Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------
Bùi Thị Khánh
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT
BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ
KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2015

2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------
Bùi Thị Khánh
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT
BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ
KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM
Mã số: 60420114
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
Hà Nội – 2015

3. LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.
Phan Tuấn Nghĩa, thầy luôn tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS. Nguyễn Văn
Minh và Cn. Phùng Bảo Khánh và các anh chị em làm việc tại phòng Protein tái tổ
hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng
Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm.
Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Y tế Thái Bình,
Trƣởng khoa Y học cơ sở và các anh em trong bộ môn Y học cơ sở đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi đƣợc đi học nâng cao trình độ của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý
thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin g i lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ
nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng chức năng của Trƣờng Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập, hoàn thành
chƣơng trình học Cao học.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
khích lệ tôi hoàn thành khóa học.
Hà Nội, tháng 12 năm 2015
HVCH: Bùi Thị Khánh

5. iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN …..…………………………………………………………... ii
MỤC LỤC …..…………………………………………………………………….. iii
DANH MỤC C C K HI U VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……………….…….vi
DANH MỤC C C BẢNG...............................................................................viii
DANH MỤC C C HÌNH……………………………………………….........ix
MỞ ĐẦU............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LI U............................................................. 3
1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI ....................... 3
1.1.1. Cấu trúc của ty thể ............................................................................. 3
1.1.2. Chức năng của ty thể ......................................................................... 6
1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào ....... 6
1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa......................................................... 7
1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết của tế bào ........................................ 9
1.1.3. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể.................... 10
1.1.3.1. Hệ gen ty thể ............................................................................. 10
1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể........................................ 12
1.1.3.3. Tính chất dị tế bào chất và tốc độ đột biến của ty thể .............. 12
1.2. ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ C C B NH LIÊN QUAN .................. 13
1.2.1. Các loại đột biến gen ty thể ............................................................. 13
1.2.1.1. Đột biến điểm............................................................................ 14
1.2.1.2. Đột biến cấu trúc mtDNA ......................................................... 15
1.2.2. Các bệnh do đột biến gen ty thể ...................................................... 15
1.2.2.1. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã
hóa tRNA................................................................................................ 17
1.2.2.2. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên
gen mã hóa protein ................................................................................ 19
1.2.2.3. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA... 21
1.2.2.4. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA..................... 22
1.3. HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU
(MERRF)....................................................................................................... 24
1.3.1. Các đột biến của hội chứng MERRF............................................... 25

6. iv
1.3.1.1. Đột biến A8344G ...................................................................... 25
1.3.1.2. Đột biến T8356C....................................................................... 26
1.3.1.3. Đột biến G8363A ...................................................................... 26
1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời
bệnh..........................................................................................................27
1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF............................... 30
1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp
với RFLP ...........………………………………………………………………30
1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định
trình tự gen …...……………………………............................................31
1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded
conformational polymorphism)..………………………………………....31
1.3.3.4. Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time
PCR ………………..…………………………………………………………32
1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh
học.......................................................................................................... 32
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LI U VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU ........... 34
2.1. NGUYÊN LI U..................................................................................... 34
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ............................................................................... 34
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác ....................................................... 34
2.2. M Y MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ ..................................................... 34
2.3. PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU.......................................................... 35
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số .................................................................. 35
2.3.2. Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết.......................................... 35
2.3.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR................................. 36
2.3.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân
cắt giới hạn (PCR-RFLP) .......................................................................... 37
2.2.5. Điện di trên gel agarose ................................................................... 37
2.2.6. Điện di trên gel polyacrylamide ...................................................... 38
2.2.7. Kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa
cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid).............................................. 39
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 43
3.1. THU THẬP MẪU M U B NH NHÂN VÀ T CH CHIẾT DNA
TỔNG SỐ...................................................................................................... 43

7. v
3.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích ................................................... 43
3.2. Tách chiết DNA tổng số của các mẫu ................................................ 43
3.2. SÀNG LỌC C C ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở
NGƢỜI VI T NAM BẰNG PHƢƠNG PH P PCR-RFLP ........................ 44
3.2.1. Sàng lọc đột biến A8344G............................................................... 44
3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR......................... 44
3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP... 45
3.2.2. Sàng lọc đột biến T8356C ............................................................... 47
3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR......................... 47
3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP ... 48
3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363A............................................................... 49
3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582 .......................................... 49
3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP... 51
3.3. XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN
A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ........................................ 53
3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA.................................. 53
3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA............................. 53
3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G.............. 55
3.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp
real-time PCR để định lƣợng đột biến A8344G ........................................ 57
3.3.2.1. Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và
không đột biến A8344G.......................................................................... 57
3.3.2. 2. Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G................... 57
3.2.4. Th nghiệm khả năng phát hiện và định lƣợng đột biến A8344G .. 61
3.4. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG
PHƢƠNG PH P GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP ........................................ 62
3.4.1. Kết quả giải trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292
trên hệ gen ty thể........................................................................................ 62
KẾT LUẬN....................................................................................................... 64
TÀI LI U THAM KHẢO................................................................................. 65
PHỤ LỤC …………………………………………………………………………..79

8. vi
DANH MỤC CÁC K HIỆU VÀ CH VIẾT TẮT
APS Ammonium persulfate
ANT Adenine nucleotide translocase
ADP Adenine diphosphat
ATP Adenine triphosphate
bp Base pair (cặp bazơ)
BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ huỳnh quang)
CoQ Coenzyme Q
CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia
(Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên)
Cyt c Cytochrome c
Cyt b Cytochrome b
D-loop Vòng chuyển vị
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate
ddH2O Deionized distilled H2O (nƣớc cất loại ion, kh trùng)
EtBr Ethidium bromide
FAD+
Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)
FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng kh )
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside
kb Kilobase
KSS Kearns-Sayre syndrome (Hội chứng KSS)
LB Luria Bertani
LHON Leber’s hereditary optic neuropathy
(Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)
LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)
MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like
Episodes (Hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả
tai biến mạch)
MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres
(Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều)
MIDD Maternally inherited diabetes and deafness

9. vii
(Bệnh tiểu đƣờng và câm điếc di truyền theo mẹ)
MRI Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ)
mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)
nDNA Nuclear DNA (DNA nhân)
NAD+
Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)
NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng kh )
NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos
(Hội chứng gây liệt, mất sự điều hòa và viêm võng mạc
OD Optical density (Mật độ quang học)
PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PEO Progressive external ophthalmoplegia
(Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển)
RFLP Restriction fragment length polymorphism
(Sự đa hình các đoạn phân cắt giới hạn)
ROS Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng)
SDS Sodium dodecylsulphate
TAE Tris -Acetate-EDTA
TBE Tris -Borate-EDTA
TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine
Tm Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi)

10. viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF. 29
Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến
MERRF ............................................................................................................. 36
Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% ........................................ 38
Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR...................... 41
Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366......................................... 44
Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII .................................... 46
Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 .................. 47
Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 .................................. 50
Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR.................................. 54
Bảng 3.6: Tƣơng quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không
đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định bằng real-time
PCR ................................................................................................................... 58
Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn............................ 59
Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn. ....... 60

11. ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc ty thể..................................................................................... 3
Hình 1.2. Cấu tạo màng ty thể ............................................................................ 4
Hình 1.3. Hệ gen ty thể ..................................................................................... 10
Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA ..................................... 39
Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman ....................................... 40
Hình 3.1. Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân...... 43
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8155 - 8366 ..................... 45
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân46
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8166 - 8385 ..................... 48
Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân49
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8342 - 8582 ..................... 50
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân51
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mẫu dò ……………………………………….....60
Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột
biến A8344G bằng real-time PCR .................................................................... 58
Hình 3.10. Sự tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết 60
Hình 3.11. Th nghiệm định lƣợng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến
A8344G bằng real-time PCR ............................................................................ 61
Hình 3.12. Kết quả blast của trình tự 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2...63

12. 1
MỞ ĐẦU
Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năng
cung cấp năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Ty thể sản xuất
năng lƣợng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trình
chuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H2O, CO2, và năng
lƣợng dƣới dạng ATP.
Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân. DNA ty thể ngƣời
tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho 2
RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong các
phức hợp của chuỗi hô hấp. DNA ty thể dễ bị tổn thƣơng do ty thể là môi trƣờng
giàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế s a chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến
xuất hiện trong hệ gen ty thể. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn
năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA ty thể có
thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hƣởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chức
khác nhau.
Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty
thể ngƣời gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s
hereditary optic neuropathy - LHON). Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau
trong hệ gen ty thể ngƣời đã đƣợc xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khả
năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau.
MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh
giật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hƣởng đến hệ thần kinh và cơ xƣơng cũng nhƣ
các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của
DNA ty thể. Ngoài ra, ngƣời mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh,
mất điều hòa vận động, suy nhƣợc và mất trí nhớ. Triệu chứng thƣờng khởi phát ở
trẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thƣờng, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé,
thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát đƣợc các u mỡ khu trú dƣới da. Tế bào

13. 2
cơ bất thƣờng và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm với
Gomori trichrome và quan sát dƣới kính hiển vi.
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứng
MERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng nhƣ tính di truyền
của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ
chế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phƣơng pháp thăm khám
lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thƣờng quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh
nhân MERRF vẫn chƣa đƣợc phát hiện và không có phƣơng pháp điều trị hiệu quả.
Ở Việt Nam, gần nhƣ chƣa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện và
định lƣợng đột biến MERRF ở ngƣời Việt Nam.
Nhằm góp phần vào công tác chẩn đoán, điều trị và tƣ vấn di truyền đối với
các bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề
tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động
kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam“.

