấm men. Gồm các chi: Fusarium sp., Aspergillus sp., Alternaria sp., Stemphylium sp., Ulocladium sp., Phoma sp., Curvularia sp., Cylindrocarpon sp., Cylindrocarpon sp; trong đó , các chi Alternaria sp., Phoma sp., Fusarium sp. là phong phú nhất. - Nấm nội sinh trong cây kiwi (Actinidia macrosperma): Ở Trung Quốc, cây Kiwi là một cây thuốc dùng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau như bệnh phong, áp xe, viêm thấp khớp, viêm khớp, vàng da, và huyết trắng bất thường. Trong nghiên cứu điều tra vi nấm nội sinh trong kiwi và xác định hoạt tính sinh học của chúng thu được 17 chủng vi nấm nội sinh phân lập được từ cây Kiwi Trung Quốc, có 11 chủng thuộc 5 chi khác nhau: Acremonium sp., Cylindrocarpon sp., Trichoderma sp., Paecilomyces sp., và Chaetomium sp. Sáu chủng với các đặc điểm hình thái và dữ liệu phân tử còn giới hạn nên mới chỉ xác định thuộc lớp Ascomycete [19].
  • 20. 13 1.2.3. Ứng dụng của vi nấm nội sinh trong thực vật 1 2 3 1 T ô ệ Các chất có hoạt tính sinh học được sản xuất trực tiếp từ vi nấm nội sinh, hay là sản phẩm kết hợp giữa mối quan hệ tương tác giữa nấm và thực vật, giúp cho vi nấm nội sinh thích ứng tốt hơn và thực hiện một số chức năng bảo vệ, cung cấp các chất có lợi cho cây chủ [13]. Bên cạnh đó, vi nấm nội sinh cũng có thể là nguyên nhân gây biến đổi sinh lý cây chủ giúp cây chủ chống lại được với điều kiện sống bất lợi. Acremonium sp. là một dạng nấm nội sinh được biết đến khả năng có thể kiểm soát côn trùng gây hại. Lợi dụng tính chất này, Koga và cộng sự đã thực hiện cấy nhiễm nấm chi Acremonium vào các cây để chúng có thể truyền cho cây chủ khả năng kháng lại sự cạnh tranh với các loài gây hại cho cây. Kết quả nghiên cứu công bố đã cấy nhiễm thành công vào cây cỏ đuôi trâu (Festuca arundinacea) và cỏ hắc mạch (Lolium perenne), các cây này đã kháng lại được sâu kéo màng cỏ Poa P. teterrella [12]. Năm 1999, Pereira và cộng sự đã áp dụng trên cây chuối.Việc cấy nhiễm nấm nội sinh vào cây chuối không chỉ giúp cây có khả năng kháng lại thuốc diệt nấm mà nó còn đột biến để duy trì sự đối kháng [12]. Beauveria bassiana là loại nấm diệt côn trùng bằng cách gây bệnh lên côn trùng giai đoạn ấu trùng và trùng. Nấm này được cấy nhiễm vào một số hạt ngũ cốc để chống lại các côn trùng tấn công cây chủ trong một số giai đoạn sinh trư ng và phát triển. Tuy nhiên, trong một số cây đã tìm thấy sự có mặt của loài này, chứng tỏ nấm này có dạng nội sinh tự nhiên không liên quan tới quá trình nấm xâm nhập vào cây. Ngoài ra, một số nấm gây bệnh trên côn trùng cũng đã được phân lập trên một số cây trồng khác [12]. 1 2 3 2 T y dư Các chất có hoạt tính sinh học được sản sinh b i các vi nấm nội sinh được đánh giá là có tiềm năng phát triển trong l nh vực y dược. Theo các nghiên cứu đánh giá, vi nấm nội sinh cung cấp hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trúc độc đáo, bao gồm: alkaloid,
  • 21. 14 benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, steroid, terpenoid, tetralon,... [20]. Các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi như hóa chất nông nghiệp, thuốc kháng sinh, ức chế miễn dịch, chất chống oxy hóa và chất chống ung thư [18]. Ergoflavin (C30H26O14) thuộc nhóm hợp chất Ergochromes được mô tả như là một tác nhân chống ung thư mới được phân lập từ một loại nấm nội sinh phát triển trên lá của cây thuốc Sến xanh (một loài thuộc họ Hồng xiêm) Ấn Độ [21]. Chủng nấm nội sinh Penicillium brasilianum được tìm thấy trong vỏ rễ cây Xoan, thúc đẩy sự sinh tổng hợp các amit phenylpropanoid - nhóm chất Phenylpropanoid này được chú ý vào việc sử dụng như thuốc chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm. Chủng nấm F0010 thuộc chi Xylaria sp. nội sinh trong cây thân g được mô tả là sản xuất ra Griseofulvin – một chất kháng sinh chống nấm được dùng điều trị cho người và động vật. Chất chống oxy hóa tự nhiên thường được tìm thấy trong cây thuốc, rau và trái cây. Tuy nhiên, chất chuyển hóa từ nấm nội sinh có thể là một nguồn tiềm năng của chất chống oxy hóa tự nhiên mới. Pestacin (C15H14O4) đã thu được từ các loại nấm nội sinh Pestalotiopsis sp. phân lập từ cây Terminalia morobensis. Pestacin được cho là có hoạt tính chống oxy hóa gấp 11 lần lớn hơn trolox - một dẫn xuất vitamin E [20]. Ngoài ra, các nhà khoa học đã tách chiết được rất nhiều các chất có hoạt tính sinh học có ứng dụng cao trong y dược từ các nấm nội sinh thuộc các chi: Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Penicillium, Pestalotiopsis, [20] 1. . TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới 1 3 1 1 ề y T ạ ù ư Hầu hết hoạt chất Huperzine A hiện đang sử dung được tách chiết từ cây Thạch tùng răng cưa và các cây thuộc họ Thạch tùng. Tuy nghiên, trong cây Thạch tùng răng cưa chứa rất ít lượng Huperzine A. Bên cạnh đó, loài cây
