Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ ngành vi sinh vật học với đề tài: Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, cho các bạn làm luận văn tham khảo

1. 1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------
PHẠM HOÀI LINH LY
NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC
VIỆT NAM
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng
GS. TS. Phạm Văn Ty
HÀ NỘI-2014

2. 2
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình nào khác.
HỌC VIÊN
Phạm Hoài Linh Ly

3. 3
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
 Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học QGHN
 Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ TƯ
Đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn
Lê Khánh Hằng, Khoa Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình chỉ bảo
và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu từ bước đầu tới khi hoàn thiện luận
văn, tạo mọi điều kiện nghiên cứu thuận lợi để tôi có được kết quả như ngày hôm
nay. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến GS. TS. Phạm Văn Ty,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã hướng dẫn tôi những kiến thức
chuyên ngành hữu ích trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh
học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã cho tôi những kiến thức
chuyên ngành quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học.
Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS. TS. Lê Thị Quỳnh Mai, Phó Viện
trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, ThS. Hoàng Vũ Mai Phương, ThS.
Nguyễn Cơ Thạch cùng các anh chị công tác tại Phòng Thí nghiệm Cúm, Khoa
Virút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, nhiệt tình
hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp - những người đã tiếp thêm cho tôi nguồn động viên quý giá, luôn bên cạnh
chia sẻ và giúp đỡ để tôi đạt được thành quả hôm nay.
Hà Nội, ngày 14 tháng 4 năm 2014
Phạm Hoài Linh Ly

4. 4
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU………………………………………………………................ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……………………………………………. 3
1.1. VIRUS CÚM B…………..…………………………………...…… 3
1.1.1. Đặc điểm chung………………………………..………………… 3
1.1.2. Hình thái và cấu trúc virion của virus cúm B................................. 4
1.1.3. Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức năng….……………... 5
1.1.4. Cơ chế nhân lên của virus cúm B……………………..…………. 8
1.2. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TRÊN THẾ GIỚI…….. 10
1.3. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI VIỆT NAM………. 12
1.4. SỰ TIẾN HÓA CỦA VIRUS CÚM B…………..…..…………… 13
1.5. BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CÚM.. 14
1.5.1. Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm……………………………….. 14
1.5.2. Sinh bệnh học bệnh cúm………………………….……………… 14
1.6. ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM……………………….
1.6.1. Các thuốc kháng virus……………………………...……...……..
15
15

5. 5
1.6.2. Dự phòng…………….……………………………………...……. 17
1.7. CHẨN ĐOÁN VIRUS HỌC…...………………………..………..
1.7.1. An toàn phòng thí nghiệm………………………………………...
1.7.2. Thu thập mẫu để chẩn đoán virus …...………….……………...…
1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định typ virus……………..........
1.7.4. Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence)………………......
19
19
20
20
21
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. 23
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU..………………………..……….. 23
2.2. VẬT LIỆU...……………………………………………………… 23
2.2.1. Chủng virus cúm B……….……………………………………….. 23
2.2.2. Sinh phẩm……………...………………………………………….. 23
2.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ………………..………….……...……… 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP..………………..…………………...…………. 25
2.3.1. Định typ virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
(HAI)……………………………………………………..……….. 25
2.3.2. Giải trình tự gen…………………………...………...………….... 27
2.3.3. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu………..…………. 34
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………….………….…. 36
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ KHUẾCH ĐẠI CÁC CHỦNG
VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012…….……...
3.1.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012.
3.1.2. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-
2012………………………………………………….……….
36
36
37

6. 6
3.2. ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM B, 2010-
2012 ……………………………………………………………………… 39
3.3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN HA CÁC CHỦNG
VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012……….…... 46
3.3.1. Sự phân bố các chủng virus cúm B theo thời gian...……………… 46
3.3.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen HA của virus cúm B………………. 46
3.3.3. Cây gia hệ gen HA……………………………………………...… 48
3.3.4. Protein HA….………………...…………………………………… 52
3.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN NA CÁC CHỦNG
VIRUS CÚM B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012……………
3.4.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus cúm B.……………....
57
57
3.4.2. Cây gia hệ gen NA………………………………………………... 61
3.4.3. Protein NA………………………………………….…………….. 65
KẾT LUẬN……………………………………………………………… 72
KIẾN NGHỊ………………………………………………………........... 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

7. 7
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid Deoxy Ribonucleic
ARN Acid Ribonucleic
CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm phòng chống
và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ)
HA Hemaglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu)
HI Hemaglutination Inhibition test (Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu)
ILI Influenza like illness (Hội chứng cúm)
MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells (Tế bào thận chó thường trực)
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase)
QIV Quadrivalent Influenza Vaccine (Vắc xin gồm 4 thành phần virus
H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria)
RNP Phức hợp Ribonucleoprotein
TCYTTG World Health Oganization (Tổ chức Y tế Thế giới )
VSDTTƯ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

8. 8
DANH MỤC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.1. Các phân đoạn ARN của virus cúm và chức năng………................ 5
3.1. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012.. 38
3.2. Kết quả định typ virus cúm B bằng phương pháp HAI, 2010-2012.. 39
3.3. Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2010-2012………………. 41
3.4. So sánh hiệu giá HAI giữa hai dòng B/Victoria và B/Yamagata…..
42
3.5. So sánh kháng nguyên virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam với
thành phần vắc xin cúm tại Bắc và Nam Bán cầu theo khuyến cáo
của TCYTTG, 2010-2012………………………………………….
43
3.6. Số lượng chủng phân tích gen HA và NA ………………………… 46
3.7. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Vitoria, 2010-
2012...................................................................................................
53
3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata, 2010-
2012…………………………………................................................
55
3.9. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein HA so với
virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012…………………
57
3.10. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Vitoria, 2010-
2012…………………………………………………………………
64
3.11. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata, 2010-
2012…………………………………………………………………
65
3.12. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein NA so với
virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012…………………
66

9. 9
DANH MỤC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1. Mô hình cấu trúc chung của virus cúm...................................... 4
1.2. Chu trình nhân lên của virus cúm ……………………………. 8
1.3. Các vị trí đột biến trên cấu trúc không gian 3 chiều của
Neuraminidase ………………………………….…………….
16
3.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 -
2012………………………………….......................................
37
3.2. Tỷ lệ lưu hành 2 dòng kháng nguyên virus cúm B theo năm ...
40
3.3.
Sản phẩm gen HA sau PCR …………………………………..
47
3.4.
Sản phẩm gen HA sau khi tinh sạch…………………………. 47
3.5. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata và
dòng B/Victoria, 2010-2012.........................………………….
48
3.6. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010-
2012…………………………………………….……………...
49
3.7. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata,
2010-2012…………………………………..…………………
50
3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Victoria……
53
3.9. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata.....
54
3.10. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Victoria giữa
các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin…………….
56

10. 10
3.11. Số axit amin khác nhau trên protein HA dòng B/Yamagata
giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin……….
56
3.12. Sản phẩm gen NA sau PCR…………………………………... 58
3.13. Sản phẩm gen NA sau khi tinh sạch…………………………. 58
3.14. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria và
dòng B/Yamagata, 2010-2012……………..………………….
59
3.15. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010-
2012............……………………………………………………
60
3.16. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Yamagata,
2010-2012………………………………………………….….
61
3.17. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Victoria……
63
3.18. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata…
64
3.19. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Victoria giữa
các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin………….…
65
3.20. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Yamagata
giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin……….
66
3.21. Các vị trí axit amin trên protein NA của 2 dòng B/Yamagata
và B/Victoria liên quan đến đột biến kháng thuốc hoặc giảm
độ nhạy của thuốc oseltamivir và zanamivir…………………
68

11. 11
MỞ ĐẦU
Hàng năm trên Thế giới cũng như tại Việt Nam, virus cúm vẫn tiếp tục gây
ra các vụ dịch/ đại dịch cúm với tỉ lệ mắc và tử vong cao [31]. Trong đó, virus cúm
A được quan tâm nghiên cứu hơn cả do loại virus này có khả năng gây ra các
dịch/đại dịch nghiêm trọng, gần đây nhất có thể kể đến đại dịch H1N1 (2009) cũng
như các vụ dịch do virus cúm độc lực cao lây truyền từ gia cầm sang người
A/H5N1. Nguyên nhân là do virus cúm A có đối tượng gây nhiễm đa dạng như gia
cầm, thủy cầm, chim di cư, động vật có vú và người [8].
Trong nhiều thập kỷ qua, virus cúm B được biết đến như một loại virus gây
bệnh cảm lạnh thông thường, không gây thành dịch/đại dịch lớn. Khác với virus
cúm A, virus cúm B chỉ có những thay đổi nhỏ kháng nguyên (đột biến) [43]. Tuy
nhiên, trong một số nghiên cứu đã cho thấy triệu chứng lâm sàng khi nhiễm cúm B
cũng như tỷ lệ nhập viện và tử vong liên quan đến cúm B và viêm phổi do bội
nhiễm cũng tương tự khi nhiễm virus cúm A. Tại Mỹ, trong giai đoạn 2004-2008,
trong 309 trẻ tử vong liên quan đến virus cúm mùa có 34% trường hợp tử vong do
virus cúm B [23]. Trong mùa cúm 2011-2012, tỷ lệ trẻ em tử vong do virus cúm B
chiếm tới 38 % (44/115), trong đó chỉ có 50% số trẻ em được điều trị các loại thuốc
kháng virus. Chính vì vậy, các trường hợp nhiễm cúm B này đã không có cơ hội
được điều trị và can thiệp kịp thời tránh bội nhiễm, biến chứng dẫn tới tử vong [18].
Khi nghiên cứu 45 trường hợp tử vong do virus cúm B cho thấy 1/3 trong số này bội
nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus, trong đó số trường hợp tử vong trong 3 và 4
ngày sau khi nhiễm virus là 50% và 70% [20]. Như vậy, thời gian từ khi nhiễm
virus cúm B đến khi tử vong nhanh hơn so với virus cúm A/H1N1 1918, A/H2N2
1957, A/H3N2 1968, A/H1N1pdm 2009 và A/H3N2 [21, 26, 32, 35,]. Mặt khác,
virus cúm B kết hợp với các virus gây viêm đường hô hấp khác sẽ có khả năng gây
biến chứng nguy hiểm cho trẻ em, người già, người suy giảm miễn dịch hoặc mắc
các bệnh mạn tính và phụ nữ mang thai nếu không có biện pháp phòng ngừa kịp
thời.

12. 12
Trên thế giới, từ những năm 1970, vắc xin cúm được sản xuất là vắc xin đa
giá, thành phần vắc xin bao gồm 2 phân týp virus cúm A (A/H1N1, A/H3N2) và 1
dòng virus cúm B (Trivalent influenza vaccine - TIV). Vào những năm của thập kỷ
80, virus cúm B đã xuất hiện 2 dòng, B/Yamagata và B/Victoria, lưu hành đồng thời
ở nhiều nước nhưng thành phần vắc xin vẫn lựa chọn chủng đại diện cho một dòng
kháng nguyên virus cúm B [37, 48]. Vì vậy, những năm virus cúm B lưu hành cả 2
dòng kháng nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng sẽ hạn chế. Mặt khác, nhiều
năm đã có sự không phù hợp giữa chủng virus cúm B đang lưu hành và chủng virus
cúm B được lựa chọn trong thành phần vắc xin hàng năm.
Tại Việt Nam, kể từ khi dịch viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARS), cúm
gia cầm A/H5N1 xuất hiện năm 2003 đến nay gánh nặng bệnh cúm gần đây đã được
quan tâm nhiều hơn. Tuy nhiên, virus cúm B dường như vẫn chưa đươc quan tâm
đúng mực. Với những gánh nặng bệnh của virus cúm B như vậy, việc triển khai
nghiên cứu về sự lưu hành, đặc điểm di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên của
virus cúm B tại Việt Nam là hết sức cần thiết. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài:
“Nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam”
Với mục tiêu:
1. Xác định đặc điểm di truyền gen HA và NA của virus cúm B lưu hành tại miền
Bắc Việt Nam, 2010-2012.
2. Xác định đặc tính kháng nguyên và các axit amin thay đổi liên quan đến sự thay
đổi đặc tính kháng nguyên của virus cúm.