14. 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI
1.1.1. Cấu trúc của ty thể
Ty thể là bào quan phổ biến đƣợc tìm thấy trong hầu hết các tế bào nhân
chuẩn. Chức năng chính của ty thể là cung cấp năng lƣợng hóa học cần thiết cho các
hoạt động sinh tổng hợp và vận động của tế bào. Ty thể đƣợc lần đầu tiên tìm thấy
trong tế bào cơ năm 1857 bởi nhà giải phẫu học ngƣời Thụy Sĩ, Kollier. Đến năm
1890, nhà mô học ngƣời Đức, Richard Altmann, bằng phƣơng pháp nhuộm fuchsine
đã quan sát đƣợc ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dƣới kính hiển vi quang học [27].
Ty thể có đƣờng kính khoảng 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Hình dạng và
số lƣợng ty thể tùy thuộc vào nhu cầu năng lƣợng của mỗi loại tế bào khác nhau,
các tế bào mô cơ xƣơng hoặc thận cần một lƣợng ty thể lớn hơn các tế bào khác
trong cơ thể. Ty thể có thể hình cầu, hình que hay hình sợi nhƣng đều có cấu trúc
chung giống nhau. Ty thể có khả năng thay đổi hình dạng, kích thƣớc, có thể liên
kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc nhỏ
hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý
bên trong tế bào [35].
Hình 1.1. Cấu trúc ty thể [68]

15. 4
Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng trong và màng
ngoài, bao lấy khối chất nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng đƣợc gọi là
xoang gian màng. Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tƣơng tự nhƣ màng
sinh chất, nhƣng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất lý hóa chuyên trách
cho việc thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng [35].
Màng ngoài của ty thể có độ dày 6 nm, có tỷ lệ protein (P)/ lipid (L) lớn hơn
hoặc bằng 1. Màng ngoài ty thể chứa tỷ lệ cholesterol thấp (bằng 1/6 so với màng tế
bào hồng cầu), tỷ lệ phosphatidyl choline cao gấp hai lần so với màng tế bào. Màng
ngoài có nhiệm vụ tiếp thu phần lớn protein sản xuất từ tế bào chất để xây dựng ty
thể và kiến tạo màng. Đặc biệt, màng ngoài của ty thể có tính bán thấm rộng hơn
với các ion và các phân t lớn cho phép các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên
sinh chất vào xoang gian màng và ngƣợc lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều
enzyme quan trọng nhƣ các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl
CoA synthetase [35].
Hình 1.2. Cấu tạo màng ty thể [67]
Màng trong của ty thể có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%,
và một lƣợng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53. Màng
trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lƣợc. Cấu trúc “mào” làm tăng diện
tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến
chức năng của nó là tăng cƣờng vận chuyển điện t và tổng hợp ATP. Màng trong

16. 5
chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein
kênh vận chuyển các ion Na+
, K+
, Ca2+
và H+
. Màng trong là nơi bám của 5 phức
hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện t (phức hợp I-IV), ATP
synthase (phức hợp V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotide
translocase (ANT) [9].
Xoang gian màng (khoảng xen kẽ giữa hai màng) là nơi trung chuyển các
chất giữa hai màng, môi trƣờng cũng tƣơng tự và cân bằng với bào tƣơng của tế
bào. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+
từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi
vận chuyển điện t , chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện t cơ động cho
chuỗi hô hấp, giải phóng Cyt c vào bào tƣơng sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò
trong quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [32].
Chất nền (matrix) là một vùng vật chất không định hình chứa nhiều cấu trúc
đặc biệt. Chất nền này là một phức hệ protein tan trong nƣớc, tƣơng đối đậm đặc và
chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo,
acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể. Nhƣ vậy, ở tế bào động vật, thực vật
và ngƣời ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể. Ty thể có
vật chất di truyền và bộ máy của riêng nó để tổng hợp nên các RNA cũng nhƣ
protein của chúng. Các DNA ngoài nhiễm sắc thể này mã hóa một số các peptide
của ty thể (ở ngƣời là 13 loại peptide). Các peptide này gắn vào lớp màng trong
cùng với các protein khác đƣợc mã hóa trong nhân tế bào [32].
Ty thể nhân lên theo phƣơng thức rất giống với tế bào vi khuẩn. Khi chúng
trở nên quá lớn, chúng bắt đầu chia đôi. Quá trình này xảy ra sau khi bộ DNA của
ty thể đƣợc nhân đôi hoàn toàn, đƣợc thực hiện bằng sự tạo thành rãnh bên trong và
sau đó màng ngoài thắt lại hình thành hai ty thể con. Đôi khi các ty thể mới đƣợc
tổng hợp ở các trung tâm giàu protein và polyribosome cần thiết. Tuy nhiên, nhiều
ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu
(autophagy). Cơ chế này giúp duy trì số lƣợng ty thể đặc trƣng trong một tế bào [9].

17. 6
1.1.2. Chức năng của ty thể
1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào
Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lƣợng của tế
bào. Quá trình hô hấp biến đổi hóa học và trao đổi chất tại ty thể đã giúp chúng
chuyển đổi năng lƣợng hóa học tiềm tàng trong các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2,
H2O và giải phóng năng lƣợng vào phân t cao năng ATP (adenosine triphosphate).
ATP đƣợc tạo thành từ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa dựa trên các phức hệ hô
hấp (gọi là chuỗi vận chuyển điện t ) nằm trên màng trong của ty thể. Quá trình oxy
hóa của tế bào s dụng nguồn các đƣơng lƣợng kh NADH và FADH2 nhƣ nguồn
điện t chính trong chuỗi vận chuyển điện t . Các thành phần của chuỗi vận chuyển
điện t nằm ở màng trong của ty thể bao gồm bốn phức hợp I, II, III và IV và một
số chất mang điện t . Các điện t đƣợc vận chuyển dọc theo chuỗi, ba trong bốn
phức hợp hoạt động nhƣ máy bơm proton, đẩy proton từ chất nền tạo thành dòng
chuyển proton. Nhờ gradient proton và sự chênh lệch điện thế qua màng, mà ATP
đƣợc tổng hợp từ ADP và Pi bởi phức hệ F0F1 synthase, do đó cho phép các proton
trở lại chất nền. Sự kết hợp vận chuyển điện t và tổng hợp ATP hoạt động theo cơ
chế hóa thẩm. Có hai giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra
trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện t nằm
ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme [23].
Nguồn tạo ra năng lƣợng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein
đƣợc lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate. Các hợp chất carbohydrate,
chủ yếu là glucose thông qua quá trình đƣờng phân (glycolysis) đƣợc phân cắt và
biến đổi cuối cùng tạo thành pyruvate, chất kh NADH và một lƣợng ATP.
Pyruvate đƣợc đƣa vào ty thể và bị oxy hóa, decarboxyl hóa để tạo thành acetyl-
CoA (acetyl-CoA có thể tạo ra từ quá trình oxy hóa acid béo) và tiếp tục đƣợc oxy
hóa hoàn toàn qua chu trình Krebs để tạo thành CO2, H2O và năng lƣợng chủ yếu
đƣợc tích trữ dƣới dạng ATP. Trong chu trình Krebs, điện t và proton H+
đƣợc
tách ra và chuyển đến các phân t nhận điện t là NAD+
và FAD+
trong chuỗi vận

18. 7
chuyển điện t để tạo thành NADH và FADH2. Chuỗi vận chuyển điện t bao gồm
bốn phức hợp: nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase (NADH-
CoQ reductase/ phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II), ubiquinol
cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV) và hai
phân t vận chuyển điện t giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt
c. Phức hệ I và II có vai trò xúc tác cho sự nhận điện t của CoQ từ NADH và
succinate. Sau đó phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện t từ CoQ đến Cyt
c. Cuối cùng phức hệ IV xúc tác cho sự vận chuyển điện t từ Cyt c tới chất nhận
cuối cùng là oxy phân t . Ở mỗi giai đoạn, điện t đi qua các phức hệ, năng lƣợng
đƣợc giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H+
) từ chất nền qua màng trong
ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng. Do đó, hệ thống F0F1 synthase
hoạt động và tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ [35].
ATP là nguồn năng lƣợng lớn đƣợc s dụng cho tất cả các quá trình trao đổi
chất cần thiết bên trong tế bào. Vì vậy, khi ty thể bị tổn thƣơng, quá trình sản sinh
ra năng lƣợng bị chậm lại, thậm chí là ngừng lại hoàn toàn. Pyruvate không đƣợc
chuyển hóa tiếp, nên bị biến đổi thành lactate, vì vậy các bệnh nhân bị bệnh ty thể
thƣờng có hàm lƣợng lactate trong máu và trong dịch não tủy cao. Do gần nhƣ tất
cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp nên khi ty
thể bị tổn thƣơng có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hƣởng đến nhiều loại tế
bào cũng nhƣ mô và các cơ quan [35].
1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa
Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, là yếu tố nguy cơ lớn cho sự phát
triển của ung thƣ, thoái hóa thần kinh và các bệnh tim mạch. Cơ chế phân t của sự
lão hóa là vấn đề phức tạp, tuy nhiên quá trình oxy hóa và nitrat hóa protein trong tế
bào đã đƣợc đề xuất là cơ sở cho việc suy giảm chức năng của tế bào và làm giảm
khả năng chống chịu của cơ thể [60].
Các gốc tự do, chủ yếu là các dạng oxy phản ứng (ROS – Reactive oxygen
species) đƣợc xem là những phân t tín hiệu của nhiều hoạt động sinh lý. Những