  • 22. 15 này phải mất nhiều thời gian để phát triển (phải mất ít nhất 15 năm từ khi bào tử nảy mầm cho đến giai đoạn trương thành), đòi hỏi điều kiện phát triển ngặt nghèo và chi phí cao trong trồng trọt. Mặc dù các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra nhân giống in vitro có thể cung cấp lượng HupA cao hơn cây trồng tự nhiên [7, 6]; tuy nhiên, nó vẫn mất rất nhiều thời gian để có thể đủ lượng sinh khối cho thu nhận HupA nên chưa thể đáp ứng được hết nhu cầu của ngành công nghiệp dược. Gần đây, nấm nội sinh thực vật được phân lập từ các loại cây được chấp nhận như là nguồn nguyên liệu quan trọng cung cấp cho ngành công nghiệp dược. Một lượng lớn các chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học đa dạng đã được chiết xuất từ nấm nội sinh [22]. Do vậy, các nhà khoa học đã quan tâm đến việc nghiên cứu các chủng nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa có khả năng sản sinh hoạt chất HupA nhằm thay thế cho phương pháp chiết xuất hoạt chất từ cây trồng tự nhiên, giúp tăng cường lượng HupA phục vụ ngành công nghiệp dược. Đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan được công bố, đặc biệt là Trung Quốc – nơi có cây H. serrata phân bố nhiều. Hợp chất Hup A được tìm thấy sinh tổng hợp b i các loài nấm nội sinh trong cây H. serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Coniochaeta, Rhizoctonia, Alternaria, Plectosphaerella,Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis. Với phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái và bằng phân tích trình tự ITS – rDNA, Shi và cs (2005) đã phân lập được 4 chủng: Cephalosporium sp., Plasmoparad sp., Saccharomyces sp., Penicillium sp. nội sinh trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh An Huy [21]; Huang và cs (2009) đã phân lập được 4 chủng trong cây H. Serrata trồng tại tỉnh Hồ Nam (Cladosporium sp., Penicillium sp., Fusarium sp., and Coniothyrium sp.) [23]; Chen và cs (2011a,b) – sau khi khử trùng mẫu rễ, thân, lá cây H. Serrata bằng ethanol và sodium hypochloride, các mẫu cây được đặt nuôi trên môi trường PDA có bổ sung streptomycin sunfate - đã phân lập được 52 chủng nấm nội sinh trong cây H. serrata trồng tỉnh Hải Nam và 5 chủng trong cây trồng tỉnh Quảng Tây, các chủng này thuộc 26 chi (Colletotrichum, Trichoderma, Fusarium, Coniochaeta, Rhizoctonia,
  • 23. 16 Alternaria, Aspergillus, Plectosphaerella, Podospora, Cyphellophora...)[24]. Trong đó - bằng kỹ thuật phân tích sắc ký màng lỏng (TLC) và sắc ký màng lỏng hiệu năng cao (HPLC) - Li và cộng sự (2007) đã xác định được chủng Acremonium sp. 2F09P0 B sản sinh HupA với hàm lượng , 2µg l [25]; Wang và cộng sự (2011) - với phương pháp khử trùng mẫu thân, lá cây H. serrata bằng ethanol và mercuric chloride, sau đó đặt các mẫu cây trên môi trường PDA có bổ sung streptomycin và ampicilin - đã phân lập được 127 chủng nấm, trong đó bằng nhận dạng hình thái và phân tích trình tự ITS đã định dạng được 69 chủng thuộc 19 chi nấm Aspergillus, Podospora, Penicillium, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis... [34]. Bằng kỹ thuật phân tích sắc ký màng lỏng (TLC) và sắc ký màng lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã xác định được 9 chủng có khả năng sản sinh HupA và chủng Shiraia sp. Slf14 cho sản lượng HupA cao nhất là 27, µg L [26]; trình tự gennom của chủng Shiraia sp. Slf14 đã được Zhang và cs công bố vào 2014. 1 3 1 2 ạ Các chủng giống vi nấm có khả năng sinh tổng hợp HupA là nguồn cung cấp HupA dễ kiểm soát và thao tác, có thể thu với lượng lớn với thời gian nhanh nhất. Tuy nhiên, chủng sản phân lập từ tự nhiên thường có khả năng tổng hợp hoạt chất sinh học thấp. Thông thường, để chủng có khả năng tổng hợp hoạt chất sinh học cao, có giá trị trong công nghiệp cần phải áp dụng các phương pháp nâng cao hoạt tính như lựa chọn các điều kiện, môi trường nuôi cấy thích hợp, tối ưu thành phần môi trường lên men theo mô hình đáp ứng bề mặt... hoặc gây đột biến chủng (đột biến cảm ứng, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, điều khiển hoạt động của gen, gây đột biến định hướng). Theo các tài liệu đã công bố hoạt tính huperzin A của các chủng nấm nội sinh khác nhau dao động từ ,32 đến 27, mcg L dịch lên men. Tuy nhiên nhiều chủng nấm dại phân lập có hoạt tính thấp, cần có sự nghiên cứu về thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, điều kiện lên men để tăng khả năng sản sinh Hup A. Các chủng nấm nội sinh tổng hợp Hup A cần nhiều chất dinh dưỡng đặc biệt trong môi trường sống, chúng phát triển tốt
  • 24. 17 trong cây thạch tùng và độ cao và nhiệt độ đặc biệt cho nên trong môi trường tổng hợp Hup A có lẽ cũng cần một số chất đặc biệt. Tuy nhiên, hai yếu tố nguồn cacbon và nguồn nito trong môi trường vẫn đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp Hup A. Các chủng vi nấm khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nito khác nhau để sinh tổng hợp Hup A. Theo Zhao X-M và cộng sự (201 ), khi nghiên cứu ảnh hư ng của nguồn cacbon đến tổng hợp Hup A của chủng Colletotrichum gloeosporioides ES026 cho thấy nguồn cacbon, glucose và sucrose, tổng hợp HupA cũng như hệ sợi mạnh hơn trong khi nguồn cacbon maltose cũng chủng này thì ngược lại [27]. Nghiên cứu tối ưu các điều kiện lên men khác nhau để sản xuất HupA từ C. gloeosporioides ES026 đã làm tăng 25,5 % sản lượng HupA. Môi trường khoai tây bổ sung glucose hoặc sucrose nhưng không có maltose đã làm tăng khả năng sản xuất HupA từ nấm. Ethanol được bổ sung vào môi trường đạt nồng độ cuối cùng 0,5-2% đã kích thích sự phát triển của nấm trong khi