13. 13
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. VIRUS CÚM B
1.1.1. Đặc điểm chung
Virus cúm B thuộc họ Orthomyxoviridae [9], ngoài ra trong họ này còn có
các nhóm virus khác như: virus cúm A, virus cúm C, virus Thogoto và virus Isa.
Trong đó, virus cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác
như lợn, ngựa..., là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Virus cúm B
và C chỉ lưu hành chủ yếu ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ
[8]. Gây ra dịch bệnh theo mùa là đặc tính của virus cúm A và B, xảy ra chủ yếu
vào cuối mùa thu và đầu mùa đông. Khi có những thay đổi lớn kháng nguyên
(antigenic shift) xuất hiện ở kháng nguyên của virus cúm A, các vụ dịch lớn có thể
xảy ra với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao. Virus cúm B không có những thay đổi lớn
kháng nguyên nhưng có thể tiến hóa bởi những thay đổi nhỏ kháng nguyên
(antigenic drift) và không gây nên các vụ đại dịch nghiêm trọng. Tuy nhiên những
biến chứng thể nặng có thể dẫn tới tử vong do virus cúm B đã được ghi nhận.
Danh pháp quốc tế được quy định cho virus cúm B được viết như sau: B/nơi
phân lập/mã số PTN/năm phân lập (ví dụ: B/HongKong/330/2001). Do sự thay đổi
về kháng nguyên bề mặt của virus cúm B hầu như không quan sát được nên danh
pháp quốc tế của virus cúm B không có sự tham gia của kháng nguyên bề mặt HA
và NA như đối với danh pháp quốc tế được quy định cho virus cúm A.
Virus cúm B được phân chia thành 2 dòng kháng nguyên phân biệt vào
những năm 1980, đó là dòng B/Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) và dòng
B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage viruses). Các dòng virus này được đặt tên
sau khi xuất hiện các đại diện đầu tiên là B/Victoria/2/87 - like virus và
B/Yamagata/16/88 - like virus [48].

14. 14
1.1.2. Hình thái và cấu trúc của virus cúm B
Thành phần cấu trúc của virus cúm B gồm có: 1% ARN, 70% protein, 20%
lipit và 5-8% carbohydrate. Virion cúm (hạt virus hoàn chỉnh, dạng virus nghỉ ở
ngoài tế bào) có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc hình sợi kéo dài
tới 2000nm, đường kính trung bình từ 80-120nm. Virus cúm B có cấu trúc phức tạp
và có vỏ ngoài bao bọc. Vỏ ngoài virus có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng
tế bào chất của vật chủ, bao gồm một số glycoprotein và một số protein dạng trần
không được glycosyl hoá. Các virion cúm có các tính chất hóa lý như rất nhạy cảm
khi xử lý bằng cách đun nóng, dùng dung môi lipit, chất tẩy rửa không chứa ion,
formaldehyde, tác nhân ô xi hóa, khả năng lây nhiễm của các virus cúm cũng bị
giảm đi sau khi chúng tiếp xúc với bức xạ.
Hình 1.1. Mô hình cấu trúc chung của virus cúm
*Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin
by Fengyun Ni [22 ]
Trên bề mặt vỏ ngoài virus có đính các gai glycoprotein, đó là các kháng
nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Virus cúm C chỉ có một gai
glycoprotein. Protein HA gây ngưng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc

15. 15
gắn virus vào tế bào chủ, protein NA có chức năng phá vỡ liên kết giữa virus và tế
bào chủ để giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm. Tỉ lệ HA/NA là 4/1 (hình 1.1).
1.1.3. Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức năng
Genome của virus cúm B gồm 8 phân đoạn giống như virus cúm A, còn
virus cúm C chỉ gồm 7 phân đoạn, trên mỗi phân đoạn có thể ghi dấu cho nhiều mật
mã di truyền. Sợi ARN của virus cúm là sợi đơn âm, có chiều dài khoảng ~13.6kb
đối với virus cúm A và ~14.6kb đối với virus cúm B [6]. Mỗi phân đoạn mã hoá
cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc.
Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của virus cúm và chức năng [52]
Phân
đoạn
ARN
Protein Chức năng
1 PB2 Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN thông tin
(mRNA). Đóng vai trò làm enzyme phiên mã: gắn kết,
kéo dài, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp virus thế
hệ mới trong tế bào chủ
2 PB1
3 PA Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN virion (vRNA).
4 HA
(Haemagglutinin
)
Phân tử có cấu trúc trimer, cắt bởi enzyme thuỷ phân
thành HA1 và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng.
HA gắn với tế bào túc chủ, dung hợp giải phóng phức
hợp ribonucleoprotein (RNP), mở đầu cho quá trình
nhân lên của virus.
5 NP
(Nucleoprotein)
Là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa
một trong các kháng nguyên đặc hiệu týp, phân biệt 3

16. 16
týp cúm A, B, C.
6 NA
(Neuraminidase)
NB (=M2)
Phân tử có cấu trúc tetramer, thuỷ phân bằng protease,
cho phép virus tiến qua lớp niêm dịch tới các tế bào của
đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng.
Loại bỏ phân tử axít sialic của phân tử HA từ các virion
mới được tổng hợp, làm lộ HA ra ngoài, tăng khả năng
nhiễm trùng.
7 M1-M2
(matrix protein)
M1: là kháng nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn
định cấu trúc virus, điều khiển hoạt tính RNA-
polymerase và tham gia vào quá trình lắp ráp virus
(70%).
M2: kênh ion.
8 NS1-NS2 Là protein không cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp
protein của tế bào túc chủ, chỉ có trong tế bào nhiễm
virus.
Qua những nghiên cứu về hoạt động chức năng các protein của virus cúm
trong quá trình nhân lên và sao chép trong tế bào chủ cho thấy vùng gen HA của
virus cúm B tiến hóa chậm hơn vùng gen của virus cúm A. Phân đoạn HA của virus
cúm B có cấu trúc và chức năng tương tự phân đoạn HA của virus cúm A, đó là một
kháng nguyên bề mặt chủ yếu, giúp virus bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ [10,
47]. Khác với virus cúm A, virus cúm B được ghi nhận chỉ lưu hành ở người và hải
cẩu. Vì vậy chỉ quan sát thấy các thay đổi nhỏ kháng nguyên ở virus cúm B. Các
thay đổi nhỏ kháng nguyên ở phân đoạn HA của virus cúm B xuất hiện như ở virus
cúm A, bởi sự tích tụ của các axit amin thay thế trong polypeptide HA1, nhưng chỉ

17. 17
khoảng ¼ tỉ lệ này ở virus cúm A. Do đó virus cúm B không gây ra đại dịch như
một số virus cúm A.
Vào những năm 1980, virus cúm B đã được phân chia thành hai dòng kháng
nguyên phân biệt là B/Victoria và B/Yamagata. Hai dòng virus cúm B được phân
biệt bởi sự khác nhau ở axit amin vị trí 269. Axit amin vị trí 269 của dòng
Yamagata là Pro nhưng ở tất cả các virus dòng Victoria là Ser. Sự biến đổi từ Pro
sang Ser là một biến đổi bất bảo toàn, liên quan đến sự phân phối điện tích (trung
tính thành có cực) và hình dạng của các axit amin [19].
Hiện nay, thử nghiệm ngăn ngưng kết hồng cầu (Heamagglutinin inhibition
test - HI) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với hai dòng virus đã cho phép phân
biệt hai dòng kháng nguyên này của virus cúm B.

18. 18
1.1.4. Cơ chế nhân lên của virus cúm B
Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virus cúm
* Nguồn: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin [22]
Đầu tiên, virus sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất của tế bào
chủ nhờ gai glycoprotein HA theo nguyên tắc khóa - chìa. Các thụ thể đặc hiệu có
bản chất là các axit sialic (N- acetyl neuraminic acid - NANA). Sau đó virus xâm
nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào. Các virion virus ấn sâu vào màng
Gắn vào các
receptor
Nảy chồi
Nhập bào
Thể nội bào
Cởi vỏ
Màng tế bào
Màng nhân
Biến đổi sau dịch
mã
Dịch mã

19. 19
tế bào tạo hốc rồi khép lại tạo túi nội bào hay bọng (endosome) nằm bên trong tế
bào chất. Bơm proton trong endosome vận chuyển H+
vào làm cho pH trong
endosome giảm xuống 5, pH thấp tạo điều kiện cho protein F (fusion) chồi lên cắm
vào màng endosome như chiếc neo, kéo vỏ ngoài virus sát với endosome và tiến
hành dung hợp với màng endosome để giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Sự
hợp nhất này chỉ xảy ra khi phân tử HA tiền thân (HA0) phân tách thành HA1 và
HA2 nhờ protease phổ biến là furin. Phân tử HA2 có đầu - N đóng vai trò hoà tan
trung gian giữa vỏ virus và màng nội bào (hình 1.2). Protein M2 ở virus cúm A hay
còn gọi là kênh ion (ion - channels) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình
thay đổi pH và dung hợp này.
Hầu hết các virus ARN tiến hành sao chép trong tế bào chất vì chúng có thể
mã hóa cho tất cả các enzym cần cho sao chép genome mà không cần đến các
enzym của tế bào nằm trong nhân, nhưng đối với virus cúm, chúng lại cần bộ máy
cắt nối của tế bào nên genome của chúng phải được đưa vào nhân. Sau khi hợp nhất
màng, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào. Trong nhân, sợi ARN
(-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung
[cARN (+)] nhờ enzyme RNA - polymerase phụ thuộc ARN của virus. Chính các
cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên
vật liệu di truyền của virus. Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn
chỉnh về độ dài (có độ dài đủ - full length ARN), không được mũ hoá ở đầu 5’ và
không được adenyl hoá ở đầu 3’. Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã
tạo ra các mRNA (+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các
chức năng khác nhau xảy ra ở tế bào chất. Các protein này bao gồm 7 protein cấu
trúc PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc NS1, NS2 và
M2 đối với virus cúm A và 1 protein không cấu trúc NB đối với virus cúm B. Các
protein NS1, M1 và NP được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới
tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó được vận chuyển ra tế bào chất.
Tại đây, các protein HA, NA, M2 được chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy Golgi,
tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việc nảy chồi của virus. Hạt

20. 20
virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất. Phân tử NA phân
cắt axit sialic giải phóng virus ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm
mới [8].
1.2. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TRÊN THẾ GIỚI
Hoạt động của virus cúm B được báo cáo trên nhiều quốc gia trong những
năm gần đây với sự lưu hành đồng thời của cả 2 dòng B/Yamagata và dòng
B/Victoria. Cúm B lưu hành đồng thời từ cuối thập niên 80 thế kỷ 19 khi biến thể
của virus cúm B là B/Panada/45/90 lần đầu tiên được quan sát thấy. Chủng này và
các biến thể thuộc dòng Yamagata đã lan ra khắp thế giới, trong khi các chủng của
dòng B/Victoria/2/87 trước đó lại tiếp tục lưu hành ở Châu Á rồi sau đó trải qua các
tiến hóa không phụ thuộc trở thành dòng phân biệt về đặc tính kháng nguyên [46].
Trên thế giới, hai dòng virus cúm B đều được xác định lưu hành hàng năm,
tuy nhiên một trong hai dòng sẽ chiếm ưu thế trong từng năm. Dựa vào kết quả
giám sát này, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) sẽ đưa ra khuyến cáo về sự lựa chọn
dòng kháng nguyên B trong thành phần vắc xin cúm hàng năm cho các nước thuộc
khu vực Bắc bắn cầu hoặc Nam bán cầu. Trong giai đoạn từ năm 1999 đến năm
2002, dòng B/Yamagata chiếm ưu thế hơn đã được lựa chọn vào thành phần vắc
xin. Các virus cúm B thuộc dòng Yamagata trong giai đoạn này có đặc tính kháng
nguyên và di truyền giống với chủng B/Sichuan/379/99. Trong giai đoạn tiếp theo
từ năm 2002 đến năm 2004, ở cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu dòng virus cúm B
chiếm ưu thế lại là dòng Victoria với các virus có đặc tính kháng nguyên và di
truyền giống với chủng B/HongKong/330/2001. Tương tự như vậy, dường như sự
lưu hành của virus cúm B có một quy luật lặp lại 2-3 năm một lần. Khi mà trong
giai đoạn từ năm 2004 đến năm 2006, dòng Yamagata quay trở lại chiếm ưu thế trên
thế giới với đại diện là chủng B/ShangHai/361/2002. Trong giai đoạn từ năm 2006
đến năm 2008, trên cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu, dòng chiếm ưu thế là dòng
Victoria với đại diện là chủng B/Malaysia/2506/2004. Trong giai đoạn tiếp theo từ