19. 8
năm 1990, hydrogen peroxide đƣợc làm sáng tỏ là có liên quan đến cytokine,
insulin, yếu tố tăng trƣởng, AP-1 và tín hiệu NF-кB [48]. Sau đó, nhiều báo cáo chỉ
ra rằng H2O2 có thể thúc đẩy sự bất hoạt phosphatase bằng sự oxy hóa cysteine làm
ảnh hƣởng đến con đƣờng truyền tín hiệu [58].
Hệ quả của các phản ứng hô hấp trong ty thể là các điện t chƣa ghép cặp, sự
tƣơng tác của các điện t này với oxy tạo thành các gốc superoxide rất hoạt động,
các gốc tự do có hoạt tính cao. Có tám điểm trong ty thể có khả năng sản xuất O2-
,
superoxide đƣợc chuyển hóa thành hydrogen peroxide (H2O2) bởi superoxide
dismutase (SODs) khi có sự tham gia của một điện t và 2 proton H+
[48].
Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ROS có thể gây ra những thay
đổi trong quá trình dịch mã protein. Cụ thể, H2O2 có thể oxy hóa nhóm thiol (-SH)
trong cysteine để tạo thành axit sulphenic (-SOH), tiếp theo phản ứng với GSH sinh
ra glutathionylate (-SSG) mang liên kết disulfide (-S-S-) hoặc amide sulfenyl (-SN).
Mỗi sự thay đổi này có thể ảnh hƣởng đến hoạt động của một protein nhất định.
Phosphorylase bị tác động khá nặng bởi ROS, làm ức chế hoạt động tách gốc
phosphate [48].
Hơn nữa, các gốc tự do khác nhƣ các gốc hydroxyl (OH-
) và hydrogen
peoxyde (H2O2) cũng có thể tồn tại ở nồng độ tƣơng đối cao, gây nên nguy cơ oxy
hóa lipid làm tổn thƣơng màng tế bào và ảnh hƣởng đến cấu trúc DNA. Đáng chú ý
rằng sự tác động của các gốc tự do này tới DNA ty thể sẽ lớn hơn DNA trong nhân
do DNA ty thể không liên kết với Histone và không có cơ chế tự s a chữa. Khả
năng tạo năng lƣợng ATP của ty thể giảm và tăng quá trình oxy hoá làm hƣ hại cấu
trúc tế bào. Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát,
tế bào không tăng trƣởng, không đƣợc s a chữa và chết. ROS phá hủy hoặc ngăn
cản sự tổng hợp protein, lipid, đƣờng, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho
collagen, elastin mất tính đàn hồi khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [22].
ROS đƣợc cho là tác nhân chính gây ra những tổn thƣơng sinh lý của tế bào.
Sự tích lũy ROS và các tác nhân oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm

20. 9
các bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đƣờng, ung thƣ và lão hóa sớm. ROS và các gốc
tự do gây ra các đột biến gen, tăng sự hình thành và tích lũy các đột biến DNA ty
thể ở các mô trong quá trình lão hóa [48]. Theo thuyết ty thể về lão hoá, việc tích
luỹ những tổn thƣơng ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDNA, protein,
lipid làm ảnh hƣởng đến chức năng của ty thể. Nói chung, những tổn thƣơng của
mtDNA trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn đến ty thể bị rối loạn, thậm chí
ngừng hoạt động là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị lão hoá [21].
1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào
“Chết theo chƣơng trình” (apoptosis) là một quá trình quan trọng giúp các sinh
vật đa bào duy trì sự toàn vẹn và chức năng của mô và để loại bỏ những hƣ hại hoặc
các tế bào không mong muốn. Ty thể đóng vai trò cốt lõi trong việc điều tiết sự chết
của tế bào bằng cách cung cấp nhiều yếu tố quan trọng bao gồm cả sự hoạt hóa
caspase và phân mảnh nhiễm sắc thể. Ty thể có vai trò quan trọng trong cơ chế tích
tụ Ca2+
và rối loạn quá trình oxy hóa, sự tích lũy lƣợng Ca2+
đủ lớn trong ty thể dẫn
đến sự chết tế bào theo chƣơng trình. Nồng độ và khả năng hoạt động của Ca2+
trong ty thể đƣợc điều khiển bởi họ protein Bcl-2, yếu tố quan trọng tham gia vào
quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [34].
Tín hiệu gây chết nội bào phụ thuộc vào sự phóng thích Cyt c. Tác động của
Cyt c là liên kết với thụ thể protein hoạt hóa procaspase (Apaf-1), tổ hợp lại với
nhau tạo thành heptamer gọi là apoptosome. Apaf-1 trong apoptosome hoạt hóa
procaspase mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn
sự chết tế bào. Bcl-2 điều hòa con đƣờng apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sự
phóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bào
chất. Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kích
thích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngƣợc lại, ức chế sự giải
phóng Cyt c từ đó kìm hãm sự chết của tế bào [32, 60].
Nồng độ Ca2+
trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào. Sự kích
hoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca2+
trong ty thể phải đủ

21. 10
lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c
và hoạt hóa caspase. Mặt khác, khi một lƣợng lớn Ca2+
tích tụ trong ty thể, sẽ tƣơng
tác với cyclophilin D để kích thích mở lỗ bán thấm trên màng trong của ty thể làm
chất nền bị trƣơng lên làm vỡ màng ty thể và phát tán Cyt c. Hơn nữa, Ca2+
còn
kích thích sự tổng hợp các gốc tự do có hoạt tính cao (ROS). Sự dƣ thừa ROS trong
ty thể hoạt động nhƣ chất trung gian của các con đƣờng truyền tín hiệu chết theo
chƣơng trình [34].
Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tố
gây độc cho gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chƣơng trình.
1.1.3. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể
1.1.3.1. Hệ gen ty thể
Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. DNA ty
thể ngƣời tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc 16.569 bp, gồm 37 gen mã
hóa cho 2 phân t ARN ribosome, 22 phân t ARN vận chuyển và 13 phân t
protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp.
Hình 1. 3. Hệ gen ty thể [11]

22. 11
ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hợp (NADH-ubiquinone
oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ đƣợc mã hóa bởi mtDNA
(ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 mã hóa cho 3 tiểu đơn vị của
phức hợp V (ATP synthase). Các phân t protein còn lại của chuỗi hô hấp đƣợc mã
hóa bởi gen nhân, đƣợc dịch mã trong tế bào chất, sau đó đƣợc vận chuyển vào bên
trong ty thể [59].
Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không mã hóa
xen kẽ với vùng mã hóa. D-loop nằm giữa gen tRNAPhe
(gen MT-TK) và tRNAPro
(gen MT-TP) là vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điều
hòa quá trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên
mã chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản. Hai
gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA đƣợc
nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho
sự tổng hợp protein bên trong ty thể [11].
Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng trong
ty thể nhƣng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân mã hóa. Quá trình
phiên mã và dịch mã của DNA ty thể lại đƣợc điều khiển bởi gen nhân. Hệ gen ty
thể đƣợc phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên mã sau
đó đƣợc endonuclease phân cắt để hình thành nên phân t rRNA 12S và 16S, tRNA
và mRNA tiền thân. Phân t mRNA hoàn thiện của ty thể không đƣợc gắn mũ
nhƣng có đuôi polyA. Mô hình phiên mã trên có nhiều điểm giống với một operon
của vi khuẩn [11, 59].
Các tế bào ngƣời có thể chứa tới hàng ngàn bản sao mtDNA trong một tế bào và
có số lƣợng dao động tùy thuộc vào nhu cầu s dụng năng lƣợng của từng loại tế bào.
Số bản sao mtDNA giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng nhƣng dƣờng nhƣ
tăng đột ngột trong quá trình tạo trứng. Số lƣợng bản sao mtDNA thay đổi rất lớn ở
các mô khác nhau và đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt trong thời kỳ đầu của quá trình
phát triển của động vật. Số bản sao mtDNA tăng khi quá trình trao đổi chất tăng [46].

23. 12
1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể
Sự di truyền của các gen trên mtDNA là sự di truyền qua tế bào chất. Giống
nhƣ các DNA ngoài nhân, DNA ty thể đƣợc di truyền theo dòng mẹ, ngƣời mẹ
truyền gen ty thể cho các con, nhƣng chỉ con gái của bà mới có thể truyền các kiểu
gen này cho thế hệ tiếp theo. Cơ chế di truyền này đƣợc lý giải bởi tế bào trứng của
ngƣời phụ nữ trung bình chứa khoảng 100.000 phân t DNA ty thể, trong đó một
tinh trùng khỏe mạnh chỉ chứa trung bình 100 - 1500 phân t , mặt khác sự suy thoái
của mtDNA trong đƣờng sinh dục nam và sự phá hủy mtDNA của tinh trùng khi
vào tế bào trứng là rất rõ ràng nên mtDNA trong tế bào hợp t thƣờng chỉ đƣợc
thừa hƣởng từ trứng [29, 61].
Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân
theo các quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhƣng
hệ gen ty thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng
xác định có những kiểu di truyền riêng đặc trƣng cho chúng. Đột biến mtDNA
đƣợc truyền từ mẹ sang con nhƣng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con
khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay
đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rất
khác nhau [29, 46].
Một đặc điểm khác biệt nổi bật về tính di truyền gen ty thể là tần số xuất hiện
của gen đột biến giữa mẹ và con cái. Ví dụ, một ngƣời mẹ khỏe mạnh mang đột
biến mtDNA có thể sinh ra hai ngƣời con với tần suất mang gen đột biến hoàn toàn
khác nhau, một ngƣời con khỏe mạnh và một ngƣời con có biểu hiện bệnh trầm
trọng ngay từ khi còn nhỏ. Kiểu di truyền này đƣợc gọi là “nút cổ chai”, theo đó tần
suất mang mtDNA đột biến của các thế hệ con cháu khác nhau đáng kể và cũng
khác với mẹ [14, 46, 50].
1.1.3.3. Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể
Mỗi tế bào có thể chứa hàng ngàn bản sao DNA. Vì vậy, khi xuất hiện đột biến
thì trong cùng một mô có thể có cả mtDNA bình thƣờng và mtDNA đột biến, hiện