methanol với lượng tương tự đã ức chế sự tăng trư ng. Tuy nhiên, cả methanol và ethanol đã làm tăng khả năng sản xuất HupA lên nhiều (năng suất cao nhất của HupA tăng 51, 9% khi bổ sung ethanol). Phân tích sâu hơn cho thấy cả ethanol và methanol là chất cảm ứng mạnh mẽ cho sản xuất HupA, trong khi ethanol một phần được sử dụng như một nguồn carbon trong quá trình lên men. Màu sắc của sợi nấm dần dần tr nên đen khi cho ethanol trong khi cho methanol thì sợi nấm có màu xám trong suốt quá trình lên men. Các nghiên cứu này đã cho thấy tầm quan trọng của việc tối ưu hóa quá trình lên men, trong đó, kết hợp với các chất gây cảm ứng đem lại hiệu quả sản xuất hợp chất Hup A từ nấm nội sinh. Theo Zhu và cộng sự (2010), chủng nấm Shiraia sp. Slf14 sau khi lên men 14 ngày 2 o C cho lượng Hup A đạt 27, mcg L dịch lên men [26]. Nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp Hup A của chủng Shiraia sp. Slf14, Yan và cộng sự (2014) đã bổ sung vào môi trường lên men một số chất cảm ứng HSE (H. serrata extracts - tách chiết từ cây, lá thạch tùng răng cưa), L-Lysine và acid acetic với các nồng độ khác nhau, lên men 2 o C trong 14 ngày [28]. Việc bổ sung L-Lysine và HSE đã kích thích khả năng sinh Hup A và hệ
  • 25. 18 sợi nấm, với acid acetic thì ngược lại. Bổ sung 1 lượng rất nhỏ HSE đã làm tăng khả năng sinh Hup A, đạt 40 mcg g sinh khối khô. Đặc biệt, chủng Shiraia sp. Slf14 bổ sung 0,2 g L-1 l-lysine trong môi trường nuôi cấy năng suất Hup A tăng đến 296,7 mg L-1, cao hơn so với đối chứng không bổ sung L-Lysine khoảng 40%. Theo Zhou và cộng sự (2009), để tăng sản lượng huperzin A của nấm nội sinh Penicillium chrysogenum SHB từ cây họ Thạch sam (Lycopodium serratum), các điều kiện lên men lỏng đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy điều kiện lên men lỏng thích hợp nhất của SHB để sản xuất huperzin A là 28℃, pH ban đầu 6,4, tỉ lệ giống 12% , tuổi giống 4 giờ, khuấy 160 vòng phút và lên men trong ngày. Dưới những điều kiện này năng suất huperzin A có thể đạt 7,21 mcg /ml [28]. 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa mới được phát hiện tại Sa Pa, Lâm Đồng độ cao 1.000 m. Đây là loài cây dược liệu quý hiếm, thuộc danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị bệnh tại Việt Nam. Ở Việt Nam trước đây đã có nhiều đề tài nghiên cứu về vi nấm nội sinh; tuy nhiên, các nghiên cứu về nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa Việt Nam đến nay là chưa có công bố. Gần đây, tại Viện Công nghệ sinh học các nhà khoa học đã phân lập được một số chủng vi nấm nội sinh từ cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Sa Pa và Đà Lạt. Bằng phương pháp sắc ký màng mỏng (TLC) và sắc ký hiệu năng cao (HPLC), nhóm đề tài đã xác định được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA thuộc các chi Penicillium, Fusarium, Xylaria, Fungal Endophyte...; trong đó có chủng Penicillium sp. LĐL4.4 được phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt. Các kết quả này là tiền đề và cơ s khoa học để các nhà khoa học thực hiện các nghiên cứu tiếp theo về tạo nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu sản xuất HupA nhằm phục vụ h trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer Việt Nam.
  • 26. 19 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM 1.4.1. Ảnh hưởng của nuôi cấy đến sự sinh trưởng phát triển của vi nấm Sự sinh trư ng hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể được mô tả bằng khả năng hình thành các pellet, kích thước của các pellet và sinh khối sợi nấm thu được. Trong đó, sinh khối sợi là tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá khả năng sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể. Sự sinh trư ng và phát triển của nấm trong môi trường nhân giống dịch thể chịu ảnh hư ng của tát cả các yếu tố như thành phần dinh dưỡng, pH của môi trường, nhiệt độ nuôi cấy và tốc độ lắc trong quá trình nuôi giống. Độ pH môi trường nhân giống có ảnh hư ng đến chức năng của mảng tế bào, hình thái và cấu trúc tế bào, độ hòa tan của các muối, các ion, sự hấp thụ các chất dinh dưỡng và quá trình sinh tổng hợp các chất khác nhau. Các tế bào chỉ có thể phát triển trong một phạm vi pH nhất định và sự hình thành chuyển hóa các chất cũng chịu ảnh hư ng của giá trị pH [30]. Kim và cộng sự (200 ) đã báo cáo rằng, nồng độ các hợp chất polysaccharide ngoại bào và sinh khối sợi nấm đạt giá trị cao nhất tại pH = 6 và sẽ giảm dần khi giảm pH xuống ,0 hay tăng dần pH lên 9,0 [31] . Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh tổng hợp các chất tạo sinh khối sợi phụ thuộc vào m i loại nấm và điều kiện nuôi cấy. Nguồn dinh dưỡng carbon khác nhau có ảnh hư ng trực tiếp đến khả năng phân giải và hấp thụ dinh dưỡng của tế bào. Glucose và sucrose là 2 nguồn carbon mang lại hiệu quả sinh tổng hợp các hợp chất polysaccharide và tạo sinh khối sợi cao nhất đối với nấm. Nguồn dinh dưỡng nitrogen được sử dụng cho sự tăng trư ng hệ sợi nấm là amoniac, muối amoni, axit amin và nitrogen hữu cơ phức tạp [32]. Nitrogen hữu cơ được sử dụng rộng rãi nhất cho hầu hết các loại nấm và cho hiệu quả sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trưòmg dịch thể cao hơn nguồn vô cơ.