21. 21
năm 2008 đến năm 2009, dòng virus cúm B lưu hành chiếm ưu thế là dòng
Yamagata với đại diện là chủng B/Florida/4/2006.
Từ năm 2009 đến năm 2011, virus cúm B xuất hiện ở trên khắp các Châu
lục, cả 2 dòng virus cúm B là dòng Victoria và dòng Yamagata lưu hành đồng thời
nhưng dòng chiếm ưu thế là dòng Victoria. Các virus cúm B thuộc dòng Victoria có
mối quan hệ gần gũi về đặc tính kháng nguyên và di truyền với chủng vắc xin
B/Brisbane/60/2008. Phần lớn các virus thuộc dòng Yamagata có các đặc tính gần
với chủng đại diện trước đó là chủng B/Florida/4/2006. Tuy nhiên bắt đầu từ cuối
năm 2011, cả 2 dòng cúm B được quan sát thấy với tỉ lệ ngang nhau ở một số quốc
gia, điều này gợi ý đến khả năng quay trở lại lưu hành của dòng Yamagata mặc dù
số lượng virus thu thập được là tương đối ít. Hầu hết các virus dòng Yamagata đã
có sự khác biệt về tính kháng nguyên và di truyền với chủng B/Florida/4/2006 trước
đó mà có các đặc tính có mối liên hệ gần hơn với chủng B/Bangladesh/3333/2007,
B/Hubei-Wujiang/158/2009 và B/Wisconsin/1/2010. Trong năm 2012, hoạt động
lan rộng và có tính chất vùng miền của virus cúm B được báo cáo trên nhiều quốc
gia, vùng miền và lãnh thổ ở Bắc bán cầu trong giai đoạn từ tháng 2 đến tháng 7 bao
gồm Châu Mỹ, Châu Á và Châu Âu. Ở Nam bán cầu, hoạt động này cũng được báo
cáo ở Bolivia, Ecuador, Paraguay và Peru trong khoảng tháng 6 đến tháng 8. Ở
Châu Đại dương và Châu Úc các vụ dịch cũng xuất hiện vào tháng 8. Ở Nam Mỹ,
hoạt động của virus cúm B tăng lên vào tháng 7 và trở nên mang tính chất vùng
miền vào tháng 8. Trong thời gian này vẫn có sự lưu hành đồng thời của cả 2 dòng
virus cúm tuy nhiên dòng Yagamata đã tăng lên ở một số nơi và trở nên chiếm ưu
thế. Và phần lớn các virus thuộc dòng Yamagata đều có mối liên hệ mật thiết về
tính chất kháng nguyên và di truyền với chủng B/Wisconsin/1/2010 [46].
Vào cuối năm 2012 và đầu năm 2013, hoạt động virus cúm B tăng lên ở Nam
Mỹ từ tháng 11 với các vụ dịch mang tính chất vùng miền được báo cáo ở Mexico
và Mỹ. Các vụ dịch lan rộng cũng được báo cáo ở Châu Âu vào tháng 1 năm 2013.
Ở Châu Á, hoạt động của virus cúm B nhìn chung thấp. Hoạt động của virus cúm B

22. 22
không liên tục và mang tính chất vùng miền cũng được báo cáo ở một số quốc gia ở
Bắc Phi. Trong thời điểm này, virus cúm B vẫn lưu hành ở cả 2 dòng đồng thời, tuy
nhiên các virus cúm B dòng Yamagata vẫn tiếp tục tăng tỷ lệ và trở nên chiếm ưu
thế ở nhiều quốc gia. Hầu hết các virus thuộc dòng Yamagata phân lập được trong
giai đoạn này có tính chất kháng nguyên phân biệt với chủng vắc xin trước đó là
B/Wisconsin/1/2010 mà có những đặc tính có mối liên hệ gần hơn với chủng
B/Massachusett/2/2012.
Nhìn chung có thể thấy rằng sự lưu hành của virus cúm B trên Thế giới trong
thời gian qua tuân theo một quy luật 2-3 năm lại thay đổi dòng chiếm ưu thế là dòng
B/Victoria hoặc dòng B/Yamagata.
1.3. SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TẠI VIỆT NAM
Hội chứng cúm (Influenza like illness - ILI) là một trong 26 bệnh truyền
nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất trong các bệnh truyền nhiễm gây dịch tại Việt Nam.
Vai trò của virus cúm trong ILI cũng như ảnh hưởng của nhiễm virus cúm, gánh
nặng bệnh tật cùng với các biến chứng do virus cúm gây ra như viêm phổi cấp tính,
phụ nữ có thai 3 tháng đầu nhiễm virus cúm... với sức khỏe cộng đồng tại Việt
Nam vẫn chưa có những thống kê chính xác. Bắt đầu từ năm 2001, việc giám sát
chủ động sự lưu hành của virus cúm đã được triển khai tại Hà Nội. Theo Niên giám
thống kê các bệnh truyền nhiễm 2001-2005, tỷ lệ hội chứng cúm trung bình trong 5
năm (2001-2005) là 2040,4/ 100.000 dân, đứng đầu trong 10 bệnh có tỷ lệ mắc cao
nhất tại Việt Nam [1-5]. Năm 2006, Viện Viện Vệ sinh Dịch tễ (VSDTTƯ) đã bước
đầu thiết lập và triển khai hệ thống giám sát cúm trọng điểm để phát hiện và xác
định các chủng virus cúm gây bệnh hàng năm ở 15 điểm trong toàn quốc. Kết quả
giám sát cho thấy virus cúm lưu hành đồng thời các chủng cúm mùa khác nhau như
A/H3N2, A/H1N1 và B. Khác với virus cúm A là các phân týp A/H3N2 hoặc
A/H1N1có thể là căn nguyên chính trong mỗi năm và xuất hiện xen kẽ giữa các
năm, virus cúm B lưu hành hàng năm. (Nguồn từ Chương trình giám sát Cúm Quốc
Gia-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương do CDC-Mỹ tài trợ).

23. 23
Trong giai đoạn từ năm 2001 đến năm 2008, tại miền Bắc Việt Nam, virus
cúm B và các virus cúm mùa khác là A/H3N2 và A/H1N1 lưu hành quanh năm,
thường tập trung vào 2 thời điểm là cuối mùa xuân (tháng 2-3) và giữa mùa hè
(tháng 7-8). Trong đó, virus cúm B là căn nguyên chủ yếu gây ra các vụ dịch vào
cuối mùa xuân (2001, 2006 và 2008), virus cúm A/H1N1 hoặc A/H3N2 là căn
nguyên chủ yếu gây ra các vụ dịch vào giữa mùa hè. Đặc biệt virus cúm B đóng vai
trò gây bệnh nổi trội vào năm 2001. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm B lưu
hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn này tương đồng với các chủng virus
cúm được Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo cho sản xuất thành phần vắn xin khu
vực Bắc bán cầu cho từng năm. Cụ thể là sự xuất hiện dòng kháng nguyên
Yamagata được xác định tại Miền Bắc Việt Nam vào các năm 2001, 2005 và 2008,
dòng Victoria vào các năm 2003, 2004, 2006 và 2007. Đã xác định được sự lưu
hành đồng thời của 2 dòng kháng nguyên của virus cúm B trong cùng một năm [7].
1.4. SỰ TIẾN HÓA CỦA VIRUS CÚM B
Ở virus cúm A có thể xảy ra các biến đổi trong vật liệu di truyền như sự thay
đổi kháng nguyên: thay đổi nhỏ kháng nguyên (antigen drift) hoặc thay đổi lớn
kháng nguyên (antigen shift) [15, 27]. Nguyên nhân là do virus A có đối tượng gây
nhiễm đa dạng như gia cầm, thủy cầm, chim di cư, động vật có vú và người. Mà vật
liệu di truyền ARN của virus luôn chịu tác động của vật chủ trong quá trình xâm
nhập vào bên trong tế bào, tiến hành phiên mã, nhân lên, tích hợp, nảy chồi và giải
phóng virus mới ra khỏi tế bào vật chủ. Kết quả là đã xảy ra các đột biến trong vật
liệu di truyền hoặc sự pha trộn các phân đoạn gen của virus cúm A khác nhau khi
cùng đồng nhiễm trên một tế bào thông qua quá trình trao đổi và tích hợp. Sự biến
đổi trong vật liệu di truyền của virus cúm A chính là nguyên nhân gây ra các vụ
dịch lẻ tẻ hoặc đại dịch cúm cho nhân loại. Những thay đổi trong vật liệu di truyền
của virus cúm A là động lực cho sự tiến hóa của nó [8].
So với virus cúm A, đối tượng gây nhiễm của virus cúm B ít hơn rất nhiều,
chỉ bao gồm con người và hải cẩu. Do đó sự tiến hóa của virus cúm B cũng xảy ra

24. 24
với tần suất thấp hơn [33, 36]. Hiện nay trên thế giới lưu hành 2 dòng cúm B là
dòng B/Victoria/2/87-like virus và dòng B/Yamagata/16/88-like virus, trong đó
dòng B/Victoria/2/87-like virus lưu hành chủ yếu ở Đông Nam Á còn dòng
B/Yamagata/16/88-like virus lưu hành trên khắp thế giới trong thế kỷ XX [48, 49].
Sự trao đổi chéo và tích hợp vật liệu di truyền của virus cúm B chỉ xảy ra khi hai
dòng này lưu hành đồng thời. Hiện tượng này đã được ghi nhận ở một số nước
Châu Âu vào năm 2001 [57].
1.5. BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CÚM
Bệnh cúm là bệnh viêm nhiễm cấp tính đường hô hấp gây nên bởi virus cúm.
1.5.1. Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm
Sau thời gian ủ bệnh từ 2 - 4 ngày, bệnh thường khởi phát đột ngột với các
triệu chứng toàn thân như sốt cao, rét run, cơ thể rất mệt và yếu. Đồng thời xuất
hiện những dấu hiệu viêm đường hô hấp như ho khan, đau họng và viêm mũi. Với
trẻ em những triệu chứng như viêm tai giữa, buồn nôn và nôn cũng thường xảy ra.
Biến chứng thường gặp nhất của cúm là viêm phổi, trong đó viêm phổi do
bội nhiễm vi khuẩn là dạng phổ biến nhất và viêm phổi nguyên phát là dạng trầm
trọng nhất. Bệnh cúm kèm bội nhiễm vi khuẩn làm cho bệnh nặng lên nhiều lần [6].
Trong các vụ dịch thường có dạng kết hợp viêm phổi virus và vi khuẩn. Ngoài ra
còn có các biến chứng khác như viêm cơ, hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng Rey
[16, 51].
1.5.2. Sinh bệnh học bệnh cúm
Phương thức lây truyền virus cúm từ người sang người là virus cúm có trong
chất tiết hô hấp và hạt khí dung được phát tán trong không khí do bệnh nhân cúm
ho và hắt hơi đã thải virus ra không khí từ khoang mũi. Phương thức lây truyền
virus cúm từ động vật sang người là do con người đã tiếp xúc trực tiếp với gia cầm,
phân gia cầm bị bệnh hoặc ăn thịt gia cầm, tiết canh gia cầm chưa nấu kỹ. Nhiễm