24. 13
tƣợng này đƣợc gọi là tính không đồng nhất (Heteroplasmy). Nếu các bản sao của
mtDNA đều giống nhau thì đƣợc gọi là đồng nhất giữa các bản sao ty thể
(Homoplasmy).
Số bản sao mtDNA đột biến so với tổng lƣợng mtDNA của tế bào sẽ xác định
mức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Đa
số các đột biến mtDNA gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy. Những hiểu biết
về mức độ dị plasmid của ngƣời mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiên
lƣợng đƣợc tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể [14].
mtDNA có tốc độ đột biến cao gấp 10 - 20 lần so với DNA trong nhân, do hệ
gen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone nhƣ hệ gen
nhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do [54].
Ngoài ra, ty thể không có cơ chế s a chữa DNA hiệu quả nhƣ với DNA trong nhân.
Hiện nay, đã có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh đƣợc phát hiện và nghiên cứu.
Các đột biến gen ty thể này thƣờng gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủ
yếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể.
1.2. ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN
1.2.1. Các loại đột biến gen ty thể
Bộ gen ty thể có tỷ lệ đột biến rất cao, cao hơn từ 10 đến 20 lần so với đột biến
DNA trong nhân.
Hầu hết những thay đổi trên DNA ty thể là đa hình và có vai trò quan trọng
trong việc theo dõi sự di cƣ của con ngƣời. Những đột biến mtDNA gây bệnh
đầu tiên đã đƣợc xác định vào năm 1988. Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNA
gây bệnh đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là
đột biến điểm và đột biến cấu trúc. Các đột biến mtDNA có tính không đồng
nhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ của
bệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn. Ƣớc tính ở phía Đông Bắc nƣớc Anh có
tỷ lệ 1/10.000 ngƣời đã có biểu hiện lâm sàng bệnh ty thể và 1/6000 ngƣời có
nguy cơ mắc bệnh. Nghiên cứu tỷ lệ sinh gần đây đã báo cáo tần số đột biến là

25. 14
0,14% đối với đột biến A3243G và 0,2% đối với đột biến A1555G liên quan đến
MT-RNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những
hiểu biết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56].
1.2.1.1. Đột biến điểm
Đột biến điểm là đột biến thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide xảy ra trong
cấu trúc của gen tại một điểm trên phân t DNA. Hơn 250 đột biến điểm gây bệnh
đã đƣợc xác định trên gen ty thể qua các bệnh nhân với hàng loạt các rối loạn khác
nhau (http://mitomap.org/MITOMAP), thƣờng di truyền từ mẹ sang con và liên
quan đến nhiều hệ thống cơ quan. Đột biến điểm trên mtDNA có thể xảy ra trên gen
mã hóa tRNA, rRNA hay protein, tuy nhiên hơn một n a trong số các đột biến điểm
đƣợc báo cáo liên quan đến gen tRNA của ty thể [31].
tRNA ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với tRNA trong tế bào chất
(mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạng
hình L của tRNA, ảnh hƣởng đến cấu trúc bậc ba của chúng. Một số đột biến
trên tRNA ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS. Tùy
thuộc vào điểm đột biến trên gen tRNA ty thể sẽ ảnh hƣởng đến các kênh vận
chuyển điện t khác nhau trong chuỗi hô hấp tế bào. Các nguyên nhân gây ra
khiếm khuyết trong quá trình tổng hợp các tRNA ty thể là rất nhiều bao gồm: kết
thúc phiên mã, biến đổi tRNA trƣởng thành, thay đổi bộ ba đối mã, ảnh hƣởng
đến cấu trúc và chức năng của tRNA do đó giảm khả năng gắn acid amin, giảm
liên kết với các yếu tố dịch mã mtEFT hoặc các ribosome ty thể. Đột biến điểm ở
gen mã hóa protein ty thể đặc biệt ảnh hƣởng đến các chức năng của phức hợp
chuỗi hô hấp tế bào mà nó đảm nhiệm [56].
Đột biến điểm trên mtDNA chủ yếu ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy),
tỷ lệ đột biến giữa các mô trong cùng một cá thể cũng rất khác nhau. Một số đột
biến gen ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) đang đƣợc nghiên cứu nhiều hơn,
đột biến này thƣờng ảnh hƣởng đến các mô xác định và có biểu hiện lâm sàng đặc

26. 15
trƣng. Tuy nhiên, đột biến điểm gen ty thể rất đa hình nên việc xác định tỷ lệ đột
biến gen gây bệnh ty thể là vấn đề cần đƣợc nghiên cứu nhiều hơn nữa [31].
1.2.1.2. Đột biến cấu trúc mtDNA
Đột biến cấu trúc gen ty thể bao gồm mất đoạn, lặp đoạn và một số sự sắp xếp
cấu trúc phức tạp khác đã nghiên cứu đƣợc trong các tình trạng bệnh lý. Phần lớn
đột biến cấu trúc mtDNA đƣợc phát hiện liên quan đến mất đoạn, thay đổi kích
thƣớc khoảng 1,3 - 8 kb hay một vài gen. Đột biến mất đoạn mtDNA thƣờng xảy ra
ở giai đoạn sớm trong quá trình phát triển của hợp t dẫn đến tần số xuất hiện và
biểu hiện bệnh ở các mô là tƣơng tự nhau. Kích thƣớc đoạn mtDNA bị mất có thể
do đột biến gen nhân quy định việc duy trì, sao chép và trao đổi nucleotide trong
mtDNA (ví dụ, POLG và PEO1 mã hóa Twinkle) [56].
Ở cấp độ phân t , khoảng 60% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra trong khu
vực mtDNA mà hai bên là trình tự lặp ngắn, kiểu mất đoạn này đƣợc gọi là đột biến
mất đoạn type I. Khoảng 30% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra tại những vùng có
trình tự lặp không tuyệt đối, đƣợc gọi là mất đoạn type II. Còn lại khoảng 10% đột
biến mất đoạn xảy ra ở vùng không có trình tự lặp. Mất đoạn mtDNA phổ biến nhất,
gặp ở khoảng 1/3 số bệnh nhân, là đột biến mất đoạn 5 kb (8470 - 13447) đƣợc giới
hạn bởi trình tự lặp 13 bp (type I) [24].
Mặc dù có nguồn gốc khác nhau, hầu hết đột biến mất đoạn mtDNA đều có
đặc điểm chung, chủ yếu xảy ra từ quá trình phiên mã. Cơ chế xảy ra đột biến cũng
giống nhau, Krishnan và cộng sự [24] đã đề xuất rằng mất đoạn mtDNA phát sinh
trong quá trình s a chữa các sai hỏng trong phân t mtDNA tái bản. Số lƣợng
nucleotide bị mất và tần suất xuất hiện của đột biến trong các mô là cơ sở quan
trọng cho việc xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh, nhƣng có thể không tỷ lệ
thuận với nhau.
1.2.2. Các bệnh do đột biến gen ty thể
Ty thể là bào quan sản xuất năng lƣợng quan trọng trong các tế bào nhân
chuẩn. Bệnh ty thể là bệnh lý trong đó khả năng sản xuất năng lƣợng và đảm

27. 16
nhiệm vai trò bình thƣờng trong tế bào của ty thể bị tổn hại. Nhiều nghiên cứu
cho thấy đột biến mtDNA là một trong các nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở
ngƣời, ngoài ra một số đột biến gen nhân cũng có thể làm mất chức năng của ty
thể gây nên bệnh ty thể [56]. Bệnh ty thể có ảnh hƣởng đến nhiều cơ quan với tập
hợp các triệu chứng liên quan đến cơ, hệ thần kinh và các cơ quan thiết yếu cho sự
sống cần năng lƣợng cao. Biểu hiện lâm sàng của bệnh ty thể rất đa dạng, có những
triệu chứng đan xen vào nhau, thƣờng đƣợc xác định bởi tình trạng thiếu năng
lƣợng tế bào do khiếm khuyết quá trình phosphoryl hóa oxy hóa.
Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu
hiện của bệnh ty thể chịu sự chi phối của một số yếu tố bao gồm hiệu ứng
ngƣỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lƣợng bản sao DNA đƣợc
nhân lên trong ty thể, và sự di truyền “nút cổ chai”. Nhiều đột biến gen gây bệnh
ty thể ở trạng thái không đồng nhất, trong trƣờng hợp này thì tỷ lệ gen đột biến
có liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh. Tỷ lệ gen đột biến nhỏ nhất cần
thiết có thể gây nên những biến đổi sinh hóa và chức năng của tế bào dẫn đến
biểu hiện lâm sàng của bệnh đƣợc gọi là ngƣỡng biểu hiện của đột biến. Giá trị
ngƣỡng này khác nhau đối với từng loại đột biến và giữa các mô, cơ quan trong
cơ thể; sự hô hấp của tế bào theo con đƣờng hiếu khí sẽ bị ảnh hƣởng sớm hơn
so với con đƣờng kị khí. Thông thƣờng các giá trị ngƣỡng trong khoảng 60 -
90% gen đột biến mtDNA [14]. Trong quá trình phân bào, ty thể đƣợc tách ngẫu
nhiên và trong tế bào con sẽ không có sự đồng nhất về tỷ lệ đột biến mtDNA, sự
thay đổi này đôi khi thấp hơn hoặc cao hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh. Mặt
khác, mỗi ty thể của tế bào có hàng ngàn bản sao DNA dẫn đến sự thay đổi tỷ lệ
mtDNA đột biến trong tế bào và mô. Cơ chế di truyền “nút cổ chai” cũng quyết
định sự biểu hiện bệnh ty thể ở các con sinh ra từ trứng của ngƣời mẹ mang đột
biến gen ty thể ở dạng không đồng nhất, bởi sự di truyền ngẫu nhiên lƣợng
mtDNA đột biến vào tế bào trứng của mẹ tạo nên tỷ lệ không đồng nhất ở tế bào
hợp t cao hơn hay thấp hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh [46].