  • 27. 20 Ngoài dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy cũng là một yếu tố ảnh hư ng đến sự sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể. Nhiều nghiên cứu cho thấy, tốc độ lắc là cơ s duy nhất để cung cấp oxy hòa tan cho quá trình sống của sợi nấm trong môi trường dịch lòng, ảnh hư ng đến khả năng cuộn xoắn cùa hệ sợi nấm và ảnh hư ng trực tiếp đến hình thái kích thước pellet cũng như sinh khối sợi nấm thu được 1.4.2. Các nguồn dinh dư ng trong sinh trưởng của vi nấm Dinh dưỡng nấm mốc thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng. Đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được sử dụng – dinh dưỡng nội bào. Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trư ng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào. 1 2 1 D dưỡ b Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm mốc bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác như đường, rượu, acid hữu cơ, acid amin, Hầu hết các loài nấm mốc đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulase. Vì vậy, nấm mốc không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose. Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm mốc sử dụng đặc biệt là đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm mốc. Glucose được coi như nguồn carbon vạn năng đối với vi sinh vật. Trong môi trường có một h n hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trư ng tốt sẽ được ư tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường được gọi là
  • 28. 21 tính đa dưỡng của nấm mốc. Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết. Những loại nấm mốc cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau. Các loài khác nhu sẽ đồng hòa các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Các nguồn carbon khác thường được sử dụng cho dinh dưỡng nấm mốc như saccarose, maltose, lactose, các acid béo, 1 2 2 D dưỡ ơ Nguồn nito cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường. Các hợp chất hữu cơ chứa nito của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và pyrimidin, protein và một số vitamin. Nguồn nito vô cơ được nấm mốc sử dụng tốt là các muối amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amoni sucxinat. Trong môi trường có muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng. Các nguồn nito hữu cơ thường là h n hợp các acid amin, các peptid, các nucleic, Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên làm nguồn nito hữu cơ. Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc các acid amin vừa là nguồn nito vừa là nguồn carbon dinh dưỡng. Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acid amin mơi như là chất cho nhóm amin (NH2-). 1 2 3 D dưỡ y ố ô ơ Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm mốc bao gồm các nguyên tố phospho, kali, magie và lưu huỳnh, - Phospho: tham gia vào các thành phần quan trong của tế bào, như các nucleoproteic, acid nucleic, polyphosphate, phospholipid, Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng. Nấm mốc sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là
  • 29. 22 orthophosphate. Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K. - Lưu huỳnh: là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (SH-) của một số enzyme CoA. B i vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp được protein. Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin, vitamin và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amoni và nguồn lưu huỳnh. - Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men. Thông thường ion K+ được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca2+, Mg2+ thường có mặt trong nước sinh hoạt, tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ quá cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước). Giúp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn. 1 2 D dưỡ á ưở Những chất kích thích sinh trường là các vitamin, các base purin và pyrimidin. Những nhân tố sinh trường cơ bản đối với nấm mốc là vitamin nhóm B, tiamin và acid paraaminobenzic. Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc quy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây, làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường. 1.5. TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN 1.5.1. Khái niệm chung
  • 30. 23 a) Khái niệm đột biến sinh học: Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền cấp độ phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các đời sau [34] - Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định hướng cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên. - Đa số là đột biến gen lặn và có hại, một số ít có lợi và có ý ngh a rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống. b) Phương pháp tạo đột biến [33] - Tạo đột biến bằng việc sử dụng các tác nhân vật lí - Tạo đột biến bằng các tác nhân hóa học - Tạo giống bằng phương pháp sốc nhiệt c) Cơ s khoa học của chọn giống bằng phương pháp đột biến [33] - M i một kiểu gen nhất định của một giống chỉ cho một năng suất nhất định. Trong điều kiện nuôi trồng tối ưu thì thì m i giống chỉ cho một năng suất tối đa nhất định (mức phản ứng của kiểu gen). - Để thu được hiệu năng cao hơn thì phải thay đổi vật chất di truyền của giống do đó ta sử dụng các tác nhân vật lí, hóa học tác động vào bộ máy di truyền để gây đột biến. 1.5.2. Quy trình tạo giống bằng phương pháp gây đột biến Quy trình tạo giống mới bằng phương pháp gây độ biến gồm các bước : Bước 1: Xử lí mẫu vật bằng tác nhân gây đột biến Bước 2: Chọn lọc các thể đột biến có kiểu hình mong muốn Bước : Tạo dòng thuần chủng 1.5.2.1. Xử í ẫ ậ bằ á y đ b ế a) Sử dụng tác nhân vật lí (Bảng 1.1)
  • 31. 24 Bảng 1.1. Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến Loại tác nhân Cơ chế tác động Cách sử dụng Các loại tia phóng xạ (tia X, tia gama, tia bêta, chùm nơtrôn...) Kích thích và iôn hóa các nguyên tử khi chúng đi xuyên qua các mô sống. Các phân tử ADN, ARN trong tế bào chịu tác động trực tiếp của các tia phóng xạ hoặc chịu tác động gián tiếp của chúng qua quá trình tác động lên các phân tử nước trong tế bào (đặc biệt là các gốc OH- và H2O2 sinh ra có tác dụng ôxi hóa rất mạnh) làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN gây ra đột biến gen và đột biến NST. Chiếu xạ với cường độ và liều lượng thích hợp lên đỉnh sinh trư ng của thân, cành hoặc hạt phấn, bầu nhụy, mô thực vật nuôi cấy. Tia tử ngoại Không có khả năng xuyên sâu và ion hóa các nguyên tử mà chỉ có khả năng kích thích, nhưng khi được tế bào hấp thu nó cũng gây ra đột biến gen và đột biến NST. Nhiệt độ Tăng giảm nhiệt độ đột ngột (sốc nhiệt) làm cơ chế nội cân bằng của cơ thể không kh i động kịp gây chấn thương bộ máy di truyền Thay đổi nhiệt đôi môi trường cách đột ngột b) Sử dụng tác nhân hóa học (Bảng 1.2): Bảng 1.2. Cơ chế tác động của tác nhân hóa học gây đột biến Loại tác nhân Cơ chế tác động 5BU(5 brôm uraxin) Thay thế T, chuyển đổi cặp A-T thành G-X qua nhân đôi ADN: A-T => A-5BU => G-5BU => G-X. Etyl metal sunfonat (EMS) Gây đột biến thay thế cặp G-X thành cặp A-T NMU Thay thế G –X thành X- G hoặc A-T Acridin Gây đột biến mất hoặc thêm cặp Nu, nếu được chèn vào mạch khuôn cũ gây đột biến thêm cặp Nu Côsixin Rối loạn hình thành thoi vô sắc dẫn đến rồi loạn phân li cặp nhiễm sắc thể
  • 32. 25 1 5 2 2 C ọ ọ á ể đ b ế ó ể ì ố Khi trong quần thể giống xuất hiện các đột biến, dựa vào những đặc điểm có thể nhận biết để tách các cá thể mang đột biến có lợi ra khỏi quần thể giống. 1 5 2 3 Tạ dò ầ Sau khi nhận biết được thể đột biến mong muốn, ta cho chúng sinh sản để nhân lên thành dòng thuần chủng theo đột biến tạo được. 1.5.3. Đột biến chủng bằng tia UV Tia UV có thể tạo ra đột biến giữa 2 vòng pyrimidine (cystosine hoặc thymine) để tạo nên 2 liên kết giữa chúng. Tia cực tìm tạo ra cầu nối dimer giữa các nhóm cytosine gần nhau. Việc dimer cytosine có thể tạo ra adenine (thay vì guanine) được bổ sung vào các sợi mới. Quá trình sao chép AND, CC (thể dại) thành TT (đột biến). Mặc dù, các đột biến điểm dimer cytosine trên ADN có thể được sửa chữa b i hệ thống của tế bào nhưng không thể hết. Kết quả là cặp GC, GC (tự nhiên) thành AT, AT (đột biến) sau khi chiếu UV. 1.5.4. Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine) NTG là một trong những hóa chất gây đột biến được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu hiện nay, có công thức phân tử C2H5N5O3. NTG gây đột biến mạnh thuộc lớp alkyl hóa. Dạng alkyl hóa gây đột biến bằng cách thêm nhóm methyl hoặc nhóm ethyl trên các bazo, đó tạo sự thay đổi khi kết cặp của các bazo trên sợi ADN. Cơ chế của sự đột biến này là đột biến điểm, làm biến đổi bazo gây ra sự kết cặp sai. NTG gây ra là các đột biến điểm, thay thế cặp GC bằng cặp AT, một số rất ít các trường hợp dẫn đến dịch chuyển khung đọc hoặc mất đoạn [34]. 1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [35] 1.6.1. Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography – TLC) Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua
  • 33. 26 pha t nh trên đó đã chấm h n hợp các chất cần tách. Pha t nh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong h n hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha t nh và dung môi làm pha động. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = Trong đó: - a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. - b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. - Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi, vị trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tương đối Rr. Hệ số dịch chuyển tương đối Rr được xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu được sắc ký trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với mẫu thử: Rr 
  • 34. 27 Trong đó: + a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. + c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn, tính bằng cm. 1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC ) 1 6 2 1 K á ệ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (hay còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong h n hợp [36]. Sắc ký lỏng hiệu lăng cao do Csaba Horváth biên soạn lần đầu cho bài báo Pittcon 1970 của ông, ban đầu chỉ ra rằng áp lực cao được sử dụng để tạo ra dòng chảy cần thiết cho sắc ký lỏng các cột đóng [37]. Ban đầu, máy bơm chỉ có một áp suất 500 psi ( 5 bar). Đây được gọi là sắc ký lỏng cao áp , hoặc HPLC, là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong h n hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa h n hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. M i thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của m i thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột. Sắc ký lỏng hiệu suất cao bây giờ là một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa học phân tích [36]. Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: - Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption liquid chromatography). - Sắc ký phân bố (partition chromatography). - Sắc ký ion (ion chromatography).
  • 35. 28 - Sắc ký rây phân tử (size exclusion gel permeation chromatography). Trong sắc ký phân bố nói chung, pha t nh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: - Pha t nh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý: sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). - Pha t nh liên kết hóa học với chất nền : sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography). Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: - Hòa tan mẫu phân tích. - Phù hợp với đầu dò. - Không hòa tan hay làm mòn pha t nh. - Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. - Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade). Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng h n hợp dung môi MeOH nước trước, rồi ACN nước hay THF nước. Với một h n hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các h n hợp MeOH, ACN và THF hoặc ethylenglycol với nước có độ rửa giải tương đồng. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn [36]. 1 6 2 2 y ắ Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong h n hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn nhau: Pha t nh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của h n hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp thụ hoặc phân bố
  • 36. 29 vào pha t nh tùy thuộc vào bản chất của cột và chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách [36]. Các chất sau khi ra khỏi cột tách sẽ được phát hiện b i bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. 1 6 2 3 Cơ ở ý yế Quá tình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha t nh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theobaor chất pha t nh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách của các chất ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký chúng ta có sắc đồ [36]. 1 6 2 y ắ ạ ệ ố C Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau [36]: - Hệ thống bơm: Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) - Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi: Bình chứa dung môi bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ 0.45 µm) và đuổi khí hòa tan. - Hệ tiêm mẫu: Để đưa mẫu phân tích vào cột. Có nhiều phương phap tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Mẫu thử (dạng lỏng hay rắn) đều phải hòa tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0.45µm trước khi tiêm. - Cột sắc ký lỏng HPLC: Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar
  • 37. 30 + Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pah t nh có đường kính rất nhỏ ( .5, 10 µm). + Đường kính cột: 4 hoặc 4.6 mm Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu sử dụng đúng cách. Ví dụ dung môi có tính chất axit mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay các nguyên liệu bẩn thì tuổi tho của cột sẽ bị giảm. - Detector trong HPLC: Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất cần phân tích mà sử dụng hay detector hấp thụ UV – VIS. Nguyên lý hoạt động của detector UV – VIS dựa trên nguyên lý hoạt động của phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa. 1 6 2 5 Ứ dụ C Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng cso ứng dụng chính: - Định tính và thử độ tinh khiết: Thời gian lưu của các chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ. - Sắc ký điều chế: Qua quá trình sắc ký các chất được tachs ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất. - Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lơn trong định lượng chất trong h n hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha t nh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả
  • 38. 31 năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong l nh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi nấm nội sinh Penicillium sp. LĐL 4.4 phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt - Việt Nam, đã được xác định có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A. Chủng Penicillium sp. LĐL4.4 hiện đang được lưu giữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học. - Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN. 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN. Hầu hết dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: - Cân phân tích (Mettelex, Toledo - Tủ cấy vô trùng (Esco, Singapore) - Máy lắc ổn nhiệt (Gerharat, Đức) - Tủ lạnh (Sanaky, Nhật) - Kính hiển vi điện tử (Nikon, Nhật) - Pipetman 10 µl, 200 µl, 1000 µl - Máy li tâm (Eppendof, Đức) - Nồi khử trùng (Tommy, Nhật) - Tủ ấm nuôi cấy VSV (Esco, Singapore) - Lò vi sóng (Electrolux, Nhật)
  • 39. 32 . 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi nấm 2 2 1 1 ươ á ô y Nuôi cấy lỏng: - Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị trong các bình tam giác 500ml chứa 150ml môi trường lỏng, khử trùng 121O C, 1 atm trong 30 phút. - Các sợi nấm thuần được cấy chuyển sang các bình tam giác đựng các môi trường lỏng. - Sau khi cấy xong, các bình tam giác được nuôi lắc 150 vòng phút, 28O C trong thời gian -5 ngày. Nuôi cấy trên đĩa thạch: - Chuẩn bị các môi trường có bổ sung thêm agar, khử trùng 121O C, 1 atm trong 30 phút. - Cấy chuyển chủng sang các đ a peptri chứa thạch môi trường. - Sau khi cấy xong, các đ a thạch được nuôi trong tủ ấm 2 O C trong thời gian 3-5 ngày. Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy Môi trường Thành phần (g L) PDA 200g Khoai tây; 10g Glucose; 16g Agar; 1L Nước cất PDB 200g Khoai tây; 10g Glucose; 1L Nước cất 2 2 1 2 ươ á b q Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đ a petri chứa môi trường PDA, chủng vi nấm được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khử trùng. Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 2 O C trong thời gian 3-5 ngày. Các ống giống sau khi phát triển sẽ được bảo quản 4O C.