25. 25
trùng đầu tiên được gây ra bởi virus cúm là viêm đường hô hấp trên, do virus xâm
nhập và nhân lên chủ yếu trong tế bào biểu mô trụ của đường hô hấp và gây phá
hủy nhung mao, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên và quan trọng trong hệ
thống hô hấp của cơ thể, dẫn đến hoại tử và bong biểu mô hô hấp. Kèm theo sự
nhân lên của virus, interferon được phát hiện trong giai đoạn cấp tính của bệnh là
nguyên nhân của sự nguy hiểm do nhiễm virus cúm [6].
Virus cúm B kết hợp với các virus gây viêm đường hô hấp khác sẽ có khả
năng gây biến chứng nguy hiểm cho trẻ em, người già, người suy giảm miễn dịch
hoặc mắc các bệnh mạn tính và phụ nữ mang thai nếu không có biện pháp phòng
ngừa kịp thời. Ngoài ra virus cúm B còn có khả năng gây bội nhiễm vi khuẩn
Staphylococcus aureus với tỷ lệ tử vong cao [30].
1.6. ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM
1.6.1. Các thuốc kháng virus
Hiên nay, có 2 nhóm thuốc được sử dụng để dự phòng và điều trị cúm [8].
Đó là:
- Nhóm thuốc ức chế hoạt động kênh ion M2: 2 loại thuốc
+ Amantadine và Rimantadine (Flumadine).
- Nhóm thuốc ức chế neuraminidase (NAIs): 4 loại thuốc
+ Oseltamivir (Tamiflu ®) và Zanamivir (Relenza ®)
+ Peramivir (Rapiacta ®) và Laninamivir (Inavir ®)
Để điều trị virus cúm B nên sử dụng các thuốc ức chế Neuraminidase là
Oseltamivir, Zanamivir, Permivir và Laninamivir, không sử dụng thuốc ức chế
kênh ion M2 như đối với virus cúm A vì virus cúm B không có protein M2. Tất cả
các thuốc đều có tác dụng điều trị hiệu quả nhất nếu được sử dụng trong vòng vài
giờ khi triệu chứng bắt đầu và thường được phép sử dụng trong vòng 48 tiếng sau
khi có triệu chứng đầu tiên. Thuốc có tác dụng làm giảm bớt mức độ trầm trọng của
bệnh cũng như các triệu chứng cúm và làm rút ngắn thời gian bệnh khoảng 1 - 3
ngày.

26. 26
Thuốc ức chế neuraminidase: Virus cúm B khi muốn giải phóng virus thế
hệ mới ra khỏi tế bào nhiễm cần có sự tham gia trực tiếp của enzyme
neuraminidase. Neuraminidase của virus tham gia cắt tách các phần dư axit sialic từ
màng glycoprotein của virus, đóng một vai trò quan trọng khi phóng thích các hạt
virus thế hệ mới và tạo điều kiện thuận lợi cho virus lan rộng trong đường hô hấp.
Thuốc ức chế có tác dụng can thiệp vào chức năng bình thường của enzyme
neuraminidase (NA), ức chế hoạt động của enzyme này do đó ngăn cản sự giải
phóng virus khỏi tế bào nhiễm, virus sẽ bị giữ lại bên trong tế bào và không có cơ
hội tấn công các tế bào khác.
Hình 1.3. Các vị trí đột biến trên cấu trúc không gian 3 chiều của
Neuraminidase ( * Các axit amin được đánh số dựa trên hệ thống đánh số
N2 NA. Các vị trí đột biến tương ứng trên virus cúm B/Beijing/1/87 là
Asp196, Ile220, Ser248 và Gly406. Đối với các týp virus cúm B lưu hành
trong thời gian gần đây, các vị trí đột biến tương ứng lần lượt là Asp197,
Ile221, Ser249 và Gly407).
Nguồn: Shuji Hatakeyama, Norio Sugaya, Mutsumi Ito, et al, JAMA [50]

27. 27
Trong nghiên cứu giám sát sự giảm hoặc kháng thuốc điều trị của virus cúm
A và B trên thế giới giai đoạn 2004-2008 cho thấy đã xác định được 12/3261 (0,4%)
chủng kháng thuốc và 16/3261 (0,5%) chủng giảm độ nhạy với thuốc điều trị
Oseltamivir hoặc Zanamvir. Trong đó, xác định được 3 chủng giảm độ nhạy với
thuốc (đột biến tại H274Y, I222T và T326I) [54]. Nghiên cứu tại Nhật bản 2004-
2005, xuất hiện 1/74 (1,4%) chủng có đột biến tại vị trí G407S làm giảm độ nhạy
của Oseltamivir đối với bệnh nhân nhiễm virus cúm B sau khi điều trị. 7/422 (1,7%)
chủng virus cúm B xuất hiện đột biến tại các vị trí D197N, I221T, S249G. Tỷ lệ
chủng virus giảm/kháng thuốc ở virus cúm B (1,4%) là thấp hơn so với virus cúm A
(5,5%-18%), tuy nhiên những chủng này đã được ghi nhận lây truyền từ người sang
người [50].
Như vậy, việc sử dụng các loại thuốc kháng virus như oseltamivir và
zanamivir có thể dẫn đến những đột biến thích nghi trên gen NA của virus cúm và
có thể dẫn đến kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc điều trị. Vì vậy, việc kiểm soát
phác đồ điều trị, giám sát sự kháng thuốc của virus cúm và nghiên cứu, phát triển
thuốc mới trong điều trị bệnh cúm là điều rất cần thiết.
1.6.2. Dự phòng
Biện pháp hữu hiệu của sức khỏe cộng đồng để đề phòng virus cúm A và B
là gây miễn dịch bằng cách sử dụng vắc xin cúm. Tuy nhiên do tính dễ bị biến dị
của virus cúm nên việc sản xuất virus cúm gặp nhiều khó khăn. Vắc xin làm từ
kháng nguyên của týp virus gây bệnh cúm năm nay rất khó bảo vệ được cơ thể đối
với týp gây bệnh cúm năm sau. Có hai cách khắc phục khó khăn trên trong nghiên
cứu phát triển vắc xin cúm: một là sản xuất vắc xin cúm đa týp kháng nguyên; hai là
căn cứ vào dự đoán dịch tễ học để dự đoán týp virus cúm mới sẽ xuất hiện trong
năm tới để sản xuất vắc xin phòng ngừa týp đó. Khối lượng vắc xin sản xuất hàng
năm thường không đáp ứng đủ nhu cầu của cộng đồng nên việc tiêm vắc xin thường
được ưu tiên cho những đối tượng sau:

28. 28
- Nhóm đối tượng có nguy cơ cao: người già trên 65 tuổi, người tàn tật, trẻ em,
bệnh nhân suy hô hấp, suy tim, bệnh chuyển hóa như đái tháo đường hoặc
mắc các bệnh mạn tính khác, phụ nữ mang thai.
- Nhóm tiếp xúc với các tác nhân gây bệnh: nhân viên làm việc trong phòng
thí nghiệm.
- Nhóm người làm việc tại các dịch vụ công cộng: nhân viên y tế, cảnh sát…
Vắc xin nên được tiêm sớm vào mùa thu trước đợt bùng nổ bệnh cúm và
nhắc lại hàng năm để duy trì chống lại những chủng virus cúm phổ biến nhất. Hiện
nay có các loại vắc xin cúm như sau:
 Vắc xin bất hoạt (Inactivated vaccine): Vắc xin bất hoạt gồm các phân týp
virus cúm được bất hoạt bởi formalin hoặc ether. Bao gồm các loại sau [25]:
- Vắc xin toàn bộ hạt virus bất hoạt: sử dụng formalin hoặc ß-
propiolactone.
- Vắc xin tiểu đơn vị hoặc kháng nguyên bề mặt HA và NA (subunit hoặc
surface).
- Vắc xin thành phần tách rời của virus: toàn bộ hạt virus nhưng bị tách rời
bằng ether (split).
 Vắc xin sống giảm độc lực (Live attenuated influenza virus - LAIV):được
phát triển dựa trên các kỹ thuật di truyền, người ta tạo ra các chủng virus
không gây bệnh, được ghép gen mã hóa tổng hợp HA và NA. Vắc xin cúm
sống giảm động lực được sử dụng bằng cách nhỏ vắc xin vào mũi hoặc bơm
xịt vắc xin vào mũi họng. Vắc xin này có hiệu lực kém hơn các loại vắc xin
bất hoạt và chỉ dùng cho người khỏe mạnh trong độ tuổi 5 - 49 [13, 41].
 Vắc xin bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (Reassortment vaccine): tái
tạo các virus từ các phân đoạn gen có lựa chọn khác nhau bằng kỹ thuật di
truyền ngược (reverse genetic) [39, 40, 42].
Hiện tại, vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin sống bất hoạt,
thành phần vắc xin bao gồm virus cúm A/H1N1, A/H3N2 và B. Thành phần vắc xin

29. 29
cúm theo mùa hàng năm cũng lựa chọn chủng đại diện cho một dòng kháng nguyên
Yamagata hoặc Victoria. Vì vậy những năm virus cúm B lưu hành cả 2 dòng kháng
nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng là hạn chế.
1.7. CHẨN ĐOÁN VIRUS HỌC
Để có thể chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh của bệnh truyền nhiễm,
chúng ta không thể chỉ dựa trên dấu hiệu lâm sàng và triệu chứng, vì một bệnh có
thể có nhiều căn nguyên và mỗi căn nguyên có thể gây bệnh với những biểu hiện
lâm sàng và triệu chứng nặng hay nhẹ khác nhau. Do đó việc chẩn đoán trong
phòng thí nghiệm là rất quan trọng, giúp cho các nhà lâm sàng có thể chẩn đoán
được chính xác.
Bên cạnh các kỹ thuật chẩn đoán cúm cơ bản, nhờ có sự phát triển của khoa
học kỹ thuật mà ngày nay đã có nhiều các kỹ thuật chẩn đoán mới nhanh và hiện đại
hơn. Nhờ đó sớm xác định được sự nhiễm virus cúm để có các biện pháp xử lý,
cách li, điều trị kịp thời, giúp tránh lây nhiễm trong cộng đồng , tránh được những
thiệt hại to lớn về tính mạng con người và kinh tế mà các vụ dịch cúm có thể gây ra.
Quá trình phân tích các mẫu bệnh phẩm trong phòng thí nghiệm có giá trị quan
trọng trong việc tìm hiểu đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh, quá trình sinh
kháng thể sau khi lây nhiễm, cũng như quá trình khu trú và phát tán virus trong cơ
thể.
1.7.1 An toàn phòng thí nghiệm
Trong phòng thí nghiệm chẩn đoán virus, làm việc với những mẫu bệnh
phẩm lâm sàng có thể tiềm tàng tác nhân gây nhiễm dưới dạng khí dung, mà nhân
viên phòng thí nghiệm có nguy cơ phơi nhiễm hàng ngày. Do đó, an toàn phòng thí
nghiệm là hết sức quan trọng và cần thiết, trong quá trình làm việc cần có những
trang thiết bị cũng như các phương tiện bảo hộ phù hợp để bảo vệ cả người làm việc
cũng như công việc đang làm không bị nhiễm chéo.