28. 17
Từ việc xác định đƣợc các đột biến mtDNA đầu tiên vào năm 1988, sau đó đã
có nhiều nghiên cứu quan trọng đi sâu tìm hiểu những rối loạn di truyền mtDNA
dẫn đến tình trạng bệnh lý. Hiện nay, đã có hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh
đƣợc xác định. Ngoài ra còn có nhiều báo cáo về các đột biến gen nhân làm thay đổi
protein trong chuỗi hô hấp của ty thể gây nên bệnh ty thể. Những nghiên cứu này
làm sáng tỏ cơ chế phân t của bệnh ty thể, đặc biệt tập trung vào các khuyết tật di
truyền mtDNA, hệ quả chức năng đặc trƣng của đột biến mtDNA nhằm mang lại sự
tiến bộ về phƣơng pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ty thể.
1.2.2.1. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA
Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and
stroke-like episodes) là hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai
biến mạch, đƣợc di truyền từ mẹ sang con. Bệnh có ảnh hƣởng đến nhiều hệ
thống của cơ thể, đặc biệt là não bộ, hệ thần kinh và cơ bắp. Các dấu hiệu và
triệu chứng của rối loạn này thƣờng xuất hiện ở trẻ em sau một thời gian phát
triển bình thƣờng, có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi. Triệu chứng của bệnh bao
gồm yếu cơ, đau cơ, đau đầu, nôn, và co giật, một số cá nhân có thể bị đột quỵ
trƣớc tuổi 40. Bệnh tiến triển có thể là liệt n a ngƣời, bất thƣờng về thị giác, co
giật và nhức đầu nghiêm trọng, những lần đột quỵ lặp lại làm tổn thƣơng não dẫn
đến mất thị lực, mất chức năng trí tuệ [6, 56].
Hầu hết bệnh nhân MELAS đều bị tích tụ acid lactic trong cơ thể dẫn đến
nhiễm toan làm nôn m a, đau bụng, rất mệt mỏi, yếu cơ và khó thở. Một số trƣờng
hợp MELAS co thắt cơ không tự chủ, giảm thính lực, bệnh tim và thận, tiểu đƣờng,
mất cân bằng nội tiết tố [40].
Nguyên nhân là do một trong các loại đột biến A3243G, A3251G, T3271C,
T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu
; đột
biến G13513A, A12770G và A13514G trên gen MT-ND5 mã hóa cho ND5
ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I, G583A trên gen MT-TF mã hóa cho
tRNAPhe
, G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal
, A5814G trên gen MT-TC

29. 18
mã hóa cho tRNACys
. Trong đó, đột biến A3243G chiếm 80% số ca mang hội chứng
MELAS, tiếp theo là đột biến T3271C xảy ra khoảng 7,5% [16]. MELAS có thể gây
ra bởi các đột biến điểm mtDNA ở các gen khác nhƣ COXIII, ND1, ND5 hoặc gen
mã hóa tRNAPhe
, tRNAVal
, tRNACys
, rRNA hoặc mất đoạn với kích thƣớc ngắn. Tuy
nhiên, đột biến trên tRNALeu
vẫn là đột biến phổ biến nhất liên quan đến kiểu hình
MELAS. Trong số đó, đột biến A3243G đƣợc báo cáo đầu tiên trên gen mã hóa cho
tRNALeu
và là đột biến phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc [1]. Nhƣ vậy, đột biến
A3243G là một chỉ tiêu quan trọng để chẩn đoán hội chứng MELAS ngoài các kiểm
tra lâm sàng.
Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội
chứng liệt cơ mắt ngoài tiến triển do rối loạn chức năng ty thể, thƣờng gặp ở ngƣời
lớn. Triệu chứng điển hình của bệnh là liệt cơ mắt, sa mí mắt, rối loạn tâm thần và
đột t .
CPEO là một bệnh tiến triển chậm, có thể bắt đầu ở mọi lứa tuổi và tiến triển
trong khoảng thời gian 5 đến 15 năm. Các triệu chứng đầu tiên xuất hiện thƣờng là
mí mắt sụp xuống làm giảm giới hạn vận động của mắt, hạn chế tầm nhìn của mắt,
và tổn thƣơng giác mạc. Bệnh nhân thƣờng s dụng cơ trán để giúp nâng mí mắt
nên có thể xảy ra teo các nhóm cơ trên mặt, khó khăn trong việc nhai, một số bệnh
nhân đục thủy tinh thể, suy giảm thính giác, đau thần kinh sợi trục, mất điều hòa co
cơ, Parkinson [56].
CPEO là tình trạng bệnh gây nên bởi những khuyết tật trong ty thể làm ảnh
hƣởng đến quá trình phosphoryl oxy hóa trên chuỗi hô hấp tế bào. Trong một số
trƣờng hợp, đột biến ở gen MT-TL1 trên mtDNA gây nên CPEO. Nguyên nhân của
bệnh là do đột biến A3243G nằm trên gen mã hóa tRNALeu(UUR)
và đột biến T4274C
nằm trên gen mã hóa tRNAIle
. Mất đoạn mtDNA là nguyên nhân quan trọng gây
nên hội chứng CPEO, những mất đoạn có kích thƣớc 3,4 đến 6,9 kb với mức độ
không đồng nhất dao động trong khoảng 18,8 đến 85,5% cho thấy các biểu hiện lâm
sàng khác nhau. Một nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể ở

30. 19
Malaysia cho thấy rằng độ dài, vị trí mất đoạn và mức độ không đồng nhất đóng vai
trò quan trọng trong việc xác định kiểu hình lâm sàng của bệnh nhân CPEO, hai
bệnh nhân nặng đƣợc tìm thấy mất đoạn mtDNA có kích thƣớc 4320 bp và 4717 bp.
Bệnh nhân CPEO có thể mang đột biến điểm, bao gồm các đột biến trên tRNALeu
,
tRNAIle
và tRNAAsp
. Mặt khác, các đột biến gen POLG, SLC25A4 và C10orf2 trên
DNA nhân cũng là nguyên nhân gây bệnh, những gen này rất quan trọng để bảo vệ
mtDNA. Mặc dù cơ chế chƣa rõ ràng, nhƣng đột biến bất kỳ trong 3 gen này đều
dẫn đến mất đoạn lớn trên mtDNA, dao động từ 2-10 kb [17].
1.2.2.2. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã
hóa protein
Hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)/NARP
(neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos)
Hội chứng Leigh và NARP (yếu cơ do thần kinh, mất điều hòa và viêm sắc tố
võng mạc) là một phần của chuỗi các rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển gây ra
bởi sự bất thƣờng của chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể [53].
Hội chứng Leigh đặc trƣng bởi tình trạng thoái hóa thần kinh tiến triển,
trong đó đặc biệt ảnh hƣởng đến não, não trung gian và hạch thần kinh, thƣờng
dẫn đến t vong do suy hô hấp. Các dấu hiệu đầu tiên ở trẻ mắc hội chứng Leigh
là nôn m a, tiêu chảy, khó nuốt dẫn đến ăn uống kém, không phát triển, giảm
trƣơng lực cơ, co cơ không kiểm soát, mất cảm giác và yếu ở các chi, triệu
chứng phổ biến là c động khó khăn. Một số cá nhân liệt cơ mắt, teo dây thần
kinh thị giác, phì đại cơ tim. Ngoài ra, khó thở thƣờng gặp ở những ngƣời mắc
hội chứng Leigh dẫn đến suy hô hấp, hoặc sự tích tụ lactate trong cơ thể đo đƣợc
ở máu, dịch não tủy và nƣớc tiểu [56].
NARP đƣợc đặc trƣng bởi yếu cơ do thần kinh gây mất cảm giác thần kinh,
mất điều hòa và bệnh võng mạc sắc tố. Triệu chứng khởi phát là mất điều hòa vận
động và trí tuệ chậm phát triển, thƣờng xuất hiện ở trẻ em. Một số bệnh nhân NARP

31. 20
có thể tƣơng đối ổn định trong nhiều năm, nhƣng có thể bị xuống cấp từng đợt,
thƣờng có biểu hiện rõ ràng khi kết hợp với các bệnh do virus [66].
Hầu hết các đột biến gen ty thể gây ra hội chứng Leigh đƣợc báo cáo là trên
các gen MT-ATP6, MT-ND3 và MT-ND5, một vài đột biến đƣợc xác định trên các
gen MT-ND2, MT-ND6 và MT-ND4. Ngoài ra, còn có trƣờng hợp trên gen liên
quan đến quá trình tổng hợp protein, đó là gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal
, gen
MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu
, gen MT-TW mã hóa cho tRNATrp
và gen MT-TK
mã hóa cho tRNALys
. MT-ATP6 là gen duy nhất bị đột biến gây NARP [66].
Trong các trƣờng hợp của hội chứng Leigh, đa số các đột biến nằm trên gen
MT-ATP6, đặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C. Sự biến đổi T thành G tại 8993
trong mtDNA ngƣời là một trong các đột biến ty thể kèm theo hội chứng Leigh
đƣợc mô tả nhiều nhất. Đột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí 156
trên ATPase 6 của ty thể, một trong hai tiểu đơn vị của tiểu phần Fo của phức hệ
ATPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng hợp ATP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc oxy tự
do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [53].
Hội chứng Leigh còn liên quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫn
đến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124. ND5 là gen chức năng gồm
1812 bp (từ vị trí 12337 tới 14148) đƣợc mã hóa bởi chuỗi nặng của mtDNA. Sản
phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ NADH-ubiquinon
oxidoreductase. Sản phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nƣớc của phức hệ I. Protein
này là một trong 7 tiểu phần đƣợc mã hóa bởi mtDNA trong số 42 tiểu phần của
phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnh
trong đó có LHON, Leigh và MELAS [61].
Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt thần
kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây hội chứng
teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt. Bệnh thƣờng
phát triển ở tuổi trƣởng thành, tỷ lệ ảnh hƣởng của nam giới cao hơn 4 đến 5 lần so
với nữ giới. Ngƣời mang bệnh ban đầu hoàn toàn không có biểu hiện cho đến giai