  • 40. 33 Khoảng -6 tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môi trường mới. Phương pháp bảo quản giống lâu dài: Chủng vi nấm sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trong môi trường glycerol 20% nhiệt độ lạnh sâu -86O C. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu một số đ c điểm sinh h c của chủng nấm [38] Chủng vi nấm được nuôi cấy trên 6 môi trường khác nhau (đặc trưng của chi Penicillium) để quan sát đặc điểm hình thái và vi hình thái. Thành phần dinh dưỡng của các môi trường được thể hiện bảng 2.2. Bảng 2.2. Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái Môi trường Nguồn Carbon (g l) Nguồn Nitơ (g l) Nguyên tố khoáng (g l) CYA 3g Sucrose 0,5g Yeast extract 0,1g K2HPO4 3mg NaNO3 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O CYA+ NaCl 5% 3g Sucrose 0,5g Yeast extract 0,1g K2HPO4 3mg NaNO3 0,5g NaCl 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O Oat meal agar 6g Oat meal Yeast Extract 0,3g Yeast extract
  • 41. 34 Sucrose 0,5g Peptone CREA 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O Malt Extract Agar 2g Dextrose 2g Malt Extract 0,6g Peptone Các bước tiến hành: i. Nuôi cấy nấm trên đ a peptri chứa các môi trường. Theo dõi hằng ngày thời gian phát triển, hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc trên các môi trường nuôi cấy khác nhau. ii. Nuôi cấy, quan sát vi hình thái: Dùng que cấy lấy một miếng thạch có sợi nấm phát triển kích thước khoảng 0,5 cm x 0,5 cm đặt lên lam kính rồi lấy lamen đậy lên bề mặt miếng thạch. Sau đó đặt lam kính chứa lamen đó vào trong đ a peptri. Nuôi 2 O C trong khoảng thời gian -7 ngày cho đến khi sợi nấm mọc lan đều bề mặt lamen. Soi dưới kính hiển vi quang học; quan sát hệ sợi, bào tử, cuống bào tử, vách ngăn, của chủng nấm.
  • 42. 35 2.2.3. Các phương pháp gây đột biến chủng 2.2.3 1 ươ á y đ b ế bằ UV [39] 1 ml dịch nuôi cấy chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 (pha loãng nồng độ 10-6 ) được chuyển vào các đ a peptri khử trùng, gạt đều dịch nuôi cấy trên đ a để tế bào phân bố đều, bật tia UV (50W – 254 nm), khoảng cách từ nguồn UV đến đ a là 15 cm. Sau 5, 10, 15, 20 và 0 phút chiếu UV, các đ a được chuyển vào bóng tối để 1 giờ đồng hồ nhiệt độ phòng. 100 µl dịch đã chiếu được trang lên đ a PDA, ủ - 5 ngày 2 o C. Khi nấm đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc trên đ a thí nghiệm và đối chứng (không xử lí đột biến) để xác định phần trăm sống sót của bào tử sau chiếu tia UV. Các dòng đột biến được nhân nuôi, tách chiết và xác định hàm lượng HupA bằng HPLC. 2.2.3 2 ươ á y đ b ế bằ N-metyl- ’-nitro-N- Nitrosoguanidin (MNNG) [39] Chủng nấm Penicillium sp. LĐL 4.4 được nuôi cấy trong môi trường PDB, 2 ml dịch nuôi cấy được ly tâm 10000 vòng phút trong 5 phút thu sinh khối. Sinh khối nấm được hòa vào 1.5 µl dung dịch NTG (100 mg ml, pha trong đệm 0.2M citrate, pH 5), vortex đều. Sau thời gian ủ 5, 10, 15, 20 và 0 phút 0o C, 50 µl dịch được hòa vào 45 ml dung dịch NaCl 0.9%, ly tâm rửa lần. Sau đó dịch được pha loãng đến nồng độ 10-3 rồi cấy trang trên các đ a thạch PDA, nuôi 3 - 5 ngày 2 o C rồi đếm số khuẩn lạc mọc. Các dòng đột biến được nhân nuôi, tách chiết và xác định hàm lượng HupA bằng HPLC. 2.2.3.3 ươ á y đ b ế bằ óng siêu âm [40] Chủng LĐL 4.4 nuôi cấy trên môi trường PDB, dịch nuôi cấy (mật độ tế bào khoảng 106 / mL) được đặt trong một cốc thủy tinh có chứa nước đá, đặt trong lò vi sóng công suất 1200W - thời gian xử lý bức xạ là: 0, 20, 50, 80, 110, 130 giây. Sau đó dịch được pha loãng đến nồng độ 10-6 rồi cấy trang trên các đ a thạch PDA, nuôi 3 - 5 ngày 2 o C rồi đếm số khuẩn lạc mọc. 2.2.4. Các phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy thích hợp 2.2.4 1 ươ á ự ọ ô ườ ô y í
  • 43. 36 Chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 được nghiên cứu nuôi trên các môi trường nuôi cấy vi nấm có thành phần cải tiến khác nhau (Bảng 2.3 và bảng 2.4). Sau 120 giờ nuôi cấy nhiệt độ thích hợp 2 o C, xác định hoạt tính và sinh khối. Trên môi trường nào vi nấm sinh trư ng tốt, tích lũy nhiều sinh khối mà khả năng sinh tổng hợp hoạt chất HupA trong tế bào cao nhất sẽ được lựa chọn làm môi trường nuôi cấy.