30. 30
1.7.2. Thu thập mẫu để chẩn đoán virus
Thu thập mẫu để chẩn đoán virus cần quan tâm đến thời gian lấy mẫu sau khi
mắc, vị trí lấy mẫu, cách bảo quản và vận chuyển có liên quan đến kết quả chẩn
đoán phòng thí nghiệm.
Để phân lập virus, mẫu bệnh phẩm cần thu thập trong giai đoạn sớm của
bệnh (thời gian nhiễm virus huyết) và trong suốt thời gian đào thải virus.
Để chẩn đoán huyết thanh, các mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và
giai đoạn hồi phục cần được lấy theo đúng thời gian quy định, ví dụ như mẫu huyết
thanh lấy trong giai đoạn cấp được lấy càng sớm càng tốt, mẫu huyết thanh lấy
trong giai đoạn hồi phục lấy sau đó 2 - 4 tuần.
Lựa chọn loại mẫu để thu thập đối với từng bệnh đòi hỏi có sự hiểu biết về
bệnh sinh của bệnh đó.
1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định týp virus
Phân lập chủng virus
Phân lập virus được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [17]. Chủng
virus phân lập được trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học cũng
như sự biến đổi di truyền và tính chất kháng nguyên, từ đó có thể dự đoán được sự
lan truyền của chủng một virus mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và lựa
chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm phù hợp.
Việc phân lập virus cúm B cùng với các virus cúm mùa khác là A/H1N1 và
A/H3N2 được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 và sử dụng dòng
tế bào cảm thụ MDCK. Virus cúm B có thể nhân lên trên các dòng tế bào tiên phát
như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như
MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virus cúm trên
người. Ưu điểm của phương pháp phân lập trên tế bào MDCK là đơn giản, thuận
tiện, dễ thực hiện, có thể phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm trong một
lần tiến hành. Để sản xuất vắc xin thì phương pháp phân lập trên trứng vẫn là lựa
chọn tối ưu vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virus với hiệu giá cao [24,

31. 31
43]. Việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu
[14, 29].
Ngoài ra đối với virus cúm gia cầm (cúm A/H5N1): là virus nguy hiểm mức
độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virus phải được tiến hành
trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3 và được TCYTTG khuyến cáo là
phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày
tuổi.
Định týp virus: virus sau khi phân lập được định týp (xác định đặc tính
kháng nguyên) bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).
1.7.4. Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence)
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương
pháp enzyme và khi giải trình tự thường sử dụng các máy phân tích chuỗi tự động
như ABI PRISM 3130-Avant (Applied Biosystems), hoặc Beckman Coulter (Mỹ).
Để thực hiện được giải trình tự của các máy tự động thì các mach ADN đơn sản
sinh ra trong ống nghiệm phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của
các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Sự xuất hiện của
các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và được thay
bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình
tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra
những đoạn ADN có độ dài khác nhau. Những đoạn ADN này được điện di qua
mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc
laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được
phát hiện bởi đầu đọc laser [8].
Cấu tạo của một máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính là phần điện
di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di
polyacrylamide là các ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những
con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Trong suốt quá trình điện

32. 32
di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng
lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một
đỉnh cường độ ánh sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này,
máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành
trình tự của đoạn ADN.
Phương pháp xác định trình tự gen đóng một vai trò quan trọng trong việc
nghiên cứu đặc điểm di truyền học, so sánh giữa các gen của virus cúm để xây dựng
cây gia hệ. Qua đó có thể xác định được tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số
gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của virus, giảm độ nhạy của thuốc kháng
virus và phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của các chủng
virus cúm đang lưu hành.

33. 33
Chương II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là tổng số 115 chủng virus cúm B được phân lập từ
bệnh phẩm lâm sàng thu thập trên bệnh nhân hội chứng cúm trong 3 năm (2010 -
2012) tại Hà Nội và các tỉnh miền Bắc Việt Nam. Các chủng virus cúm này được
cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Cúm - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Chủng virus cúm B
Các chủng phân lập virus cúm B được sử dụng trong nghiên cứu cần có hiệu
giá virus đạt ≥ 8 đơn vị HA xác định bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA).
2.2.2. Sinh phẩm
2.2.2.1. Sinh phẩm sử dụng cho định týp virus
Bộ sinh phẩm kháng huyết thanh chuẩn dùng trong phản ứng ngăn ngưng kết
hồng cầu (HI) để định týp virus cúm được TCYTTG cung cấp hàng năm (2010 -
2012) tùy theo từng năm.
Kháng nguyên chuẩn
(reference antigens)
Kháng huyết thanh chuẩn
(reference antisera)
A/H1N1 A/H1N1
A/H3N2 A/H3N2
B/Florida/4/2006 (B/Yamagata lineage) hoặc
B/Wisconsin/01/2010 (B/Yamagata lineage)
B/Florida/4/2006 (B/Yamagata lineage) hoặc
B/Wisconsin/01/2010 (B/Yamagata lineage)
B/Brisbane/60/2008 ( B/Victoria lineage) B/Brisbane/60/2008 ( B/Victoria lineage)

34. 34
2.2.2.2. Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trình tự gen
- Uni 12 primer (CDC - Mỹ)
- cADN SuperscriptIII Reverse Transcriptase, P/N 02321, Invitrogen
- Hotstar Hifidelity Polymerase Kit, Cat No 202605, Qiagen
- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR: Qiaquick PCR Purification kit 250,
Cat.No. 28106, Qiagen và Qiaquick Gel Extraction kit 250, Cat.No. 28706,
Qiagen.
- Bộ sinh phẩm cho chu kỳ nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide
(Cycle sequencing): BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N:
4336917, ABI.
- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide : Big Dye X
Terminator Purification Kit, Cat. No. 4376486, ABI.
- Hệ thống mồi:
Tên mồi Trình tự
HA-25F ATCCACAAAATGAAGGCA
HA-36F GAAGGCAATAATTGTACT
HA-482F GCAACAATGGCTTGGGC
HA-660R TATCAGAGTGGAACCCC
HA-760R GCCGCCAATCTGAGAAAC
HA-1140R ACCAGCAATAGCTCCGAA
NA-F1 AGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAA
NA-560F CTCCATTTTCCACATGGCAGCTTG
NA-620R ATTACTGTCAGGGCCATCAAC
NA-1557R AGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGAAA

35. 35
2.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ
2.2.3.1. Trang thiết bị
Trang thiết bị Hãng
Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2 Viện VSDTTƯ
Tủ an toàn sinh học cấp độ 2 (Biosafety Cabinet - Class2) Bioquell - Anh
Tủ ấm CO2 Jouan - Pháp
Tủ lạnh 4o
C, - 20o
C và - 80o
C Sanyo - Nhật
Máy li tâm Rotofex - Mỹ
Máy khuếch đại gen Biorad - Mỹ
Máy phân tích trình tự gen ABI-3130 Avant Hitachi - Nhật
Máy lắc (vortex) IKA - Malaysia
2.2.3.2. Dụng cụ
- Phiến nhựa 96 giếng, đáy chữ U và đáy chữ V.
- Pipet tự động vi lượng các loại từ 0,5µl đến 1000µl.
- Pipet đa kênh các loại từ 20µl đến 300µl.
- Đầu côn vô trùng các loại, có phin lọc từ 0,5µl đến 1000µl.
- Tuýp eppendorf các loại từ 0,2ml đến 1,5ml.
Và các dụng cụ thí nghiệm cần thiết khác.
2.3. PHƯƠNG PHÁP
2.3.1. Định týp virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)
2.3.1.1. Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu
(HA)

36. 36
Phương pháp này được tiến hành trên phiến nhựa 96 giếng đáy chữ V (hồng
cầu gà) hoặc phiến nhựa 96 giếng đáy chữ U (hồng cầu chuột lang).
 Các bước tiến hành:
(1) Chuẩn bị hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% trong dung
dịch đệm PBS, pH 7,2.
(2) Cho 50µl đệm PBS vào các giếng từ hàng thứ 2 đến hàng thứ 12.
(3) Cho 100µl hỗn dịch nuôi cấy virus vào giếng đầu tiên. Trộn đều và chuyển
50µl hỗn dịch này sang giếng thứ 2, pha loãng bậc 2 hỗn dịch nuôi cấy virus
từ hàng thứ 2 đến 12. Loại bỏ 50µl ở hàng cuối cùng.
(4) Cho 50µl hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% vào toàn bộ
96 giếng. Lắc đều, ủ 30 phút (với hồng cầu gà) hoặc 60 phút (với hồng cầu
chuột lang) ở nhiệt độ phòng.
 Nhận định kết quả: Hiệu giá kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của
kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Đó chính là một đơn vị
ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên, 50µl kháng nguyên 8 đơn vị hay 25µl
kháng nguyên 4 đơn vị.
2.3.1.2. Định týp virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)
 Xử lý kháng huyết thanh chuẩn:
Trước khi tiến hành phản ứng HI cần xử lý kháng huyết thanh chuẩn để loại
bỏ những chất ức chế không đặc hiệu có trong kháng huyết thanh chuẩn.
(1) Cho 1 thể tích kháng huyết thanh kết hợp với 3 thể tích dung dịch RDE
(enzyme phá hủy các thụ thể-Recepter Destroying Enzyme). Ủ 37o
C
trong 18 giờ hoặc qua đêm.
(2) Bất hoạt tại nhiệt độ 56o
C trong vòng 30 phút.
(3) Bổ sung 6 thể tích nước muối sinh lý NaCl 0,85% để kháng huyết thanh
chuẩn được pha loãng 1/10.
 Các bước tiến hành:

37. 37
(1) Cho 25µl đệm PBS vào các giếng từ hàng B tới hàng H (trừ cột 6 và cột
12) của tấm nhựa 96 giếng. Cột 6 và cột 12 cho 50µl đệm PBS.
(2) Cho 50µl kháng huyết thanh chuẩn đã xử lý vào hàng A (trừ các giếng
A6, A12)
(3) Hút từ hàng A chuyển xuống hàng B 25µl kháng huyết thanh chuẩn và
bắt đầu pha loãng bậc 2 từ hàng B tới hàng H, tại hàng H bỏ đi 25µl. Cột
6 và cột 12 giữ nguyên.
(4) Cho thêm 25µl kháng nguyên 4 đơn vị HA thích hợp (dịch nuôi cấy tế
bào và chứng dương) vào các giếng tương ứng. Lắc nhẹ để kháng nguyên
và kháng huyết thanh tiếp xúc với nhau rồi để ủ ở nhiệt độ phòng trong
1h.
(5) Cho 50µl hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% vào tất cả
các giếng. Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
 Nhận định kết quả:
- Phản ứng đọc được khi:
+ Kháng huyết thanh chuẩn: ngăn ngưng kết hoàn toàn.
+ Chứng hồng cầu: ngăn ngưng kết hoàn toàn.
- Hiệu giá ức chế ngưng kết hồng cầu của chủng virus: là giá trị tại độ pha
loãng cao nhất của kháng huyết thanh chuẩn và chủng virus gây nên hiện
tượng ngăn ngưng kết hồng cầu.
- Phân týp của virus được xác định tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu
giá ngăn ngưng kết hồng cầu cao nhất.
2.3.2. Giải trình tự gen
2.3.2.1. Tách chiết vật liệu di truyền từ chủng virus cúm phân lập được
Sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250
preps, Cat No 52904, Qiagen. Các bước thực hiện tách chiết theo thường quy bộ
sinh phẩm như sau:

38. 38
(1) Trộn đều 140µl mẫu (dịch nổi phân lập thu hoạch được) với 560µl đệm
AVL. Ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút.
(2) Thêm 560µl Ethanol tuyệt đối (100%) vào hỗn dịch trên, lắc đều bằng
máy vortex rồi li tâm nhẹ.
(3) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch. Chuyển 630µl hỗn dịch
trên vào cột QIAamp spin. Li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ tuýp li
tâm. Sau đó lặp lại bước (3).
(4) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch, rửa cột QIAamp spin
bằng 500µl dung dịch đệm AW1, li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ
tuýp li tâm.
(5) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch, tiếp tục rửa cột QIAamp
spin bằng 500µl dung dịch đệm AW2, li tâm 14000 vòng/phút/3 phút.
Loại bỏ dung dịch trong tuýp li tâm.
(6) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm vừa được loại bỏ dung dịch. Li
tâm 14000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ tuýp li tâm.
(7) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp eppendorf 1,5ml sạch. Cho 60µl dung
dịch đệm AVE vào chính giữa màng lọc của cột, ủ tại nhiệt độ phòng
trong 1 phút, li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin.
Phần dung dịch thu được trong tuýp li tâm chính là ARN của chủng virus
thu thập được.
(8) Bảo quản ARN tại -20o
C hoặc -80o
C.
2.3.2.2. Tổng hợp sợi ADN bổ sung (cDNA)
Với những đoạn gen có kích thước > 1000bp, cần phải tổng hợp sợi ADN bổ
trợ sau đó mới thực hiện phương pháp PCR.
Hôn hợp 1
Thành phần Thể tích(µl)
Mồi Uni 12 (10µM) 5
dNTP (10µM) 1