32. 21
đoạn phát triển thị giác làm mờ một mắt, mắt còn lại biểu hiện tƣơng tự sau 2 - 3
tháng, khoảng 25% bệnh nhân khởi phát bệnh với 2 mắt ở cùng thời điểm. Thị lực
giảm nghiêm trọng đến mức không thể đếm đƣợc ngón tay hoặc kém hơn nữa. Sau
giai đoạn cấp tính, đĩa quang trở nên teo. Bất thƣờng về thần kinh nhƣ run chân tay,
bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh cơ và rối loạn vận động đƣợc báo cáo là thƣờng
gặp ở bệnh nhân LHON, ở nữ giới có thể phát triển triệu chứng đa xơ cứng [69].
Khoảng 95% trƣờng hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu
đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A trên gen ND4 (50-70% trƣờng hợp),
đột biến G3460A trên gen ND1 (15% trƣờng hợp) và đột biến T14484C trên gen ND6
(10% trƣờng hợp). Đột biến G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON.
Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác liên quan đến gen ND5 và ND6 [3].
Các đột biến trên gen ND6 bao gồm T14484C, T14459C, các đột biến này
không những gây ra các triệu chứng của hội chứng LHON mà còn gây ra hội chứng
Leigh. Đột biến G14453A cũng trên gen này, tác động lâm sàng phức tạp hơn, kèm
theo các triệu chứng của LHON còn có các biểu hiện của MELAS.
LHON thƣờng là do một đột biến mtDNA homoplasmy và các con sẽ kế thừa
các đột biến từ mẹ. Tuy nhiên khoảng 50% nam giới sẽ biểu hiện bệnh, trong khi
chỉ có 10% nữ giới bị mất thị giác. Sự tiến triển của bệnh phụ thuộc vào gen đột
biến, 71% bệnh nhân đột biến T14484C có dấu hiệu phục hồi, trong khi đó ở bệnh
nhân A11778G chỉ là 25%. Phần lớn các bệnh nhân mang đột biến A11778G sớm
khởi phát triệu chứng LHON, đã có một vài báo cáo về kiểu hình suy thoái thần
kinh thị giác [69].
1.2.2.3. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA
Bệnh do đột biến trên gen mã hóa rRNA chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Đột biến A1555G
và C1494T đƣợc phát hiện trên gen mã hóa cho rRNA 12S, các đột biến này gây
mất khả năng nghe do kích thích bởi aminoglycoside và mất khả năng nghe không
có hội chứng. Trong đó, đột biến A1555G phổ biến hơn C1494T.

33. 22
Đột biến A1555G là đột biến điểm mtDNA nằm trên gen MT-RNR1, quy dịnh
sự tổng hợp 12S rRNA. Đột biến này nằm trên vị trí mã hóa tiểu đơn vị rRNA và
đƣợc dự đoán gây ra một sự thay đổi trong cơ cấu thứ cấp của rRNA. Sự thay đổi
này làm suy yếu tổng hợp protein và tăng cƣờng tƣơng tác với kháng sinh
aminoglycoside, tiếp tục làm trầm trọng hơn tình trạng bệnh [2]. Đột biến đơn
thuần thƣờng không dẫn đến tình trạng bệnh lý, nhƣng khi kết hợp với các yếu tố
môi trƣờng nhƣ kháng sinh nhóm aminoglycoside sẽ biểu hiện triệu chứng bệnh
điển hình, thƣờng quan sát đƣợc là mất thính lực ở các mức độ khác nhau. Đột
biến A1555G thƣờng ở dạng đồng nhất nhƣng biểu hiện triệu chứng bệnh của
các thành viên trong gia đình là rất khác nhau. Trong một nghiên cứu cũng chỉ ra
rằng biểu hiện của bệnh chịu ảnh hƣởng của việc s dụng kháng sinh
amimoglycoside với 96,5% ở nhóm tuổi 30 điều trị kháng sinh và 39,9% với
nhóm không điều trị kháng sinh [7].
Đột biến khác trên gen rRNA 12S là T1095C, gây nên sự thay đổi base bảo thủ
ở vòng xoắn 25 của rRNA 12S. Nucleotide này nằm ở vị trí P của ribosome, có vai
trò quan trọng trong giai đoạn khởi đầu của quá trình tổng hợp protein của ty thể.
Sự thay đổi cấu trúc bậc ba của rRNA 12S làm ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp
protein, vì vậy dẫn đến mất chức năng của ty thể và gây ra mất khả năng nghe.
1.2.2.4. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA
Hội chứng Kearns-Sayre (KSS) là bệnh liên quan đến sự phát triển sắc tố
võng mạc và liệt cơ mắt ngoài tiến triển, thƣờng khởi phát trƣớc tuổi 20. Nguyên
nhân là do mất đoạn mtDNA khoảng 2-4 kb, thƣờng là 4997 bp từ vị trí 8488-
13460, tại điểm đứt gãy thƣờng có một đoạn 13 bp lặp lại. Ngoài những triệu chứng
nhƣợc cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, thoái hóa sắc tố võng mạc, bệnh nhân thƣờng có
các biến chứng bao gồm thất điều tiểu não, suy giảm nhận thức và điếc, tắc nghẽn
cơ tim, dáng ngƣời thấp bé, nuốt khó [56].
Hội chứng Pearson là một rối loạn hiếm gặp, thƣờng khởi phát trong những
năm đầu đời, đặc trƣng bởi thiếu máu hồng cầu, tủy xƣơng và suy tụy ngoại tiết.

34. 23
Diễn biến lâm sàng ở trẻ em có thể nặng dẫn đến t vong sớm, những trƣờng hợp
sống sót thƣờng có biểu hiện thiếu máu sau đó phát triển các đặc điểm lâm sàng của
KSS. Bệnh thƣờng đƣợc xác định là do mất đoạn mtDNA quy mô lớn, có mặt ở tất
cả các mô [65].
Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển (progressive external ophthalmoplegia-
PEO) đƣợc đặc trƣng bởi sự suy yếu của các cơ mắt, thƣờng xuất hiện ở độ tuổi 18 -
40. Dấu hiệu phổ biến và khác so với bệnh liệt mắt tiến triển kinh niên (CPEO) nhƣ
nhƣợc cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, rách cơ. Nguyên nhân gây bệnh là những khuyết
tật trong ty thể, hay gặp ở các rối loạn mất đoạn mtDNA quy mô lớn, trong một số
trƣờng hợp là đột biến gen MT-TL1. Mặt khác, các đột biến gen nhân POLG,
SLC25A4 và C10orf2 cũng là nguyên nhân gây nên bệnh này. Các nghiên cứu gần
đây chƣa chứng minh đƣợc sự tƣơng quan giữa kích thƣớc và vị trí đoạn mtDNA bị
mất với mức độ biểu hiện của bệnh [54].
Bệnh Parkinson/hội chứng MELAS gối nhau do đột biến mất đoạn TTAA
bắt đầu ở vị trí 14787 của gen CYTB. Bệnh nhân biểu hiện rối loạn tiến triển nặng,
bắt đầu từ 6 tuổi với biểu hiện khó phối hợp và tập trung vận động. Sau này, bệnh
nhân thể hiện hội chứng Parkinson, rung giật cơ và nhồi máu não [24].
Mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xảy ra ở vùng không mã hóa nằm giữa gen mã
cho cytochrome oxidase II (COII) và tRNALys
trong hệ gen ty thể. Vùng không mã
hóa gồm hai trình tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp từ vị trí 8272-8289 trên hệ gen
ty thể. Hiện tƣợng mất đoạn 9 bp đƣợc xem là một dạng đột biến của hệ gen ty thể
và có tỷ lệ cao ở các quần thể ngƣời châu bao gồm Trung Quốc (15%), Việt Nam
(20%), Thái Lan (29%) và Nhật Bản (20%) [62].
Đột biến mất đoạn xuất hiện do những sai hỏng trong quá trình tái bản không
đƣợc s a chữa hoặc do quá trình sao chép bị lỗi. Vì vậy, mất đoạn 9 bp có lẽ xuất
hiện nhƣ kết quả của một lỗi không đƣợc s a chữa trong quá trình sao chép của
mtDNA. Hiện tƣợng mất đoạn 9 bp đƣợc xem xét trên hai phƣơng diện đó là nguồn
gốc tiến hóa và mối liên quan giữa mất đoạn 9 bp với bệnh tật đặc biệt là các rối
loạn ty thể.