  • 44. 37 Bảng 2.3. Thành phần các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy Môi trường Khoai tây (g/l) Nguồn Carbon (g l) Nguồn Nitơ (g l) Nguyên tố khoáng (g l) Thành phần khác MT 1 150g 10 g Cao nấm men 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 10ml Ethanol 10g Glucose 5g Peptone 5g Tryptone MT 2 150g 10 g Cao nấm men 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 200mg Lysine 10g Glucose 5g Peptone 5g Tryptone MT 3 200g 20g Glucose - - 10ml Ethanol MT 4 200g 20g Glucose - - 200mg Lysine MT 5 150g 10g Cao nấm men 1/10 dung dịch MS (*) 10ml Ethanol 10g Glucose 5g Peptone 5g Tryptone
  • 45. 38 MT 6 150g 10g Malt extract 10g cao nấm men 10g Cao thịt 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 10ml Ethanol MT 7 150g 10g sucrose 10g fructose 10g maltose 10g Peptone 10g Tryptone 2g NaNO3 0.5g MgSO4 1g KH2PO4 0.5g K2HPO4 0.5g Na2HPO4.2H20 0.3g KCl 0.3g NaCl 10ml Ethanol MT 8 150g 10g Malt extract 10g cao nấm men 10g Cao thịt 1 10 dung dịch MS (*) 10ml Ethanol MT 9 150g 10g sucrose 10g fructose 10g maltose 10g Peptone 10g Tryptone 1 10 dung dịch MS (*) 10ml Ethanol
  • 46. 39 (*) Bảng 2.4. Thành phần dung dịch môi trường MS Thành phần đa lượng Thành phần vi lượng Vitamins và chất hữu cơ 1.650mg Ammonium nitrate (NH4NO3) 6.2 mg Boric acid (H3BO3) 100 mg i-Inositol 440mg Calcium chloride (CaCl2 · 2H2O) 0.025 mg Cobalt chloride (CoCl2 · 6H2O) 0.5 mg Niacin 370 mg Magnesium sulphate (MgSO4 · 7H2O) 0.025 mg Cupric sulphate (CuSO4 · 5H2O) 0.5 mg Pyridoxine · HCl 170 mg Potassium phosphate (KH2PO4) 27.8 mg Ferrous sulphate (FeSO4 · 7H2O) 0.1 mg Thiamine · HCl 1.900 mg Potassium nitrate (KNO3) 22.3 mg Manganese sulphate (MnSO4 · 4H2O) 2 mg Glycine 0.83 mg Potassium iodide (KI) 1 g Edamin (tùy chọn) 0.25 mg Sodium molybdate (Na2MoO4 · 2H2O) 8.6 mg Zinc sulphate (ZnSO4·7H2O) 37.2 mg Na2EDTA · 2H2O 2 2 2 ươ á ự ọ ồ b , ơ à b í ô ườ n ô y Môi trường nuôi cấy thích hợp được lựa chọn sẽ được dùng làm môi trường cơ s để lựa chọn nguồn C, N và chất bổ sung thích hợp. Tiến hành phối hợp nguồn C, N và chất bổ sung (Bảng 2.5) để chọn ra thành phần môi trường thích hợp cho khả năng sinh trư ng và sinh tổng hợp HupA cao nhất.
  • 47. 40 Bảng 2.5. Nguồn C, N và chất bổ sung được lựa chọn 2 2 3 ươ á á đ ề ệ ô y Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác dung tích 500 ml trên máy lắc tốc độ 100 - 250 vòng phút, với môi trường lên men đã lựa chọn trên. Các thông số nghiên cứu bao gồm nhiệt độ, pH, độ thông khí, tỷ lệ giống, tuổi giống và động thái lên men. Các yếu tố được kế thừa từ kết quả của các thí nghiệm trước. - Lựa chọn môi trường nhân giống: Các môi trường dùng để nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp cho chủng sinh trư ng tốt gồm Czapek – Dox, PDB, Khoai tây (Thành phần thể hiện bảng 2.6). Cấy giống vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (150 vòng phút), nhiệt độ 28o C trong 3 ngày. - Khảo sát thời gian nhân giống: Chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường PDB, trên máy lắc (150 vòng phút), nhiệt độ 2 o C trong dải thời gian 24 – 72 giờ, sau đó tiếp giống sang môi trường lên men đã được lựa chọn. - Khảo sát tỷ lệ giống: Khảo sát ảnh hư ng của tỷ lệ giống tới sinh tổng hợp HupA trong khoảng từ - 15%, sau đó tiếp giống sang môi trường lên men đã được lựa chọn. Cacbon Nitơ Chất bổ sung Cao malt Cao nấm men Ethanol Tinh bột tan Cao thịt Methanol Casein thủy phân Acid acetic Pepton + trypton L-lysin Dịch chiết cây Thạch tùng răng cưa
  • 48. 41 - Khảo sát pH: Nghiên cứu ảnh hư ng của pH môi trường đến sinh trư ng hệ sợi nấm chủng trong môi trường dịch thể. Các bình nhân sinh khối được nuôi trong thời gian 120 giờ với tỷ lệ giống và tuổi giống được lựa chọn thí nghiệm trước. Đánh giá sự sinh trư ng hệ sợi giống nấm tại các ngưỡng pH môi trường là 6, 6.5, 7 và 7,5. - Khảo sát nhiệt độ: Các bình nhân sinh khối được nuôi 6 nhiệt độ khác nhau từ 25÷ 0o C. - Khảo sát độ thông khí: Chủng nấm trong môi trường dịch thể được nuôi lắc trong môi trường dịch thể với các tốc độ khác nhau (100, 120, 150, 1 0 và 200 vòng phút) để khảo sát sự ảnh hư ng của tốc độ lắc tới sự sinh trư ng hệ sợi nấm. - Xác định động thái lên men: Quá trình lên men chủng LĐL 4.4 được tiến hành trong thiết bị lên men thể tích 5-10 lít, với các điều kiện lên men đã xác định các thí nghiệm trên. Sau m i 12 giờ lên men, tiến hành lấy mẫu, xác định pH, sinh khối nấm và hàm lượng HupA. Bảng 2.6. Thành phần môi trường nhân giống Môi trường Thành phần (g/L) Czapek - Dox 30g Saccharose 3g NaNO3 1g K2HO4 0,5g MgSO4 0,5g KCl 0,1g FeSO4 PDB 200g Khoai tây 10 glucose Khoai tây 200g Khoai tây
  • 49. 42 2.2.5. Phương pháp tách chiết hoạt chất Huperzine A từ chủng nấm [26] Các bước tiến hành - Nuôi nấm trong ≥250 ml môi trường PDA-I lỏng, lắc 150 rpm, 2 o C trong 5-14 ngày tùy chủng; - Ly tâm 000 rpm thu sinh khối nấm; - Sấy khô sinh khối nấm 45-50o C; - Nghiền nấm bằng nitơ lỏng thành bột mịn; - Bổ sung một lượng ammonia 10% với tỉ lệ 1 ml 1 g bột nấm trong 1-2h nhiệt độ phòng; - Bổ sung 0ml dung môi HCl 5% tỉ lệ 1: 0 ml, lắc nhiệt độ phòng trong 24h; - Ly tâm thu dịch chiết 000 rpm 10 phút; - Chỉnh dung dịch thu được về pH 9-10 bằng NaOH 10% NH4OH 25%; chiết lần với Chloroform, thu pha dưới; - Cô quay loại bỏ dung môi, thu được căn alkaloid toàn phần được hòa tan trong 1 lượng methanol đậm đặc ≥1ml. 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt chất HupA [26] 2 2 6 1 ươ á ắ ý b ỏ - TLC - Nguyên liệu, hóa chất: + Dịch chiết nấm nội sinh + Hóa chất: Chất chuẩn Huperzine A, chloroform, acetone, isopropanol, axit acetic, axit tartaric, phenol, isoamyl alcohol, iod, KMnO4 + Bản mỏng silicagel Merck 0.25mm - Tiến hành: (1) Hòa tan chất chuẩn Huperzine A trong Methanol 1mg ml. Pha loãng đến các nồng độ chuẩn; (2) Hoạt hóa bản mỏng silicagel bằng