39. 39
ARN 10
Tổng 16
Ủ hỗn hợp này ở 65o
C / 5 phút. Giữ lạnh ngay trong đá.
Hỗn hợp 2
Thành phần Thể tích(µl)
Buffer 5x 5
DTT (0,1M) 1
RNase inhibitor 1
SuperSriptIII (200U/µl) 1
Tổng 8
Trộn hỗn hợp 1 và hỗn hợp 2 rồi ủ 50o
C/45 phút, 70o
C/15 phút.
2.3.2.3. Thực hiện PCR
Sử dụng bộ sinh phẩm Hotstar Hifidelity Polymerase Kit, Cat No 202605,
Qiagen.
Thành phần Thể tích(µl)
Đệm 5x 10
Mồi xuôi (100pmol) 0,5
Mồi ngược (100pmol) 0,5
Hifi Taq polymerase 2
Nước cất tinh khiết 31

40. 40
cADN 6
Tổng 50
Mồi sử dụng trong phản ứng này là:
Tên mồi Trình tự
HA-25F ATCCACAAAATGAAGGCA
HA-1140R ACCAGCAATAGCTCCGAA
NA-F1 AGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAA
NA-1557R AGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGAAA
Chu kỳ nhiệt:
(1) 95o
C trong 5 phút
(2) 94o
C 15 giây lặp lại (2) 35 lần
50o
C 1 phút
68o
C 2 phút
(3) 68o
C 10 phút
(4) 10o
C ∞
Điện di sản phẩm PCR: Sử dụng thạch 1% và thang trọng lượng phân tử
1kb (Hãng Promega).
2.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR nhằm loại bỏ những sinh phẩm và mồi thừa trong
quá trình PCR để tránh gây nhiễu trong quá trình giải trình tự.

41. 41
Nếu sản phẩm PCR sau điện di cho kết quả đặc hiệu: sử dụng bộ sinh
phẩm Qiaquick PCR Purification kit 250, Cat.No. 28106, Qiagen để tinh sạch.
Thành phần của bộ Kit:
+ Cột Quiquick 250 chiếc
+ Đệm PB 150ml
+ Đệm PE 55ml
+ Đệm EB 15ml
+ Tuýp 2 ml: 250 chiếc
Trước khi tiến hành tinh sạch, cần thêm 220ml cồn tuyệt đối (96 - 100%) vào
đệm PE.
Các bước tiến hành:
(1) Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có.
(2) Dùng pipet chuyển toàn bộ hỗn dịch đã trộn ở bước (1) vào cột
Qiaquick đặt trong tuýp 2ml, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
(3) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp.
(4) Dùng pipet hút 750µl đệm PE cho vào cột Qiaquick để rửa ADN, li
tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
(5) Loại bỏ dung dịch rửa ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp, li tâm 13000
vòng/phút/1 phút để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.
(6) Chuyển cột Qiaquick sang tuýp eppendorf 1,5ml sạch đã chuẩn bị
sẵn.
(7) Cho 30µl đệm EB vào chính giữa màng lọc của cột Qiaquick, ủ tại
nhiệt độ phòng trong 1 phút, li tâm 13000 vòng/phút/1phút. Sản phẩm thu
được chính là ADN đã được tinh sạch. ADN sau khi tinh sạch giữ ở -
20o
C đến -80o
C.
Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di không cho kết quả đặc hiệu: Sử dụng
bộ sinh phẩm Qiaquick Gel Extraction kit 250, Cat.No. 28706, Qiagen.

42. 42
Thành phần bộ Kit:
+ Cột Qiaquick 250 chiếc
+ Đệm QG 150ml
+ Đệm PE 55ml
+ Đệm EB 15ml
+ Tuýp 2ml 250 chiếc
Trước khi tiến hành tinh sạch cần thêm 220ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào
đệm PE trước khi sử dụng.
Các bước tiến hành:
(1) Cắt băng sản phẩm cần giải trình tự trên thạch 1% đã điện di (dưới đèn
chiếu tia cực tím)
(2) Cân trọng lượng thạch chứa băng sản phẩm. Cho 3 lần thể tích dung
dịch đệm QG vào 1 lần thể tích thạch (100µg ≈ 100µl)
(3) Ủ tại 50o
C trong 10 phút cho tới khi thạch tan hết trong dung dịch đệm
QG. Để thạch có thể tan nhanh hơn có thể lắc tuýp bằng máy lắc sau mỗi
2-3 phút ủ.
(4) Đặt cột Qiaquick vào tuýp 2ml.
(5) Dùng pipet chuyển 750µl hỗn dịch ở bước (3) sang cột Qiaquick, li tâm
13000 vòng/phút/1 phút.
(6) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp.
(7) Lặp lại bước (5) và (6) cho tới khi hết hỗn dịch ở bước (3).
(8) Dùng pipet chuyển 500µl dung dịch đệm QG vào cột Qiaquick, li tâm
13000 vòng/phút/1 phút.
(9) Dùng pipet chuyển 750µl dung dịch đệm PE vào cột Qiaquick, li tâm
13000 vòng/phút/1 phút.
(10) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp, li tâm 13000
vòng/phút/1 phút.

43. 43
(11) Chuyển cột Qiaquick sang tuýp 1,5ml sạch
(12) Cho 30µl đệm EB vào chính giữa màng lọc của cột Qiaquick để thu
ADN, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
ADN sau khi tinh sạch giữ ở -20o
C đến -80o
C.
2.3.2.5. Chu trình nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle
sequencing)
Sử dụng bộ sinh phẩm Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N:
4336917, ABI.
Thành phần Thể tích (µl)
Đệm 5x 3
BDX 64 1,5
Bigdye 1/3 1,5
Mồi (3.2 pmol) xuôi hoặc ngược 1
Sản phẩm ADN đã tinh sạch 2
Nước cất tinh khiết 11
Tổng số 20
Chu kỳ nhiệt:
(1) 96o
C trong 3 phút
(2) 96 o
C 10 giây lặp lại (2) 35 lần
50 o
C 5 giây
60 o
C 2 phút
(3) 4 o
C ∞

44. 44
2.3.2.6. Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide
Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide và sinh phẩm còn thừa sau khi
chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide, tránh tín hiệu nhiễu trong quá trình giải
trình tự.
Sử dụng bộ sinh phẩm Big Dye X Terminator Purification Kit, Cat. No.
4376486, ABI.
Thành phần: XTerminator Solution 9ml
SAM Solution 2ml
Các bước tiến hành:
(1) Dùng pipet hút 45µl SAM Solution vào tuýp 0,2 ml đặt trên giá PCR 96
giếng.
(2) Dùng pipet và đầu côn cắt hút 10µl XTerminator Solution cho tiếp vào tuýp
trên.
(3) Dùng pipet hút 10µl sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn
dideoxynucleotide cho tiếp vào tuýp trên.
(4) Dùng giấy bạc bọc giá PCR 96 giếng này lại, lắc đều trong 30 phút bằng
máy vontex.
(5) Li tâm nhẹ trong 5 phút. Hút 20µl sản phẩm tinh sạch sang phiến 96 giếng,
tránh không để đầu côn chạm vào thành tuýp hay đáy tuýp.
(6) Chuyển phiến 96 giếng vào máy.
(7) Cài đặt chương trình, tạo tệp dữ liệu và bắt đầu chạy máy.
2.3.3. Phương pháp phân tích kết quả và xử lý số liệu
 Sử dụng phần mềm DNAstar: chỉnh sửa các tín hiệu lỗi, nối các đoạn
nucleotide lại với nhau tạo thành một gen hoàn chỉnh.

45. 45
 Sử dụng phần mềm BioEdit: So sánh các đoạn gen của virus cúm B tại Miền
Bắc Việt Nam năm 2010-2012 với các virus cúm B lưu hành trong khu vực
và trên thế giới.
 Sử dụng phần mềm Mega 4 [53]: Xây dựng cây gia hệ của các gen HA của
virus Cúm B tại Miền Bắc Việt Nam năm 2010-2012: sử dụng phương pháp
ước tính khả năng chênh lệch tối đa (maximum likelihood) thông qua mô
hình NJ (Neighbor-Joining). Trình tự của các chủng vắc xin được sử dụng
làm gốc của cây gia hệ được lấy từ GenBank.

46. 46
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ KHUẾCH ĐẠI CÁC CHỦNG VIRUS CÚM
B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012
3.1.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2012
Tại Việt Nam, Chương trình giám sát cúm Quốc gia được triển khai từ năm
2006 do sự tài trợ của Trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ
(CDC) tại 4 vùng là miền Bắc, miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên với mục
đích xác định sự lưu hành của các phân týp virus cúm bằng phản ứng RT-PCR. Tại
miền Bắc Việt Nam từ năm 2010 đã triển khai 4 điểm giám sát bệnh nhân hội
chứng cúm (ILI): Bệnh viện Nhi Trung Ương, Trung tâm Y tế huyện Cao Lộc -
Lạng Sơn, Trung tâm Y tế huyện Kiến Xương - Thái Bình, Phòng khám đa khoa
Thanh Xuân - Hà Nội.
Trong giai đoạn nghiên cứu, 2010 - 2012, sự lưu hành của virus cúm B được
quan sát theo số liệu của chương trình Giám sát cúm Quốc gia tại các điểm nghiên
cứu như sau:

47. 47
Hình 3.1. Sự lưu hành của virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 -
2012
Nguồn: Chương trình Giám sát Cúm Quốc gia- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung
Ương
Thông qua Dự án Giám sát Cúm Quốc gia được triển khai tại Việt Nam với
sự phối hợp của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Trung tâm phòng chống và
kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) từ năm 2006 đến nay cho thấy virus cúm B được
quan sát thấy hàng năm, cùng với 2 loại virus cúm mùa khác là A/H1N1 và
A/H3N2, virus cúm B lưu hành quanh năm tại Việt Nam, trong đó virus cúm B
thường tập trung lưu hành chủ yếu vào mùa đông xuân (tháng 2 - 3).
3.1.2. Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2012
Virus cúm B cùng với các virus cúm mùa khác là A/H1N1 và A/H3N2 được
tiến hành phân lập trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 và sử dụng dòng tế bào
0
5
10
15
20
25
30
Tỷlệ%
Năm
Tỷ lệ % bệnh nhân ILI dương tính với virus cúm B, Việt Nam 2006–
2012, N=37,636
B

48. 48
cảm thụ MDCK. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virus cúm B trên
người do virus cúm B có khả năng thích ứng tốt nhất trên dòng tế bào này.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam, 2010 - 2012
Trong tổng số 397 mẫu bệnh phẩm được xác định là dương tính với virus
cúm B trong 3 năm (2010 - 2012) đã phân lập được 115 chủng virus cúm B
(29,0%), trong đó số mẫu dương tính phân lập của năm 2010 chiếm tỉ lệ thấp hơn
hẳn so với năm 2011 và 2012, mặc dù số mẫu dương tính với virus cúm B trong
năm 2010 là cao nhất. Kết quả của phương pháp phân lập virus phụ thuộc rất nhiều
vào chất lượng bệnh phẩm, điều kiện bảo quản cũng như kỹ năng phân lập. Trong
năm 2011, 2012 điều kiện và kỹ năng phân lập đã được nâng cao, do đó đã làm tăng
tỷ lệ phân lập từ 7,5% năm 2010 lên 43,4% và 40,1% vào năm 2011 và 2012.
Phân lập virus được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán nhiễm virus
cúm [17]. Bên cạnh những nhược điểm như quy trình phân lập virus đòi hỏi nhiều
thời gian (3 tuần) cũng như phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng bệnh phẩm, vì vậy
tỷ lệ dương tính sẽ không cao. Phương pháp này cũng có những ưu điểm như cho
phép tìm hiểu đặc điểm di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên - hệ quả của quá
trình tiến hóa của virus cúm [7]. Chủng virus phân lập được phục vụ cho việc
nghiên cứu về các đặc điểm sinh học cũng như sự biến đổi di truyền và tính chất
kháng nguyên, từ đó có thể dự đoán được sự lan truyền của một chủng virus mới có
Năm
Số mẫu có hội
chứng cúm
Số mẫu phân
lập được
Tỷ lệ (%)
2010 147 11 7,5
2011 113 49 43,4
2012 137 55 40,1
Tổng số 397 115 29,0