35. 24
Ngoài ra, một số bệnh ty thể còn liên quan đến sự đảo đoạn. Nghiên cứu đầu
tiên về một đột biến đảo đoạn trong mtDNA gây bệnh cơ đƣợc phát hiện bởi
Musumeci và tập thể vào năm 2000 [41]. Bệnh nhân đƣợc phát hiện mang đột biến
đảo đoạn 7 nucleotide (ACCTTGC thành GCAAGGT) ở vùng 3902-3908 thuộc
gen mã hóa cho ND1 của NADH ubiquinone oxidoreductase. Đột biến đảo đoạn
này dẫn đến thay thế 3 acid amin (D199G, L200K, và A201V) có tính bảo thủ cao
trong chuỗi polypeptide, là đột biến ở dạng không đồng nhất 80% và đƣợc phát hiện
trong cơ nhƣng không có trong máu bệnh nhân. Sự thay đổi 3 acid amin liên tiếp từ
Asp-Leu-Ala thành Gly-Lys-Val, liên quan đến một vùng bảo thủ cao của gen ND1 có
vai trò quan trọng trong việc gắn ubiquinone.
1.3. HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU
(MERRF)
Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liên
quan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên đƣợc mô tả. Sau đó các trƣờng hợp khác
tiếp tục đƣợc mô tả, Fukuhara và cộng sự [28] đã đƣa ra các tính năng cơ bản của
bệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều đƣợc gọi là hội
chứng MERRF. Bệnh nhân MERRF đƣợc chẩn đoán bởi các tiêu chí: rung giật cơ,
động kinh, thất điều tiểu não, sinh thiết cơ cho thấy sợi cơ đỏ bị rách. Mặc dù đó là
những biểu hiện chính nhƣng thực tế lâm sàng tìm thấy nhiều bệnh nhân MERRF
có triệu chứng không đồng nhất, có thể gặp bệnh nhân điếc, không chịu đƣợc vận
động, mất trí nhớ, u mỡ đối xứng, bệnh sắc tố võng mạc [15, 37].
Hội chứng lần đầu tiên đƣợc mô tả là do đột biến A8344G trên gen mã hóa cho
tRNALys
của ty thể [13, 20, 42]. Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do
đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MT-TK mã hóa cho tRNALys
gây
ra, tất cả đột biến đều tồn tại ở dạng không đồng nhất. Đột biến A8344G là phổ biến
nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [9, 42]. MERRF cũng đƣợc mô tả
ở bệnh nhân bị mất đoạn mtDNA. Các hội chứng gối nhau với đặc điểm
MELAS/MERRF đã đƣợc báo cáo ở đột biến T7572C và T8356C trên tRNASer
[18].

36. 25
1.3.1. Các đột biến của hội chứng MERRF
1.3.1.1. Đột biến A8344G
Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80 - 90% số ca mang hội chứng
MERRF. Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK của ty thể
làm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNAlys
, do đó giảm khả năng tƣơng tác với bề mặt
ribosome. Đột biến tại vùng này ảnh hƣởng đến sự hợp nhất của dƣ lƣợng lysine vào
protein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi
hô hấp trong ty thể. Từ đó, ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt là
các phức hợp I (NADH dehydrogenase) và IV (cytochrome c oxidase) [10, 20, 33].
Đột biến A8344G đƣợc di truyền độc lập từ mẹ sang con và thƣờng tồn tại ở
dạng không đồng nhất, nhƣng mức độ phân bố của thể đột biến rất khác nhau giữa
các cá thể và các mô trong cùng một cá thể [10]. Một nghiên cứu cho thấy rằng ở
một phụ nữ lƣợng gen đột biến A8344G trong cơ xƣơng là 94%, trong máu là 38%,
trong nƣớc tiểu là 18%, cũng định lƣợng đột biến tƣơng tự trên mẹ và em gái cho
thấy, ở mẹ có 16% gen đột biến trong máu và 18% trong nƣớc tiểu, kết quả của em
gái là 3% gen đột biến trong máu và 4% trong nƣớc tiểu. Định lƣợng đƣợc tỷ lệ gen
đột biến nhằm xác định mức độ ảnh hƣởng của bệnh đến cá thể mang đột biến. Tỷ
lệ đột biến A8344G có tƣơng quan với sự giảm tổng hợp protein, giảm tiêu thụ oxy
và thiếu cytochrome c oxidase, cũng nhƣ các polypeptid lớn và giàu lysine bị ảnh
hƣởng nặng nề gợi ý rằng các đột biến MERRF trực tiếp hạn chế quá trình tổng hợp
protein của ty thể. Hơn thế nữa, stress oxy hóa và oxy hóa trên các mô bị ảnh hƣởng
bởi thiếu chuỗi hô hấp dẫn đến sự tiến triển các triệu chứng của bệnh ty thể [30].
Mặc dù đƣợc mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứng
MERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ rách
nham nhở nhƣng đột biến A8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất.
Một nghiên cứu ở ngƣời phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứng
MERRF còn có nhiều triệu chứng khác nhƣ suy hô hấp và loạn dƣỡng cơ. Một số
trƣờng hợp biểu hiện tầm vóc ngắn, mất thính lực, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh

37. 26
cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận. Kết quả nghiên cứu mối tƣơng quan giữa
kiểu gen đột biến A8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thể
biểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh,
rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30].
1.3.1.2. Đột biến T8356C
Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc biết đến với đột biến A8344G, nhƣng không
quan sát thấy trong khoảng 10 - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu
biểu của hội chứng MERRF. Một nghiên cứu giải trình tự gen tRNAlys
của năm
bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng đƣợc xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh),
mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền s gia đình tƣơng thích với sự kế
thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy nhiễm toan acid lactic, sinh thiết cơ
cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy có sự thay đổi nucleotide tại
vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base đƣợc bảo tồn trong
phân t mtDNA gốc [51].
Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356C
cũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhƣng sự phân bố của gen đột biến cũng rất
khác nhau, kết quả phân tích trên 1 bệnh nhân mang đột biến trong cơ là 100% còn
trong máu là 47%. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này cũng
khá phức tạp, có bệnh nhân xuất hiện triệu chứng rung giật cơ, động kinh, điếc và
đột quỵ giả tai biến giống nhƣ hội chứng MELAS [6].
1.3.1.3. Đột biến G8363A
Năm 1996, nhóm nghiên cứu Filippo M. Santorelli và cộng sự [45] đã s
dụng phƣơng pháp phân tích đa dạng cấu hình DNA sợi đơn (SSCP) và giải trình
tự trực tiếp của tất cả 22 gen tRNA mã hóa mtDNA để phát hiện tình trạng đột
biến trong 9 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tƣơng tự nhƣ hội chứng MERRF
bao gồm tăng acid lactic và pyruvic trong máu, rối loạn thần kinh ngoại biên,
thất điều não, giảm thính lực, sinh thiết cơ cho thấy các sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết
quả cho thấy cả 9 bệnh nhân trong 2 gia đình đều mang đột biến thay đổi

38. 27
nucleotide A bằng G tại vị trí 8363 trên mtDNA. Phân tích RFLP cho thấy rằng
đột biến tồn tại ở dạng không đồng nhất và có mức độ phân bố ở các mô khác
nhau nhƣ ở cơ là 95%, ở máu là 59 - 94% [49].
Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa
(OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biến
G8363A gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gen
tRNAlys
. Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hƣởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp
của tế bào, ảnh hƣởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp.
Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thƣờng trong nguyên
bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A [45, 49, 57].
Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng không
đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính
giác, nhiều u mỡ,... đƣợc chẩn đoán giống hội chứng Leigh.
1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời bệnh
Ty thể là bào quan s dụng oxy để chuyển hóa các sản phẩm trung gian của
thức ăn thành năng lƣợng thông qua một quá trình phosphoryl oxy hóa. Những đột
biến gây MERRF làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo ra các protein, s
dụng oxy và sản xuất năng lƣợng. Những đột biến này ảnh hƣởng đến các cơ quan
và các mô với nhu cầu năng lƣợng cao nhƣ não và cơ. Bệnh thƣờng biểu hiện trong
các mô và dễ dàng phát hiện trong mtDNA từ bạch cầu trong máu [37]. Tuy nhiên,
sự xuất hiện của dạng không đồng nhất có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện ở các
mô mang đột biến. Do đó những ngƣời có triệu chứng ít phù hợp với MERRF có
thể không đƣợc phát hiện từ bạch cầu mà chỉ phát hiện ở các mô khác nhƣ nguyên
bào sợi da nuôi cấy, niêm mạc miệng,... nhƣng đáng tin cậy nhất là phát hiện từ các
tế bào cơ xƣơng [38].
Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc chẩn đoán lâm sàng dựa trên các triệu chứng
bao gồm: tăng nồng độ lactate, pyruvate trong máu và trong dịch não tủy. Protein
dịch não tủy có thể tăng lên trong hội chứng MERRF. Kỹ thuật chụp ảnh não nhƣ

39. 28
hình ảnh cộng hƣởng từ có thể tìm thấy các tổn thƣơng nhƣ đột quỵ. Điện tâm đồ có
thể đƣợc s dụng để chẩn đoán bất thƣờng về tim. Bảng 1.1 liệt kê các triệu chứng
và dấu hiệu thấy đƣợc trong 62 bệnh nhân mang đột biến MERRF [70]. Các đặc
điểm lâm sàng thƣờng gặp nhất có tỷ lệ tƣơng ứng là: giật cơ, yếu cơ, mất điều hòa
(35 - 45%); động kinh tổng quát, mất thính lực (25,0 - 34,9%); suy giảm nhận thức,
nhiều u mỡ, bệnh thần kinh, không dung nạp tập thể dục (15,0 - 24,9%); tăng CK,
teo dây thần kinh thị giác, teo cơ, suy hô hấp, tiểu đƣờng, đau cơ, run, và chứng đau
n a đầu (5,0 - 14,9%) [70].