  • 50. 43 cách sấy 1h 110o C. Mẫu được chấm lên bản mỏng bằng pipet (chất chuẩn HupA 1µl nồng độ 10-6 ; mẫu dịch chiết nấm là 5 µl). Khoảng cách các giếng chấm cách mép dưới 1 cm, hai bên mép 0.5 cm, giữa các giếng 0.7 cm. Kích thước của vệt chấm càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt. Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi; ( ) Dùng kẹp đưa bản mỏng đã chấm vào bình dung môi, đậy nắp bình.Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến khi cách mép trên tấm bản mỏng 1 cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ bản mỏng; (4) Sử dụng thuốc nhuộm KMnO4 0.5% xịt đều lên bản mỏng. Sấy nhẹ bản mỏng, quan sát vết. 2.2.6 2 ươ á ắ ý ỏ ệ – HPLC Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột phân tích Zorbax SB – C18 RP (3.0 x 15 nm) trên hệ thống detector PDA. Qua khảo sát các điều kiện chạy khác nhau, lựa chọn ra điều kiện chạy cho HupA với hệ thống thiết bị hiện có là: - Bước sóng phân tích: 10 nm - Vận tốc dòng chảy: 1ml phút - Chế độ chạy: isocratic + Kênh A: 5% nước - 20mM Amoniacetat + Kênh B: ACN - 0.1% A.Acetic - Lượng mẫu bơm: 10 ul - Thời gian phân tích: 20 phút
  • 51. 44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HÌNH THÁI CỦA CHỦNG VI NẤM Penicillium sp. LĐL 4.4 Trong các nghiên cứu trước, chủng Penicillium sp. LĐL4.4 đã đựơc phân loại đến chi theo phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự vùng rADN – ITS khi nuôi cấy trên môi trường PDA. Để tìm hiểu thêm về đặc điểm sinh học của chủng LĐL4.4, tiến hành nuôi cấy chủng trên 6 môi trường nuôi cấy có thành phần dinh dưỡng khác nhau - đặc trưng cho chi Penicillium - như mô tả phần phương pháp. Kết quả cho thấy trên 6 môi trường nuôi cấy có nguồn dinh dưỡng khác nhau - đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn ty trên các môi trừơng dinh dưỡng khác nhau là khác nhau; tuy nhiên các đặc điểm sợi khuẩn ty và bào tử của chủng LĐL4.4 đều giống nhau: sợi khuẩn ty có vách ngăn, bào tử trần không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i (hình .1, .2 và bảng .1). Các đặc điểm này đều cho thấy chủng LĐL4.4 là thuộc chi Penicillium như đã được phân loại. Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 trên các môi trường nuôi cấy Môi trường Đ c điểm hình thái Vi hình thái Khuẩn lạc Sợi sinh dư ng Sợi cơ chất Đ c điểm khác CYA - Đường kính khuẩn lạc ≈ 3cm. - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt - Dạng mép khuẩn lạc:dày, liền, có khía đồng tâm Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng nâu. - Giọt tiết: nhiều, không màu - Sắc tố hòa tan: không. - Sợi nấm: có vách ngăn. - Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. CYA + - Đường kính khuẩn lạc ≈ 4cm. Màu sắc: xanh lục, Màu sắc: vàng nâu - Giọt tiết: nhiều, không - Sợi nấm: có vách ngăn.
  • 52. 45 NaCl 5% - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt - Dạng mép khuẩn lạc: dày, liền, có khía đồng tâm. viền trắng. màu. - Sắc tố hòa tan: không. - Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. Yeast Extract Sucrose - Đường kính khuẩn lạc ≈ 2,5 cm. - Hình dáng khuẩn lạc: tròn. -- Dạng mặt: nhung mượt - Dạng mép khuẩn lạc: dày, liền, không có khía. Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng nâu - Giọt tiết: ít, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. - Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. Oat Meal Agar - Đường kính khuẩn lạc ≈ 1,3cm. - Hình dáng khuẩn lạc: tròn, cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt. - Dạng mép khuẩn lạc: mỏng, không có khía. Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng - Giọt tiết:nhiều, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. -Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. CREA - Đường kính khuẩn lạc ≈ 1,8 cm. - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt. - Dạng mép khuẩn lạc: không. Màu sắc: trắng Màu sắc: trắng - Giọt tiết: ít, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. -Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i. Malt Extract Agar - Đường kính khuẩn lạc ≈ 2,1cm. - Hình dáng khuẩn lạc: không cân đối. - Dạng mặt: nhung mượt. - Dạng mép khuẩn lạc: mỏng, không có khía. Màu sắc: xanh lục, viền trắng. Màu sắc: vàng nâu - Giọt tiết: ít, không màu. - Sắc tố hòa tan : không. - Sợi nấm: có vách ngăn. -Bào tử trần: không có vách ngăn, hình cầu, sắp xếp thành chu i.
  • 53. 47 3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HUPA CỦA CHỦNG Penicillium sp. LĐL4.4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN CHỦNG Chủng nấm Penicillium sp. LĐL4.4 đã xác định được khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A với hàm lượng 1,38 mg/L dịch lên men trên môi trường PDB (Hình 3.3). Hình 3.3. Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp. LĐL4.4 trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Để có thể nâng cao khả năng sinh tổng hợp HupA của chủng, tiến hành đột biến chủng bằng 3 phương pháp chiếu tia UV, sử dụng hóa chất MNNG và sóng siêu âm (như mô tả phần phương pháp) nhằm tạo ra những dòng biến thể mới có khả năng cho sản lượng HupA cao hơn chủng gốc.