49. 49
độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm
phù hợp.
3.2. ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM B, 2010-2012
Đặc tính kháng nguyên của virus cúm được quyết định bởi những thay đổi
trong vật liệu di truyền tại một số vị trí đặc biệt trên gen HA. Đặc tính kháng
nguyên của virus quyết định hiệu quả bảo vệ của vắc xin phòng chống virus và
được thể hiện rất rõ trong lịch sử phát triển của vắc xin cúm trong hơn 50 năm qua.
Thông thường đặc tính kháng nguyên của virus được xác định thông qua khả
năng tương tác với các kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera) được sản xuất
từ các chủng dự tuyển vắc xin thông qua phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).
Các chủng virus cúm B phân lập được từ các bệnh nhân hội chứng cúm (ILI) từ
năm 2010-2012 tại Miền Bắc Việt Nam có hiệu giá HA ≥ 8 sẽ được xác định đặc
tính kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) sử dụng kháng
huyết thanh chuẩn do TCYTTG cung cấp hàng năm (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Kết quả định týp virus cúm B bằng phương pháp HI, 2010-
2012
Năm
Dòng kháng nguyên
2010 2011 2012
Tổng
n % n % n %
B/Victoria/2/87 9 81,8 41 83,7 22 40,0 65
B/Yamagata/16/88 2 18,2 8 16,3 33 60,0 50
Tổng số 11 100 49 100 55 100 115

50. 50
Hình 3.2. Tỷ lệ lưu hành 2 dòng kháng nguyên virus cúm B theo năm
Tại Việt Nam, khác với virus cúm A là xuất hiện xen kẽ giữa các năm với
phân týp khác nhau (A/H1N1, A/H3N2), virus cúm B xuất hiện hàng năm và đều có
sự lưu hành đồng thời 2 dòng kháng nguyên B/Yamagata/16/88 và B/Victoria/2/87,
trong đó sẽ có một dòng kháng nguyên chiếm ưu thế. Mùa cúm năm 2007-2008,
dòng B/Yamagata chiếm ưu thế; năm 2009 được thay thế bằng dòng Victoria (theo
số liệu Giám sát Cúm Quốc gia). Trong nghiên cứu của chúng tôi, 2010-2012, dòng
kháng nguyên B/Victoria chiếm ưu thế trong 2 năm 2010 và 2011 với tỷ lệ gần như
ngang bằng nhau (81,8% và 83,7%) và giảm dần vào năm tiếp theo (40% năm
2012). Thay vào đó, dòng kháng nguyên B/Yamagata năm 2010, 2011 có tỷ lệ thấp
(18,2% và 16,3%), và dần chiếm ưu thế vào năm 2012 với tỷ lệ 60% (hình 3.2). Kết
quả này phù hợp với quy luật lưu hành của virus cúm B là 2 dòng kháng nguyên
virus cúm B gồm có B/ Victoria và B/Yamagata thay phiên nhau chiếm ưu thế trong
2-3 năm.
18.2 16.3
60
81.8 83.7
40
0
20
40
60
80
100
120
B/Yamagata/16/88 B/Victoria/2/87
2010 2011 2012

51. 51
Tỷ lệ này chỉ dựa trên những chủng vius phân lập và khuếch đại được với
hiệu giá HA ≥ 8 (115/397 mẫu, chiếm tỷ lệ 29,0%). Số mẫu dương tính với RT-
PCR nhưng phân lập không thành công hoặc hiệu giá HA ≤ 8 còn lại (chiếm tỷ lệ
71%) không cho phép phân tích được đặc tính kháng nguyên. Tuy nhiên kết quả so
sánh về tỷ lệ lưu hành của 2 dòng cúm B trong giai đoạn này vẫn mang tính đại diện
cao, phù hợp với quy luật lưu hành của virus cúm B tại các nước Đông Nam Á.
Bảng 3.3. Hiệu giá HI của các chủng virus cúm B, 2010-2012
Dòng kháng
nguyên
Hiệu
giá HI
2010
(n)
2011
(n)
2012
(n)
Tổng
n %
B/Victoria ≥160 9 34 19 62 86,1
80 0 5 2 7 9,7
≤40 0 2 1 3 4,2
Tổng 9 41 22 72 100
B/Yamagata ≥ 320 2 4 18 24 55,8
160 0 3 7 10 23,3
≤80 0 1 8 9 20,9
Tổng 2 8 33 43 100
Bảng 3.3 cho thấy, trong dòng kháng nguyên B/Victoria, tỷ lệ chủng virus có
hiệu giá HI ≥ 160 khi tương tác với kháng huyết thanh tạo ra từ chủng virus vắc xin
dự tuyển B/Brisbane/60/2008, tương đương với hiệu giá chuẩn, là 86,1% (62/72
chủng). Trong khi đó, tỷ lệ này ở dòng B/Yamagata là 55,8% (24/43 chủng) với
hiệu giá HI ≥ 320. Tỷ lệ hiệu giá HI của các chủng virus thấp hơn 1-2 bậc so với
hiệu giá chuẩn của dòng B/Victoria là 9,7% và 4,2%, thấp hơn so với dòng
B/Yamagata là 23,3 và 20,9%. Điều này cho thấy hiệu quả bảo vệ của vắc xin có
chủng virus cúm B/Victoria với chủng virus thuộc dòng B/Victoria lưu hành tại
Việt Nam cao hơn so với các chủng B/Yamagata.

52. 52
Bảng 3.4. So sánh hiệu giá HI giữa hai dòng B/Victoria và B/Yamagata
Năm Mã số PTN Kết quả HI Kết quả
định týp
Kháng huyết
thanh chuẩn
Dòng B/Yamagata Dòng B/Victoria
2010
TX 72 320 >640 B/ Victoria
TX 73 160 >640 B/ Victoria
TX 121 160 640 B/ Victoria
N 101 80 >640 B/ Victoria
N131 80 >640 B/ Victoria
N121 >640 160 B/Yamagat
a
2011
N32 80 >640 B/ Victoria
N361 80 160 B/ Victoria
N373 ≥1280 40 B/Yamagat
a
2012
N15 80 ≥1280 B/ Victoria
N22 80 160 B/ Victoria
N27 80 160 B/ Victoria
Để tìm hiểu khả năng bảo vệ chéo giữa 2 dòng kháng nguyên, chúng tôi lựa
chọn các chủng đã được xác định đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng HI có
kháng thể bảo vệ chéo với dòng kháng nguyên còn lại với hiệu giá kháng thể bằng
hoặc thấp hơn từ 1 đến 2 bậc pha loãng. Đối với các chủng B/Victoria có hiệu giá

53. 53
tương đương với chủng chuẩn là HI ≥160 và B/Yamagata là HI ≥320, chúng tôi sẽ
lựa chọn những chủng thuộc dòng B/Vitoria có hiệu giá với kháng huyết thanh
chuẩn dòng B/Yamagata là HI= 320, 160 và 80 hoặc ngược lại những chủng thuộc
dòng B/Yamagata có hiệu giá với kháng huyết thanh chuẩn dòng B/Victoria là
HI=160, 80 và 40. Kết quả đã xác định được 6 chủng năm 2010, 3 chủng năm 2011
và 3 chủng năm 2012 (bảng 3.4). Như vậy, khi lựa chọn một trong 2 dòng kháng
nguyên trong thành phần vắc xin cúm 2010-2012, tỷ lệ nhóm được bảo vệ với dòng
kháng nguyên còn lại là 12/115 (10,4%).
Bảng 3.5. So sánh kháng nguyên virus cúm B tại Miền Bắc Việt Nam với
thành phần vắc xin cúm tại Bắc và Nam Bán cầu theo khuyến cáo của
TCYTTG, 2010-2012
Mùa
cúm
Dòng KN Nam Bán cầu Bắc Bán cầu Miền Bắc Việt Nam
2010/
2011
B/Victoria
B/Brisbane/60/2008-
like virus
B/Brisbane/60/2008-
like virus
B/ Brisban/60/2008
-like virus
B/Yamagata
B/Florida/4/2006-
like virus
2011/
2012
B/Victoria
B/Brisbane/60/2008-
like virus
B/Brisbane/60/2008-
like virus
B/ Brisban/60/2008
-like virus
B/Yamagata
B/Florida/4/2006-
like virus
2012/
2013
B/Victoria
B/Brisbane/60/2008-
like virus
B/ Brisban/60/2008 -
like virus
B/Yamagata
B/Wisconsin/1/2010-
like virus
B/Wisconsin/1/2010-
like virus
Nguồn: Khuyến cáo về thành phần vắc xin cúm mùa hàng năm của TCYTTG

54. 54
Kháng nguyên virus cúm B lưu hành trên thế giới từ trước năm 1983 đến nay
được chia thành 2 dòng: dòng Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage viruses) và
dòng Victoria (B/Victoria/2/87-lineage viruses) [48]. Trong 2 năm 2010 - 2011,
virus cúm B được khuyến cáo trong thành phần vắc xin tại Bắc Bán cầu và Nam
Bán cầu đều thuộc dòng kháng nguyên B/Victoria (B/Brisbane/60/2008-like virus).
Đến năm 2012, dòng kháng nguyên B/Victoria được khuyến cáo trong thành phần
vắc xin tại Nam Bán cầu, trong khi đó dòng kháng nguyên B/Yamagata
(B/Wisconsin/1/2010-like virus) được khuyến cáo cho thành phần vắc xin tại Bắc
Bán cầu. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm B lưu hành tại Miền Bắc Việt Nam
trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với các chủng virus trong thành phần
vắc xin tại Bắc Bán cầu và Nam Bán cầu trong 3 năm.
Trong nghiên cứu này, virus cúm B/Yamagata lưu hành với tỷ lệ thấp năm
2010, 2011 (18,2% và 16,3%) và có xu hướng tăng và chiếm ưu thế năm 2012
(60%) (bảng 3.2). Vì vậy, thành phần vắc xin cúm B khuyến cáo tại Bắc bán cầu
năm 2012 sẽ phù hợp hơn tại miền Bắc Việt Nam. Tuy nhiên, dù lựa chọn 1 trong
2 dòng cúm B lưu hành chiếm ưu thế trong năm để khuyến cáo làm chủng dự tuyển
vắc xin thì khả năng bảo vệ là hạn chế do virus cúm B lưu hành cả 2 chủng kháng
nguyên với tỷ lệ B/Yamagata (60%) và B/Victoria (40%).
Trên thế giới, từ những năm 1970, vắc xin cúm được sản xuất là vắc xin đa
giá, thành phần vắc xin bao gồm 2 phân týp virus cúm A (A/H1N1, A/H3N2) và 1
dòng cúm B (Trivalent influenza vaccine - TIV). Vào những năm của thập kỷ 80,
virus cúm B đã xuất hiện 2 dòng, Yamagata và Victoria, lưu hành đồng thời ở nhiều
nước nhưng thành phần vắc xin vẫn lựa chọn chủng đại diện cho một dòng kháng
nguyên virus cúm B [37, 48]. Vì vậy, những năm virus cúm B lưu hành cả 2 dòng
kháng nguyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng sẽ là hạn chế. Mặt khác, nhiều năm
đã có sự không phù hợp giữa chủng virus cúm B đang lưu hành và chủng cúm B
được lựa chọn trong thành phần vắc xin hàng năm. Năm 2007, các quan chức y tế
đã đưa ra một quyết định sai lầm. Tại thời điểm đó, trên thế giới dòng B/Yamagata