40. 29
Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân
MERRF [70]
Biểu hiện lâm sàng Tần số xuất hiện Tỷ lệ %
Giật cơ 62/62 100%
Động kinh 62/62 100%
Phát triển ban đầu bình
thƣờng
17/17 100%
Sợi cơ đỏ rách nham nhở 47/51 92%
Giảm thính lực 41/45 91%
Tăng acid lactic máu 24/29 83%
Tính kế thừa theo dòng mẹ 34/42 81%
Không dung nạp tập thể dục 8/10 80%
Mất trí 39/52 75%
Bệnh thần kinh 17/27 63%
Ngƣời thấp bé 4/7 57%
Giảm cảm giác 9/18 50%
Liệt dây thần kinh thị giác 14/36 39%
Bệnh cơ tim 2/6 33%
Hội chứng Wolff-
Parkinson-White
2/9 22%
Bệnh võng mạc sắc tố 4/26 15%
U mỡ 2/60 3%
Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức
tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hƣởng đến nhiều

41. 30
bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời
thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy việc phân tích mtDNA là quan trọng ở nhiều
trƣờng hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng.
1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF
1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với
RFLP [25, 30, 45]
Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân
tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA đƣợc phân cắt giới hạn. Phƣơng
pháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phân
cắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự thay đổi về trình tự nucleotide
của DNA dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho
các đoạn DNA bị phân cắt có kích thƣớc khác nhau, có thể nhận biết đƣợc dựa trên
phổ băng khi điện di. Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DNA tại
những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn
DNA khi đƣợc cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tƣợng này đã
tạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel
thì có thể phát hiện đƣợc các đột biến.
Kỹ thuật RFLP đã trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR
(polymerase chain reation). PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu của
DNA và khả năng kéo dài chuỗi của DNA polymerase để nhân bản các đoạn DNA
khác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu. DNA polymerase hoạt động theo
nguyên tắc cần phức hợp khuôn - mồi, trong môi trƣờng thích hợp có các dNTP thì
sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản đƣợc đoạn
DNA đích, ngƣời ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu. Đây là một kỹ
thuật rất nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứng
cũng có thể diễn ra.
Việc kết hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phát hiện các đột biến
di truyền, trong đó có đột biến điểm trên gen ty thể. PCR-RFLP là công cụ chẩn
đoán sớm đƣợc s dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong

42. 31
mtDNA. Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc chính sau: (1) đoạn mtDNA chứa vị
trí đột biến đƣợc khuếch đại nhờ các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu; (2) sản phẩm
PCR đƣợc phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn DNA cắt đƣợc
điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide không biến tính, nhuộm ethidium
bromide (EtBr) và đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại. Việc lựa chọn enzyme
giới hạn có ý nghĩa quyết định trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtDNA.
Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn DNA chứa đột biến hoặc
đƣợc chủ động tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR mà có thể xác định đƣợc đột
biến và không đột biến sau phản ứng cắt với enzyme.
Trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng, PCR-RFLP là phƣơng pháp phổ
biến nhất đƣợc s dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm gen ty thể. Đây là
phƣơng pháp đơn giản và hiệu quả để phát hiện đột biến mtDNA khi sàng lọc với số
lƣợng mẫu lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có độ nhạy tƣơng đối, đôi khi đột biến
khó đƣợc phát hiện vì sự có mặt của các băng DNA mờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ
mtDNA đột biến trong mẫu thấp [26]. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP
nhuộm ethidium bromide là 5-10% [8].
1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự
gen [10]
Kỹ thuật giải trình tự đƣợc s dụng để phát hiện, tìm kiếm đột biến trong hệ
gen ty thể. Xác định trình tự nucleotide có thể phát hiện và khẳng định chắc chắn
loại đột biến trên DNA ty thể. Tuy vậy kỹ thuật này tốn nhiều thời gian và chi phí
cao, vì vậy nó thƣờng đƣợc s dụng để khẳng định chắc chắn sự có mặt của các đột
biến trong đó có đột biến điểm mtDNA.
1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded
conformational polymorphism)[12]
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến
tính, các mạch đơn DNA sẽ có cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Các cấu
hình khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến
sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Vì vậy, khi xuất hiện

43. 32
đột biến trong phân t mtDNA sẽ làm thay đổi cấu trúc bậc hai, cho phép phân tách
sợi DNA đột biến và không đột biến. Phƣơng pháp này có thể áp dụng để sàng lọc
đột biến điểm chƣa biết ở bệnh nhân nghi ngờ rối loạn mtDNA.
1.3.3.4. Định lượng đột biến MERRF bằng phương pháp real-time PCR [19, 52]
Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch
đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đo tín hiệu huỳnh quang,
trong đó sự tăng lên về số lƣợng DNA tƣơng ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh
quang. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm đƣợc khuếch
đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầu có trong ống
phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc
điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên
mối quan hệ của mẫu chuẩn đã biết rõ số lƣợng DNA đích ban đầu và mẫu nghiên
cứu với giá trị chu kỳ ngƣỡng [5, 8].
Ƣu điểm chính của real-time PCR là cho phép xác định số bản sao ban đầu của
mẫu DNA ở tỷ lệ thấp với độ chính xác và độ nhạy cao. Kết quả real-time PCR có
thể tính sự có mặt hay vắng mặt của alen hoặc định lƣợng số bản sao. Ngoài ra,
lƣợng sản phẩm DNA đích có thể theo dõi đƣợc sau mỗi chu kỳ mà không cần kiểm
tra bằng phƣơng pháp điện đi [5, 8].
1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học [71]
Biochip là một kỹ thuật mới, đƣợc s dụng trong sàng lọc phát hiện các đột
biến mtDNA, với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng
vi tính.
Để sản xuất các chip DNA, các cặp mẫu dò đƣợc thiết kế đặc hiệu cho từng
loại đột biến, bao gồm mẫu dò cho trình tự bình thƣờng và mẫu dò cho trình tự đột
biến. Mẫu dò đƣợc cài trên phiến kính một cách tự động, mỗi phiến kính với diện
tích khoảng 1 cm2
có thể chứa hàng trăm đến hàng ngàn mẫu dò khác nhau. DNA
khuôn đƣợc đánh dấu và lai với các mẫu dò. Các phƣơng pháp đánh dấu bao gồm

44. 33
gắn trực tiếp chất đánh dấu vào DNA khuôn, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng
enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích.
Ở Việt Nam, một bệnh nhân MELAS mang đột biến A3243G đã đƣợc phát
hiện lần đầu tiên bởi Lê Thị Bích Thảo và tập thể [4] bằng phƣơng pháp PCR-RFLP
và giải trình tự nucleotide. Năm 2014, Trƣơng và tập thể [55] đã s dụng phƣơng
pháp PCR-RFLP sàng lọc 106 bệnh nhân cơ não tuy nhiên các tác giả không phát
hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến thuộc hội chứng MERRF. Nhƣ vậy đột
biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đã đƣợc nghiên cứu tuy nhiên các thông tin có
đƣợc còn hạn chế. Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở ngƣời
Việt Nam, đặc biệt là việc định lƣợng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến
để đƣa ra mối tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến và biểu hiện lâm sàng của bệnh là cần
thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao.

45. 34
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu máu ngoại vi của 312 bệnh nhân ngƣời Việt Nam nghi bị bệnh ty thể
(Phụ lục 1) đƣợc lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ƣơng. Các mẫu máu đƣợc bảo quản ở
-80o
C. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đƣợc nghi ngờ mắc hội chứng
MERRF dựa trên sự có mặt của ít nhất hai trong ba đặc điểm sau:
- Tác động lâm sàng liên quan đến các cơ quan: hệ thần kinh trung ƣơng, cơ
xƣơng và cơ tim, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa.
- Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch não tủy.
- Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ não không bình thƣờng.
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác
Plasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có và không mang đột biến A8344G là sản
phẩm của đề tài KC.04.10/11-15
Các kit tách chiết DNA tổng số đƣợc mua từ hãng Qiagen; các cặp mồi và mẫu
dò đƣợc mua từ hãng Integrated DNA Technologies; thang chuẩn DNA, hỗn hợp
dNTP; (Enzynomics, Hàn Quốc); enzyme giới hạn đƣợc mua từ hãng
Thermoscientifics, Kapa probe fast qPCR, Master Mix đƣợc mua của hãng
Kapabiosystems.
Các hóa chất còn lại đều đƣợc mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt
độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân t .
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ
Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy NanoDropTM
8000,
máy PCR gradient (Eppendorff), máy real-time PCR iQTM 5 cycler (Biorad), máy
ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad) và hệ
thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad).

46. 35
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số đƣợc tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân theo
QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
Hỗn hợp tách DNA chứa 20 µl protease Qiagen, 200 µl mẫu máu, 200 µl đệm
AL và 4 µl RNase 10 mg/ml. Hỗn hợp đƣợc trộn đều bằng máy vortex trong 15
giây để thu đƣợc một dung dịch đồng nhất và đƣợc ủ ở 56o
C trong 10 phút. Sau đó
hỗn hợp đƣợc ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc bổ sung 200 µl
ethanol 100%, trộn đều và ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Dung dịch trong ống đƣợc
chuyển vào cột Qiagen, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột
đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc bổ sung 500 µl AW1 và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1
phút, sau đó dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột tiếp tục đƣợc cho thêm 500 µl AW2,
ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc
chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và đƣợc bổ sung 150 µl nƣớc cất vô trùng và để
yên trong 1 phút, sau đó đƣợc ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là
DNA tổng số. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20o
C cho đến khi s dụng.
2.3.2. Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết
Sự có mặt của DNA đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 5 µl
DNA đƣợc trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên
giếng gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế
ổn định 10 volt/cm gel, các băng DNA đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại.
Nồng độ của DNA tách chiết đƣợc định lƣợng bằng cách đo mật độ hấp thụ
ánh sáng t ngoại của các acid nucleic ở bƣớc sóng 260 nm (A260) trên máy Nano-
Drop. Nguyên tắc của phƣơng pháp là dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng t ngoại
ở bƣớc sóng 260 nm (A260) của các phân t DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bƣớc
sóng 260 nm của các phân t DNA, với hệ số A260 = 1 tƣơng đƣơng với hàm lƣợng
DNA sợi đôi là 50 μg/ml, s dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần
pha loãng) để định lƣợng DNA có trong mẫu tách chiết.