55. 55
chiếm ưu thế (98%) nhưng các nhà y tế đã khuyến cáo trong thành phân vắc xin là
dòng B/Victoria [55]. Trong phân tích nhóm trẻ em sử dụng vắc xin cúm sống giảm
độc lực, hiệu quả bảo vệ với chủng virus cúm B giống với chủng virus đang lưu
hành là 86%, với chủng virus cúm B dòng kháng nguyên khác là 31% [12]. Nghiên
cứu tại Thổ Nhĩ Kỳ trong 9 mùa cúm liên tiếp (2003-2012), 2 mùa cúm có sự lưu
hành đồng thời của 2 dòng kháng nguyên và 6 mùa có sự lưu hành của 1 trong 2
dòng kháng nguyên. Phân tích về tính kháng nguyên cho thấy virus cúm B lưu hành
chỉ tương đồng một phần hoặc toàn bộ với thành phần trong vắc xin 3/8 mùa [11].
Chính vì vậy, việc phát triển vắc xin cúm mùa bao gồm cả 2 dòng kháng
nguyên B/Yamagata và B/Victoria là hết sức cần thiết. Đó là vắc xin gồm 4 thành
phần virus (H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria- Quadrivalent Influenza
Vaccine/QIV). Ngày 29/2/2012, vắc xin cúm giảm độc lực QIV (FluMist
Quadrivalent) của công ty MedImmune, LLC (Hoa Kỳ) là vắc xin gồm 4 chủng
virus cúm đầu tiên trên thế giới đã được Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ
chấp thuận sử dụng cho lứa tuổi từ 2-49 tuổi [56]. Hiện nay, các công ty như Sanofi
Pasteur, GlaxoSmithKline (GSK) và Novartis cũng đang nỗ lực phát triển vắc xin
cúm QIV. Gần đây nhất, 11/12/2013, vắc xin FluLaval Quadrivalent của công ty
GlaxoSmithKline cũng đã được Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ chấp
thuận sử dụng cho nhóm từ 3 tuổi trở lên.
Hiện nay, tại Việt Nam, vắc xin cúm được sử dụng là vắc xin Bắc Bán cầu.
Vì vậy, việc giám sát và xác định tính kháng nguyên của virus cúm mùa lưu hành
tại Việt Nam nói chung và Miền Bắc nói riêng có ý ‎nghĩa lớn trong việc sử dụng và
phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam trong tương lai. Ngoài ra, giám sát sự thay đổi
đặc tính kháng nguyên của virus cúm sẽ cung cấp các thông cần thiết cho mạng
lưới giám sát cúm toàn cầu (Global Influenza Surveillance and Response System -
GISRS) trong việc phát triển vắc xin phòng chống cúm cho khu vực, các quốc gia
có chung điều kiện khí hậu, kinh tế... để nâng cao hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm.

56. 56
3.3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN HA CÁC CHỦNG VIRUS CÚM
B TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012
3.3.1. Sự phân bố của các chủng virus cúm B theo thời gian
Bảng 3.6. Số lượng chủng phân tích gen HA và NA
Năm Số chủng phân tích
Gen HA Gen NA
2010 5 5
2011 22 14
2012 14 7
Tổng số 41 26
Trong tổng số 115 chủng virus cúm B đã được xác định đặc tính kháng
nguyên, chúng tôi tiến hành lựa chọn và phân tích 41 chủng virus đại diện cho các
điểm giám sát tại Miền Bắc Việt Nam theo thời gian. Số chủng phân tích gen HA
là 41 chủng và gen NA là 26 chủng.
3.3.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen HA của virus cúm B
Sử dụng các cặp mồi thiết kế cho phân tách phân đoạn gen HA của virus
cúm B kết hợp với enzym DNA polymerase Hifi trong kỹ thuật PCR có khả năng
khuếch đại và tổng hợp các gen mong muốn từ các chủng virus phân lập được với
kích thước lớn và độ đặc hiệu, chính xác cao. Đây là một bước đệm trong quá trình
giải trình tự gen tìm ra các biển đổi trên vật liệu di truyền.
Kết quả khuếch đại đoạn gen HA của virus cúm B bằng phương pháp PCR
trong nghiên cứu của chúng tôi cho sản phẩm có kích thước băng đặc hiệu là
1140bp (hình 3.3). Đoạn gen này sau khi tinh sạch đã được loại bỏ những sản
phẩm thừa không đặc hiệu trong quá trình phản ứng (hình 3.4). Sản phẩm tinh
sạch này được sử dụng trong quá trình giải trình tự.

57. 57
Hình 3.3. Sản phẩm gen HA sau PCR
(M: Thang trọng lượng phân tử)
Hình 3.4. Sản phẩm gen HA sau khi tinh sạch
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
← HA
1140bp
← HA
1140bp
1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16

58. 58
3.3.3. Cây gia hệ gen HA
Hình 3.5. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata và dòng
B/Victoria, 2010-2012
Chủng năm 2010
Chủng năm 2011
Chủng năm 2012
Chủng vắc xin
Chủng năm 2008, 2009

59. 59
Hình 3.6. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010-2012
Chủng năm 2010
Chủng năm 2011
Chủng năm 2012
Chủng vắc xin
Chủng năm 2008, 2009

60. 60
Hình 3.7. Cây gia hệ gen HA (1140 nucleotide) dòng B/Yamagata, 2010-2012
Chủng năm 2010
Chủng năm 2011
Chủng năm 2012
Chủng năm 2008, 2009
Chủng Vắc xin

61. 61
Cây gia hệ gen HA được xây dựng dựa trên việc phân tích gen HA (1140
nucleotide) của 41 chủng virus cúm B phân lập được tại Việt Nam, 2010-2012 bằng
phần mềm MEGA 4 trên cơ sở ước tính khả năng chênh lệch tối đa (maximum
likelihood) thông qua mô hình NJ (Neighbor-Joining). Trong 41 chủng cúm B phân
tích gen HA, có 5 chủng thuộc năm 2010, 22 chủng thuộc năm 2011, 14 chủng
thuộc năm 2012. Cây gia hệ được thiết lập dựa trên các dữ liệu thu thập trên
Genbank bao gồm các chủng vắc xin dự tuyển giai đoạn 2004-2012 (B/
Malaysia/2506/2004, B/Ohio/1/2005 và B/Brisbane/60/2008), các chủng virus cúm
B lưu hành tại một số nước trên thế giới (Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật
Bản, Úc, Mỹ...) và các chủng virus cúm B lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009-
2013. Tại Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới, virus cúm B dường như
chưa được quan tâm đúng mực. Do vậy, các nghiên cứu về đặc tính di truyền, kháng
nguyên virus cúm B chưa nhiều nên các dữ liệu trên Genbank cũng hạn chế.
Trong giai đoạn 2010-2012, cả 2 dòng kháng nguyên B/Vicroria
(B/Victoria/2/87-lineage) và B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage) lưu hành
đồng thời tại Việt Nam với số lượng chủng lần lượt là 24 và 17. Trong đó, các virus
cúm dòng B/Victoria được chia thành 2 nhóm: nhóm Victoria 1 (V1) gồm chủ yếu
các chủng lưu hành năm 2010-2011 (3 chủng năm 2010 và 13 chủng năm 2011) và
nhóm Vitoria 2 (V2) gồm chủ yếu các chủng lưu hành năm 2012 (7 chủng năm
2012 và 1 chủng năm 2011). Cũng giống dòng B/Victoria, virus cúm dòng
B/Yamagata trong giai đoạn nghiên cứu cũng được chia thành 2 nhóm Yamagata 1
(Y1) và Yamagata 2 (Y 2). Tuy nhiên, 16/17 chủng nghiên cứu thuộc dòng
B/Yamagata đều thuộc phân nhóm Y1, có độ tương đồng cao với chủng vắc xin
B/Florida/04/2006. Có duy nhất 1 chủng năm 2012 (B/Vietnam/IS0712401/2012)
thuộc nhóm Y2, cùng nhóm với chủng vắc xin B/Wisconsin/01/2010 (hình 3.5 và
hình 3.7). Sự chuyển dịch này cũng được phản ánh trong phản ứng ngăn ngứng kết
hồng cầu. Hiệu giá của chủng virus B/Vietnam/IS0712401/2012 với kháng huyết
thanh chuẩn dòng B/Yamagata (B/Frolida/04/2006 reference antisera) thấp hơn 3
bậc pha loãng so với kháng nguyên chuẩn (HI=40) (phụ lục).

62. 62
Như vậy, phân tích cây gia hệ gen HA của virus cúm B đã cho thấy có sự
tiến hóa về mặt di truyền trong từng dòng virus cúm B. Trong khoảng thời gian
2010-2011, các virus xuất hiện trong phân nhóm V1, có độ tương đồng cao về mặt
di truyền học, trong đó có 2 chủng virus cúm B tại Việt Nam năm 2008 và 2009
(B/Vietnam/DN353/2008 và B/Vietnam/TX532/2009) cũng nằm trong phân nhóm
này. Sau đó, phát triển phân nhóm V2 và có độ tương đồng cao với các chủng lưu
hành cùng thời gian tại Thái Lan, Trung Quốc... Toàn bộ các virus thuộc nhóm V1
trong nghiên cứu được nhóm vào cùng phân nhóm với virus B/Brisbane/60/2008 là
chủng vắc xin cho Nam Bán cầu trong 3 năm 2010-2012 và Bắc bán cầu trong 2
năm 2010, 2011. Trong khi đó, virus dòng B/Yagamata trong 3 năm nghiên cứu
phần lớn thuộc nhóm Y1, có độ tương đồng cao với các chủng virus tại Đài Loan,
Nhật Bản, Thái Lan...
3.3.4. Protein HA
Khi so sánh mức độ tương đồng về axit amin trên protein HA của các chủng
virus cúm B lưu hành tại miền Bắc Việt Nam năm 2010-2012 với chủng
B/Brisbane/60/2008-like virus (chủng dự tuyển vắc xin Bắc Bán cầu 2010, 2011) và
chủng B/Wisconsin/1/2010-like virus (chủng dự tuyển vắc xin Bắc Bán cầu 2012)
cho thấy thay đổi axit amin như sau:

63. 63
Hình 3.8. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Victoria
Bảng 3.7. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Vitoria, 2010-2012
Chủng Năm Vị trí axit amin thay đổi
3
8
4
8
5
2
7
3
9
0
1
0
5
1
4
4
1
6
1
1
6
9
1
8
0
1
8
7
1
9
8
2
1
2
2
1
7
2
3
3
2
4
0
2
7
0
B/Brisbane/60/20
08.vac
E T T L K V N I A K P E N A N V S
Vic 1 2010 I N V N S I
2011 D S I N I V N S S Y
Vic 2 2011 V S
2012 P N I S V E G S E S
Chủng virus B/Brisbane/60/2008 được lựa chọn trong thành phần vắc xin
cúm trong 3 năm ở Nam bán cầu (2010-2012) và 2 năm ở Bắc bán cầu (2010-2011)
được lựa chọn làm chủng chuẩn để so sánh sự khác biệt về axit amin với các virus
thuộc dòng B/Vicroria. Sự so sánh này cho phép xác định các axit amin đóng vai
trò quyết định sự phân tách nhóm V1 (năm 2010-2011) và V2 (chủ yếu năm 2012).

64. 64
Kết quả phân tích trên protein HA cho thấy có 17 axit amin thay đổi so với chủng
vắc xin B/Brisbane/60/2008, nằm trên protein HA1 (bảng 3.7). Thay đổi axit amin
K90N và I161V xuất hiện trong ở cả 2 nhóm V1 và V2 (các chủng năm 2012),
trong khi đó, thay đổi tại T52I , K180N và P187S chỉ xuất hiện tại nhóm Vic 1
trong cả 2 năm 2010 và 2011. Kết quả trên gợi ý 3 sự thay đổi trên có thể là
nguyên phân tách nhóm V1 và V2. Trong đó, nhóm V1 xuất hiện 6 axit amin
(2010) đến 10 axit amin (2011) thay đổi so với chủng vắc xin.
Hình 3.9. Vị trí axit amin thay đổi trên protein HA dòng B/Yamagata